Interleukin-4 ELISA
Imunoensaio enzimático para a determinação quantitativa
da interleucina-4 humana (IL-4) nos sobrenadantes de culturas
celulares, soro, plasma e urina humanos.
BE53041
96
2-8°C
TABELA DE CONTEÚDOS
1
Aplicações
2
2
Sumário
2
3
Princípio do Teste
2
4
Materiais Fornecidos
3
5
Instruções de conservação – Kit ELISA
4
6
Recolha e armazenamento de amostras
4
7
Materiais Necessários Mas Não Fornecidos
4
8
Avisos e Precauções
5
9
Preparação de Reagentes
6
10
Procedimento do Ensaio
8
11
Cálculo de Resultados
11
12
Limitações do Procedimento
12
13
Características de Desempenho
13
14
Informações para pedidos
15
15
Sumário da Preparação de Reagentes
15
16
Sumário do Procedimento do Ensaio
16
1
Aplicações
O ELISA para IL-4 humana é um ensaio imunossorvente ligado a enzima para a deteção quantitativa de IL-4 humana. O ELISA para IL-4 humana destina-se ao uso em diagnóstico in
vitro. Não se destina a ser usado em procedimentos terapêuticos.
2
Sumário
A IL-4 humana existe em formas com peso molecular entre 15 e 19 kDa, representando uma glicosilação variável. O gene da IL-4 humana encontra-se no braço longo do cromossoma 5 em íntima associação com os genes da IL-13, IL-5, GM-CSF e IL-3.
A IL-4 medeia a sua função ao ligar-se a recetores expressos nas células-alvo. Os recetores de IL-4 apresentam uma afinidade de aproximadamente 10-10 M. Os recetores existem em linfócitos B e T e macrófagos recém-preparados, bem como em diversas linhas celulares, incluindo das células linfoides, de mastócitos, em diversas linhas de outras células hematopoiéticas, de fibroblastos e de células estromais. Nas células T e B, os recetores apresentam-se em número reduzido (aprox. 400), os quais se sabe serem supra-regulados pela IL-2 e IL-4.
A IL-4 é produzida por um subconjunto particular de células T auxiliares, as células TH2. Estas células tendem a criar um conjunto específico de linfocinas, incluindo IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-13, IL-3 e GM-CSF, mas não conseguem produzir IL-2, IFN gama e linfotoxina (TNF-beta). À exceção das células T, foi comprovado que os mastócitos podem produzir IL-4).
A IL-4 exerce inúmeros efeitos em vários tipos de células hematopoiéticas. Nas células B, a IL-4 promove uma mudança de classe imunológica para os isótopos IgE e IgG1 e sobre-regula o MHC de classe II e a expressão de CD23. Pode promover a sobrevivência, o crescimento e a diferenciação tanto dos linfócitos T e B, como dos mastócitos e das células endoteliais. Além disso, a IL-4 pode inibir a produção de TNF, IL-1 e IL-6 através dos macrófagos.
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Princípio do Teste
Um anticorpo de revestimento anti-IL-4 humana é adsorvido nos micropoços.
Figura 1 Micropoços Revestidos
A IL-4 humana presente na amostra ou no padrão liga-se aos anticorpos adsorvidos nos micropoços. Um anticorpo anti-IL-4 humana conjugado com biotina é adicionado, ligando-se à IL-4 humana capturada pelo primeiro anticorpo.
Figura 2 Primeira Incubação
Após a incubação, o anticorpo anti-IL-4 humana conjugado com biotina não ligado é removido durante a lavagem. É adicionada estreptavidina com HRP que se liga ao anticorpo anti-IL-4 humana conjugado com biotina.
Figura 3 Segunda Incubação
Após a incubação, a estreptavidina com HRP não ligada é removida durante a lavagem e adiciona-se aos poços um substrato reativo com HRP.
Figura 4 Terceira Incubação
Forma-se um produto colorido em proporção à quantidade de IL-4 humana presente na amostra ou no padrão. A reação é terminada pela adição de ácido e a absorvância é medida a 450 nm. Uma curva padrão é preparada a partir de 7 diluições padrão de IL-4 humana e determina-se então a concentração da amostra de IL-4 humana.
Figura 5
4
Materiais Fornecidos
1 bolsa de alumínio com uma placa de micropoços revestidos com anticorpo monoclonal de IL-4 humana
1 frasco (70 µL) Conjugado de Biotina anticorpo monoclonal anti-IL-4 humana 1 frasco (150 µL) Streptavidina-HRP
2 frascos Padrão IL-4 humana liofilizados, 1000 pg/mL após reconstituição 1 frasco (5 mL) Tampão de Reacção Concentrado 20x
(PBS con 1 % Tween 20, 10 % BSA)
1 frasco (50 mL) con Tampão de Lavagem Concentrado 20x (PBS con 1 % Tween 20)
1 frasco (15 mL) Solução de Substrato (tetrametilbenzidina) 1 frasco (15 mL) Solução de Paragem (1M Ácido Fosfórico) 4 Película Aderente
Substrato reagiu
Substrato
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Instruções de conservação – Kit ELISA
Conserve os reagentes do kit a uma temperatura entre 2 °C e 8 °C. Imediatamente após usar, os reagentes remanescentes devem ser novamente colocados no frio (2-8 °C). A data de validade do kit e dos reagentes está indicada nos rótulos.
A data de validade dos componentes do kit só pode ser garantida se os componentes forem devidamente armazenados e, no caso de utilização repetida de um componente, se este reagente não for contaminado pela primeira manipulação.
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Recolha e armazenamento de amostras
Sobrenadante de cultura celular, soro, plasma e urina foram testados com este ensaio. Outras amostras biológicas podem ser adequadas para utilização no ensaio. Remova o soro ou o plasma do coágulo ou das células logo que possível depois da coagulação e separação.
As amostras que contenham um precipitado visível devem ser clarificadas antes de utilizadas no ensaio. Não utilize espécimes grosseiramente hemolisados ou lipémicos.
As amostras devem ser aliquotadas e conservadas congeladas a -20 °C para evitar perda de IL-4 humana bioativa. Se as amostras forem testadas num prazo de 24 horas, podem ser conservadas a uma temperatura entre 2 e 8 °C (para estabilidade da amostra, consulte a secção 13.5).
Evite ciclos repetidos de congelação-descongelação. Antes do ensaio, a amostra congelada deve atingir a temperatura ambiente lentamente e ser misturada suavemente. Não descongele as amostras em banho-maria a 37 °C. Não agite as amostras bruscamente ou em vórtice.
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Materiais Necessários Mas Não Fornecidos
Pipetas graduadas de 5 mL e 10 mL
Micropipetas de canal único ajustáveis de 5 µL a 1000 µL com ponteiras descartáveis Micropipetas multicanais ajustáveis de 50 µL a 300 µL com ponteiras descartáveis Reservatório de micropipeta multicanais
Provetas, balões de vidro, cilindros necessários para a preparação dos reagentes
Dispositivo para descarga de solução de lavagem (garrafa de esguicho multicanal ou sistema de lavagem automática)
Leitor de tiras de micropoços com capacidade para ler a 450 nm (620 nm como comprimento de onda de referência opcional)
Agua bidestilada o deionizada
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Avisos e Precauções
Todos os produtos químicos devem ser considerados como potencialmente perigosos. Recomendamos, portanto, que este produto seja manuseado apenas por pessoas com formação em técnicas laboratoriais e que seja manuseado de acordo com os princípios das boas práticas laboratoriais.
Use vestuário protetor adequado, como bata de laboratório, óculos de proteção e luvas. Deve usar-se de cuidado para evitar o contacto com a pele ou os olhos. Em caso de contacto com a pele ou os olhos, lave imediatamente com água. Consulte a(s) ficha(s) de dados de segurança do material e/ou as declarações de segurança para obter instruções específicas. Os reagentes destinam-se ao uso em diagnóstico in vitro e não se destinam a ser usados em
procedimentos terapêuticos.
Não misture nem substitua os reagentes com os de outros lotes ou outras origens. Não utilize os reagentes do kit depois de vencida a data de validade indicada no rótulo.
Não exponha os reagentes do kit à luz forte durante o período de armazenamento ou incubação.
Não pipete com a boca.
Não coma nem fume em áreas onde os reagentes ou as amostras do kit são manuseados. Evite o contacto da pele ou das membranas mucosas com os reagentes ou os espécimes do
kit.
Devem usar-se luvas de latex descartáveis ou de borracha ao manusear os reagentes ou os espécimes do kit.
Evite o contacto do substrato com agentes oxidantes e com metal. Evite salpicos ou a criação de aerossóis.
De modo a evitar a contaminação microbiana ou a contaminação cruzada de reagentes ou espécimes que possam invalidar o teste, use ponteiras nas pipetas e/ou pipetas descartáveis. Utilize tabuleiros de reagentes limpos exclusivos para distribuir o conjugado e o reagente do
substrato.
A exposição ao ácido inativa o conjugado.
Deve usar-se água destilada em vidro ou água desionizada na preparação dos reagentes. O substrato deve estar à temperatura ambiente antes de ser usado.
Descontamine e elimine os espécimes e todos os materiais potencialmente contaminados, uma vez que podem conter agentes infeciosos. O método preferencial de descontaminação é por autoclavagem durante no mínimo 1 hora a 121.5 °C.
Os resíduos líquidos que não contenham ácido e os resíduos neutralizados podem ser misturados com hipoclorito de sódio em volumes tais desde que a mistura final contenha 1.0 % de hipoclorito de sódio. Espere 30 minutos para uma descontaminação eficaz. Os resíduos líquidos que contenham ácido devem ser neutralizados antes da adição de hipoclorito de sódio.
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Preparação de Reagentes
Os concentrados de tampão devem atingir a temperatura ambiente e ser diluídos antes de
iniciar o procedimento de teste.
Se houver formação de cristais nos concentrados de tampão, aqueça-os ligeiramente até que fiquem totalmente dissolvidos.
9.1 Tampão de Lavagem(1x)
Deite o conteúdo total (50 mL) do Concentrado de Tampão de Lavagem (20x) num cilindro graduado limpo de 1000 mL. Encha até ao volume total de 1000 mL com água destilada em vidro ou água desionizada. Misture suavemente para evitar a formação de espuma.
Transfira para um frasco para lavagem limpo e conserve a uma temperatura entre 2 °C e 25 °C. Tenha em atenção que o Tampão de Lavagem (1x) se mantém estável durante 30 dias.
O Tampão de Lavagem (1x) pode também ser preparado de acordo com a seguinte tabela: Número de tiras Tampão de Lavagem(20x) (mL) Agua bidest. (mL)
1 - 6 25 475
1 - 12 50 950
9.2 Tampão de Reacção (1x)
Deite o conteúdo total (5 mL) do Concentrado de Tampão de Reacção (20x) num cilindro graduado limpo de 100 mL. Encha até ao volume total de 100 mL com água destilada. Misture suavemente para evitar a formação de espuma.
Conserve entre 2 °C e 8 °C. Tenha em atenção que o Tampão de Reacção (1x) se mantém
estável durante 30 dias.
O Tampão de Reacção (1x) pode também ser preparado de acordo com a seguinte tabela: Número de tiras Tampão de Reacção (20x) (mL) Agua bidest. (mL)
1 - 6 2.5 47.5
1 - 12 5.0 95.0
9.3 Conjugado de Biotina
Tenha em atenção que o Conjugado de Biotina deve ser usado no máximo de 30 minutos após a diluição.
Faça uma diluição de 1:100 da solução concentrada de Conjugado de Biotina com Tampão de Reacção (1x) num tubo de plástico limpo conforme necessário de acordo com a seguinte tabela:
Número de tiras Conjugado de Biotina (mL) Tampão de Reacção (1x) (mL)
1 - 6 0.03 2.97
9.4 Estreptavidina-HRP
Tenha em atenção que a Estreptavidina-HRP deve ser usada no máximo de 30 minutos após a diluição.
Faça uma diluição de 1:200 da solução concentrada de Estreptavidina-HRP com Tampão de Reacção (1x) num tubo de plástico limpo conforme necessário de acordo com a seguinte tabela:
Número de tiras Streptavidina-HRP (mL) Tampão de Reacção (1x) (mL)
1 - 6 0.03 5.97
1 - 12 0.06 11.94
9.5 Padrão IL-4 Humana
Reconstitua o Padrão IL-4 humana adicionando água destilada durante exatamente 10 minutos. O volume de reconstituição está indicado no rótulo do frasco de vidro do padrão. Agite ou misture suavemente para garantir a solubilização completa e homogénea (concentração do padrão reconstituído = 1000 pg/mL). Misture bem antes de fazer as diluições.
O padrão tem de ser usado imediatamente após o tempo de reconstituição e não pode ser guardado.
As diluições do padrão podem ser preparadas diretamente na placa do micropoço (consulte a
secção 10.c) ou, em alternativa, em tubos (consulte a secção 9.5.1).
9.5.1 Diluição Padrão Externa
Rotule 7 tubos, um para cada ponto do padrão. S1, S2, S3, S4, S5, S6, S7
Depois prepare diluições em série de 1:2 para a curva padrão da seguinte forma: Pipete 225 µL de Tampão de Reacção (1x) para cada tubo.
Pipete 225 µL de padrão reconstituído (concentração = 1000 pg/mL) para o primeiro tubo, rotulado S1, e misture (concentração do padrão 1 = 500 pg/mL).
Pipete 225 µL desta diluição para o segundo tubo, rotulado S2, e misture bem antes da próxima transferência.
Repita as diluições em série mais 5 vezes criando assim os pontos da curva padrão (veja a Figura 6).
O Tampão de Reacção (1x) serve como teste em branco. Figura 6 Transferir 225 µL IL-4 Humana Padrão Reconstituído S1 S2 S3 S4 - S7
Tampão de Reacção (1x) 225 µL Eliminar 225 µL
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Procedimento do Ensaio
a. Determine o número de tiras de micropoços necessário para testar o número desejado de amostras mais o número apropriado de poços necessários para executar os brancos e os padrões. Cada amostra, padrão, branco e amostra opcional de controlo deve ser testado em duplicado. Remova as tiras extra do micropoço do suporte e guarde num saco de alumínio com o dessecante fornecido a uma temperatura de 2-8 °C fechado hermeticamente.
b. Lave as tiras do micropoço duas vezes com aproximadamente 400 μL de Tampão de
Lavagem por poço realizando uma aspiração completa do conteúdo do micropoço entre as
lavagens. Permita que o tampão de lavagem repouse nos poços durante cerca de
10-15 segundos antes de aspirar. Tome cuidado para não arranhar a superfície dos
micropoços.
Após o último passo de lavagem, esvazie os poços e bata com as tiras dos micropoços em papel absorvente ou toalhas de papel para remover o tampão de lavagem em excesso. Utilize as tiras dos micropoços imediatamente após a lavagem. Em alternativa, as tiras dos micropoços podem ser colocadas invertidas sobre um papel absorvente húmido durante 15 minutos no máximo. Não deixe que os poços sequem.
c. Diluição de padrão na placa do micropoço (Em alternativa, a diluição de padrão pode ser
preparada em tubos – consulte a secção 9.5.1):
Adicione 100 μL de Tampão de Reacção (1x)em duplicado em todos os poços de padrão. Pipete 100 μL do padrão preparado (consulte Preparação de Padrão na secção 9.5, concentração = 1000 pg/mL) em duplicado no poço A1 e A2 (consulte a Tabela 1). Misture o conteúdo dos poços A1 e A2 por aspiração e ejeção repetida (concentração do padrão 1, S1 = 500 pg/mL), e transfira 100 μL para os poços B1 e B2, respetivamente (consulte a Figura 7). Tenha cuidado para não arranhar a superfície interior dos micropoços.
Continue este procedimento 5 vezes, criando duas filas de diluições padrão de IL-4 humana variando entre 500.0 e 7.8 pg/mL. Elimine 100 μL do conteúdo dos últimos micropoços (G1, G2) utilizados.
Figura 7
No caso de uma diluição de padrão externo (consulte a secção 9.5.1), pipete 100 μL destas diluições de padrão (S1 - S7) nos poços de padrão de acordo com a Tabela 1.
Tabela 1
A tabela representa um exemplo da disposição de testes em branco, padrões e amostras nas tiras dos micropoços: 1 2 3 4 A Padrão 1 (500.0 pg/mL) Padrão 1 (500.0 pg/mL) Amostra 1 Amostra 1 B Padrão 2 (250.0 pg/mL) Padrão 2 (250.0 pg/mL) Amostra 2 Amostra 2 C Padrão 3 (125.0 pg/mL) Padrão 3 (125.0 pg/mL) Amostra 3 Amostra 3 D Padrão 4 (62.5 pg/mL) Padrão 4 (62.5 pg/mL) Amostra 4 Amostra 4 E Padrão 5 (31.3 pg/mL) Padrão 5 (31.3 pg/mL) Amostra 5 Amostra 5 F Padrão 6 (15.6 pg/mL) Padrão 6 (15.6 pg/mL) Amostra 6 Amostra 6 G Padrão 7 (7.8 pg/mL) Padrão 7 (7.8 pg/mL) Amostra 7 Amostra 7
H Blanco Blanco Amostra 8 Amostra 8
Trasferir 100 µL IL-4 Humana Padrão Reconstituído S1 S2 S3 S4 - S7 Tampão de Reacção (1x) 100 µL Eliminar 100 µL
d. Adicione 100 μL de Tampão de Reacção (1x) em duplicado aos poços em branco. e. Adicione 50 μL de Tampão de Reacção (1x) aos poços da amostra.
f. Adicione 50 μL de cada amostra em duplicado aos poços da amostra.
g. Prepare o Conjugado de Biotina (consulte Conjugado de Biotina na secção 9.3). h. Adicione 50 μL de Conjugado de Biotina a todos os poços.
i. Cubra com uma película adesiva e incube à temperatura ambiente (18-25 °C) durante 2 horas, num agitador de microplacas, se houver, definido para 400 rpm.
j. Prepare a Estreptavidina-HRP (consulte a preparação de Estreptavidina-HRP na secção 9.4). k. Remova a película adesiva e esvazie os poços. Lave as tiras dos micropoços 3 vezes de
acordo com o ponto b. do protocolo de teste. Avance de imediato para o próximo passo. l. Adicione 100 µL de Estreptavidina-HRP diluída a todos os poços, incluindo os poços em
branco.
m. Cubra com uma película adesiva e incube à temperatura ambiente (18-25 °C) durante 1 hora num agitador de microplacas, se houver, definido para 400 rpm.
n. Remova a película adesiva e esvazie os poços. Lave as tiras dos micropoços 3 vezes de acordo com o ponto b. do protocolo de teste. Avance de imediato para o próximo passo. o. Pipete 100 μL de Substrato TMB para todos os poços.
p. Incube as tiras do micropoço à temperatura ambiente (18-25 °C) durante cerca de 10 min. Evite a exposição direta à luz intensa.
O desenvolvimento de cor na placa deve ser monitorizado e a reação do substrato interrompida (veja o próximo ponto deste protocolo) antes que os poços positivos não possam ser devidamente registáveis.
A determinação do período de tempo ideal para o desenvolvimento da cor tem de ser feita individualmente para cada ensaio.
Recomenda-se adicionar a solução de paragem quando o padrão mais elevado tiver desenvolvido uma cor azul-escura. Em alternativa, o desenvolvimento da cor pode ser monitorizado a 620 nm pelo leitor de placas ELISA. A reação do substrato deve ser parada logo que o Padrão 1 atingiu uma DO de 0.9 – 0.95.
q. Pare a reação da enzima ao pipetar rapidamente 100 μL de Solução de Paragem para cada poço. É importante que a solução de paragem seja espalhada rápida e uniformemente pelos micropoços para inativar completamente a enzima. Os resultados devem ser lidos imediatamente após a solução de paragem ser adicionada ou no período de uma hora se as tiras dos micropoços forem guardadas a uma temperatura de 2-8 °C no escuro.
Concentration (pg/ml) A b s orpt ion 4 5 0 nm 1 10 100 1000 0.01 0.1 1 10 Concentration (pg/ml) A b s orpt ion 4 5 0 nm 1 10 100 1000 0.01 0.1 1 10
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Cálculo de Resultados
Calcule os valores médios de absorvância para cada conjunto de padrões e amostras em duplicado. Os duplicados devem estar a 20 por cento do valor médio.
Crie uma curva padrão ao representar graficamente a absorvância média para cada concentração de padrão na ordenada face à concentração da IL-4 humana na abcissa. Desenhe a curva que melhor se ajusta através dos pontos no gráfico (recomenda-se um ajuste de curva de 5 parâmetros).
Para determinar a concentração de IL-4 humana em circulação para cada amostra, encontre primeiro o valor médio de absorvância na ordenada e prolongue uma linha horizontal para a curva padrão. No ponto de interseção, prolongue uma linha vertical para a abcissa e leia a concentração correspondente de IL-4 humana.
Se as instruções neste protocolo tiverem sido seguidas, as amostras terão sido
diluídas a 1:2 (50 μL amostra + 50 μL Tampão de Reacção (1x)), a concentração lida da curva padrão deverá ser multiplicada pelo fator de diluição (x 2).
O cálculo das amostras com uma concentração que exceda o padrão 1 poderá resultar
em níveis de IL-4 humana baixos e incorretos. Tais amostras exigem uma pré-diluição externa adicional de acordo com os valores esperados da IL-4 humana com o Tampão de Reacção (1x) de modo a quantificar com precisão o nível real de IL-4 humana.
Tem-se sugerido que cada instituição de teste determine uma amostra de controlo da concentração conhecida de IL-4 humana e execute este controlo adicional com cada ensaio. Se os valores obtidos não se encontrarem dentro do intervalo esperado do controlo, os resultados do ensaio podem ser inválidos.
A Figura 8 mostra uma curva padrão representativa. Esta curva não pode ser usada para obter resultados de teste. Cada laboratório deve preparar uma curva padrão para cada grupo de tiras de micropoços usadas no ensaio.
Figura 8
Curva padrão representativa do ELISA para IL-4 humana. A IL-4 humana foi diluída duas vezes em série em Tampão de Reacção (1x). Não use esta curva padrão para obter resultados de teste. Deve ser executada uma curva padrão para cada grupo de tiras de micropoços usadas no ensaio.
Dados típicos usando o ELISA para IL-4 humana Comprimento de onda: 450 nm
Comprimento de onda de referência: 620 nm
Tabela 2 Padrão Concentração da IL-4 Humana (pg/mL) D. O.a 450 nm D.O. Media a 450 nm C.V. (%) 1 500.0 1.944 1.964 1.4 1.984 2 250.0 0.997 1.006 1.2 1.014 3 125.0 0.528 0.539 2.8 0.549 4 62.5 0.274 0.278 1.8 0.281 5 31.3 0.150 0.155 4.1 0.159 6 15.6 0.098 0.099 1.4 0.100 7 7.8 0.051 0.052 1.4 0.052 Bianco 0.0 0.023 0.022 2.8 0.021
Os valores da D.O. da curva padrão podem variar de acordo com as condições de execução do ensaio (p. ex., funcionário, técnica de pipetagem, técnica de lavagem ou efeitos da temperatura). Além disso, a vida útil do kit pode afetar a atividade enzimática e, assim, a intensidade da cor. Os valores medidos continuam a ser válidos.
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Limitações do Procedimento
Uma vez que as condições exatas podem variar de um ensaio para outro, deve ser criada uma curva padrão para cada série de testes.
A contaminação bacteriana ou fúngica das amostras a testar ou dos reagentes ou a contaminação cruzada entre os reagentes pode dar origem a resultados erróneos.
É preferível usar ponteiras de pipetas descartáveis, frascos ou material de vidro; o material de vidro reutilizável deverá ser lavado e todos os detergentes deverão ser eliminados antes de o material ser usado novamente.
A lavagem inadequada ou insuficiente em qualquer fase do procedimento dará origem a resultados falso positivos ou falso negativos. Esvazie os poços completamente antes de distribuir solução de lavagem fresca, encha com tampão de lavagem conforme indicado para cada ciclo de lavagem e não deixe que os poços fiquem destapados ou sequem durante períodos prolongados.
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Características de Desempenho
13.1 Sensibilidade
O limite de deteção da IL-4 humana definida como a concentração do analito que resulta numa absorvância significativamente maior do que a do meio de diluição (média mais 2 desvios padrão) foi determinado como 1.3 pg/mL (média de 6 ensaios independentes).
13.2 Reprodutibilidade 13.2.1 Intra-Ensaio
A reprodutibilidade dentro do ensaio foi avaliada em 3 experiências independentes. Cada ensaio foi realizado com 6 réplicas de 6 amostras de soro contendo concentrações diferentes de IL-4 humana. Foram executadas 2 curvas padrão em cada placa. Os dados abaixo mostram a concentração média da IL-4 humana e o coeficiente de variação para cada amostra (veja a Tabela 3). O coeficiente de variação global calculado intra-ensaio foi de 4.8 %.
Tabela 3
A concentração média da IL-4 humana e o coeficiente de variação de cada amostra. Amostra Experimento Concentração Média de IL-4 Humana (pg/mL) Coeficiente de Variação (%) 1 1 732.6 1.5 2 672.2 10.0 3 687.1 3.2 2 1 437.5 6.1 2 405.8 6.1 3 488.6 5.3 3 1 168.5 7.9 2 173.3 2.7 3 157.6 1.5 4 1 141.6 3.9 2 132.1 4.2 3 131.9 5.1 5 1 125.3 5.1 2 111.1 7.7 3 102.9 1.1 6 1 56.5 6.2 2 56.3 2.5 3 56.9 5.7
13.2.2 Inter-Ensaio
A reprodutibilidade de ensaio para ensaio no mesmo laboratório foi avaliada em 3 experiências independentes. Cada ensaio foi realizado com 6 réplicas de 6 amostras de soro contendo concentrações diferentes de IL-4 humana. Foram executadas 2 curvas padrão em cada placa. Os dados abaixo mostram a concentração média da IL-4 humana e o coeficiente de variação calculados em 18 determinações de cada amostra (veja a Tabela 4). O coeficiente de variação global calculado entre ensaios foi de 5.6 %.
Tabela 4
A concentração média da IL-4 humana e o coeficiente de variação de cada amostra.
Amostra Concentração Média de IL-4 Humana (pg/mL) Coeficiente de Variação (%)
1 697.3 4.5 2 444.0 9.4 3 166.5 4.8 4 135.2 4.1 5 113.1 10.0 6 56.6 0.6 13.3 Recuperação do reforço
A recuperação do reforço foi avaliada ao reforçar 4 níveis de IL-4 humana no soro humano normal agrupado. As recuperações foram determinadas em 3 experiências independentes com 8 réplicas cada. O soro não reforçado foi usado como branco nestas experiências.
A recuperação variou de 75 % a 111 % com uma recuperação média global de 94 %.
13.4 Paralelismo de diluição
3 amostras de soro com diferentes níveis de IL-4 humana foram analisadas em 2 diluições em série com 4 réplicas cada.
A recuperação variou de 104 % a 120 % com uma recuperação global média de 113 %.
13.5 Estabilidade da amostra
13.5.1 Estabilidade durante a congelação-descongelação
Alíquotas de soro e amostras de sobrenadante em cultura celular (com reforço ou sem reforço) foram armazenadas a -20 °C e descongeladas 5 vezes, e determinaram-se os níveis de IL-4 humana. Não houve perda significativa da imunorreatividade detetada da IL-4 humana através da congelação e descongelação.
13.5.2 Estabilidade de conservação
Alíquotas de soro e amostras de sobrenadante em cultura celular (com reforço ou sem reforço) foram armazenadas a -20 °C, 2-8 °C, à temperatura ambiente e a 37 °C, e o nível da IL-4 humana foi determinado após 24 h. Não houve perda significativa da imunorreatividade detetada da IL-4
13.7 Valores esperados
Um painel de 22 amostras de soro de dadores aparentemente saudáveis e aleatoriamente selecionados (do sexo masculino e feminino) foi testado quando à IL-4 humana.
Não se encontraram níveis de IL-4 humana detetáveis.
Os níveis de IL-4 humana elevados dependiam do tipo de distúrbio imunológico.
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Informações para pedidos
Para encomendas entre em contacto com:
Veja a última página.
Para obter informações técnicas, por favor contacte: e-mail: [email protected]
www.IBL-International.com
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Sumário da Preparação de Reagentes
15.1 Tampão de Lavagem (1x)
Adicione Concentrado de Tampão de Lavagem 20x (50 mL) a 950 mL de água destilada. Número de tiras Tampão de Lavagem (20x) (mL) Agua Bidest. (mL)
1 – 6 25 475
1 – 12 50 950
15.2 Tampão de Reacção (1x)
Adicione Concentrado de Tampão de Reacção 20x (5 mL) a 95 mL de água destilada. Número de tiras Tampão de Reacção (20x) (mL) Agua Bidest. (mL)
1 - 6 2.5 47.5
1 - 12 5.0 95.0
15.3 Conjugado de Biotina
Faça uma diluição de 1:100 de Conjugado de Biotina em Tampão de Reacção (1x):
Número de tiras Conjugado de Biotina (mL) Tampão de Reacção (1x) (mL)
1 - 6 0.03 2.97
1 - 12 0.06 5.94
15.4 Estreptavidina-HRP
Faça uma diluição de 1:200 de Estreptavidina-HRP em Tampão de Reacção (1x):
Número de tiras Estreptavidina-HRP (mL) Tampão de Reacção (1x) (mL)
1 - 6 0.03 5.97
1 - 12 0.06 11.94
15.5 Padrão IL-4 Humana
Reconstitua o Padrão IL-4 humana adicionando água destilada durante exatamente 10 minutos. (O volume de reconstituição está indicado no rótulo do frasco de padrão.)
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Sumário do Procedimento do Ensaio
1. Determine o número de tiras de micropoços necessário.
2. Lave as tiras dos micropoços duas vezes com Tampão de Lavagem.
3. Diluição de padrão na placa do micropoço: Adicione 100 μL de Tampão de Reacção (1x), em duplicado, a todos os poços de padrão. Pipete 100 μL do padrão preparado para os primeiros poços e crie diluições de padrão para transferir 100 μL de poço para poço. Elimine 100 μL dos últimos poços.
Em alternativa, diluição de padrão externa em tubos (consulte a secção 9.5.1): Pipete 100 μL destas diluições de padrão nas tiras dos micropoços.
4. Adicione 100 μL de Tampão de Reacção (1x), em duplicado, aos poços em branco. 5. Adicione 50 μL de Tampão de Reacção (1x) aos poços com as amostras.
6. Adicione 50 μL da amostra em duplicado aos poços de amostra designados. 7. Prepare o Conjugado de Biotina.
8. Adicione 50 μL de Conjugado de Biotina a todos os poços.
9. Cubra as tiras dos micropoços e incube 2 horas à temperatura ambiente (18 °C a 25 °C). 10. Prepare Estreptavidina-HRP.
11. Esvazie e lave as tiras dos micropoços 3 vezes com Tampão de Lavagem. 12. Adicione 100 μL de Estreptavidina-HRP diluída a todos os poços.
13. Adicione 100 μL de Estreptavidina-HRP diluída a todos os poços.
14. Esvazie e lave as tiras dos micropoços 3 vezes com Tampão de Lavagem. 15. Adicione 100 μL de Solução de Substrato TMB a todos os poços.
16. Incube as tiras dos micropoços durante cerca de 10 minutos à temperatura ambiente (18-25 °C).
17. Adicione 100 μL de Solução de Paragem a todos os poços.
18. Ponha em branco o leitor dos micropoços e meça a intensidade da cor a 450 nm.
Nota: Se as instruções neste protocolo tiverem sido seguidas, as amostras terão sido diluídas a 1:2 (50 μL amostra + 50 μL Tampão de Reacção (1x)), a concentração lida da curva padrão deverá ser multiplicada pelo fator de diluição (x 2).
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Referências Bibliográficas do Produto
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REF Cat.-No.: / Kat.-Nr.: / No.- Cat.: / Cat.-No.: / N.º Cat.: / N.–Cat.: / Αριθμός-Κατ.:
LOT Lot-No.: / Chargen-Bez.: / No. Lot: / Lot-No.: / Lote N.º: / Lotto n.: / Αριθμός -Παραγωγή: Use by: / Verwendbar bis: / Utiliser à: / Usado por: / Usar até: / Da utilizzare entro: / Χρησιμοποιείται από:
No. of Tests: / Kitgröße: / Nb. de Tests: / No. de Determ.: / N.º de Testes: / Quantità dei tests: / Αριθμός εξετάσεων:
CONC Concentrate / Konzentrat / Concentré / Concentrar / Concentrado / Concentrato / Συμπύκνωμα LYO Lyophilized / Lyophilisat / Lyophilisé / Liofilizado / Liofilizado / Liofilizzato / Λυοφιλιασμένο
IVD
In Vitro Diagnostic Medical Device. / In-vitro-Diagnostikum. / Appareil Médical pour Diagnostics In Vitro. / Dispositivo Médico para Diagnóstico In Vitro. / Equipamento Médico de Diagnóstico In Vitro. / Dispositivo Medico Diagnostico In vitro. / Ιατρική συσκευή για In-Vitro ∆ιάγνωση.
Evaluation kit. / Nur für Leistungsbewertungszwecke. / Kit pour évaluation. / Juego de Reactivos para Evaluació. / Kit de avaliação. / Kit di evaluazione. / Κιτ Αξιολόγησης.
Read instructions before use. / Arbeitsanleitung lesen. / Lire la fiche technique avant emploi. / Lea las instrucciones antes de usar. / Ler as instruções antes de usar. / Leggere le istruzioni prima dell’uso. / ∆ιαβάστε τις οδηγίες πριν την χρήση.
Keep away from heat or direct sun light. / Vor Hitze und direkter Sonneneinstrahlung schützen. / Garder à l’abri de la chaleur et de toute exposition lumineuse. / Manténgase alejado del calor o la luz solar directa. / Manter longe do calor ou luz solar directa. / Non esporre ai raggi solari. / Να φυλάσσεται μακριά από θερμότητα και άμεση επαφή με το φως του ηλίου.
Store at: / Lagern bei: / Stocker à: / Almacene a: / Armazenar a: / Conservare a: / Αποθήκευση στους:
Manufacturer: / Hersteller: / Fabricant: / Productor: / Fabricante: / Fabbricante: / Παραγωγός: Caution! / Vorsicht! / Attention! / ¡Precaución! / Cuidado! / Attenzione! / Προσοχή!
Symbols of the kit components see MATERIALS SUPPLIED.
Die Symbole der Komponenten sind im Kapitel KOMPONENTEN DES KITS beschrieben. Voir MATERIEL FOURNI pour les symbôles des composants du kit.
Símbolos de los componentes del juego de reactivos, vea MATERIALES SUMINISTRADOS. Para símbolos dos componentes do kit ver MATERIAIS FORNECIDOS.
Per i simboli dei componenti del kit si veda COMPONENTI DEL KIT.
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