UNIVERSIDADE ESTADUAL DE PONTA GROSSA PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO
LIBARDONE JOSE RIBEIRO BRUSTULIM
ANATOMIA FOLIAR E CAULINAR, CARACTERIZAÇÃO QUÍMICA E ATIVIDADES BIOLÓGICAS DO ÓLEO ESSENCIAL DE Ocotea porosa (NEES &
MART.) BARROSO: UMA ABORDAGEM INTERDISCIPLINAR
PONTA GROSSA-PR 2019
LIBARDONE JOSE RIBEIRO BRUSTULIM
ANATOMIA FOLIAR E CAULINAR, CARACTERIZAÇÃO QUÍMICA E ATIVIDADES BIOLÓGICAS DO ÓLEO ESSENCIAL DE Ocotea porosa (NEES &
MART.) BARROSO: UMA ABORDAGEM INTERDISCIPLINAR
Dissertação apresentada como requisito à obtenção do grau de Mestre em Ciências da Saúde pelo Programa de Pós-graduação em Ciências da Saúde, Setor de Ciências Biológicas e da Saúde, Universidade Estadual de Ponta Grossa.
Orientadora: Profa. Dra. Jane Manfron Budel Coorientador: Prof. Dr. Paulo Vitor Farago
PONTA GROSSA-PR 2019
Ficha Catalográfica Elaborada pelo Setor de Tratamento da Informação
BICEN/UEPG
Dedico este trabalho à minha mãe Vilma, pelo apoio incondicional, e a todos que de alguma maneira contribuíram para que eu pudesse chegar até aqui.
AGRADECIMENTOS
À Deus, que sempre me manteve de pé, forte, iluminado e abençoado.
A amiga e professora Melissa Georgia Schwartz, pelo incentivo, apoio e motivação, em mais essa trajetória. Obrigado pelo aporte pedagógico, multiprofissional durante a confecção desse estudo. Muito obrigado.
À Professora Dra. Jane Manfron Budel, pela dedicação e paciência nas orientações, confiança e apoio em todos os momentos. Obrigada por me encorajar a superar meus limites.
Ao Professor Dr. Paulo Vitor Farago, por sempre ter me ajudado e apoiado, pelas aulas brilhantes de metodologia da pesquisa, que tanto contribuiu na construção desse estudo.
À Professora Dra. Katia Paludo, pela ajuda, dedicação e gentileza durante meu experimento, com os testes citotóxicos. Obrigada também pelas nossas conversas e por compartilhar sua experiência profissional comigo. sinto um carinho enorme por você. Sinto-me honrado em ter trabalho com você.
Ao professor Dr. Luís Antonio Esmerino, por me ensinar ajudar com os testes antimicrobianos, sempre de forma gentil e contribuindo no aspecto multidisciplinar. Muito obrigado.
À Professora Dra. Beatriz Helena Lameiro de Noronha Sales Maia, pelo auxílio na analise química dos óleos essenciais.
Aos Professores Edson Aires da Silva e Marta Borges Maia, pelo incentivo e exemplo como educadores.
À técnica do Laboratório de Farmacognosia Luciane Mendes Monteiro, pela dedicação e parceria na realização deste trabalho.
Aos amigos e colegas de mestrado Wagner Ozório D’Almeida, Valter Paes de Almeida, Paola Raeski, Lislaine Klider e Isabel Pietczak Migacz pela amizade e companheirismo.
A colega Bárbara Justus pela ajuda com as analises antimicrobianas.
Ao Acadêmico de iniciação científica, Kennon Rios Santos, pelo auxílio no experimento de citotoxicidade.
À senhora Lurdes Mundstock e Rafaeli de Paula Bueno, por ceder o material botânico utilizado na realização dessa pesquisa
Ao Laboratório Multiusuário (c-LABMU) pela.
À Faculdades Integradas do Vale do Iguaçu – UNIGUAÇU, pelo apoio incondicional na realização dos experimentos, cedendo laboratórios e equipamentos. E pelo incentivo dado aos docentes para a realização do Mestrado.
RESUMO
Ocotea é um dos importantes gêneros da família Lauraceae e compreende cerca de 350 espécies, sendo encontradas, especialmente na América latina. No Brasil, espécies do gênero são importantes economicamente, pela utilização da madeira. Todavia a caracterização da espécie por estudos morfoanatômicos, químicos e atividades biológicas envolvendo o óleo essencial são precários. Esse trabalho teve como objetivo realizar o estudo da morfoanatomia das folhas de Ocotea porosa a fim de auxiliar na identificação desse táxon, determinar a composição química, investigar o potencial citotóxico e a atividade antioxidante do óleo essencial dessa espécie vegetal. O material botânico foi coletado em União da Vitória, Paraná, Brasil. A partir dos métodos usuais de microscopia óptica e eletrônica de varredura, ficou comprovado que as folhas são hipoestomáticas, possuem estômatos paracíticos e possuem tricomas tectores. A nervura central e o pecíolo são biconvexos e apresentam um feixe vascular colateral em arco aberto. O caule apresenta camada esclerenquimática e areia cristalina formada por oxalato de cálcio. Compostos fenólicos são encontrados na epiderme, floema e xilema da nervura central, pecíolo e caule. Por meio de hidrodestilação de folhas, obteve-se um teor de 1,03% ± 0,7% de óleo essencial. Os componentes majoritários do óleo essencial de O. porosa identificados por CG-EM foram o biciclogermacreno (24,62%), α-pineno (19,71%) e β-pineno (13,86%). Quanto à citotoxicidade avaliada pelo método do MTT, o óleo essencial de O. porosa mostrou-se citotóxico para as linhagens celulares fibroblasto murino (McCoy, ATCC® CRL-1696), melanoma murino (B16F10) e adenocarcinoma de mama humano (MCF7). Desta forma não evidenciou seletividade contra as células tumorais em estudo. Quanto à análise antioxidante o óleo essencial evidenciou baixa atividade pelo método DPPH e não evidenciou ação inseticida e antimicrobiana.
ABSTRACT
Ocotea is one of the most important genera of the family Lauraceae and comprises about 350 species, being found, especially in Latin America. In Brazil, species of the genus are economically important for using the wood. However, the characterization of the species by morphological, chemical and biological activities involving the essential oil are precarious. The objective of this work was to study the morpho-anatomy of the leaves of Ocotea porosa in order to help in the identification of this taxon, determine the chemical composition, investigate the cytotoxic potential of the essential oil and the antioxidant activity. The botanical material was collected in União da Vitória (Paraná, Brazil). From the usual methods of optical microscopy and scanning electron microscopy, it has been proven that the leaves are hypostomatic, have paracytic stomata and have non-glandular trichomes. The central vein and the petiole are biconvex and have a collateral vascular bundle in an open arch. The stem has a sclerenchymatic layer and calcium oxalate crystals. Phenolic compounds are found in the epidermis, phloem and xylem of the central vein, petiole and stem. The main anatomical marker of the stem is the presence of a continuous sclerenchymatous sheath in the pith. Two shapes of calcium oxalate crystals namely crystal sand and raphides are observed in this species. By means of hydrodistillation of leaves, a content of 1.03% ± 0.7% of essential oil was obtained. The essential oil of O. porosa were identified by GC-MS and the major compounds were bicyclogermacrene (24.62%), α-pinene (19.71%) and β-pinene (13.86%). As for cytotoxicity assessed by the MTT method, the essential oil of O. porosa was shown to be cytotoxic to the cell lines murine fibroblast (McCoy, ATCC® CRL-1696), murine melanoma (B16F10) and human breast adenocarcinoma (MCF7). Thus, there was no selectivity against the tumor cells under study. As for the antioxidant analysis, the essential oil did not show activity.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
FIGURA 1 - Estrutura química dos alcaloides. ...17
FIGURA 2 - Distribuição da espécie Ocotea porosa(Nees & Mart.) Barrosono Brasil...20
FIGURA 3 - Exsicata de Ocotea porosa (Nees & Mart.) Barroso catalogada no herbário da UEPG ... 22
FIGURA 4 - Aparato de clevenger utilizado na extração de óleo essencial de O. porosa ... 32
FIGURA 5 - Morfoanatomia de Ocotea porosa (Nees & Mart.) Barroso ... 41
FIGURA 6 - Secções transversais (TS) de Ocotea porosa (Nees & Mart.) Barroso ... 42
FIGURA 7 – Testes histoquímicos da folha de Ocotea porosa (Nees & Mart.) Barroso ... 44
FIGURA 8 - Óleo essencial de Ocotea porosa (Nees & Mart.) Barroso extraído por meio de hidrodestilação... ... 45
FIGURA 09 - Cromatograma do óleo essencial de Ocotea porosa (Nees & Mart.) Barroso... 47
FIGURA 10 - Espectro de massas do biciclogermacreno presente no óleo essencial Ocotea porosa (Nees & Mart.) Barroso... ... 49
FIGURA 11 - Espectro de massas do α - pineno presente no óleo essencial Ocotea porosa (Nees & Mart.) Barroso...49
FIGURA 12 - Espectro de massas do β - pineno presente no óleo essencial Ocotea porosa (Nees & Mart.) Barroso...50
GRÁFICO 1 - Viabilidade celular após 72 h de exposição à diferentes concentrações: óleo essencial de Ocotea porosa pelo método do MTT. ...51
FIGURA 14 - Alterações morfológicas encontradas em linhagens celulares incubadas com 77 µg/mL do óleo essencial de O. porosa por 24 horas. A: linhagem de adenocarcinoma de mama humano (MCF7) controle (incubada apenas com meio de cultura). B: MCF7 tratada com óleo de O. porosa. C: Linhagens celulares de melanoma murino (B16F10) controle (incubadas apenas com meio de cultura). D: B16F10 tratada com óleo essencial de O. porosa. É possível perceber alterações morfológicas importantes como condensação de cromatina (), arredondamento celular () e formação de blebs (). Aumento 1000x, coloração de May Grunwald-Giemsa ... 56
LISTA DE TABELAS
TABELA 1 - Índices de retenção e identificação dos compostos presentes no óleo essencial de Ocotea porosa (Nees & Mart.) Barroso ... 46 TABELA 2 - Valores de IC50 para as linhagens celulares incubadas com o óleo essencial de
Ocotea porosa e os índices de seletividade (IS) das linhagens tumorais
(B16F10 e MCF-7) em relação à linhagem não tumoral (McCoy)... 52 TABELA 3 - Média e desvio padrão das porcentagens de atividade antioxidante : método do DPPH• em diferentes concentrações, no tempo 30 min...54 TABELA 4 - Determinação da atividade antioxidante pela formação do complexo
fosfomolibdênio...55 TABELA 5 - Referente à atividade antimicrobiana por microdiluição...56
LISTA DE ABREVIATURAS
A absorvância
AA atividade antioxidante
AAR atividade antioxidante relativa
ABRAF Associação Brasileira dos Produtores de Floresta Plantada ABTS + radical catiônico
a.C. período cronológico antes do nascimento de Cristo ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária
°C graus Celsius
CG cromatografia gasosa
CG-EM cromatografia gasosa acoplada à espectroscopia de massa CIM concentração inibitória mínima
cm centímetros
DNA ácido desoxirribonucleico DMAPP difosfato de dimetillalil
DPPH radical livre 1,1-difenil-2-picrilhidrazila EMBRAPA Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária et al. expressão latina abreviada et alli, (=e outros)
FAA fixador de tecidos vegetais constituído de formol, ácido acético e álcool etílico FPP pirofosfato de farnesil
GPP difosfatogeramil h hora
H2O2 peróxido de hidrogênio
INCA Instituto Nacional do Cãncer
IC50 concentração necessária para reduzir 50 % de algo
IBGE Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística IPP difosfato de isopentenil
L Litro m metro mg miligrama min minuto mL mililitro mm milímetro mmol milimol nº número Na2SO4 sulfato de sódio nm nanômetro
OMS Organização Mundial da Saúde
OH- íon hidroxil
O2− íon superóxido
O2 oxigênio singleto
ROS espécies reativas de oxigênio UFPR Universidade Federal do Paraná V volume μg micrograma μL microlitro μm micrômetro % porcentagem
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ... 14
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ... 16
2.1 PLANTAS MEDICINAIS ... 16
2.2 FAMÍLIA Lauraceae JUSS. ... 18
2.3 O GÊNERO Ocotea Aubl. ... 19
2.3.1 Ocotea porosa (Nees & Mart.) Barroso... .... 21
2.4 ÓLEOS ESSENCIAIS ... 23
2.5 Atividade citotóxica / antitumoral ... 25
2.6 Atividade antioxidante ... 26 2.7 Atividade inseticida ... 27 2.8 Atividade microbiológica ... 27 3 OBJETIVOS ... 29 3.1 OBJETIVO GERAL... 29 3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ... 29 4 MATERIAL E MÉTODO ... 30
4.1 OBTENÇÃO DO MATERIAL BOTÂNICO ... 30
4.2 PREPARAÇÃO DA AMOSTRA PARA MICROSCOPIA DE LUZ ... 30
4.3 MICROMEDIDAS ... 30
4.4 ANÁLISES HISTOQUÍMICAS ... 31
4.5 PREPARAÇÃO DA AMOSTRA PARA MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE VARREDURA POR EMISSÃO DE CAMPO (FESEM) ... 31
4.6 EXTRAÇÃO E DETERMINAÇÃO QUANTITATIVA DO ÓLEO ESSENCIAL .. 31
4.7 CARACTERIZAÇÃO QUÍMICA DO ÓLEO ESSENCIAL ... 32
4.8 AVALIAÇÃO DAS ATIVIDADES BIOLÓGICAS ... 33
4.8.1 Atividade Citotóxica... 33
4.8.1.1 Linhagens tumorais... 33
4.8.1.2 Ensaio de viabilidade com MTT ... 33
4.8.1.3 Cálculo da Concentração inibitória mínima IC50... 34
4.8.1.4 Cálculo do índice de seletividade ... 34
4.8.2 Atividade Antioxidante ... 34
4.8.2.1 Método da redução do radical 2,2-difenil-1-picril-hidrazila (DPPH)34 ... 34
4.8.2.2 Determinação da atividade antioxidante: formação do complexo fosfomolibdênio... 35
4.8.3 Atividade inseticida... ... 36
4.8.3.1 Criação dos insetos... ... 36
4.8.3.2 Bioensaio tópico... .... 36
4.8.3.3 Bioensaio residual... 37
4.8.3.4 Bioensaio fumigação... 37
4.8.4 Atividade antimicrobiana... ... 38
4.8.4.1 Método micro diluição em caldo... ... 38
5 ANALISE ESTATÍSTICA ... 39
6 RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 40
6.1 ESTUDOS ANATÔMICOS ... 40
6.2 EXTRAÇÃO E TEOR DO ÓLEO ESSENCIAL (EO) ... 45
6.3 IDENTIFICAÇÃO E QUANTIFICAÇÃO DOS COMPOSTOS VOLÁTEIS ... 45
6.4 AVALIAÇÃO DE ATIVIDADES BIOLÓGICAS ... 50
6.4.1 Citotoxicidade ... 50
6.4.1.1 Determinação da citotoxicidade e IC50 do óleo essencial de Ocotea porosa ... 50
6.4.3 Atividade antioxidante ... 54
6.4.3.1 Método da redução do radical 2,2-difenil-1-picril-hidrazila (DPPH) ... 54
6.4.3.2 Determinação da atividade antioxidante: formação do complexo fosfomolibdênio ... 55
6.4.4 Atividade inseticida ... 56
6.4.5 Atividade microbiológica ... 56
7 CONCLUSÃO ... 57
Os vegetais têm sido utilizados por diversas civilizações desde a antiguidade tanto como fonte alimentar quanto na utilização como fármacos para o tratamento de várias patologias (DUTRA et al., 2016). A prática milenar do uso de plantas medicinais tornou-se parte fundamental no processo evolutivo, contribuindo de forma significativa para o desenvolvimento tecnológico (VANDERLINDE et al., 2012; SOUZA et al., 2011).
O tratamento de doenças utilizando produtos naturais de origem, vegetal apesar de serem consideradas formas antigas da prática medicinal são utilizadas por diversas comunidades no mundo todo e servem de base para a pesquisa e desenvolvimento de novos fármacos (DAVID, WOLFENDER, DIAS, 2015, LAHLOU, 2013). Estima-se que 80% da população dos países em desenvolvimento dependam das plantas medicinais para seus cuidados primários em saúde (PICKING, 2017).
O ecossitema brasileiro, rico em diversidade principalmente vegetal, possui matéria prima para ensaios e análises de novos fármacos aplicados no tratamento de diferentes doenças, uma vez que são muitos os compostos químicos vegetais que apresenta (RUFATTO et al., 2013).
Dessa forma, para garantir que o uso de uma planta seja seguro e eficaz é essencial o desenvolvimento de ensaios farmacológicos e toxicológicos (BLASS, 2015; CHAVEERACH, SUDMOON; TANEE, 2017). Considerando o desenvolvimento de medicamentos fitoterápicos são necessárias diversas pesquisas de caráter multidisciplinar, pois esses estudos envolvem diversas áreas do conhecimento a exemplo da botânica, agronomia, química, farmacologia, etnofarmacologia, toxicologia, desenvolvimento tecnológico, entre outros (MACIEL, et al., 2002).
Espécies de Lauraceae se destacam entre as outras famílias botânicas pela sua importância econômica. Diversas espécies são utilizadas pelas indústrias alimentícia, farmacêutica e cosmética, especialmente porque são produtoras de óleos essenciais. Muitas espécies ainda têm uso medicinal restrito às comunidades tradicionais que detêm o conhecimento empírico da utilização dessas plantas(MARQUES, 2001).
Ocotea Aubl. é um dos gêneros mais representativos da família Lauraceae com 428 espécies (THE PLANT LIST, 2018), sendo 169 espécies ocorrendo no Brasil (Ocotea na Flora do Brasil 2020 em construção). Os representantes brasileiros mais importantes do gênero são O. porosa (Nees & Mart.) Barroso e O. pretiosa Mez. (VATTIMO-GIL, 1980). A
taxonomia e a delimitação do gênero são problemáticas, especialmente em relação à Cinnamomum e Nectandra (ROHWER, 1986).
Investigações de atividades biológicas de espécies de Ocotea têm mostrado resultados significativos, principalmente para as atividades antioxidante, citotóxicas e inseticidas (SILVA, 2017). Muitas das atividades biológicas de espécies de Ocotea estão relacionadas à presença dos óleos essenciais, entretanto a quantidade e a qualidade dos componentes dos óleos essenciais podem variar dependendo do órgão da planta, métodos utilizados para extração e armazenamento, e com as características edáfica e ambientais. Nesse sentido, é importante o estudo da composição química do óleo essencial, pois este interfere diretamente nas atividades biológicas (SAULLE et al., 2018).
Ocotea porosa (Nees & Mart.) Barroso, conhecida popularmente como imbuia, canela-imbuia, canela-preta e canela-broto, apresenta Oreodaphne porosa Ness, Phoebe porosa (Nees & Mart.) Mez e Cinnamomum porosum (Nees & Mart.) Kosterm como sinonímias (THE PLANT LIST, 2018).
O. porosa possui escassos estudos anatômicos e histoquímicos, de composição química e de atividades biológicas do óleo essencial extraído de folhas. Adicionalmente, há estudo do óleo essencial de O. porosa apenas extraído da madeira dessa espécie vegetal (WEYERSTAHL et al., 1994;REYNOLDS, 1995).
Considerando as atividades biológicas de espécies de Ocotea, a ausência de estudos dos constituintes do óleo essencial extraído de folhas de O. porosa e a carência de estudos anatômicos e histoquímicos, o objetivo desse trabalho foi fornecer caracteres micrográficos de folha e caule a fim de auxiliar na identificação da espécie, determinar os constituintes químicos e as atividades antioxidante, citotóxica, inseticidas e antimicrobianas do óleo essencial de O. porosa.
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 PLANTAS MEDICINAIS
A humanidade sempre utilizou plantas para sua alimentação e também para o tratamento de doenças. Registros anteriores a Cristo demonstravam o uso de plantas como medicamentos (CRAGG, NEWMAN, 2016, DUTRA, 2016). Na Mesopotâmia encontrou-se o primeiro registro do uso de plantas medicinas, no qual eram usados óleos das espécies de Cedrus atlantica (Endl.) Manetti ex Carrière, Cupressus sempevirens L. e Papaver somniferum L., estas espécies são utilizadas até hoje para o alívio de tosses, resfriados, infecções e inflamações. Foram encontrados em túmulos egípcios e datam de 3000 a.C., como o Papiro Hieratic e Papiro Ebers. No ano de 1500 a.C. foi encontrado o Ebers Papyrus que tem descrito 811 prescrições com uso de 700 medicamentos, incluindo cebola, papoula, coentro, mirra, aloe, anis entre outras espécies (ATANASOV, 2015; CRAGG, NEWMAN, 2016).
Na Babilônia, em 1770 a.C. foram encontrados registros que descreviam entre as drogas vegetais usadas para o tratamento de doenças o ópio, rícino, mirra, diversos minerais entre outros. Na medicina Indiana (Ayurveda e Riveda) os medicamentos usados atualmente são os mesmos desde 2000 a.C. incluindo plantas sagradas, além do sândalo, áloe, óleo de gergelim, óleo de rícino, gengibre, canabis, cravo, cardamomo, pimenta, entre outros. A medicina chinesa, famosa pelas técnicas de acupuntura, tem em seus apontamentos (3000 a.C.) evidencias do uso de plantas medicinais como o anis, ginseng, ruibarbo, romã entre outros (ELUFIOYE; BADAL 2016; ATANASOV, 2015; CRAGG, NEWMAN, 2016).
As plantas também foram importantes para fixar grupos populacionais em determinadas regiões geográficas, estabelecendo suas culturas alimentar. As espécies vegetais desempenharam importante papel na história da descoberta de novas drogas para a medicina, sendo utilizadas para o tratamento de diversas doenças (CHE et al., 2017).
O estabelecimento do consumo de determinadas plantas por grupos populacionais com a baixa incidência de doenças levou cientistas a pesquisar a relação existente, como exemplo entre dieta mediterrânea e a menor incidência de câncer. Esta informação levou ao isolamento de diferentes compostos presentes em alimentos como por exemplo o β-caroteno, licopeno, curcumina, catequinas, antocianinas, resveratrol, entre outros compostos. No
entanto, alguns sem efeito contra o câncer, mas que continuam sendo estudados para descobrir outras atividades biológicas (GORDON; CRAGG; PEZZUTO, 2016).
As plantas ainda fazem parte da medicina tradicional em todo mundo. Estima-se que 80% da população no mundo não tem acesso a medicina convencional, fazendo uso das plantas como a principal fonte para o tratamento de doenças (PFERSCHY-WENZIG; BAUER, 2015).
Devido a grande aplicabilidade das plantas na medicina tradicional, estudos da composição química e os efeitos biológicos de espécies vegetais tem sido cada vez mais enfatizados). Por exemplo, os alcaloides vimblastina (1) e vincristina (2), ambos isolados de Catharanthus roseus, o paclitaxel (3), isolado das cascas de Taxux brevifolia, e a camptotecina, isolada de Camptotheca acuminata Decne são fármacos utilizados no tratamento linfoma de Hodgkin, sarcoma de Kaposi, câncer de ovário e testículo e leucemia linfoblástica aguda infantil (BRANDÃO et al., 2010; CRAGG, NEWMAN, 2016).
O paclitaxel (3) (Taxol®), utilizado no tratamento de câncer de mama, ovário e
pulmão, induz diferentes tipos de morte celular, seu exato mecanismo de citotoxicidade frente a células é amplamente estudado. Os análogos dos taxanos tem se mostrado importantes para o desenvolvimento de agentes antineoplásicos (CRAGG, NEWMAN, 2016; LEE et al., 2016).
FIGURA 1 - Estrutura química dos alcaloides.
N H N OH O O N N OH O O O O O H H H N H N OH O O N N OH O O O O O H H H O NH O O H O O O OO OH O O O O O O H vimblastina (1) Vincristina (2) Paclitaxel (3)
N N O O O O H N N O O N O H N N
Camptotecina (4) Irinotecan (5) Topotecan (6) Fonte: Autor, 2018.
A classe de agentes derivados da camptotecina (4), um alcaloide isolado de uma
árvore ornamental chinesa, Camptotheca acuminata Decne também oferece uma contribuição importante. O extrato da C. acuminata é utilizado no tratamento de atividade antitumoral e a camptotecina foi estabelecida como o componente ativo (CRAGG, NEWMAN, 2016; LEE et al., 2016).
Em ensaios pré-clínicos feitos na década de 70, a substância apresentou uma baixa atividade cancerígena e toxicidade para os rins, entretanto, pesquisas realizadas posteriormente, desenvolveram o irinotecan (5) e topotecan (6), dois equivalentes da
camptotecina, utilizados para câncer de ovário, pulmão e cólon-retal (BRANDÃO et al., 2010; CRAGG; NEWMAN, 2016).
Estima-se que existam entre 350.000 e 550.000 espécies de plantas, das quais menos de 20% foram investigadas. O Brasil detém aproximadamente 10% da flora mundial, sendo que menos de 1% de suas espécies já foram estudadas quanto a sua composição química e suas propriedades biológicas (KUMAR, 2015).
A fitoterapia representa aproximadamente 5% do mercado atual de medicamentos, devendo-se considerar as diferenças existentes no uso entre países desenvolvidos e em desenvolvimento, neste último, o uso de produtos a base de plantas medicinais para o tratamento de doenças chega a representar 80% dos medicamentos usados.
A pesquisa científica com produtos naturais para a descoberta de compostos biologicamente ativos bem como, suas estruturas químicas, é um passo importante para a evolução da ciência na busca de medicamentos que possam ser efetivos na cura das doenças (GORDON; CRAGG; PEZZUTO, 2016). No entanto, apenas uma pequena parcela do reino vegetal foi avaliada quanto as suas propriedades químicas e biológicas, assim, continua sendo importante a busca por novas biomoléculas ativas, bem como, a elucidação química e identificação das atividades biológicas (KUMAR, 2015).
2.2 FAMÍLIA Lauraceae JUSS.
Lauraceae é uma das maiores famílias das Angiospermas, sendo catalogadas aproximadamente 2.978 espécies divididas em 68 gêneros (THE PLANT LIST, 2018). Essa família vem sendo apontada como uma das mais representativas, tanto em número de indivíduos quanto em riqueza de táxons nos inventários florísticos e fitossociológicos (BROTTO; CERVI; SANTOS, 2013).
Espécies de Lauraceae apresentam ampla distribuição geográfica, no entanto, é na América do Sul onde ocorre a maior concentração de diversidade de espécies. No Brasil, essa família apresenta 24 gêneros com 438 espécies registradas, distribuídas de Norte a Sul do país (FLORA DO BRASIL 2020, em construção, 2018).
Espécies de Lauraceae são importantes economicamente, pois são utilizadas na marcenaria e construção civil, na fabricação de papel, na indústria química, farmacêutica e de perfumes (MARQUES et al., 2001). Muitas espécies são também utilizadas na culinária a exemplo do louro (Laurus nobilis L.) Além do uso como condimento na culinária, essa espécie era utilizada pelos gregos e romanos para confeccionar coroas, com as quais se homenageavam guerreiros e atletas vitoriosos (BROTTO; CERVI; SANTOS, 2013).
Outra espécie de destaque é Persea americana Mill., procedente da América Central, reconhecida pelo alto valor nutricional da polpa dos seus frutos, do mesocarpo e da semente, e também do óleo que é utilizado na para a fabricação de cosméticos. A canela (Cinnamomum zeylanicum Blume) também merece lugar de destaque entre as espécies de Lauraceae, pois, especialmente suas cascas são muito utilizadas na medicina e na culinária (BROTTO; CERVI; SANTOS, 2013).
Em vestígios da Floresta Atlântica, Lauraceae tem grande representatividade tanto pela numerosa população, quanto pela riqueza de táxons (QUINET; ANDREATA, 2002). Entre esses, destacam-se as espécies produtoras de madeira, a exemplo de O. porosa (BRITO, 2009). Decorrente da exploração econômica, cerca de 36 espécies dessa família estão sob ameaça de extinção (IUCN, 2018). Adicionalmente, de acordo com a Portaria nº 443/2014 do Ministério do Meio Ambiente no Brasil, diversas espécies da família encontram-se nas categorias “vulneráveis”, “ameaçadas” e “criticamente em perigo” (MINISTÉRIO DO MEIO AMBIENTE, 2014).
2.3 O GÊNERO Ocotea Aubl.
O gênero Ocotea é dos mais representativos da família Lauraceae, sendo descrito primeiramente por Aublet (1775) e tendo como espécie-tipo O. guianensis Aubl. É considerado o maior gênero no Neotrópico, apresentando aproximadamente 792 espécies distribuídas do México e sul da Flórida até a Argentina, das quais 140 ocorrem no Brasil (THE PLANT LIST, 2018), onde 84 são endêmicas. O estado do Paraná possui representação muito significativa em quase todas as formações florestais e campestres (BROTTO; CERVI;
SANTOS, 2013). Algumas espécies de Ocotea aparecem entre as dominantes no estrato arbóreo da Floresta Ombrófila Densa e Floresta Ombrófila Mista (RODERJAN et al., 2001). A figura 2 mostra a distribuição da espécie Ocotea porosa no Brasil.
FIGURA 2 – Distribuição da espécie Ocotea porosa(Nees & Mart.) Barrosono Brasil.
FONTE: Lista de Espécies da Flora do Brasil, QUINET et al. (2015).
Nas florestas Paranaenses, Ocotea se encontra entre os gêneros mais abundantes, representado por 11 espécies na Floresta Ombrófila Mista e 18 espécies em na Floresta Ombrófila Densa e, ainda 8 espécies em Floresta Estacional Semidecidual, (SCHEER, BLUM, 2011).
Araucaria angustifolia (Bertol.) Kuntze é uma das principais espécies associadas à Floresta Ombrófila Mista e integram-se a ela diversas espécies, destacando-se Campomanesia xanthocarpa (Mart.) O.Berg (gabiroba), Cedrela fissilis Vell. (cedro-rosa), Dicksonia sellowiana Hook. (xaxim-bugio), Ilex paraguariensis A.St.-Hil. (erva-mate), O. odorifera (Vell.) Rohwer (canela-sassafrás), O. porosa (imbuia), Podocarpus lambertii Klotzsch ex Endl. (pinheiro-bravo), entre outras (MAACK, 2002).
Ocotea apresenta grande variação morfológica, servindo como última opção para espécies que não são prontamente acomodadas em outros gêneros (VAN DER WERFF 1991). Coe-Teixeira (1980) afirma que os gêneros Nectandra e Ocotea são muito difíceis de distinguir, sendo possível identificá-los apenas pela posição das glândulas basais e da forma
das anteras. Adicionalmente, a plasticidade morfológica, o grande número de espécies, a inexistência de estudos taxonômicos atualizados, e a carência de coletas associadas a determinações pouco precisas torna esse grupamento vegetal de difícil taxonomia (BROTTO; CERVI; SANTOS, 2013).
O estudo realizado por DAMASCENO (2017) mostra que a morfologia dos estames e o desenvolvimento da cúpula do fruto são considerados os caracteres morfológicos de maior importância pelos especialistas na família, e são usualmente empregados nas chaves de identificação, para a 36 separação entre espécies de Lauraceae (COE-TEIXEIRA, 1980; BROTTO; CERVI; SANTOS, 2013).
As espécies de Ocotea, O. catharinensis Mez., O. odorifera (Vellozo) Rohwer e O. porosa são conhecidas popularmente como imbuias e têm alto valor comercial tanto de sua madeira quanto dos óleos essenciais que delas são extraídos. Devido à importância econômica, especialmente na Mata Atlântica do Brasil, essas espécies têm sofrido exploração predatória, o que levou as espécies ao estado de vulnerabilidade (MARTINS et al., 2014). 2.3.1 Ocotea porosa (Nees & Mart.) Barroso
Ocotea porosa, conhecida popularmente como imbuia, canela-imbuia, imbuia-amarela, imbuia-preta e imbuia-zebrina, é uma árvore monóica que pode atingir 7 m de altura e diâmetro de 50-150 cm na altura do peito. O caule é grosso, tortuoso, formando copa ampla, pouco densa, sendo as folhas simples, alternas e verde-claras. A inflorescência se apresenta como racemos simples ou subracemosos corimbosos, sendo as flores hermafroditas, pequenas, amareladas e os estames externos (típicos de Ocotea) quase sésseis. O fruto da imbuia é uma baga globosa (esférica), de 13 a 17 mm de diâmetro, com superfície lisa, pesando 1,2 a 2,3 g, o qual deve ser despolpado para a retirada da semente (KALIL FILHO et al., 2004; 2005). A semente apresenta superfície lisa, contendo inúmeras estrias, medindo de 12 a 15 mm de diâmetro (SIMEONE; KALIL FILHO, 2010).
A figura 3 mostra a exsicata da espécie Ocotea porosa, confeccionada e depositada no herbário da Universidade Estadual de Ponta Grossa.
FIGURA 3 – Exsicata de Ocotea porosa (Nees & Mart.) Barroso, catalogada no herbário da UEPG.
Fonte: Autor 2018
O. porosa é encontrada nos estados do sul, sudeste, centro-oeste e nordeste do Brasil, concentrando–se em vastas áreas no norte do Estado de Santa Catarina, onde foi considerada árvore mais importante depois do pinheiro-brasileiro, imprimindo a fisionomia à paisagem (BRITO, 2009). Essa espécie, possivelmente seja a espécie arbórea mais longeva da "floresta de araucária", podendo ultrapassar 500 anos de vida (CARVALHO, 1994). É tolerante à sombra até cerca de 1 m de altura. Indivíduos de tamanho maior em ambientes pouco iluminados não são encontrados no interior de florestas, o que indica uma possível mudança de comportamento em relação à luminosidade (AMATO; MARQUES, 2001).
A madeira de imbuia por muito tempo foi manipulada na confecção de móveis diversos, sendo considerada como artigo de luxo. A madeira empregada para movelaria, exportada e suas qualidades estéticas são universalmente apreciadas. Foi também utilizada na construção civil usada como vigas, caibros, ripas, forro, tábuas e tacos para assoalhos, marcos ou batentes de portas e janelas, venezianas, molduras e lambris. Na carpintaria e marcenaria também recebeu destaque sendo muito requisitada para obras de entalhes, coronha de arma de fogo, estaca, piquete, esquadrias, instrumentos musicais, escadarias, dormentes e hidráulicas (CORRÊA, 1969).
2.4 ÓLEOS ESSENCIAIS
Os óleos essenciais (OE) são produtos do metabolismo secundário de algumas plantas, denominadas aromáticas por possuírem atividades conservantes, terapêuticas e por darem sabor agradável aos alimentos. Os OEs são utilizados há muitos anos por diversas civilizações. O uso de plantas aromáticas data de 10.000 anos a.C. (KUBECZKA, 2016) e Paracelsus Von Hohenheim, no século 16, foi o primeiro a utilizar o termo “óleo essencial”, que significa “a alma da planta” ou “a quinta essência” para a cura (HENRIQUES; SIMÕES-PIRES; APEL, 2012). O aperfeiçoamento do uso dos OEs iniciou–se por volta do século XIII quando as farmácias começaram a produzir compostos denominados de óleos-remédios e a registrar as suas propriedades farmacológicas e efeitos fisiológicos nas Farmacopéias (BRITO, 2009).
Os OEs, conhecidos como essências, óleos voláteis e óleos etéreos, são complexas misturas de compostos voláteis de baixo peso molecular produzidos por organismos vivos e extraídos por métodos físicos, utilizando-se a planta inteira ou seus diferentes órgãos. Os compostos voláteis são derivados principalmente de três rotas biossintéticas, via do mevalonato formando os sesquiterpenoides, via do metil-eritritolfosfato produzindo monoterpenoides, e via do ácido chiquímico formando fenilpropanoides. Uma vez biossintetizado, os terpenoides podem sofrer diversas reações enzimáticas, a exemplo da isomerização e oxidação (RAUT; KARUPPAYIL, 2014; FRANZ, NOVAK, 2016).
Os compostos voláteis presentes nos OEs apresentam diversas funções ecológicas, como antibacterianos, antivirais, antifúngicos, inseticidas, inibidores da germinação, na proteção contra predadores, na atração de polinizadores, na proteção contra desidratação, elevação da temperatura, entre outros (SOLETTI, 2015). Os OEs podem ser biossintetizados
e acumulados em todos os órgãos das plantas e anatomicamente são armazenados em
estruturas secretoras, a exemplo de cavidades, dutos e tricomas glandulares (BUDEL et al.,
2018a).
OEs têm sido amplamente utilizados em todo o mundo e a demanda por produtos com alta qualidade está constantemente aumentando. Para garantir a qualidade, os OEs podem ser analisados por diferentes técnicas, a exemplo de métodos físicos, organolépticos, químicos, cromatográficos e análise espectroscópica (DO et al., 2015).
Grandes quantidades de OEs são produzidas anualmente e utilizadas nas indústrias de aromas, fragrâncias, cosméticos, farmacêutica e alimentícia (DO et al., 2015). Alguns OEs são produzidos em grande escala, por exemplo, em 2008, a produção de óleo de laranja era ~ 51.000 toneladas, óleo de hortelã-pimenta ~ 32.000 toneladas e óleo de limão ~ 9.200 toneladas (SAWAMURA, 2010).
Diversas famílias botânicas apresentam espécies aromáticas que têm sido alvo de pesquisa, por exemplo em dicotiledôneas, destacam-se Apiaceae, Asteraceae, Geraniaceae, Illiciaceae, Lamiaceae, Lauraceae, Myristicaceae, Myrtaceae, Oleaceae, Rosaceae e Santalaceae. Em monocotiledôneas, a plantas aromáticas são substancialmente mais restritas à Acoraceae, Poaceae and Zingiberaceae (FRANZ, NOVAK, 2016).
Diversas atividades biológicas de OEs têm sido encontradas e entre essas destacam-se: antibacteriana, antifúngica, antitumoral, antimutagênica, antidiabética, antinociceptiva, antiviral, anti-inflamatória, antitripanossoma, antimalárica, vasodilatadora, citotóxica e inseticida (HENRIQUES; SIMÕES-PIRES; APEL, 2007; FLORÃO et al., 2012; RAUT; KARUPPAYIL, 2014; BUCHBAHUER, BOHUSCH, 2016; PEREIRA et al., 2017; PERERA et al., 2011; BUDEL et al., 2018).
Comumente, nos OEs, são encontrados entre 20 e 60 compostos voláteis em diferentes concentrações, e estes são caracterizados por dois ou três componentes principais com concentrações mais altas em comparação com outros compostos presentes. Em geral, os compostos majoritários presentes nos OEs são os responsáveis pelas atividades biológicas (GUIMARÃES et al., 2012; RAUT, KARUPPAYIL, 2014).
A composição química dos OEs produzidos por uma espécie vegetal pode variar dentro da mesma espécie. Essa variação pode ocorrer por fatores edáficos e ambientais, presença de quimiotipos, além dos métodos utilizados para extração e armazenamento desses óleos essenciais (SOLETTI, 2015; SAULLE, 2018).
A família Lauraceae está entre as mais utilizadas por indústrias. As espécies Cinnamomum camphora (L.) Presl. e Lindera benzoin (L.) Blume são reconhecidas como algumas das principais espécies produtoras de óleos essenciais da família. Cinnamomun camphora (L.) Presl., popularmente conhecida como cânfora, é uma das espécies conhecidas desde a Grécia antiga (MARQUES, 2001).
Entre as espécies de Ocotea encontradas em Santa Catarina, destaca-se a espécie O. pretiosa (Nees) Benthan & Hooke (canela-sassafrás), da qual se pode extrair um OE muito peculiar pelo seu odor característico, misto de cinamomo, sassafrás e rosa, semelhante à O. costulata Mez que apresenta agradável aroma de cânfora pela presença do OE na casca e na madeira.
Ocotea apresenta o maior número de espécies medicinais entre as Lauraceae. O. aciphylla (Nees) Mez é usada como tônico e estomáquico em infusões de folhas, enquanto que a casca é utilizada como anti-reumática e depurativa. Estudos etnobotânicos, mencionam o uso da folha para enrolar o cigarro em rituais de cura, por índios do Xingu, quando queimada, pode ter um efeito narcótico (MARQUES, 2001).
O. indecora Schott. é utilizada como sudorífica, anti-reumática e até anti-sifilítica, devido as propriedades do OE obtido da casca que é geralmente extraído do caule ou da raiz. O OE de O. barcellensis Mez, extraído da madeira, é utilizado no tratamento da pitiríase, enquanto que o OE de O. opifera Mart, extraído dos frutos, é utilizado no combate ao reumatismo e artrites (BRITO, 2009).
Uma avaliação preliminar realizada com O. porosa para testar a ação antifúngica do OE não apresentou inibição do crescimento dos organismos Cladosporium spharospermum e C. cladosporioides (BRITO, 2009).
2.5 ATIVIDADES CITOTÓXICAS
Atualmente, um problema considerado grave na saúde pública é a incidência de diversos tipos de câncer. Caracterizada pela multiplicação desordenada de células que invadem o organismo, tecidos e órgãos, o câncer, uma doença invasiva e agressiva, tem seu desenvolvimento acelerado e desordenado, com a capacidade de formar tumores, afetando o funcionamento do organismo (SAMPAIO; COSTA, 2017).
O câncer está sendo considerado uma doença de países desenvolvidos, há mais de quarenta anos. Porem observa-se também um crescente numero de casos em países em
desenvolvimento, que possuem poucos recursos voltados à qualidade da Medicina (MORAES et al., 2017).
No Brasil, estimou-se para o ano de 2017, apontamentos sobre a ocorrência de aproximadamente 600 mil novos casos de câncer, incluindo os casos de pele não melanoma, reforçando a magnitude desse problema no país (ALVES; MORAIS NETO, 2015; MORAES et al., 2017).
Muitos estudos apresentam resultados promissores em relação a atividade citotóxica dos OEs de plantas contra células tumorais. Terpenoides tem se demonstrado atuantes na prevenção da proliferação de células tumorais através de necrose ou indução de apoptose. Nesse contexto, estudos de OEs e compostos voláteis presentes em espécies de ocotea, a exemplo de O. caudata (Nees) Mez, O. cujumary Mart. e O. caniculata (Rich.) evidenciaram ação citotóxica frente a diferentes linhagens celulares (DA SILVA et al., 2017).
2.6 ATIVIDADES ANTIOXIDANTES
A enorme quantidade de compostos fenólicos nos OE favorece os estudos com interesse focado ao seu potencial antioxidante, uma vez que os radicais livres e outras espécies reativas de oxigênio, quando existentes na constituição do organismo, favorecem várias alterações celulares que se relacionam à patologias diversas, entre elas doenças cardiopatias, câncer, diabetes, Alzheimer, entre outras (LI et al., 2012; MIGUEL, 2010).
OEs que possuem propriedade antioxidante comprovadas têm sido utilizados na indústria farmacêutica, de cosmético e, principalmente, na alimentícia. Como exemplo temos os óleos de orégano (Origanum vulgare L.), de menta (Mentha spp.) e alecrim (Rosmarinus officinallis L.). Entretanto, OEs com propriedades antioxidantes podem apresentar uso terapêutico, uma vez que o potencial antioxidante está ligado a uma série de atividades farmacológicas por representar uma proteção contra danos celulares causados por radicais livres e espécies reativas de oxigênio (HENRIQUES; SIMÕES-PIRES; APEL, 2007).
Dentre as atividades farmacológicas já encontradas em algumas espécies de Ocotea, destacam-se a antioxidante (BRUNI et al., 2004). Neste contexto, os OEs e seus componentes químicos isolados agem como antioxidantes naturais por conterem normalmente em sua estrutura química um anel benzeno com uma hidroxila funcional que atua como doador de elétrons seja ele o hidrogênio ou outro (AMIRI, 2012; DÖLL-BOSCARDIN, 2010).
2.7 ATIVIDADES INSETICIDAS
Extratos e substâncias químicas diversas são testados e muitas vezes utilizados num sistema agroecológico como praguicidas ou mesmo utilizadas como modelo de novos inseticidas necessários para uma produção orgânica (TAVARES et al., 2009).
Compostos bioativos provenientes de vegetais possuem ação repelente, inibição de crescimento e efeito tóxico, representando estratégias para o manejo e controle de insetos (CAVALCANTE et al. 2006).
Pesticidas sintéticos são amplamente usados como estratégia para o controle de pragas e doenças de plantas, porém sua aplicação ilimitada causa problemas diversos como o acúmulo de resíduos em produtos tratados, a contaminação do ambiente e o desenvolvimento de resistência das pragas entre outros (PRIETO, et.al. 2010).
Devido aos inconvenientes gerados pelo uso contínuo de agroquímicos convencionais, a necessidade de desenvolver novos biocontroladores para tratar pragas que afetam muitas plantas, fontes de alimentos ou uso industrial aumentou (PRIETO, et.al. 2010). Nesse sentido, OE extraídos de O. odorifera mostraram resultados promissores como inseticidas naturais no controle de Sitophilus zeamais (PINTO JUNIOR et al., 2006). Apesar dos OE estarem se destacando no controle de pragas, não se conhece a ação inseticida do OE de O. porosa.
2.8 ATIVIDADES MICROBIOLÓGICAS.
A utilização dos OEs com o objetivo de inibir a multiplicação bacteriana, pode ser demonstrado por diversos mecanismos, como por exemplo, a coagulação do citoplasma, alteração na membrana plasmática e nas proteínas de membrana e na degradação da parede bacteriana (CANTON et al., 2010).
Recentes pesquisas justificam o surgimento de novas espécies de microrganismos e novos perfis de resistência comparado aos antimicrobianos convencionais (MENDES et al., 2011). Terpenos, seus derivados oxigenados e terpenoides, incluindo compostos fenólicos são os grupos mais comuns presentes nos OEs. Esses grupamentos têm mostrado atividade contra vírus, fungos, bactérias e protozoários (PROBST, 2012).
A terapia da combinação entre antibiótico e extratos de plantas pode expandir o espectro antimicrobiano, evitando o aparecimento de resistência mutante e minimizando a
toxicidade. Muitas vezes o efeito sinérgico exercido pela a combinação de drogas, ultrapassa o seu desempenho individual, tornando o agente antibacteriano mais eficaz na inibição de uma espécie particular de micro-organismo (CHANDA; RAKHOLYA, 2011).
3 OBJETIVOS
3.1 OBJETIVO GERAL
• Realizar estudo anatômico de folha e caule, caracterizar quimicamente e investigar as atividades inseticida, antioxidante e citotóxica do óleo essencial de Ocotea porosa (Nees & Mart.) Barroso.
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
• Coletar o material botânico de O. porosa; • Promover a identificação botânica de O. porosa;
• Avaliar anatomicamente as folhas e caules de O. porosa;
• Extrair e determinar o teor de óleo essencial de folhas de O. porosa;
• Identificar e quantificar os compostos voláteis presentes no óleo essencial de O. porosa;
• Avaliar in vitro a atividade citotóxica do óleo essencial de O. porosa. • Testar a atividade inseticida do óleo essencial de O. porosa.
• Determinar a atividade antioxidante do óleo essencial de O. porosa; • Avaliar a ação antimicrobiana do óleo essencial de O. porosa;
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 OBTENÇÃO DO MATERIAL BOTÂNICO
A coleta do material botânico foi realizada no bairro Rio Vermelho, no Município de União da Vitória, na região sul do estado do Paraná (830 m de altitude, 26.9'18,5'' S de latitude e 51.0'58,8'' O de longitude), no mês de março de 2017. Foram confeccionadas exsicatas, depositadas e identificadas pelo número HUPG 22243, no herbário da Universidade Estadual de Ponta Grossa, Paraná. O acesso ao patrimônio genético Ocotea porosa (Nees & Mart.) Barroso foi autorizado pelo Conselho de Gestão do Patrimônio Genético (CGEN/SISGEN) e está registrado sob o número AD3F256.
4.2 PREPARAÇÃO DA AMOSTRA PARA MICROSCOPIA DE LUZ
Para o estudo anatômico, folhas e os caules frescos de O. porosa foram coletados e fixados em solução de FAA70, contendo etanol 70% (90%), formaldeído (5%) e ácido acético (5%). O material vegetal foi fixado em FAA 70 (JOHANSEN, 1940) e estocados em etanol a 70% (BERLYN; MIKSCHE, 1976).
As lâminas semipermanentes foram seccionadas nos sentidos transversal e longitudinal à mão livre, utilizando-se lâminas de barbear. Para a montagem das lâminas foi usado uma gota de glicerina 50% e para lutagem utilizou-se esmalte incolor. As secções foram coradas com azul de astra e fucsina básica (ROESER,1962) ou azul de toluidina (O’BRIEN et al., 1964). Para a análise das características epidérmicas das folhas, as amostras serão mergulhadas em solução de hipoclorito de sódio até ficaram translúcidas. As amostras foram lavadas com água e coradas com safranina (KRAUS, ARDUIN, 1997).
4.3 MICROMEDIDAS
Estudos quantitativos dos estômatos foram realizados por meio de 20 medidas de múltiplas folhas de O. porosa. O índice estomático (SI) foi calculado utilizando a seguinte fórmula SI= (S/(E+S)) x 100; em que S = número de estômatos por unidade de área, e E = número de células epidérmicas (incluindo tricomas) na mesma área unitária.
O comprimento e a largura dos estômatos foram medidos a partir de 20 estômatos em diferentes locais da lâmina foliar para se determinar o tamanho estomático médio. 4.4 ANÁLISES HISTOQUÍMICAS
Para os testes histoquímicos foram realizadas secções transversais mão livre com material fresco. Os reativos utilizados foram: Sudam III para compostos lipofílicos (SASS, 1951), solução de cloreto férrico 2% (JOHANSEN, 1940) e solução de dicromato de potássio 20% (GABE, 1968) para a pesquisa de compostos fenólicos, solução de floroglucinol/HCl para detectar lignina (FOSTER, 1949) e solução de lugol para verificar a presença de amido (BERLYN; MIKSCHE, 1976) Os resultados foram registrados por meio de fotomicrografias no microscópio fotônico Olympus CX 31, acoplado à câmera digital C7070 do laboratório de Farmacognosia da Universidade Estadual de Ponta Grossa.
4.5 PREPARAÇÃO DA AMOSTRA PARA MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE VARREDURA POR EMISSÃO DE CAMPO (FESEM)
Para essa análise foram utilizadas folhas e caules frescos de O. porosa e analisados em um microscópio eletrônico de varredura por emissão de campo (Mira 3 Tescan). Primeiramente, as amostras foram submetidas à desidratação em série etanólica crescente (30, 50, 70, 80, 90 e 100%) e após montagem em suporte, foram submetidas à metalização com ouro em aparelho Quorum, modelo SC7620.
4.6 EXTRAÇÃO E DETERMINAÇÃO QUANTITATIVA DO ÓLEO ESSENCIAL (OE) Folhas de O. porosa foram coletadas, selecionadas e padronizadas para obtenção do material vegetal. Em seguida, foi seco em estufa com ventilação, à temperatura de 35º e cortados em pequenos pedaços (~ 1 cm). A extração foi realizada por meio de hidrodestilação, utilizando o aparelho de Clevenger (USP XXXVII, 2014) para essência menos densa, onde utilizou-se 300 gramas do material vegetal em 500 ml de água, com duração de 6 horas. Após esse tempo, a quantidade de OE obtida foi determinada através da medição em tubo graduado. O material obtido foi estocado em tubos Eppendorf, em temperatura de 4 ± 0,5ºC.
FIGURA 4 - Aparato de Clevenger utilizado na extração de óleo essencial de O. porosa.
Fonte: O autor, 2018
4.7 CARACTERIZAÇÃO QUÍMICA DO ÓLEO ESSENCIAL
As análises do OE de O. porosa foram realizadas utilizando um cromatógrafo Shimadzu GC-2010 Plus GC-EM/EM acoplado a um detector de massas tandem TQ8040 triplo tipo quadrupolo e um injetor automático AOC-5000 Plus para análise de amostras líquidas. A amostra foi diluída a 1% (v/v) em diclorometano e caracterizada usando as seguintes condições analíticas: coluna capilar de sílica fundida Rtx-5MS (5% difenil + 95% dimetilpolisiloxano (30 m x 0,25 mm x 0,25 μm). O gás utulizado foi o hélio com vazão de 1,02 mL min-1, em modo de divisão 1:90, o injetor a 250 °C e o sistema de ionização 70 eV. 1 µl de amostra foi injetado na seguinte rampa de aquecimento: temperatura inicial de 60 °C (0') a 250 °C, com aquecimento a 3 °C/min. Uma série homóloga de hidrocarbonetos saturados lineares, C8 a C19, foi usada para calcular o índice de retenção. O índice de retenção experimental foi calculado usando a equação de Van den Dool e Kratz (mostrada abaixo):
(1)
Cn é o número de átomos de carbono do n-alcano cujo tempo de retenção é imediatamente maior que o tempo de retenção do analito, Cn-1 é o número de átomos de carbono do n-alcano cujo tempo de retenção é imediatamente menor que o tempo de retenção Tx é o tempo de retenção do analito, Tn é o tempo de retenção do alcano Cn, Tn-1 é o tempo de retenção do alcano Cn-Tn-1.
Os componentes dos OEs foram identificados comparando os índices de retenção e espectros de massa com a literatura de Adams (2007) e os espectros de massa também foram comparados com a biblioteca de massa NIST 02 (NIST, Gaithersburg, EUA). A quantificação relativa foi determinada a partir da normalização da área dos picos com a área total do cromatograma, sem o uso de nenhum fator de correção. Essas análises foram realizadas na Universidade Federal do Paraná.
4.8 AVALIAÇÃO DAS ATIVIDADES BIOLÓGICAS 4.8.1 Atividade Citotóxica
4.8.1.1 Linhagens tumorais
Foram utilizadas células de melanoma murino (B16F10), carcinoma de mama humano (MCF-7) e a linhagem não tumoral de fibroblasto murino (McCoy) obtidas de culturas mantidas no laboratório da Universidade Estadual de Ponta Grossa, através de expansão contínua em meio RPMI® 1640 suplementado com 10% Soro Fetal Bovino (SFB) e antibióticos (penicilina e estreptamicina) em estufa a 37°C em uma atmosfera umidificada contendo 5% de CO2.
4.8.1.2 Ensaio de viabilidade com MTT
O método do MTT baseia-se na utilização de um corante, o brometo de 3-[4,5-Dimetiltiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazólio (MTT) para determinar a viabilidade celular por meio da atividade mitocondrial,majoritariamente pela hidrogenases. O MTT é um sal de tetrazólio, solúvel em água, o qual é convertido em um formazan púrpura insolúvel após a clivagem do anel de tetrazólio por desidrogenases mitocondriais (MOSMANN, 1983). As células McCoy, B16F10 e MCF7 (3 × 103/poço) foram plaqueadas 24 h antes da exposição ao OE de O.
porosa para a aderência, espalhamento e estabilização das mesmas na placa. Depois as células foram expostas a concentrações crescentes de OE (7700 µg/mL a 77 mg/mL) em meio RPMI, suplementado com 10% de soro fetal bovino e antibióticos por 72 h. Imediatamente antes do tratamento, as soluções contendo o óleo e o meio de cultivo eram submetidas a agitação vigorosa utilizando agitador do tipo “vortex” por pelo menos 1 min. Após período de tratamento o meio foi substituído por uma solução de MTT (0,5µg/µL) por 2 h a 37°C. Em seguida, a solução de MTT foi substituído por álcool isopropílico ácido (HCl
0,1M) para solubilização dos cristais de formazan e leitura da absorbância em 570 nm em leitor de microplacas. A densidade óptica obtida no grupo controle (células sem tratamento) foi considerada como equivalente a 100% de células viáveis e a viabilidade celular nos demais tratamentos foi calculada por regra de três. Portanto, quanto maior a densidade óptica obtida no ensaio, maior o número de células viáveis.
EQUAÇÃO 2 - Cálculo da porcentagem de viabilidade celular pelo método de redução do MTT.
(2) 4.8.1.3 Cálculo da Concentração inibitória mínima IC50
A concentração que inibe em 50% a viabilidade celular (IC50) foi calculada usando
programa GraphPad Prisma, versão 7.00 para Windows (GraphPad Software, La Jolla California USA, www.graphpad.com) seguindo tutorial fornecido pela GraphPad Software, Inc, acessado em 19 de maio de2018. (https://www.graphpad.com/support/faq/how-to-determine-an-icsub50sub/).
4.8.1.4 Cálculo do índice de seletividade
O índice de seletividade (IS) do OE foi definido pela razão da IC50 do composto
entre as linhagens não-tumoral (McCoy) e as tumorais (MCF-7 e B16F10) conforme Equação 3:
IS = IC50 (CÉLULA NÃO TUMORAL) / IC50 (CÉLULA TUMORAL)
(3) 4.8.2 Atividade Antioxidante
4.8.2.1 Método da redução do radical 2,2-difenil-1-picril-hidrazila (DPPH)
A atividade antioxidante dos OEs foi realizada de acordo com o protocolo descrito por Yamaguchi et al. (1998). Foram preparadas diferentes concentrações (35, 30, 25, 20, 15, 10,
5, 1 e 0,5 mg/mL) dos OEs em metanol. Esse solvente também foi empregado na obtenção das diluições seriadas dos controles positivos: ácido ascórbico e ácido gálico (1000 a 0,387 µg/mL) e na obtenção da solução de DPPH (0,1mM).
Em microplacas de 96 poços foram transferidos 20 µL das soluções de OEs de O. porosa bem como dos controles positivos e do branco (metanol) e 100 µL da solução de DPPH. As placas foram homogeneizadas durante 1 min e a leitura foi realizada após 30 min de incubação no escuro à temperatura ambiente em leitor de microplacas (Biotek Instruments, Winooski, VT, EUA) no comprimento de onda de 517 nm.
A atividade antioxidante (AA) foi determinada sob a forma de porcentagem e calculada pela taxa de declínio da absorvância da solução de DPPH com o OE ou padrões, após 30 min de reação, em relação à solução de referência (DPPH em metanol), de acordo com a equação 04:
%AA= 100-[(A amostra - A branco / A controle) x 100)]
(4) Onde, A é o valor de cada absorbância. A partir da porcentagem da atividade antioxidante obtida para cada concentração de óleo essencial foi construído um gráfico. A equação da reta obtida foi utilizada para o cálculo do IC50, substituindo o valor de Y por 50%.
O valor de IC50 encontrado representa a concentração da amostra com capacidade de reduzir
50% da concentração de DPPH adotada.
4.8.2.2 Método Redução pelo complexo de fosfomolibdênio.
O método de redução do complexo fosfomolibdênio foi utilizado para determinar a capacidade antioxidante total. Uma alíquota de 300 µL de OE em uma solução de etanol a 200 µg/mL foi adicionada a um tubo de ensaio, juntamente com 3 mL do reagente (4 mmol/Molibdato de amônio L, fosfato de sódio a 28 mmol/L e ácido sulfúrico a 0,6 mol/L). O tubo foi selado e transferido para um banho de até a 95 °C durante 90 min. O tubo foi arrefecido e a leitura foi realizada utilizando um espectrofotómetro modelo UV/Vis Shimadzu1601-695 nm a 695 nm contra um branco (a 300 µL de etanol foram adicionados 3 mL de reagente) em triplicado. Para fins de cálculo, o ácido ascórbico foi considerado como
100% de atividade antioxidante, de acordo com a Equação 5:
% AA = (Abs. amostra – Abs. branco / Abs. ácido ascórbico - Abs. branco) × 100 ( 5)
4.8.3 Atividades inseticidas
4.8.3.1 Criação dos insetos
As cepas dos insetos (Cimex lectularius) (Bayonne 'Resistente a inseticidas' e Ft. Dix 'Susceptível') foram fornecidas pelo Dr. Changlu Wang, Departamento de Entomologia, Universidade Rutgers, New Brunswick, NJ e foram criadas em massa no National Center of Natural Products Research, Oxford, Mississippi. Os insetos foram alimentados em frascos de vidro transparente de 473 mL, contendo papel-toalha (papel 92 - padrão multiuso) como abrigos. Os frascos foram cobertos com pano de malha fina para ventilação e foram mantidos no lugar com um elástico (Campbell e Miller, 2015). Os frascos foram mantidos em uma câmara de crescimento a 26°C e 60% de umidade relativa com um fotoperíodo de 13:11 h claro/escuro. Os insetos foram alimentados com sangue de coelho desfibrinado (Hemostat, CA) semanalmente.
Os insetos foram alimentados de acordo com o método descrito por Montes et al. (2002). Alimentadores de sangue (CG-1836-75 ChemGlass, NJ) foram ligados a um banho de água utilizando tubos de látex e um pedaço de membrana de parafilme "M" foi esticado ao longo do fundo do alimentador. Colocou-se uma quantidade de 5 mL de sangue de coelho desfibrinado (Hemostat) no centro oco do material de vidro e reuniu-se no parafilme. O parafilme forneceu uma barreira para o inseto se alimentar. O banho de água foi ajustado para circular e aquecer o sangue a 37°C. Os insetos deitaram após a alimentação e os frascos foram removidos.
4.8.3.2 Bioensaio tópico
Estudos inseticidas com o OE de O. porosa foram conduzidos de acordo com o procedimento descrito por Romero et al. (2009). Os insetos adultos foram separados usando uma pinça de peso pena nas placas de Petri. Os insetos foram anestesiados com CO2 e 1 mL
um dispensador de repetição de mão (Hamilton Co., Reno, NV) equipado com uma seringa de vidro de 50 mL (Hamilton Co). Insetos controle receberam apenas 1 mL de acetona. Após o tratamento, os insetos foram transferidos para os frascos de vidro transparente de 20 mL contendo tira de papel (padrão 92 - papel multiuso) e mantidos na câmara de crescimento. Os dados para a mortalidade dos insetos foram registados aos 1, 2, 3, 5 e 7 dias após o tratamento. Os insetos foram considerados mortos quando nenhuma parte do corpo se moveu, após serem tocados com uma agulha. Ocorreram 3 repetições com 10 insetos (ambos os sexos)/réplica. Quatro doses foram utilizadas, 125, 50, 25 e 12,5 μg EO/inseto e a deltametrina foi usada como inseticida padrão.
4.8.3.3 Bioensaio residual
Estudos residuais foram feitos usando o método de papel filtro em uma placa de Petri, conforme descrito por Campbell e Miller (2015) após pequenas modificações. Um disco de papel de filtro de 20 cm2 (Whatman # 1) foi tratado com uma alíquota de 100 μL de cada concentração de tratamento (25, 50 e 100 μg EO/cm2) usando pipeta. A alíquota de 100
μL de tratamento cobriu completamente o papel de filtro. Os papéis de filtro tratados, foram então colocados na placa de Petri (50 mm x 9 mm, Falcon). Os tratamentos de controle receberam apenas acetona. Dez insetos adultos foram liberados no papel de filtro e a mortalidade foi registrada durante 7 dias como mencionado anteriormente. Foram utilizadas 3 repetições com 10 insetos/replicação. A deltametrina foi usada como padrão.
4.8.3.4 Bioensaio de fumigação
Os insetos foram submetidos à toxicidade por vapor em frascos de vidro transparente de 125 mL. Um pequeno pedaço de papel foi colocado no fundo da jarra para fornecer um substrato para os insetos descansarem durante os testes com o óleo essencial de O. porosa. Bed bugs foram introduzidas nos frascos 2-4 h antes do tratamento para se aclimatarem. Uma solução de tratamento ou alíquota de acetona de 2 μL foi depositada diretamente na superfície interna da parede lateral da garrafa a 4 cm do fundo da garrafa usando uma seringa a 50 μL à prova de gás (Hamilton Company, Reno, NV) acoplada a um PB600, Reno, NV) repetindo dispensa. Cinco concentrações: 15,6, 31,25, 62,5, 125 e 250 μg EO/125 cm2 foram testadas contra os insetos. Os frascos foram colocados na câmara de
crescimento e os dados para mortalidade foram registrados 24 h após o tratamento. O 2,2-diclorovinil-dimetilfosfato (DDVP) foi usado como padrão.
4.8.4 Atividade antimicrobiana
4.8.4.1 Método da microdiluição em caldo
Para a análise da atividade antimicrobiana foram utilizadas cepas bacterianas de Staphylococcus aureus ATCC® 25923, Escherichia coli ATCC® 25922 e o fungo Candida albicans ATCC® 10231. Para as bactérias foi utilizado caldo BHI (brainheartinfusion) e para o fungo caldo Sabouraud. O teste de microdiluição foi realizado em placas de 96 poços de acordo com o protocolo M7-A6 do NCCLS (2004) adaptado. Em um tubo estéril, foram adicionados o óleo essencial e o caldo na proporção 1:1 e 15% de polisorbato 80. Foram realizadas diluições seriadas para obtenção das concentrações de 0,035 g/100 µL, 0,0175 g/100 µL; 0,00875 g/100 µL; 0,004375 g/100 µL; 0,0021875 g/100 µL. Em seguida, foram adicionados 10 µL da suspensão de micro-organismos inoculada em salina contendo aproximadamente 1 x 105 UFC/mL. As placas foram incubadas a 35 ºC por 24 h. Para confirmação de microrganismos viáveis em concentrações não inibitórias, foram utilizados 15 µL do corante TCC (2,3,5cloreto de trifeniltetrazólio) a 1% e aguardado 30 min em estufa a 35 ºC.
4 ANÁLISE ESTATÍSTICA
A viabilidade celular foi analisada por estatística descritiva, sendo que a barra representa a média ± o erro padrão da média de 3 experimentos diferentes realizados em quadruplicata. ANOVA de uma via e pós teste de Tukey. Foi considerado significativo p<0,05. A concentração que inibe em 50% a viabilidade celular (IC50) foi calculada usando
programa GraphPad Prisma, versão 7.00 para Windows (GraphPad Software, La Jolla California USA, www.graphpad.com), pela aplicação do teste de normalidade.
Para o teste inseticida, as médias de tratamento da toxicidade por vapor foram comparadas usando análise de variância de dois fatores (ANOVA) e separadas pela diferença honesta significativa de Tukey (HSD). Os valores de IC50 e IC90 foram calculados usando a
6 RESULTADOS E DISCUSSÃO
6.1 ESTUDOS ANATÔMICOS
Ocotea porosa (Nees & Mart.) Barroso (Fig. 5a, b) apresenta domácias nas folhas, frequentemente localizadas na junção da nervura mediana com as veias secundárias (Fig. 5d). Esta característica foi encontrada em várias espécies de Ocotea, como Ocotea urbaniana Mez, Ocotea pulchella (Nees & Mart.) Mez, Ocotea tristis (Nees & Mart.) Mez, Ocotea catharinensis Mez (SANTOS et al., 1995).
Em vista frontal, a epiderme foliar revela paredes anticlinais retas na face adaxial e onduladas na face abaxial (Figs. 5c, e). Essa característica foi encontrada em Ocotea puberula (Rich.) Nees (FARAGO et al., 2005). Entretanto, O. indecora (Schott) Mez apresentou paredes anticlinais sinuosas em ambas as faces (GONÇALVES et al., 2018), enquanto O. gardneri (Meisn.) Mez. evidenciou paredes anticlinais retas (COUTINHO et al., 2006). Esta característica mostra-se importante para distinguir as espécies de Ocotea.
Ceras epicuticulares foram encontradas na epiderme, especialmente nos estômatos (Fig. 5g, h). Os estômatos são do tipo paracítico e anomocítico (Fig. 5e) e as folhas são hipoestomáticas, como também relatadas para várias outras espécies de Ocotea (TOLEDO et al., 2000; FARAGO et al., 2005; COUTINHO et al., 2006; GONÇALVES et al., 2018). Os estômatos medem 29 µm de comprimento e 23 µm de largura, em média e o índice de estômatos é 16,43 na face abaxial.
Ocotea porosa mostra tricomas tectores unicelulares simples em ambas as superfícies, sendo raros na face adaxial (Fig. 5f, g). Tricomas semelhantes foram relatados para O. puberula (FARAGO et al., 2005), O. indecora (GONÇALVES et al., 2018). Apesar de essa característica ser comum em espécies de Lauraceae (GONÇALVES et al., 2018), O. gardneri apresentou folhas glabras (COUTINHO et al., 2006).
FIGURA 5 – Morfoanatomia de Ocotea porosa (Nees & Mart.) Barroso.
[c, e: Microscopia de luz; d, f, g, h: FESEM]. a. Planta no hábito. b. Folhas. c-h. Folha vista da superfície (c. Adaxial, e-h. Abaxial). [gl - domácia de glândulas, st - estômatos, nt - tricoma tector, wa – ceras epicuticulares]. Barra: a = 35 cm; b = 4 cm d = 1 mm; f = 100 µm, c, e = 50 µm; g = 20 µm; h = 5 µm; = 2 µm.
Fonte: Autor, 2018.
Em seção transversal, a epiderme foliar é unisseriada (Fig. 6a, b) e coberta por uma cutícula fina e lisa que reagiu com Sudam III. As
Células secretoras com forma de esférica a oblonga (Fig. 6b) e células epidérmicas contêm compostos fenólicos que reagiram positivamente nos testes histoquímicos. A folha é dorsiventral e é formada por 2 camadas de parênquima paliçádico e 5-6 camadas de parênquima esponjoso (Fig. 6b, c). Os feixes vasculares colaterais de pequeno porte atravessam a região do mesofilo e são circundados por bainha esclerenquimatosa que apresenta extensões que alcançam ambas as faces da epiderme (Fig. 6b). O mesofilo dorsiventral é frequente na família Lauraceae (METCALFE E CHALK, 1972). Entretanto, mesofilo isobilateral foi encontrado em O. gardneri (COUTINHO et al., 2006).
A borda da lâmina é ligeiramente curva. A epiderme possui células de formato irregular e recobertas por cutícula espessa. Abaixo da epiderme são encontradas muitas camadas de células esclerenquimáticas (Fig. 6a). Essas mesmas características foram observadas em O. gardneri (COUTINHO et al., 2006).
Cavidades secretoras com conteúdo lipofílico amarelo-claro reagiram com o Sudan III no teste histoquímico (Fig. 6a). Essas são encontradas no mesofilo, especialmente na face adaxial, bem como na nervura central. Células secretoras foram amplamente relatadas para espécies de Ocotea (TOLEDO et al., 2000; FARAGO et al., 2005; COUTINHO et al., 2006; GONÇALVES et al., 2018).
FIGURA 6 - Secções transversais (TS) de Ocotea porosa – Folha e caule.
[a-i: Microscopia de luz; j, k: FESEM]. a. TS da borda da folha; b. TS da lâmina; c. TS da nervura central e da lâmina; d e e. TS do pecíolo; f-k. TS do caule. [co - colênquima, cr - cristais, cs - camada subepidérmica, ct - cutícula, cx - córtex, ep - epiderme, fi - fibras, nt - tricoma tector, pc - compostos fenólicos, sc - células secretoras, sg - grãos amido, ph - floema, pp - parênquima paliçádico, pi -medula, sp - parênquima esponjoso, vb - feixe vascular, xy - xilema]. Barra: c, d, f = 200 μm; a, b, e, g, h, i = 50 μm; k = 10 μm; j = 5 μm.
Fonte: Autor, 2018.
Em secção transversal da folha, a nervura central é biconvexa (Fig. 6c). Essa característica foi observada em O. odorifera (Vell.) Rohwer (TOLEDO et al., 2000), O. puberula (FARAGO et al., 2005), O. indecora (GONÇALVES et al., 2018) e O. gardneri
