PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO STRICTO SENSU
MESTRADO EM CIÊNCIAS DA REABILITAÇÃO
DANIELLEN CRISTHINE CASTRO ALVES
EFEITOS DO ESTRESSE E DO EXERCÍCIO FÍSICO SOBRE
A METILAÇÃO DO DNA DE ESPERMATOZOIDES E
PARÂMETROS REPRODUTIVOS DE RATOS
Londrina 2017
DANIELLEN CRISTHINE CASTRO ALVES
Londrina 2017
AUTOR(ES)
EFEITOS DO ESTRESSE E DO EXERCÍCIO FÍSICO SOBRE
A METILAÇÃO DO DNA DE ESPERMATOZOIDES E
PARÂMETROS REPRODUTIVOS DE RATOS
Dissertação apresentada à UNOPAR, como requisito para a obtenção do título de Mestre em Ciências da Reabilitação.
Orientador: Prof. Dr. Marcus Vinícius de Matos Gomes
AUTORIZO A REPRODUÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE TRABALHO, POR QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO, PARA FINS DE ESTUDO E PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE.
Dados Internacionais de catalogação na publicação (CIP)
Universidade Norte do Paraná - UNOPARBiblioteca CCBS/CCECA PIZA Setor de Tratamento da Informação
Alves, Daniellen Cristhine Castro
A474e Efeitos do estresse e do exercício físico sobre a metilação do dna de espermatozoides e parâmetros reprodutivos de ratos. / Daniellen Cristhine Castro Alves. Londrina: [s.n], 2017.
86f.
Dissertação (Mestrado em Ciências da Reabilitação). Universidade Norte do Paraná.
Orientador: Prof. Dr. Marcus Vinícius de Matos Gomes.
1- Epigenética - dissertação - UNOPAR 2- Metilação de DNA, Espermatozoide 3- Capacidade funcional reprodutiva - ratos 4- Estresse 5- Exercício físico I- Gomes, Marcus Vinícius de Matos; orient. II- Universidade Norte do Paraná.
CDD 572.865
DANIELLEN CRISTHINE CASTRO ALVES
EFEITOS DO ESTRESSE E DO EXERCÍCIO FÍSICO SOBRE
A METILAÇÃO DO DNA DE ESPERMATOZOIDES E
PARÂMETROS REPRODUTIVOS DE RATOS
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências da Reabilitação (Programa Associado entre Universidade Estadual de Londrina - UEL e Universidade Norte do Paraná - UNOPAR), como requisito à obtenção do título de Mestre em Ciências da Reabilitação.
BANCA EXAMINADORA
________________________________________ Prof. Dr. Marcus Vinícius de Matos Gomes
Universidade Norte do Paraná
________________________________________ Prof. Drª Karen Barros Parron Fernandes
Universidade Norte do Paraná
________________________________________ Prof. Drª Gislaine Garcia Pelosi Gomes
Universidade Estadual de Londrina
DEDICATÓRIA
Primeiramente agradeço a Deus, por sempre guiar os meus caminhos, sem ele еυ não teria forças para essa longa jornada.
Dedico esse trabalho aos meus pais que são a minha base, agradeço a eles por todo o suporte, paciência e por sempre acreditarem no meu potêncial.
AGRADECIMENTOS
Agradeço primeiramente a Deus, pela capacitação, por ter me dado força nas horas em que eu desanimei, por me dar motivação a cada dia para continuar, por me conceder a sabedoria, por ter me dado à chance de sonhar e a oportunidade de realizar.
Agradeço aos meus pais, Amilton Castro Alves Junior e Doralice de Oliveira Alves, que são os meus melhores exemplos e as pessoas que eu mais admiro, por acreditarem na minha capacidade, por me aconselharem e me apoiarem quando precisei, por toda compreensão, por sonharem junto comigo e se realizarem nas minhas realizações, enfim por serem a base e o motivo do meu sucesso.
Agradeço a minha irmã Suellen Cristhine Castro Alves e ao meu cunhado João Kleber Helene, por todos os incentivos, os conselhos e o apoio sempre que precisei.
Ao meu orientador, professor Marcus Vinícius de Matos Gomes pelo tempo dedicado para me ensinar, pela compreensão, pelo companheirismo e por sempre acreditar em mim.
Aos participantes do Laboratório de Epigenética da UNOPAR, por toda a ajuda e pelos bons momentos que passamos nas atividades de laboratório.
Aos integrantes do Laboratório de Farmacologia Cardiovascular e aos integrantes do Laboratório de toxicologia e distúrbios metabólicos da reprodução da UEL pela imprescindível colaboração com este trabalho.
À Funadesp, pelo apoio financeiro na execução do projeto.
Aos professores e alunos do Programa de Pós-Graduação em Ciências da Reabilitação UEL/UNOPAR, que contribuíram de alguma forma na minha caminhada e que contribuem a cada dia para a melhoria deste programa. A todos que direta ou indiretamente contribuíram para a elaboração deste trabalho.
“Eu, a sabedoria, habito com a prudência e acho o conhecimento dos conselhos.”
CASTRO-ALVES, Daniellen Cristhine. EFEITOS DO ESTRESSE E DO EXERCÍCIO FÍSICO SOBRE A METILAÇÃO DO DNA DE ESPERMATOZOIDES E PARÂMETROS REPRODUTIVOS DE RATOS. 2017. 86 fls. Dissertação (Mestrado em Ciências da Reabilitação) – Universidade Norte do Paraná, Londrina, 2017.
RESUMO
Dados crescentes na literatura indicam a participação de mecanismos epigenéticos em respostas biológicas adaptativas ao estresse comportamental. No entanto, são escassas as evidências na literatura desses efeitos sobre programação epigenética de células germinativas e sobre a capacidade reprodutiva. Com o intuito de proporcionar informações adicionais, claras e objetivas à literatura vigente, o presente trabalho se apresenta dividido no formato de dois estudos científicos. O primeiro estudo objetivou avaliar os efeitos do estresse sobre o perfil de metilação global do DNA em espermatozoides e sobre os parâmetros reprodutivos. No segundo estudo o objetivo foi avaliar o potencial da prática de exercício físico em modular os efeitos relacionados ao estresse. Foram utilizados, em ambos os estudos, ratos da linhagem Wistar, os quais foram distribuídos em 4 grupos, contendo 5 animais cada: grupo ST: animais submetidos ao protocolo de estresse por restrição (14 sessões) do período do 67º dia pós-natal (DPN) ao 80ºDPN; Grupo EX: animais que foram submetidos ao protocolo de natação (20 sessões) do período do 53º ao 79º DPN; Grupo EX-ST animais submetidos à natação no período do 53º ao 79º DPN e ao protocolo de estresse do 67º ao 80º DPN; e Grupo CTL: animais que não foram submetidos a nenhum protocolo. No 80ºDPN os animais foram eutanasiados e os espermatozoides foram obtidos dos ductos deferentes para as análises moleculares, morfológica e de motilidade. Foi realizado a avaliação da função testicular e epididimária. E considerados os pesos do testículo, epidídimo, ducto deferente, vesícula (cheia e vazia) e próstata. Para as análises estatísticas foram utilizados os testes de Mann-Whitney e Kruskal-Wallis com pós teste de Dunn. Os resultados do primeiro estudo revelou uma hipermetilação no DNA dos espermatozoides (p=0.0095), diminuição de espermatozoides móveis (p=0.0079), aumento de anormalidades (p=0.0159), redução do peso da vesícula vazia relativa (p=0.0317) e próstata (p=0.0079), diminuição espermática no testículo (p=0.0317) e no epidídimo na cabeça/corpo (p=0.0285) e cauda (p=0.0159) no grupo submetido ao estresse crônico por restrição.O segundo estudo revelou uma hipermetilação no grupo EX-ST (p=0.0029) associada a diminuição de espermatozoides móveis e aumento de anormalidades espermáticas nesse grupo (p=0.0010). Redução significativa nos pesos do epidídimo, próstata e ducto deferente no grupo EX-ST e no peso da próstata no grupo EX. As contagens de espermatozoides no testículo apresentaram diminuição no número (p<0.0001) e na concentração (p=0.0004) no grupo EX-ST. O epidídimo na cabeça/corpo apresentou um aumento no número (p=0.0004) e na concentração (p=0.0004) no grupo EX. A cauda epididimária apresentou um aumento no número (p=0.0016) no grupo EX-ST e na concentração (p=0.0012) no grupo EX. Considerando conjuntamente as evidencias, demonstramos que a exposição ao estresse induz hipermetilação no DNA de espermatozoides além de afetar os parâmetros reprodutivos em ratos. Evidenciamos que a natação altera o peso da próstata, do epidídimo e do ducto deferente, porém sem alterar a metilação global de DNA, além de demonstrar que a prática de exercício físico não é capaz de proteger as células germinativas dos ratos dos efeitos causados pelo estresse crônico por restrição.
Palavras-chave: Epigenética, Estresse, Exercício físico, Metilação de DNA, Espermatozoide, Qualidade Espermática, Capacidade funcional reprodutiva.
CASTRO-ALVES, Daniellen Cristhine. EFFECTS OF STRESS AND PHYSICAL EXERCISE ON THE DNA METHYLATION OF SPERM AND REPRODUCTIVE PARAMETERS OF RATS. 2017. 86 p. Dissertation (Master of Science in Rehabilitation) - Northern University of Paraná, Londrina, 2017.
ABSTRACT
Increasing literature data indicates the participation of epigenetic mechanisms in the biological adaptive responses to behavioral stress. However, very little is still known about the effects of stress on the epigenetic program of germ cells and on reproductive capacity. In order to provide additional, clear and objective information to current literature, the present paper was divided into the format of two scientific studies. The first study aimed to evaluate the effects of stress on the global methylation profile of DNA in sperm and on reproductive parameters. In the second study the objective was to evaluate the potential of physical exercise in modulating the effects related to stress. In both studies, Wistar rats were divided into 4 groups containing 5 animals each: ST group: animals submitted to the restraint stress protocol (14 sessions) from the 67 postnatal period (DPN) at 80 DPN; Group EX: animals that were submitted to the swimming protocol (20 sessions) from the period from the 53 to the 79 DPN; Group EX-ST animals submitted to swimming in the period from the 53 to the 79 DPN and to the restraint stress protocol from the 67 to the 80 DPN; CTL Group: animals that were not submitted to the restraint stress or swimming protocols. At 80 DPN the animals were euthanized and the sperm were obtained from the vas deferens for molecular, morphological and motile analyzes. Evaluation of testicular and epididymal function was performed and considered the weights of the testis, epididymis, vas deferens, vesicle (full and empty) and prostate. For the statistical analyzes, the Mann-Whitney and Kruskal-Wallis tests were used with Dunn's post-test. The results of the first study revealed hypermethylation in sperm DNA (p=0.0095), decreased sperm motility (p=0.0079), increased abnormalities (p=0.0159), reduction of relative empty vesicle weight (p=0.0317) and prostate (p=0.0079), decreased sperm in the testis (p=0.0317), and in the epididymis in the head/body (p=0.0285) and tail (p=0.0159) in the group submitted to chronic stress by restriction. The second study revealed a hypermethylation in the EX-ST group (p=0.0029) associated with a decrease in motile sperm and an increase in sperm abnormalities in this group (p=0.0010). Significant reduction in epididymal, prostate and vas deferens weights in the EX-ST group and in the prostate weight in the EX group. Sperm counts in the testis presented a decrease in number (p<0.0001) and concentration (p=0.0004) in the EX-ST group. The epididymis in the head/body showed an increase in number (p=0.0004) and concentration (p=0.0004) in the EX group. The epididymal tail presented an increase in the number (p= 0.0016) in the EX-ST group and in the concentration (p=0.0012) in the EX group. Considering all together the evidences demonstrated that the exposure to stress induces hypermethylation in sperm DNA and affects reproductive parameters in rats. Furthermore they indicated that swimming might affect the weight of the prostate, the epididymis and the vas deferens, but without altering the overall DNA methylation profile, thus demonstrating that the practice of physical exercise is not able to protect the germ cells of the mice from the effects caused by stress chronic by restriction.
Key words: Epigenetics, Stress, Exercise, DNA Methylation, Sperm, Sperm Quality, Reproductive Functional Capacity.
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1– Ilustração explicativa do controle da expressão gênica por mecanismos epigenéticos... 17
FIGURA 2– Representação ilustrativa do papel da metilação do DNA no controle da expressão gênica e estabilidade cromossômica em diferentes regiões do genoma, bem como os respectivos padrões anormais observados em doenças... 18
FIGURA 3– Representação ilustrativa da vulnerabilidade epigenética de espermatozoides ao estilo de vida e fatores ambientais e seus efeitos transgeracionais... 20
FIGURA 4- Representação ilustrativa da ativação do eixo hipotálamo-pituitária-adrenal em resposta ao estresse ... 22
FIGURA 1A- Efeito do estresse crônico por restrição sobre a metilação global de DNA espermático... 42
FIGURA 2A- Efeito do estresse crônico por restrição sobre a morfologia espermática... 42
FIGURA 3A- Efeito do estresse crônico por restrição sobre a motilidade espermática... 42
FIGURA 1B- Efeito da prática de exercício físico e do exercício físico associado com estresse sobre a metilação global de DNA... 60
FIGURA 2B- Efeito da prática de exercício físico e do exercício físico associado com estresse sobre a morfologia espermática... 60
FIGURA 3B- Efeito da prática de exercício físico e do exercício físico associado com estresse sobre a motilidade espermática... 60
LISTA DE TABELAS
TABELA 1A - Efeito do estresse crônico por restrição no peso corpóreo e dos órgãos reprodutivos dos animais...
43
TABELA 2A - Efeito do estresse crônico por restrição na contagem espermática no testículo e no epidídimo... 43
TABELA 1B - Efeito da prática de exercício físico e do exercício físico associado com estresse sobre os pesos corporais e de órgãos reprodutivos... 61
TABELA 2B - Efeito da prática de exercício físico e do exercício físico associado com estresse sobre a contagem de espermatozoides no testículo e no epidídimo... 62
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
CTL Controle
ST Estresse
EX Exercício Físico
EX-ST Exercício Físico – Estresse DNA Ácido Desoxirribonucleico DNMT DNA Metiltransferase DPN Dias Pós-Natal
UEL Universidade Estadual de Londrina UNOPAR Universidade Norte do Paraná HPA Hipotálamo-Pituitária-Adrenal
PVN Projeções Neuronais Paraventricular GR Glicocorticoides
CRH Hormônio Liberador de Corticotrofina AVP Arginina Vasopressina
ACTH Adrenocorticotrofina MR Mineralocorticoide
SUMÁRIO
INTRODUÇÃO... 12
REVISÃO DE LITERATURA – CONTEXTUALIZAÇÃO... 15
ARTIGOS... 23
ARTIGO 1: ESTRESSE CRÔNICO POR RESTRIÇÃO CAUSA HIPERMETILAÇÃO GLOBAL DE DNA EM ESPERMATOZOIDES E PREJUÍZO NA CAPACIDADE FUNCIONAL REPRODUTIVA EM RATOS ADULTOS... 23
ARTIGO 2: EFEITOS DA NATAÇÃO SOBRE A METILAÇÃO DO DNA DE ESPERMATOZOIDES E A QUALIDADE DOS GAMETAS EM RATOS WISTAR... 43
REFERÊNCIAS... 62
CONCLUSÃO... 68
1. INTRODUÇÃO
O termo epigenética, que literalmente significa “acima do genoma”, é usado para definir os mecanismos moleculares capazes de realizar mudanças mitoticamente herdáveis que controlam a expressão gênica, sem que a sequência original do DNA seja alterada.1
Basicamente, as modificações pós-traducionais de histonas (acetilação, metilação, ubiquitinação e fosforilação) e a metilação de DNA são tidas com as principais modificações epigenéticas e, uma vez que um número crescente de evidências da literatura tem demonstrado suas respectivas vulnerabilidades a fatores ambientais, o interesse da compreensão de tais mecanismos de controle tem aumentado significativamente. 2,3,4
Atualmente, a metilação de DNA em ilhas GpGs é o marcador epigenético mais estudado sendo associada ao controle de uma série de atividades biológicas como a diferenciação celular, o imprinting genômico, o desenvolvimento embrionário, a estabilidade cromossômica, a supressão de retrovírus e a inativação do cromossomo X em fêmeas.2,5 Além disso, dados
recentes da literatura tem relacionado a metilação do DNA com o controle da plasticidade sináptica, o mecanismo de memória e inúmeros outros processos cognitivos, assim como com a formação de fenótipos e adaptações comportamentais em situação de estresse crônico.6,7
O estresse pode ser conceituado como uma condição em que a homeostase do organismo é alterada, ocorrendo a percepção de agentes aversivos (estressores) como uma estratégia de defesa, são desencadeadas repostas fisiológicas para minimizar os danos ao organismo.8,9
As respostas características do organismo ao estresse tem sido demonstradas como dependentes de fatores como idade, sexo, tipo de estímulo ao estresse, controle do agente estressor, polimorfismo genético, estado hormonal e experiências prévias do indivíduo frente a situação de estresse.10,11,12
Entre os diversos processos celulares afetados durante o estresse incluem a apoptose celular, a neurogênese e as modificações na cromatina. Além disso dados consistentes da literatura tem relacionado o acumulo ou a resposta excessiva ao estresse com a origem de diversas doenças. 13
Relatos da literatura associaram o estresse comportamental a alterações
loci específicas de metilação do DNA em células do sangue periférico de
humanos.15 Corroborando dados recentes do nosso grupo de pesquisa
demonstraram uma relação entre o estresse comportamental e alterações significativas no mecanismo de metilação do DNA em células encefálicas de ratos.15,16 Entretanto, muito pouco se sabe ainda a respeito dos efeitos do
estresse comportamental sobre a programação epigenética de células não encefálicas.
Há algum tempo a prática de exercício físico tem sido incluída entre os fenômenos capazes de diminuir o impacto biológico do estresse no organismo, com potencial de facilitar a adaptação as situações geradoras do estresse, desencadeando assim as estratégias de coping, que são um conjunto de esforços cognitivos e comportamentais para lidar com situações de danos, ameaças ou desafios.17
Dados recentes do nosso grupo de pesquisa demonstraram o potencial do exercício físico em modular a intensidade do efeito do estresse sobre a metilação global do DNA no hipocampo, córtex e substância cinzenta periaquedutal (PAG), além de modular os efeitos na expressão de genes Dnmt1 e Bdnf.16 Além disso, nossos dados prévios revelam que o exercício físico
propriamente dito pode potencialmente atuar na modulação de mecanismos epigenéticos, como descrito por Kashimoto et al.16 em que a prática do exercício
físico demonstrou aumentar a metilação do DNA global no hipotálamo.
Um interesse emergente na literatura envolve o potencial transgeracional das alterações de metilação de DNA induzidas pelo meio ambiente, ou seja, do quanto as alterações epigenéticas induzidas podem ser herdadas por gerações subsequentes e afetar os fenótipos dos descendentes. Neste contexto, a capacidade de efeitos ambientais em induzir alterações no perfil de metilação de DNA em células germinativas tem se tornado um foco emergente de estudos18,19
Neste contexto, o presente estudo objetivou esclarecer o potencial do estresse por restrição e o do exercício físico em modular a programação epigenética de espermatozoides, além de avaliar o quanto essa variação ambiental pode afetar a capacidade espermática e a função testicular de ratos
REVISÃO DE LITERATURA – CONTEXTUALIZAÇÃO
O termo epigenética é comumente usado para descrever as mudanças mitoticamente herdáveis que controlam a expressão gênica, sem que a sequência original do DNA seja alterada.1 Entre os mecanismos epigenéticos
conhecidos incluem: 1) Modificações covalentes em histonas: acetilação, metilação, ubiquitinação e fosforilação, que ocorrem nas caudas N-terminais de proteínas de histonas nas quais o DNA se enrola formando o nucleossomo, estrutura fundamental da cromatina; 2) Metilação do DNA: introdução de radical metil (CH3) no carbono 5 de Citosinas, seguidas de Guaninas, na moléculas de
DNA; 3) RNAs não codificantes: pequenos ou micro RNAs (miRNAs) espalhados ao longo do genoma com função regulatória de controle da expressão gênica.2,3
Esses mecanismos estão ilustrados na figura 1.
A metilação de DNA em ilhas GpGs é atualmente o marcador epigenético mais estudado, com vastas implicações no controle da diferenciação celular, imprinting genômico, desenvolvimento embrionário, estabilidade cromossômica, supressão de retrovírus e inativação do cromossomo X em fêmeas.2,5 Estima-se que grande parte (aproximadamente 80%) de todos os
CPG do genoma humano sejam metilados, porém, os mecanismos pelos quais a metilação do DNA controla a expressão gênica ainda não são totalmente compreendidos.21
No processo de metilação do DNA, a introdução do radical metil é catalisada e mantida por enzimas denominadas DNA metiltransferases (DNMTs), as quais obtém e transferem o radical metil a partir do composto S-adenosyl-L-metionina, que é o doador de metil, para o carbono 5 da citosina. 22
FIGURA 1 – Ilustração explicativa do controle da expressão gênica por mecanismos epigenéticos. Adaptado de Hagood 2014. 20
No que diz respeito ao controle da expressão gênica, basicamente, a metilação do DNA está associada à compactação da cromatina e ao acesso de fatores de transcrição, desse modo a metilação de regiões promotoras está normalmente associada a uma maior compactação da cromatina e por sua vez ao silenciamento gênico, enquanto que a ausência da metilação do DNA em regiões promotora está normalmente associada ao afrouxamento da cromatina e facilitação do acesso de fatores de transcrição à região promotora e, por conseguinte à transcrição gênica, como pode ser observado na figura 2.23,24
As ilhas CpGs estão em grande parte em regiões promotoras de genes, sendo essa região pelo menos 10 vezes mais metilada do que outras regiões do genoma com CpGs.24,25 Porém, de certa forma considerar a atuação da
metilação do DNA no controle da expressão gênica apenas em regiões promotoras é um tanto quanto simplista, visto que esse processo pode também afetar a função gênica quando ocorre em regiões diferentes, como por exemplo em regiões intrônicas, ilhas CpGs distantes da região promotora (shore CpG
FIGURA 2 – Representação ilustrativa do papel da metilação do DNA no controle da expressão gênica e estabilidade cromossômica em diferentes regiões do genoma. (A) As ilhas CpG em promotores de genes são normalmente não metiladas, permitindo a sua transcrição. A hipermetilação nessas regiões levam à inativação transcricional. (B) O mesmo padrão pode ser observado em ilhas CpGs próximas a região promotora. (C) Metilação ao longo do gene pode prevenir transcritos indesejados e demetilação dessas regiões permitirem a transcrição em locais incorretos. (D) As sequências repetidas parecem ser hipermetiladas prevenindo instabilidade cromossómica, translocações e ruptura de genes através da reativação de sequências endoparasitas. Adaptado de Portela & Esteller 2010.22
Considerando o importante papel exercido pela metilação do DNA, assim como pelas modificações de histonas, no controle da função gênica assume-se que o epigenoma, ou seja, a programação epigenética total do DNA, seja um fenômeno dinâmico e diferente entre os tipos celulares.21.
Há um aumento constante do interesse em identificar anormalidades em padrões da metilação de DNA com a etiologia de doenças, sendo incluídas entre essas várias síndromes pediátricas, doenças autoimunes, cardiovasculares e principalmente o câncer.22
No tocante à vulnerabilidade dos padrões epigenéticos às variações ambientais4 acredita-se que os mecanismos epigenéticos sejam a via biológica
pela qual fatores externos modulem a informação genética e afetem o surgimento de doenças multifatoriais. De maneira semelhante, especula-se que alterações epigenéticas induzidas pelo meio ambiente possam acometer células germinativas e serem herdadas por gerações subsequentes.18,19 As alterações
epigenéticas em célula espermática bem como suas causas e consequências estão representadas na figura 3.
No que tange às células germinativas, a programação epigenética consiste em um fenômeno de fundamental importância na gametogênese e apresenta padrão e cronologia distinta quando considerados espermatozoides e oócitos.26
Alterações nos padrões epigenéticos de células germinativas são considerados de grande importância para o desenvolvimento embrionário normal, de modo que desregulações epigenéticas associadas tanto à exposições ambientais, ao álcool, tabagismo, nutrição e radiação ionizante bem como à manipulações de células germinativas ou de embriões concebido por técnicas de reprodução assistida (fertilização in vitro) podem resultar em distúrbios e síndromes genéticas como a de Angelman, Prader-Willi, e Beckwith-Weidemann.27
FIGURA 3 – Representação ilustrativa da vulnerabilidade epigenética de espermatozoides ao estilo de vida e fatores ambientais e seus efeitos transgeracionais no desenvolvimento embrionário, doenças congênitas ao nascimento, e em doenças de início tardio como obesidade, hipertensão, diabetes, entre outras. Adaptado de Stuppia et al 2015.28
Estudo recente realizado em modelo animal demonstrou que o envelhecimento está associado a uma perda de metilação do DNA de espermatozoides e subsequente a alterações comportamentais e na expressão gênica dos descendentes, demonstrando assim que o epigenoma espermático é vulnerável as modificações ambientais e fisiológicas e que tal vulnerabilidade pode potencialmente repercutir na saúde dos conceptos.29
O papel da epigenética no controle de funções cerebrais como a plasticidade sináptica, memória e outros processos cognitivos, assim como na formação de fenótipos e adaptações comportamentais em situação de estresse crônico tem sido relatado nos últimos anos.6,7
O estresse pode ser conceituado como uma condição onde o equilíbrio do organismo é ameaçada por agentes estressores. Inúmeros fatores podem ser classificados como estressores, podendo ser de origem interoceptivos, como mudanças no volume ou osmolaridade do sangue e infecções ou exteroceptivos,
como ruídos, condições climáticas, exercícios físicos intensos e diversos outros, podendo assim perturbar a homeostasia do organismo, desencadeando repostas fisiológicas para minimizar os danos.8,9
Em resposta ao estresse comportamental o organismo passa pelos estados de excitação, alerta, e vigilância, além de fazer com que a atenção seja reforçada e o corpo entre em analgesia. Os recursos energéticos corporais são redistribuídos inibindo funções vegetativas como a de alimentação e reprodução e aumentando a frequência cardíaca, sudorese e níveis de glicose no sangue. Embora essas respostas busquem a adaptação do organismo para garantir condições favoráveis para sobrevivência, quando a exposição se torna prolongada e repetitiva essas respostas começam a contribuir para o desenvolvimento de doenças. 30,31 Um exemplo de resposta fisiológica ao
estresse pode ser observado na figura 4.
Dados recentes do nosso grupo de pesquisa demonstraram uma relação entre o estresse e alterações significativas no perfil global de metilação do DNA em áreas específicas do cérebro de ratos como o hipocampo, córtex e PAG, revelando assim a vulnerabilidade da programação epigenética de células encefálicas ao estresse.15
Considerando o acometimento de células germinativas, estudos realizados em modelos animais demonstraram que o estresse pode atuar prejudicando a função testicular, de modo que ratos estressados apresentam níveis de cortisol elevados e aumento de apoptose de células germinativas e células de Leydig.34,35
Em um estudo populacional, Nordkap et al36 observaram uma
associação negativa entre o estresse auto relatado e a qualidade do espermatozoide de homens adultos, evidenciando a capacidade do estresse comportamental de alterar a qualidade espermática, embora a via biológica desta associação do estresse com qualidade de espermatozoide não esteja ainda esclarecida.
FIGURA 4 – Representação ilustrativa da ativação do eixo hipotálamo-pituitária-adrenal em resposta ao estresse. Nesta, o hipocampo atua na avaliação de estressores e como um local de regulação do feedback negativo mediado por receptores de glicocorticoides (GR). Ocorre a liberação do hormônio liberador de corticotrofina (CRH) e da arginina vasopressina (AVP), que promovem a síntese e secreção de adrenocorticotrofina (ACTH), que por sua vez, estimula a liberação de glicocorticoides das glândulas suprarrenais. O GR ainda ativa a FKBP51 que codifica a proteína chaperona que restringe a atividade de GR. Adaptado de Raabe & Spengler 2013.32
Atualmente, diversos estudos tem apontado o exercício físico como um regulador epigenético; Elsner et al37 e Lovatel et al38, em seus estudos
comprovaram que o exercício físico é um importante estímulo ambiental para alterar a transcrição de genes envolvidos no funcionamento cerebral.
Atualmente, estudos tem buscado uma maior compreensão entre o exercício físico e a promoção de saúde via mecanismos epigenéticos.39 Porém,
são poucos os dados na literatura que abordam o efeito da prática de exercícios nos mecanismos epigenéticos, portanto essa relação ainda é pouco compreendida, emergindo assim a necessidade de estudos que aumentem a compreensão desses mecanismos.
Nossos estudos demonstraram o potencial do exercício físico em diminuir a intensidade do estresse sobre a metilação do DNA global no hipocampo, córtex e PAG, além de modular os efeitos na expressão de genes
Dnmt1 e Bdnf.15 Ainda em nossos estudos podemos observar que o exercício
físico atua na modulação dos mecanismos epigenéticos, como descrito por Kashimoto et al16 em que a prática do exercício físico aumentou a metilação do
DNA global no hipotálamo em modelo animal.
Denham et al40 observaram que o exercício físico melhora a aptidão
cardiorrespiratória e o perfil lipídico, além de induzir mudanças na metilação do DNA de leucócitos em homens jovens, causando demetilação em diversas regiões promotoras, o que por sua vez, pode levar a alterações na transcrição de vários genes. Em outro estudo Denham et al41 relataram que o exercício físico
induz demetilação do DNA em espermatozoides de homens adultos após 3 meses de treinamento ressaltando assim uma potencial vulnerabilidade das marcações epigenéticas de células germinativas ao exercício físico.
A literatura ainda é imprecisa quanto os efeitos da prática de exercício nos mecanismos epigenéticos em células germinativas e em parâmetros reprodutivos. Porém, estudos sugerem que a falta da prática de exercício físico pode estar associada com a redução da qualidade espermática42 e que o
sedentarismo e a obesidade estão relacionados com uma baixa contagem de espermatozoides43. Além disso, tem sido observado o efeito da prática de
exercício físico sobre o volume, número, concentração e porcentagens de espermatozoides móveis e morfologicamente normais.44 Uma pesquisa
realizada em pessoas fisicamente ativas que praticavam ciclismo em alta intensidade evidenciou alterações significas na morfologia dos espermatozoides.45
Nesse contexto, o presente estudo objetivou avaliar o efeito do estresse crônico por restrição e do exercício físico sobre a programação epigenética, especifica na metilação do DNA, de espermatozoides de ratos, bem como estabelecer a associação deste possível efeito com parâmetros celulares reprodutivos.
2. ARTIGOS ARTIGO 1:
ESTRESSE CRÔNICO POR RESTRIÇÃO INDUZ HIPERMETILAÇÃO GLOBAL DO DNA EM ESPERMATOZOIDES E AFETA A CAPACIDADE FUNCIONAL REPRODUTIVA DE RATOS
Daniellen C. Castro-Alves1, Leandro V. Toffoli1, Wyllian R. Silva1, Lucas M.
Nascimento1, Viviane B. Estrada2, Luis Fernando Verissimo2, Ana Paula F.
Punhagui2, Rafaela P. Erthal2, Glaura S. A. Fernandes2, Gislaine G. Pelosi2,
Marcus V. M. Gomes1,3.
1 Centro de Pesquisa em Ciências da Saúde, Universidade Norte do Paraná (UNOPAR), Londrina, Paraná, Brasil.
2 Centro de Ciências Biológicas, Departamento de Ciências Fisiológicas, Universidade Estadual de Londrina (UEL), Paraná, Brasil.
3Autor correspondente:
Marcus Vinicius de Matos Gomes
Centro de Ciências Biológicas e da Saúde, Universidade Norte do Paraná (UNOPAR).
Av. Paris 675, Jardim Piza. CEP: 86041-120, Londrina, Paraná, Brasil. Telefone: + 55 43 3371-9859 / Fax: +55 43 3371 7721
RESUMO
INTRODUÇÃO: O estresse tem se tornado um importante fator de desequilíbrio das relações pessoais e de saúde da humanidade. Evidências indicam o envolvimento de mecanismos epigenéticos nas respostas biológicas adaptativas ao estresse crônico por restrição. Porém não há relatos dos efeitos do estresse sobre a programação epigenética de células germinativas e possíveis efeitos sobre a capacidade reprodutiva.
OBJETIVOS: Avaliar os efeitos do estresse crônico por restrição sobre o perfil de metilação global do DNA de espermatozoides e os efeitos nos parâmetros reprodutivos.
METODOLOGIA: 10 ratos machos Wistar com o peso entre 200 a 250 gramas, foram distribuídos em 2 grupos contendo 5 animais cada: grupo ST: animais submetidos ao protocolo validado de estresse por restrição (14 sessões) do dia 67º pós-natal (DPN) ao 80ºDPN; Grupo CTL: animais que não foram submetidos ao protocolo de estresse. No 80ºDPN os animais foram eutanasiados para coleta das amostras. Os espermatozoides foram obtidos dos ductos deferentes para as análises moleculares, avaliações morfológica e de motilidade, o testículo e epidídimo foram coletados para avaliações posteriores. Foram também considerados os pesos do testículo, epidídimo, ducto deferente, vesícula (cheia e vazia) e próstata. Foi realizado a extração do DNA e a metilação global do DNA foi avaliada com o auxílio do kit Imprint® Methylated DNA Quantification
(Sigma-Aldrich). Para a análise estatística foi utilizado o software GraphPad Prism 6.0,
aplicado o teste de Mann-Whitney e adotado um nível de significância de 5% para todos os testes empregados.
RESULTADOS: O perfil global de metilação do DNA dos espermatozoides revelou uma hipermetilação no grupo ST (p=0.0095). A análise da motilidade revelou uma diminuição de espermatozoides móveis no grupo ST (p=0.0079) e aumento de anormalidades espermáticas (p=0.0159). Houve redução do peso da vesícula vazia relativa (p=0.0317) e da próstata (p=0.0079). As contagens apresentaram diminuição espermática no testículo (p=0.0317) e no epidídimo na cabeça/corpo (p=0.0285) e cauda (p=0.0159).
CONCLUSÕES: Em suma, nossos dados sugerem uma vulnerabilidade da programação epigenética de espermatozoides ao estresse além de revelarem que a exposição ao estresse crônico pode afetar os parâmetros reprodutivos.
Palavras-chave: Epigenética, Estresse, Capacidade funcional reprodutiva, Metilação de DNA, Espermatozoide.
INTRODUÇÃO
O termo epigenética significa “acima do genoma” e é usado para definir os mecanismos que são capazes de realizar mudanças mitoticamente herdáveis que controlam a expressão gênica, sem que a sequência original do DNA seja alterada; os dois tipos mais conhecidos são as modificações de histonas e a metilação de DNA. Sabe-se que fatores ambientais podem modular a programação epigenética, aumentando assim o interesse de compreensão de seus mecanismos de controle [1,2].
Atualmente a metilação de DNA em ilhas GpGs é o marcador epigenético mais estudado, isso porque essas regiões são responsáveis pelo controle da diferenciação celular, imprinting genômico, desenvolvimento embrionário, estabilidade cromossômica, supressão de retrovírus e inativação do cromossomo X em fêmeas[1,3]. A epigenética encontra-se fortemente relacionada com plasticidade sináptica, memória e outros processos cognitivos, na formação de fenótipos e adaptações comportamentais em situação de estresse crônico [4,5].
O acumulo de estresse encontra-se relacionado com diversas doenças. Basicamente podemos conceitua-lo como uma condição em que o organismo detecta a presença de agentes estressores e como uma estratégia de defesa desencadeia repostas fisiológicas para minimizar os danos ao organismo [6,7].
As características do estresse são dependentes de alguns fatores, como idade, sexo, tipo de estímulo ao estresse, controle do agente estressor, polimorfismo genético, estado hormonal e experiências prévias do indivíduo frente a situação de estresse [8,9]. Entre os diversos processos celulares que são afetados durante o estresse, alguns se tornam irreversíveis a longo prazo, como a apoptose celular, a neurogênese e as modificações na cromatina [10].
A associação do estresse com alterações loci específicas de metilação do DNA, foi observada em células do sangue periférico de humanos [11]. Estudos recentes do nosso grupo de pesquisa demonstraram uma relação entre o estresse crônico por restrição e alterações significativas no mecanismo de metilação do DNA em células encefálicas de ratos [12,13].
Existe um número crescente de evidências que a metilação de DNA induzida pelo meio ambiente pode ser herdada por gerações subsequentes e afetar seus fenótipos. Um dos mecanismos que pode estar envolvido na herança do perfil de metilação de DNA são as células germinativas [14].
A partir de um estudo realizado em modelo animal no qual foram avaliadas regiões metiladas em espermatozoides de ratos jovens e adultos, foi observado que o envelhecimento pode afetar a metilação do DNA na prole e subsequentemente afetar as expressões de genes associados ao controle do comportamento e transtornos psiquiátricos [15,16].
Diante disso, observamos a necessidade de dados na literatura que esclareçam o impacto do estresse em células germinativas, e quais os mecanismos envolvidos nesse processo. Sendo assim, objetivamos avaliar os efeitos do estresse comportamental sobre o perfil de metilação global do DNA de espermatozoides e seus respectivos efeitos em parâmetros espermáticos.
METODOLOGIA
Os procedimentos experimentais foram realizados seguindo protocolos aprovados pelo Comitê de Ética em Pesquisa local (CEUA nº 14441.2013.18).
ANIMAIS
Foram utilizados 10 ratos machos Wistar, sem parentesco, com peso entre 200-250g, provenientes do Biotério Central da Universidade Estadual de Londrina (UEL).
Esses animais foram mantidos em condições de temperatura ambiente (25±1 °C, fotoperíodo de 12h luz/12h escuro) e com água e ração convencional ad libitum de maneira imparcial para todos os grupos experimentais.
Os animais foram randomizados e distribuídos em dois grupos, contendo 5 animais cada: 1) grupo de estresse (ST): animais que foram submetidos ao protocolo de estresse crônico por restrição (14 sessões) do 67 dias pós-natal (DPN) ao 80 DNP e 2) grupo controle (CTL): animais que foram mantidos nas mesmas condições que os demais animais porém não foram submetidos ao protocolo de estresse. O protocolo experimental foi realizado no período matutino entre 08:00 e 10:00 horas.
ESTRESSE CRÔNICO POR RESTRIÇÃO
Para as análises dos efeitos do estresse comportamental sobre os padrões epigenéticos foi utilizado o ensaio validado de estresse crônico por restrição [17].
No período da manhã (08:00 e 10:00), os animais foram transportados para a sala experimental em suas gaiolas e permitido que se adaptassem a este ambiente por 30 minutos. Após este período, os animais foram submetidos ao protocolo de estresse, sendo colocados em um cilindro metálico de 6,5 cm de diâmetro e 15 cm de comprimento com orifícios que permitiam ventilação, onde permaneceram fechados durante 60 minutos.
AMOSTRAS
Os animais foram anestesiados com 100mg/kg de ketamina associado com 13 mg/kg de xilazina. Logo após foram retirados os ductos deferentes, os testículos, os epidídimos, a vesícula seminal e a próstata.
PESOS
O peso corporal de cada animal foi anotado diariamente durante o período experimental, após a eutanásia os pesos dos órgãos coletados foram anotados e cada um foi destinado para uma análise.
METILAÇÃO GLOBAL DO DNA
Metade do ducto deferente esquerdo foi seccionado e lavado internamente com o auxílio de agulha e seringa com 0,3mL de solução salina para obtenção dos espermatozoides e a extração do DNA genômico foi realizada pelo método de fenol clorofórmio [18]. A avaliação da pureza e concentração de DNA foi realizada pela análise de absorbância em um espectrofotômetro (NanoDrop ND-2000 – Thermo Scientific) a 260nm e 280nm.
O perfil de metilação global de DNA foi avaliado pela dosagem de 5-metil-citosina pelo kit Imprint® Methylated DNA Quantification kit (Sigma-Aldrich®), de acordo com as recomendações do fabricante [19]. De forma simplificada, a porcentagem de metilação de cada amostra foi calculada pela quantidade de citosinas metiladas na amostra (5mC) em relação a citidina global (5mC + dC) em um controle positivo previamente metilado (100% metilado) e um
controle negativo (0% metilado). As leituras das absorbâncias foram realizadas a 450 nm em leitor de microplaca e a porcentagem da metilação do DNA foi obtida seguindo a fórmula: A450sample-A450NTC / (A450met-A450NTC) x100. Todas as amostras foram analisadas em duplicata.
CONTAGEM DE ESPERMATOZOIDES POR TESTÍCULO
Os testículos foram descapsulados, pesados e congelados até a homogeneização segundo método descrito por Robb et al [20] com as adaptações descritas por Siervo et al [21]. O parênquima foi descongelado e homogeneizado em uma mistura de NaCl (9%) e Triton X100 (0,5%) (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.). Após diluição de 10 vezes na mistura contendo Triton X100, uma parte da amostra foi transferida para câmaras de Neubauer (4 campos por animal), procedendo-se a contagem das espermátides resistentes ao processo de homogeneização.
CONTAGEM DE ESPERMATOZOIDES NO EPIDÍDIMO
Os epidídimos direitos tiveram as porções epididimárias cabeça/corpo e cauda separadas logo após a coleta e congeladas até a homogeneização, descrito por Robb et al [20] com as adaptações descritas por Fernandes et al [22]. As porções foram descongeladas e homogeneizadas com 1ml de NaCl (9%) e Triton X100 (0,5%) (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.) para cada 200mg de tecido cabeça/corpo e para cada 100mg de tecido da região da cauda, por 45 segundos. Então, 50µl do homogeneizado foram diluídos em 950µl de solução salina (diluição 1:20), do qual uma alíquota (10µl) foi colocada em câmara de Neubauer (4 campos por animal), procedendo-se a contagem das espermátides resistentes ao processo de homogeneização.
ANÁLISE DA MORFOLOGIA DOS ESPERMATOZOIDES
Esta avaliação foi conduzida como descrito por Fernandes et al [22]. O ducto deferente direito dos animais foi seccionado nas extremidades anterior e posterior, e lavado internamente com o auxílio de agulha e seringa, com 0,3mL de solução de formol salina tamponada. O conteúdo foi colhido em um eppendorf e reservado em geladeira. Em seguida foram feitos esfregaços em lâminas histológicas, que foram deixadas secar ao ar livre por 1 minuto e
observados em microscópio de luz (aumento de 400X) [23]. Foram analisados 200 espermatozoides por animal. As anormalidades morfológicas encontradas nos espermatozoides foram classificadas em duas categorias: anormalidades da cabeça (sem curvatura característica e isolada) e anormalidades da cauda (enrolada, quebrada e isolada) [24].
ANÁLISE DA MOTILIDADE DOS ESPERMATOZOIDES
Parte do ducto deferente esquerdo foi seccionada nas extremidades anterior e posterior e raspada delicadamente com espátula de metal para retirar os espermatozoides de seu interior. O coletado foi imediatamente diluído em meio HTF (500µl) modificado com gentamicina (Human Tubal Fluid, IrvineScientific®) e pré-aquecido a 34ºC para evitar a morte celular. Uma alíquota de 10 µl foi colocada em uma câmara de Makler (Irvine, Israel) e analisada sob microscopia de luz (aumento de 400X). Foram avaliados 100 espermatozoides por animal, classificados em móvel ou imóvel. Este protocolo é descrito por Siervo et al [21] com modificações.
ANÁLISE ESTATÍSTICA
Para a análise estatística dos dados foi utilizado o software GraphPad Prism 6.0. Foi aplicado o teste de Mann-Whitney e adotado um nível de significância de 5% para todos os testes empregados.
RESULTADOS
METILAÇÃO GLOBAL DE DNA
A metilação global de DNA apresentou um aumento significativamente estatístico no grupo ST (p=0.0095) quando comparado com o grupo controle (Figura1A).
PESO CORPORAL E DOS ÓRGÃO REPRODUTORES
A pesagem dos órgãos reprodutores apresentaram diferenças significativamente estatísticas apenas no peso da vesícula seminal vazia (p=0.0317) e na próstata (p=0.0079) onde houve uma diminuição de peso no grupo ST quando comparado com o grupo CTL. O peso corporal, testicular,
epididimário e do ducto deferente mantiveram-se similares entre os grupos experimentais (Tabela1A).
MORFOLOGIA DOS ESPERMATOZOIDES
O estresse crônico por restrição evidenciou uma diminuição significativa no número de espermatozoides normais (p=0.0159) e, consequentemente, um aumento significativo de espermatozoides anormais (p=0.0159) quando comparado o grupo CTL (Figura2A).
Foram avaliados 200 espermatozoides por animal, o total de anormalidades observadas no grupo estresse foram: 12,7% de espermatozoides com cabeça sem curva, 0,4% de cabeça isolada, 6,3% de cauda isolada e 3,3% de cauda quebrada.
MOTILIDADE DOS ESPERMATOZOIDES
A análise da motilidade espermática apresentou resultados estatisticamente significantes uma vez que houve diminuição do número de espermatozoides móveis (p=0.0079) e um aumento de espermatozoides imóveis (p=0.0079) no grupo ST quando comparado ao grupo CTL (Figura3A).
CONTAGEM DE ESPERMÁTICA NOS TESTÍCULOS E EPIDÍDIMOS
Os resultados para a contagem espermática apresentou diferenças estatísticas no número de espermatozoides por testículo onde houve uma diminuição no grupo ST (p=0.0317), entretanto, o número relativo não foi alterado nesse órgão. No epidídimo o número de espermatozoides na cabeça/corpo absoluto (p=0.0285) diminuiu no grupo ST, porém os números relativos não sofreram alterações após a exposição ao estresse crônico por restrição sendo similar ao grupo CTL. A concentração espermática na região da cauda (p=0.0159) foi reduzida após exposição ao estresse crônico e o número absoluto não foi alterado (Tabela2A).
DISCUSSÃO
Alterações dos padrões epigenéticos normais tem sido amplamente relacionados com um grande número de doenças, incluindo doenças neurodegenerativas, cardiovasculares, autoimunes entre outras [25].
No presente estudo, demonstramos a vulnerabilidade da programação epigenética de células germinativas ao estresse comportamental e evidenciamos, em modelo experimental de ratos, que o estresse crônico por restrição induz um aumento do perfil global de metilação DNA nos espermatozoides e afeta parâmetros reprodutivos como a motilidade e o número de espermatozoides viáveis, o pesoda vesícula seminal e da próstata.
Sabe-se que a metilação do DNA atua na expressão gênica por meio de mecanismos diretos e indiretos. A metilação em sítios CpGs em regiões promotoras de genes é capaz de impedir o seu reconhecimento pelos fatores de transcrição, ocasionando a inativação do gene [26,27]. A metilação também pode ocorrer em regiões que apresentam domínios de ligação para a metilação, localizado em torno de sítios de regulação da transcrição atraindo indiretamente proteínas de domínio de ligação de metilação, que recrutam desacetilases e correpressores de histonas que inativam as configurações de cromatina ao redor do gene, ocasionando o seu desligamento [28].
Modificações nos padrões de metilação de DNA de grande relevância ocorrem durante a formação e maturação das células germinativas e são responsáveis pelo controle do imprinting genômico, um fenômeno que controla a expressão gênica de células somáticas dos descendentes de acordo com a origem parental [29]. Metilação diferencial de regiões específicas denominadas controladoras do imprinting (ICR, em inglês imprinting control
regions) em alelos paternos (metilações em espermatozoides) e maternos
(metilações em oócitos) estão diretamente relacionadas ao controle do imprinting genômico. Nessas regiões ICRs, o estabelecimento dos padrões parentais específicos de metilação do DNA é obtido durante a gametogênese e mantido nos espermatozóides e oócitos até momentos que sucedem a fecundação [30]. Logo após a fecundação, as marcas de metilação de células germinativas são apagadas no zigoto e um novo padrão é restabelecido de acordo com cada tipo de células somáticas primordiais [31], embora nas ICRS não ocorra a onda de demetilação e os padrões parentais específicos são mantidos [30].
Dessa forma, o controle do imprinting genômico está intimamente associado ao êxito na programação epigenética de células germinativas paternas (espermatozóides) e maternas (oócitos), e erros envolvendo a programação epigenética de células germinativas estão associadas com
alterações no crescimento embrionário, na função placentária e no desenvolvimento de todos os sistemas do organismo levando a um número significativo de doenças, incluindo entre elas distúrbios pediátricos, câncer e alterações neuropsiquiátricas [32].
No presente estudo, os dados demonstram a manutenção do peso corpóreo após o estresse crônico por restrição e corroboram com estudo realizado por Priya et al [33], no qual ratos foram submetidos ao protocolo de estresse por restrição durante 5 horas por 60 dias e mantiveram seus pesos normais durante o tempo de experimento.
A literatura inclui o estresse psicológico e fisiológico como um fator capaz de induzir a disfunção sexual e infertilidade, além de ejaculação precoce, dificuldade orgásmica e baixa qualidade do esperma [34]. No presente estudo, a função testicular foi alterada em animais estressados, sendo observada uma diminuição na contagem de espermatozoides por testículo e uma redução no número de espermatozoides normais. Além disso, a função epididimária também foi alterada pelo estresse o que foi evidenciado pela redução significativa no número de espermatozoides moveis e número de espermatozoides na região da cabeça corpo e cauda epididimária.
A alteração em parâmetros da contagem espermática no testículo e epidídimo denota o efeito prejudicial do estresse crônico por restrição na função destes órgãos que podem estar relacionados a um aumento de estresse oxidativo [35], redução nos níveis de testosterona [36] ou mesmo de receptores de andrógenos (AR) [37]. Neste contexto, apesar da manutenção dos pesos do testículo, epidídimo e ducto deferente, a redução no peso absoluto da próstata e no peso relativo da vesícula seminal vazia pode inferir alterações nos níveis de testosterona ou na expressão de AR.
Os pesos absolutos e relativos do testículo, epidídimo, ducto deferente, vesícula seminal e próstata podem ser usados, em associação com outros parâmetros reprodutivos para avaliar os riscos da exposição de agentes tóxicos ou condições ambientais que podem alterar o funcionamento correto desses órgãos [37]. No entanto, é importante ressaltar que a diminuição dos pesos desses órgãos não acompanha necessariamente a perda de peso corporal [38].
O aumento do número de espermatozoides imóveis após exposição ao estresse crônico por restrição corrobora com o estudo de Priya et al [33], que mesmo utilizando um protocolo diferente de estresse por restrição, também observou que ratos na puberdade apresentaram redução na motilidade e a viabilidade dos espermatozoides em consequência ao estresse. Similarmente, Rai et al [39] reportaram que o estresse por imobilização durante 4 horas por 2 meses afeta negativamente a função espermatogênica e endócrina dos testículos de ratos. Além disso Pook et al [40], descreveram o estresse psicológico (ansiedade, angústia, nervosismo, preocupação em excesso entre outros) como um fator que compromete a motilidade e a qualidade espermática em um estudo realizado com homens adultos. Nesse contexto, as evidências do presente estudo corroboram a hipótese de associação entre o estresse comportamental e alterações na fisiologia epididimária especificamente no processo de maturação espermática.
A morfologia de células espermáticas é uma característica importante para a avaliação da qualidade do sêmen, considerando que diversas patologias espermáticas provocam diminuição na vitalidade espermática [41,42]. No presente estudo, foi observado que o estresse crônico por restrição atuou diminuindo o número de espermatozoides normais e aumentando o número de espermatozoides anormais, sendo encontradas anormalidades nas regiões da cabeça e da cauda. Esse resultado pode indicar alteração no durante o processo de espermiogênese [21].
A busca pela compreensão de possíveis efeitos do estresse comportamental sobre a saúde reprodutiva é atualmente um importante foco de estudos no mundo todo [33,39,40,43]. O presente estudo contribui para a literatura por trazer a essa temática o envolvimento de mecanismos epigenéticos. No entanto, várias questões, como por exemplo, o efeito do estresse sobre a função endócrina dos testículos [43,44,45] ainda carecem de elucidação, e estudos futuros nessa área certamente são necessários para uma completa compreensão dos efeitos do estresse comportamental sobre a saúde reprodutiva.
Contextualizando os dados do presente estudo, sugerimos que o estresse comportamental possa ser um fator de risco para a programação epigenética de células germinativas, assim como possa estar relacionada com a
origem de doenças associadas a alterações epigenéticas na progênie. Porém, estudos futuros certamente são necessários para confirmar nossa hipótese.
CONCLUSÃO
Nosso estudo é o primeiro na literatura a associar o estresse crônico por restrição com alterações epigenéticas e parâmetros reprodutivos em ratos machos. Nossos dados permitem concluir que o estresse crônico por restrição atua como um modulador ambiental da programação da metilação do DNA em espermatozóides e afeta também a função e a morfologia dos gametas, além da função testicular e epididimária.
REFERÊNCIAS
1. Jones PA, Takai D. The role of DNA methylation in mammalian epigenetics. Science 2001; 293: 1068–70.
2. Gomes MV, Pelosi GG. Epigenetic Vulnerability and the Environmental Influence on Health. Exp Biol Med 2013; 238(1): 859-65.
3. Walsh CP, Chaillet JR, Bestor TH. Transcription of IAP endogenous retroviruses is constrained by cytosine methylation. Nat Genet 1998; 20(2): 116–117.
4. Siegmund KD, Connor CM, Campan M, Long TI, Weisenberger DJ, Bin-iszkiewicz D, Jaenisch R, Laird PW, Akbarian S. DNA methylation in the human cerebral cortex is dynamically regulated throughout the life span and involves differentiated neurons. PLoS One 2007; 19:2(9) e895.
5. Uchida S, Hara K, Kobayashi A, Otsuki K, Yamagata H, Hobara T, Suzuki T, Miyata N, Watanabe Y. Epigenetic status of GDNF in the ventral striatum determines susceptibility and adaptation to daily stressful events. Neuron 2011; 69: 359–372.
6. Ulrich-Lai YM, Herman JP. Neural Regulation of Endocrine and Autonomic Stress Responses. Nat Rev Neurosci 2009 Jun;10(6):397-409.
7. Chrousos GP. Stress and disorders of the stress system. Nat Rev Endocrinol 2009; 5(7): 374-81.
8. Joels M, Baram TZ. The neuro-symphony of stress. Nat. Rev. Neurosci 2009; 10: 459–466.
9. Herman JP, Figueiredo H, Mueller NK, Ulrich-Lai Y, Ostrander MM, Choi DC, Cullinan WE. Central mechanisms of stress integration: hierarchical
circuitry controlling hypothalamo–pituitary–adrenocortical responsiveness. Front. Neuroendocrinol 2003; 24: 151–180.
10. Lisowski P, Juszczak Gr, Goscik J. Wieczorek M, Zwierzchowski L, Swiergiel AH. Effect of chronic mild stress on hippocampal transcriptome in mice selected for high and low stress-induced analgesia and displaying different emotional behaviors. Eur. Neuropsychopharmacol 2011 Jan; 21(1): 45-62.
11. Unternaehrer E, Luers P, Mill J, Dempster E, Meyer a H, Staehli S, Lieb R, Hellhammer DH, Meinlschmidt G. Dynamic changes in DNA methylation of stress-associated genes (OXTR, BDNF ) after acute psychosocial stress. Transl Psychiatry 2012; 2: 150.
12. Rodrigues GM Jr, Toffoli LV, Manfredo MH, Francis-Oliveira J, Silva AS, Raquel HA, Martins-Pinge MC, Moreira EG, Fernandes KB, Pelosi GG, Gomes MV. Acute stress affects the global DNA methylation profile in rat brain: modulation by physical exercise. Behav Brain Res 2015; 15;279: 123-128.
13. Kashimoto RK, Toffoli LV, Manfredo MH, Volpini VL, Martins-Pinge MC, Pelosi GG, Gomes MV. Physical exercise affects the epigenetic programming of rat brain and modulates the adaptive response evoked by repeated restraint stress. Behav Brain Res 2016; 1; 296-289
14. Ng SF, Lin RC, Laybutt DR, Barres R, Owens JA, Morris MJ. Chronic high-fat diet in high-fathers programs beta-cell dysfunction in female rat offspring. Nature 2010; 467(7318): 963–966.
15. Jenkins TG, Aston KI, Pflueger C, Cairns BR, Carrell DT. Age-associated sperm DNA methylation alterations: possible implications in offspring disease susceptibility. PLoS Genet 2014; 10:(7), e1004458.
16. Milekic MH, Xin Y, O’donnell A, Kumar KK, Bradley-Moore M, Malaspina D, Moore H, Brunner D, Ge Y, Edwards J, Paul S, Haghighi FG, Gingrich JA. Age-related sperm DNA methylation changes are transmitted to offspring and associated with abnormal behavior and dysregulated gene expression. Mol. Psychiatry 2015 Aug; 20(8): 995-1001.
17. Babenko O, Golubov A, Ilnytskyy Y, Kovalchuk I, Metz GA. Genomic and Epigenomic Responses to Chronic Stress Involve miRNA-Mediated Programming. PLoS One 2012; 7(1): e29441.
18. Sambrook J, Fritschi EF, Maniatis T. Molecular cloning, a laboratory manual. 3rd ed. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press; 1989. 19. Toffoli LV, Rodrigues GM Jr, Oliveira JF, Silva AS, Moreira EG, Pelosi GG,
Gomes MV. Maternal exposure to fluoxetine during gestation and lactation affects the DNA methylation programming of rat's offspring: modulation by folic acid supplementation. Behav Brain Res 2014; 265: 142-147.
20. Robb GW, Amann RP, Killian GJ. Daily sperm production and epididymal sperm reverses of pubertal and adult rats. Reprod fértil 1978; 54. 103-7. 21. Siervo GE, Vieira HR, Ogo FM, Fernandez CD, Gonçalves GD, Mesquita
SF, Anselmo-Franci JA, Cecchini R, Guarnier FA, Fernandes GS. Spermatic and testicular damages in rats exposed to ethanol: influence of lipid peroxidation but not testosterone. Toxicology 2015; 330. 1-8.
22. Fernandes GS, Arena AC, Fernandez CD, Mercadante A, Barbisan LF, Kempinas WG. Reproductive effects in male rats exposed to diuron.
Reprod. Toxicol 2007; 23(1): 106–112.
23. Seed J, Chapin RE, Clegg ED, Dostal LA, Foote RH, Hurtt ME, Klinefelter GR, Makris SL, Perreault SD, Schrader S, Seyler D, Sprando R, Treinen KA, Veeramachaneni DN, Wise LD. Methods for assessing sperm motility, morphology, and counts in the rat, rabbit, and dog: a consensus report. ILSI Risk science institute expert working group on sperm evaluation. Reprod Toxicol 1996; 10. 237–44.
24. Filler R. Methods for evaluation of rats epididymal sperm morphology. Male reproductive toxicology 1993; 334–43.
25. Portela A, Esteller M. Epigenetic modifications and human disease. Nat Biotechnol 2010; 28(10): 1057–1068.
26. Comb M, Goodman H M. CpG Methylation inhibts proenkephdin gene expression and binding of the transcriptional factor AP-2. Nucleic Acids Res1990; 18:3975-82.
27. Prendergast GC, Law D, Ziff EB. Association of myn, the murine homolog of max, with c-myc stimulates methylation-sensitive DNA binding and ras cotransformation. Cell 1991; 65:395-07.
28. Nan X, Cross S, Bird A. Gene silencing by methyl-CpG-binding proteins. Novartis Found Symp 1998; 214:6-16.
29. Hajkova P, Erhardt S, Lane N, Haaf T, El-Maarri O, Reik W, Walter J, Surani MA. Epigenetic reprogramming in mouse primordial germ cells. Mech Dev 2002; 117(1–2):15–23.
30. Morgan HD, Santos F, Green K, Dean W, Reik W. Epigenetic reprogramming in mammals. Hum Mol Genet 2005;14: 47–58.
A, Ishino F. Erasing genomic imprinting memory in mouse clone embryos produced from day 11.5 primordial germ cells. Development 2002; 129(8): 1807–1817.
32. Paulsen M, Ferguson-Smith AC. DNA methylation in genomic imprinting, development, and disease. J Pathol. 2001; 195(1): 97–110.
33. Priya PH, Girish BP, Reddy PS. Sreenivasula Reddy b Restraint stress exacerbates alcohol-induced reproductive toxicity in male rats. Alcohol 2014; 48(8): 781-6.
34. Clarke RN, Klock SC, Geoghegan A, Travassos DE. Relationship between psychological stress and semen quality among in-vitro fertilization patients. Hum Reprod 1999; 14(3): 753–758.
35. Sakr HF, Abbas AM, Elsamanoudy AZ, Ghoneim FM. Effect of fluoxetine and resveratrol on testicular functions and oxidative stress in a rat model of chronic mild stress-induced depression. J Physiol Pharmacol 2015; 66(4): 515-27.
36. Stojkov NJ, Janjic MM, Baburski AZ, Mihajlovic AI, Drljaca DM, Sokanovic SJ, Bjelic MM, Kostic TS, Andric SA. Sustained in vivo blockade of α₁-adrenergic receptors prevented some of stress-triggered effects on steroidogenic machinery in Leydig cells. Am J Physiol Endocrinol Metab 2013; 15;305(2): 194-204.
37. Clegg ED, Perreault D, Klinefelter GR. Assessment of male reproductive toxicity. In: Hayes AW, editor. Principles and methods of toxicology. Philadelphia: Taylor & Francis 2001; 1263–300.
38. Collins TFX, Sprando RL, Shackelford ME, Hansen DK, Welsh JJ. Food and drug administration proposed testing guidelines for reproduction
studies. Reg Toxicol Pharm 1999; 30: 29–38.
39. Rai J, Pandey SN, Srivastava RK. Effect of restraint stress on spermatogenesis of albino rats. J Anat Soc India 2003; 52: 55–57.
40. Pook M, Tuschen-Caffier B, Krause W. Is infertility a risk factor for impaired male fertility? Hum Reprod 2004; 19(4): 954-9.
41. Lahnsteiner F, Berger B, Weismann T, Patzner R. Determination of semen quality of the rainbow trout, Oncorhynchus mykiss, by sperm motility, seminal plasma parameters, and spermatozoal metabolism. Aquaculture Amsterdam 1998; 163(1-2): 163-181.
42. Cosson J, Billard R, Cibert C, Dréanno C, Suquet M. Ionic factors regulating the motility of fish sperm. In: GAGNON, C. The male gamete: from basic science to clinical applications. Viena: Cache River Press 1999; 162-186. 43. Retana-Márquez S, Vigueras-Villaseñor RM, Juárez-Rojas L, Aragón-Martínez A, Torres GR. Sexual behavior attenuates the effects of chronic stress in body weight, testes, sexual accessory glands, and plasma testosterone in male rats. Horm Behav 2014; 66(5): 766-78.
44. Bitgul G, Tekmen I, Keles D, Oktay G. Protective Effects of Resveratrol against Chronic Immobilization Stress on Testis. ISRN Urol 2013; 278.720. 45. Arun S, Burawat J, Sukhorum W, Sampannang A, Maneenin C, Iamsaard S. Changes of testicular phosphorylated proteins in response to restraint stress in male rats. J Zhejiang Univ-Sci B (Biomed & Biotechnol) 2016; 17(1): 21-29.
FIGURAS M e ti la ç ã o g lo b a l d e D N A ( % ) CT L ST 0 1 0 2 0 3 0 4 0 *
FIGURA 1A - Efeito do estresse crônico por restrição sobre a metilação global de DNA espermático. Teste de Mann-Whitney *p<0.05.
N ú m e r o d e e s p e r m a to z o id e s n o r m a is CT L ST 1 2 0 1 4 0 1 6 0 1 8 0 2 0 0 A ) * N ú m e r o d e e s p e r m a to z o id e s a n o r m a is CT L ST 0 2 0 4 0 6 0 8 0 B ) *
FIGURA 2A - Efeito do estresse crônico por restrição sobre a morfologia espermática. A) Espermatozoides normais, B) Espermatozoides anormais. Teste de Mann-Whitney *p<0.05. CT L ST 6 0 7 0 8 0 9 0 1 0 0 N ú m e r o d e e s p e r m a to z o id e s m ó v e is A ) * N ú m e r o d e e s p e r m a to z o id e s im ó v e is CT L ST 0 1 0 2 0 3 0 4 0 B ) *
FIGURA 3A - Efeito do estresse crônico por restrição sobre a motilidade espermática. A) Espermatozoides móveis, B) Espermatozoides imóveis. Teste de Mann-Whitney *p<0.05.
