TESTE DE TETRAZÓLIO EM SEMENTES DE MANGABA
(Hancornia speciosa Gomes)
Daniella Inácio Barros 2
Riselane de Lucena Alcântara Bruno 3
Helber Véras Nunes 2
Maria Carmen Bhering 4
RESUMO
As sementes de mangaba apresentam rápida perda da viabilidade pelo fato de suas sementes serem recalcitrantes e possuírem germinação relativamente lenta, tornando-se necessário o detornando-senvolvimento de testes que permitam a obtenção rápida e confiável de informações sobre o potencial de germinação. Esta pesquisa foi executada com o objetivo de desenvolver metodologia apropriada para o uso do teste de tetrazólio em sementes de mangaba. Estudou-se inicialmente os seguintes métodos de pré-condicionamento: semente imersa diretamente na solução de tetrazólio (testemunha); embebição em papel toalha umedecido a 25°C por 16 e 24 horas; imersão direta em água a 40°C por 2 e 4 horas com e sem retirada do tegumento; corte longitudinal deixando o embrião exposto; corte na extremidade superior lateral com e sem imersão em água a 25°C por 4 e 8 horas; três cortes na semente, dois laterais e um na parte superior oposta ao eixo embrionário para remoção do embrião com e sem imersão em água e perfuração em área superior. Em todos os métodos testados as sementes foram colocadas em solução de 2,3,5 trifenil cloreto de tetrazólio, para coloração, nas concentrações de 0,05; 0,075; e 0,1% por 30, 60, 90 e 120 minutos, em BOD a 40°C. O teste de tetrazólio pode ser utilizado para avaliar com rapidez a viabilidade das sementes de mangaba; para a condução do teste, as sementes devem ser seccionadas com três cortes no tegumento para a retirada do embrião e imersas na solução de tetrazólio a 0,075%, por 60 a 90 minutos em BOD a 40°C, para o desenvolvimento da coloração ideal.
Termos para indexação: Pré-condicionamento, concentração da solução, período de coloração.
1 Parte da tese de doutorado do primeiro autor. 2 Professor Dr. Efetivo do IFMA-Campus Codó. danyinacio@yahoo.com.br; helberveras@yahoo.com.br 3 Prof. Dr. Adjunto do Programa de Pós-Graduação em Agronomia, Depto. de Fitotecnia, CCA/UFPB,
Areia-PB, Bolsista CNPq. lane@cca.ufpb.com.br
4 Pesquisadora MSc. Depto. de Fitotecnia, UFV, Viçosa-MG, mbhering@ufv.br
TETRAZOLIUM TEST FOR SEEDS MANGABA
(Hancornia speciosa Gomes)
ABSTRACT
Mangaba seeds present fast viability loss because the seeds are recalcitrant and possess relatively slow germination. So, the development of tests which allow a fast and trustworthy information attainment on germination potential becomes necessary. This research was executed aiming to develop appropriate methodology for the tetrazolium test use in mangaba seeds. The following pre-conditioning methods were initially studied: immersed seed directly in the tetrazolium solution (witness); imbibition in humidified paper towel at 25°C for 16 and 24 hours; direct immersion in water at 40°C for 2 and 4 hours with and without tegument withdrawal; longitudinal cut leaving the displayed embryo; cut in the extremity lateral superior with and without immersion in water at 25°C for 4 and 8 hours; three cuts in the seed, two laterals and one in the opposing superior part to the embryonic axle for removal of the embryo with and without immersion in water and perforation in superior area. In all of the tested methods, the seeds had been placed in solution of 2,3,5 triphenyl chloride of tetrazolium, for coloration, in concentrations of 0,05; 0,075; and 0.1% for 30, 60, 90 and 120 minutes, in 40 BOD°C. The tetrazolium test can be used to evaluate quickly mangaba seeds viability. The most efficient pre-conditioning method is the mangaba seeds embryo withdrawal through three cuts; then, they are immersed in tetrazolium solution at 0,075% for 60 to 90 minutes in 40 BOD°C, for the ideal coloration development.
INTRODUÇÃO
O Nordeste Brasileiro vem se destacando pelo grande número de empresas de processamento de polpa de frutas, as quais tem encontrado extrema dificuldade na obtenção de matéria-prima que garanta seu funcionamento o ano todo. Dentre as mais variadas espécies vegetais que são utilizadas para extração de polpa, ressalta-se a mangabeira (Hancornia speciosa Gomes), árvore frutífera, nativa do Brasil, da família das Apocináceas (Nogueira et al., 2003). A mangabeira encontra-se vegetando espontaneamente nas regiões Sudeste, Norte, Centro-Oeste e Nordeste, com abundância nas áreas de tabuleiros costeiros e baixadas litorâneas da região Nordeste (Ferreira, 1980; Gonzaga Neto et al., 1987).
Seu fruto é bastante apreciado por apresentar boa digestibilidade e alto valor nutritivo, com teor de proteína (1,3 a 3,0%) superior ao da maioria das frutíferas (Pinheiro et al., 2001). Sua propagação pode ser via assexuada, mediante o uso de parte vegetal e sexuada, através da semente, sendo esta o meio mais comumente utilizado.
À semelhança de muitas fruteiras nativas, ainda são poucos os conhecimentos capazes de contribuir para um maior desenvolvimento da cultura. Dentre os inúmeros problemas existentes com esta espécie, pode-se destacar a rápida perda da viabilidade pelo fato de suas sementes serem recalcitrantes, o que impõe que a semeadura seja realizada logo após a remoção das sementes dos frutos (Villachica, 1996) e a ação inibitória da polpa do fruto sobre a germinação das sementes (Tavares, 1960; Grigoletto, 1997).
O teste de germinação é completado somente após algumas semanas, de maneira que, dependendo principalmente das condições em que forem armazenadas as sementes, o resultado obtido ao final do teste pode já não mais representar a sua real capacidade de germinação (Nascimento et al., 1997).
A análise de sementes é um instrumento essencial no controle da qualidade das sementes produzidas e/ou da avaliação da tecnologia de produção empregada (Andrade et al., 1996). A sua principal finalidade é determinar o valor de cada amostra para fins de semeadura ou armazenamento. Porém, para a expressão da qualidade de um lote de sementes é preciso pessoal técnico treinado, padronização de metodologia, procedimentos uniformes e programa de trabalho voltado para a aferição e aperfeiçoamento das técnicas empregadas (Figliolia et al., 1993).
Camargo (1997) ressalta a importância do desenvolvimento de testes rápidos para avaliação da viabilidade das sementes, principalmente para aquelas que apresentam baixa capacidade de armazenamento e germinação lenta, onde o teste de germinação apresenta grandes limitações. Uma das alternativas seria o uso do teste de tetrazólio onde vem sendo usado principalmente devido à rapidez na estimativa do potencial de
germinação das sementes (Botezelli, 1998).
Pela rapidez e precisão na determinação da viabilidade e do vigor, o teste de tetrazólio tem sido usado por diversas espécies, tais como: soja - Glycine max (França Neto et al., 1999), feijão - Phaseolus vulgaris (Bhering et al., 1999), milho - Zea mays (Dias e Barros, 1999), abóbora - Cucurbita moschata e abobrinha - Cucurbita pepo (Barros, 2002), melancia - Citrullus lunatus (Bhering et al., 2005), amendoim - Arachis hypogaea (Bittencourt e Vieira, 1999), café - Coffea arabica (Araújo et al., 1997 e Vieira et al., 1998), algodão - Gossypium hirsutum (Vieira e Von Pinho, 1999), braquiária - Brachiaria
brizantha (Dias e Alves, 2001), jenipapo - Genipa americana (Nascimento e Carvalho,
1998), maracujá-doce - Passiflora alata (Malavasi et al., 2001), girassol - Helianthus
annus (Fontinélli e Bruno, 1997) e pupunha - Bactris gasipaes (Ferreira e Sader, 1987).
Conforme Rodrigues e Santos (1998), o teste de tetrazólio não é muito difundido entre espécies perenes, como florestais e frutíferas, embora apresente excelentes condições para ser utilizado rotineiramente, uma vez que muitas dessas espécies necessitam de um longo período para germinarem. Em vista dessa situação, tem sido desenvolvidas pesquisas com sementes de Jenipapo procurando abreviar o prazo requerido para a obtenção dos resultados de viabilidade, a partir da padronização do teste de tetrazólio (Nascimento e Carvalho, 1998).
Diante da inexistência de informações sobre a avaliação rápida da viabilidade de sementes de mangaba, esta pesquisa foi executada com o objetivo de desenvolver metodologia apropriada para o uso do teste de tetrazólio em sementes dessa espécie.
MATERIAL E MÉTODOS
O trabalho foi conduzido no Laboratório de Análise de Sementes da Universidade Federal da Paraíba em Areia-PB. Foram utilizados frutos de mangaba provenientes da Estação Experimental de Mangabeira pertencente a Emepa - Empresa Estadual de Pesquisa Agropecuária da Paraíba localizada em João Pessoa - PB. As sementes foram retiradas de frutos maduros (Figura 1) selecionados logo após caírem ao solo, lavadas até a completa retirada da polpa, espalhadas sobre papel toalha, secas à sombra por 24 horas permanecendo em geladeira durante o período do ensaio.
Figura 1. Fruto de mangaba.
Para a avaliação da viabilidade das sementes, pelo teste de tetrazólio, foram realizados testes preliminares visando determinar o método de pré-condicionamento, concentração da solução de tetrazólio e o período de tempo necessário para se obter coloração requerida para avaliação das sementes de mangaba.
As sementes foram submetidas aos seguintes métodos de pré-condicionamento: semente imersa diretamente na solução de tetrazólio nas concentrações de 0,075; 0,5 e 0,1% (testemunha); embebição em papel toalha umedecido com quantidade de água equivalente a 2,5 vezes o peso do papel seco em germinador a 25°C por 16 e 24 horas; imersão direta em água a 40°C por 2 e 4 horas com e sem retirada do tegumento; corte longitudinal paralelo aos cotilédones deixando o embrião exposto (Figura 2 A); corte na extremidade superior lateral da semente com e sem imersão em água a 25°C por 4 e 8 horas (Figura 2 B); três cortes na semente, dois laterais e um na parte superior oposta ao eixo embrionário para remoção do embrião com e sem imersão em água (Figura 2 C); perfuração na área superior não crítica da semente (Figura 2 D). As sementes tiveram seus embriões removidos manualmente com o auxílio de um estilete, de tal forma que fossem evitados danos em suas estruturas. Em todos os pré-condicionamentos testados as sementes foram colocadas em solução de 2,3,5 trifenil cloreto de tetrazólio, para coloração, nas concentrações de 0,075; 0,5 e 0,1% durante 30, 60, 90 e 120 minutos, no escuro em BOD a 40°C. Após cada período, os embriões foram lavados em água corrente e mantidos submersos em água até o momento da avaliação.
Figura 2. Métodos de pré-condicionamento das sementes de mangaba para o
teste de tetrazólio: A - corte longitudinal paralelo aos cotilédones; B - corte na extremidade superior lateral da semente; C - três cortes na semente, dois laterais e um na parte superior oposta ao eixo embrionário; D - perfuração em área superior não crítica da semente.
Os embriões foram analisados individualmente, externa e internamente, após o seccionamento longitudinal entre os cotilédones, observando-se a ocorrência de danos nas faces interna e externa dos cotilédones e do eixo embrionário, verificando-se ainda a profundidade de cada dano e a sua distância em relação a áreas vitais. Nas sementes de mangaba, as áreas vitais incluem o eixo hipocótilo-radícula e a região de inserção entre os cotilédones e o eixo.
A diferenciação de cores dos tecidos foi observada de acordo com os critérios estabelecidos por Moore (1985), ou seja, vermelho brilhante ou rosa brilhante (tecido vivo e vigoroso), vermelho carmim forte (tecido em deterioração) e branco leitoso ou amarelado (tecido morto). A interpretação foi feita com auxílio de lupa de seis aumentos (6x), com iluminação fluorescente.
Definida a metodologia mais adequada para o pré-condicionamento, concentração da solução e coloração das sementes, esta foi aplicada, repetindo-a diversas vezes para a caracterização correta das principais alterações e sua associação com a viabilidade das sementes. A eficiência do teste de tetrazólio na determinação da viabilidade das sementes de mangaba foi avaliada através da comparação dos resultados de tetrazólio e germinação, para tanto de cada lote eram retiradas amostras de 200 sementes divididas em duas subamostras de 100, apresentando coerência com os valores obtidos para plântulas normais e anormais e sementes mortas nos testes de germinação. Dessa forma, as classes de viabilidade foram estabelecidas, sendo assim cada semente foi classificada em viável e inviável conforme coloração dos tecidos do embrião, presença e localização dos danos.
O teste de germinação foi conduzido utilizando-se quatro repetições de 25 sementes, que antes do início do teste foram tratadas com fungicida Benomil - 500 na concentração de 1,0g/kg de sementes, em seguida distribuídas em folhas de papel “germitest”, umedecidas com água destilada numa quantidade equivalente a 2,5 vezes o peso do substrato seco (Brasil, 1992), sendo os rolos confeccionados e mantidos em germinador a 28oC por 30 dias.
Para o teste de tetrazólio foram utilizadas quatro repetições de 25 sementes, colocadas em copo plástico de 50mL, adicionando-se a este a solução de tetrazólio em quantidade suficiente para cobrí-las, em BOD a 40°C sob escuro.
Utilizou-se o delineamento experimental inteiramente casualizado com quatro repetições. Calcularam-se os coeficientes de correlação simples de Pearson (r) entre os testes de tetrazólio viabilidade e germinação. A significância dos valores de r foi determinada pelo teste t, a 1 e 5% de probabilidade.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Dentre os métodos de pré-condicionamento testados em sementes de mangaba, verificou-se que as sementes imersas diretamente na solução de tetrazólio (testemunha), as embebidas em papel toalha umedecido por 16 e 24 horas e as perfuradas na área superior, todas sem a retirada do tegumento, não coloriram. Esta ausência de coloração pode ser decorrente da presença do tegumento, que dificultou a penetração da solução de tetrazólio para o interior da semente. Resultados semelhantes foram obtidos por Zucarelli et al. (1999) e Gonzalez et al. (1997), com sementes de sucará (Gledistchia amorphoides) e quiabo (Hibiscus esculentus) respectivamente, submetidas ao teste de tetrazólio, as quais apresentaram ausência de coloração, independentemente da concentração da solução e do tempo de coloração. Os autores atribuíram esses resultados ao tegumento impermeável, que impediu a penetração da solução de tetrazólio.
As sementes de mangaba que foram cortadas na extremidade superior lateral com e sem imersão em água a 25°C por 4 e 8 horas, só coloriram no local onde foi feito o corte. Esta situação ocorreu em trabalho realizado por Mendonça et al. (2001) com sementes de louro-pardo (Cordia trichotoma), onde mesmo após o maior período de exposição e maior concentração, apenas houve coloração dos tecidos no local do ferimento.
Para as sementes imersas diretamente em água a 40°C por 2 e 4 horas, com retirada do tegumento observou-se que estas desenvolveram coloração nos dois períodos estudados. Ao contrário, em sementes com a presença do tegumento não houve coloração do embrião devido à dificuldade de penetração da solução de tetrazólio para o interior da semente. De acordo com Costa (1992), é importante ressaltar que a imersão direta das sementes em água não deve ser feita por período de tempo excessivo, pois pode acarretar redução na disponibilidade de O2 comprometendo dessa forma, a qualidade das sementes e conseqüentemente, levando a obtenção de resultados incorretos.
Nas sementes seccionadas longitudinalmente com descarte de uma metade a coloração ocorreu apenas superficialmente na parte externa do embrião, demorando cerca de 7 horas, portanto, não se mostrando um método adequado de pré-condicionamento.
As sementes de mangaba com três cortes (dois laterais e um na parte superior oposta ao eixo) com e sem imersão em água, verificou-se que estes facilitaram a retirada do embrião sem causar dano e que ambos foram eficientes apresentando o mesmo comportamento, coloração adequada e uniforme. Todavia, considerando que métodos mais demorados implicam em maior tempo necessário para a condução do teste e obtenção dos resultados, o método de pré-condicionamento mais indicado, por permitir o desenvolvimento de coloração adequada, uniforme e com maior rapidez foi o que as sementes sofreram três cortes sem imersão em água. De acordo com Delouche et al. (1976), o pré-condicionamento feito de maneira adequada permite que, após a imersão das sementes na solução de tetrazólio, ocorra o desenvolvimento da coloração ideal, facilitando a interpretação do teste.
As concentrações da solução de tetrazólio usadas neste ensaio proporcionaram variações de tonalidades nos embriões de mangaba. As de 0,5 e 0,075% desenvolveram coloração semelhante, onde os tecidos viáveis coloriram-se mais uniformemente obtendo coerência com as recomendações de Moore (1985). Todavia, é mais indicado o uso rotineiro de solução a 0,075%, considerando que o sal de tetrazólio é um produto caro e que a 0,5% requer maior consumo deste sal. Concordando, dessa forma, com os resultados obtidos para algumas espécies como soja, algodão, amendoim, milho, feijão e café os quais tem indicado o uso de solução a 0,075%, permitindo o desenvolvimento de coloração ideal tanto nos tecidos vigorosos como nos não vigorosos (Barros, 2002).
O uso da solução de tetrazólio a 0,1% não se mostrou adequado, uma vez que os tecidos vigorosos ao invés de róseo apresentaram-se vermelho um pouco menos intenso que a tonalidade de vermelho observada nos tecidos com lesões, o que dificultou a observação dos danos, devido a proximidade da intensidade da coloração vermelho desenvolvido especialmente nas regiões vitais do embrião, comprometendo sua interpretação. Bhering et al. (2005), obtiveram resultados semelhantes para o teste de tetrazólio em sementes de melancia (Citrullus lunatus), onde a concentração da solução a 0,1% não se mostrou adequada e a de 0,075% permitiu uma avaliação mais segura devido aos padrões de coloração mais uniformes.
Com relação ao período de coloração, verificou-se que a coloração mais adequada foi obtida quando as sementes foram imersas em solução de tetrazólio a 0,075% por 60 a 90 minutos a 40°C, no escuro.
Definida a metodologia de pré-condicionamento, concentração da solução e coloração, estabeleceu-se classes de níveis de viabilidade, onde cada semente de mangaba avaliada foi qualificada em uma das classes (Figura 3), com base nas observações de intensidade de coloração, profundidade e localização dos danos. Para auxiliar no estabelecimento destas classes, foram considerados também os resultados da porcentagem de germinação das plântulas obtidas no teste de germinação (Figura 4)
conduzido paralelamente ao teste de tetrazólio.
Cada foto representa uma semente de mangaba que foi seccionada longitudinalmente. A superfície externa da semente é ilustrada à esquerda e a interna à direita.
Classe 1. Sementes viáveis: coloração uniforme rosa brilhante, apresentando
tecido com aspecto normal e firme.
Classe 2. Sementes viáveis: semelhante a anterior só que com pequenas
manchas superficiais avermelhadas na face interna dos cotilédones. Pequena lesão superficial na face externa do eixo embrionário.
Classe 3. Sementes viáveis: apresentam coloração branco leitoso em menos de
50% dos cotilédones, identificando tecido em deterioração. Extremidade da radícula com coloração vermelha intenso.
Classe 4. Sementes inviáveis: ambos os cotilédones com a metade superior
branco leitoso.
Classe 5. Sementes inviáveis: Eixo embrionário completamente vermelho
carmim intenso.
Classe 6. Sementes inviáveis: totalmente branca e vermelho intenso,
apresentando tecidos flácidos, caracterizando tecido morto.
Figura 3. Classes para a determinação da viabilidade de sementes de
Figura 4. Plântulas de mangaba normais (A) e anormais (B).
O valor do coeficiente de correlação obtido entre os resultados dos testes encontra-se na Figura 5. Verificou-se que houve correlação positiva e significativa (r= 0,77) entre o teste de germinação e tetrazólio viabilidade. Esses resultados concordam com Pasha e Das (1982), quando consideraram o teste de tetrazólio seguro, confiável e apropriado para determinar o potencial de germinação de lotes de sementes de soja.
ŷ = 8,501 + 0,8812**x r = 0,77 0 20 40 60 80 100 40 60 80 100 Tetrazólio viabilidade (%) Germinação (%)
Figura 5. Correlação entre os valores de germinação e tetrazólio viabilidade em sementes
CONCLUSÕES
- O teste de tetrazólio pode ser utilizado para avaliar com rapidez a viabilidade das sementes de mangaba;
- Para a condução do teste, as sementes devem ser seccionadas com três cortes no tegumento para a retirada do embrião e imersas na solução de tetrazólio a 0,075%, por 60 a 90 minutos em BOD a 40°C, para o desenvolvimento da coloração ideal.
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