Estudo histológico da lesão
medular experimental em ratos
LUIZ ROBERTO GOMES VIALLE1, SERGEI FISCHER2, JÚLIO CÉSAR MARCON2,
EMILIANO VIALLE3, RICHARD LUZZI3, LUIZ FERNANDO BLEGGI-TORRES4
1. Chefe do Serv. de Ortop. e Traumatol. do Hosp. Universit. Cajuru, Pont. Univ. Catól. do Paraná.
2. Médico do Grupo de Coluna do HUC, PUC-PR. 3. Médico Residente do HUC, PUC-PR.
4. Professor do Mestrado em Trauma da PUC-PR.
Endereço para correspondência: Luiz Roberto Gomes Vialle, Rua Padre
Agostinho, 246, ap. 701 – 80410-020 – Curitiba, PR – Brasil. Tel/fax: (041) 223-7063. e-mail: vialle@uol.com.br
RESUMO
No estudo das possibilidades de tratamento das lesões medulares traumáticas, é fundamental a reprodução se-riada de lesões com o mesmo tipo de trauma medular e com áreas danificadas com volumes de necrose tecidual idênticos. Este trabalho visa a instalação, em hospital uni-versitário, de um sistema de estudo de lesão medular expe-rimental em animal de pequeno porte. Foi utilizado um método de contusão por impacção, com um aparelho espe-cialmente desenvolvido pela Universidade de Nova York. Os objetivos foram: conseguir o adequado funcionamento do aparelho e de seu software, para produzir uma lesão medular; padronizar a lesão medular conseguida com iguais parâmetros de impacção; avaliar as alterações his-tológicas decorrentes da lesão medular em sua fase inicial.
Unitermos – Trauma raquimedular; lesão medular experimental;
ratos SUMMARY
Histologic study of experimental spinal cord lesion in rats During the study of the possibilities of treatment of trau-matic spinal cord injuries, it is fundamental to produce sever-al lesions with the same amount of spinsever-al cord trauma and with the same amount of necrotic tissue in the lesion sites. This study aims at describing the process of installing, in this department, a system for creating experimental spinal cord
injuries in low weight animals. A method of contusion by im-pacting was applied, using a device developed by the New York University specially for this department. The goals were: – obtaining proper function from the device and its software, to produce a spinal cord injury – achieving a standard lesion with similar impacting parameters – Evaluating the histolog-ical changes secondary to the spinal cord lesion.
Key words – Spinal cord trauma; experimental spinal cord lesion; rats
INTRODUÇÃO
A lesão medular traumática (LMT) é uma das mais devas-tadoras entre as lesões que podem afetar o ser humano. Seu registro remonta à própria história da medicina.
Este projeto persegue quatro objetivos bem definidos: 1) Instalação de um sistema de estudo de lesões medulares em animais de pequeno porte, com o estabelecimento de um modelo da fase aguda do trauma medular. Isso será consegui-do com a montagem e o funcionamento adequaconsegui-do de um apa-relho para produzir impacto na medula exposta cirurgicamen-te, sem seccioná-la.
2) Em segundo lugar, vem a padronização do dano medu-lar. Impactos de altura e velocidade estabelecidos previamente deverão produzir volumes constantes de área medular lesada. Cada parâmetro experimentado deverá ser reprodutível, sem-pre com resultados idênticos.
3) O terceiro objetivo é instalar um laboratório de estudos de lesões medulares, com reprodução e produção original de pesquisas que possam despertar, no nosso meio, o interesse de jovens pesquisadores. Funcionará dentro de um hospital universitário, fornecendo a estudantes e médicos residentes elementos de iniciação à pesquisa científica nessa área, que inexiste atualmente. Mais do que descobertas eventuais, que até poderão acontecer, esse é um dos principais objetivos que nos movem.
4) Finalmente, uma vez aprovado o modelo, o laboratório tentará participar de estudos multicêntricos. Cerca de 40 apa-relhos iguais a esse foram destinados a universidades que tra-balham sob coordenação única. Esse aparelho foi especial-mente produzido para nós e é o primeiro enviado à América Latina, estando também disponível atualmente no Instituto de Ortopedia e Traumatologia do Hospital das Clínicas da Fa-culdade de Medicina da Universidade de São Paulo.
À medida que nossos testes forem homologados, o labora-tório estará apto a completar ou participar de experiências si-multâneas.
Este estudo consiste da avaliação histológica da lesão me-dular, analisando a progressão das alterações secundárias ao trauma por um período de 48 horas.
MATERIAL E MÉTODOS
A lesão medular é feita através de um aparelho denomina-do Impactor, que consiste de um aparato para posicionamen-to do raposicionamen-to e para lesão medular, conectado a uma placa de computador, no qual um programa específico analisa diversas variáveis (velocidade e intensidade da lesão, deslocamento da coluna vertebral), a fim de obter uma lesão padronizada.
Os experimentos deverão ser realizados preferencialmente em ratos do tipo Long-Evan, obtidos de uma única fonte, com 77 ± 2 dias, e com pesos de 240 ± 40g (fêmeas) e 360 ± 40g (machos). São mantidos em jejum a partir da noite que ante-cede a cirurgia. Para climatização, os animais devem ser obti-dos uma semana antes do experimento e deve-se ter certeza de que não tenham doenças. Se houver necessidade de manter mais de um animal após a cirurgia, deve-se procurar conser-var companheiros de gaiola e familiares juntos, pelo risco de luta entre ratos estranhos.
Para a realização da lesão medular é feita anestesia intrape-ritoneal com pentobarbital (35-55mg/kg para fêmeas e 55-75mg/kg para machos). Recomenda-se que seja administrada a dose mínima e, se não houver anestesia após cinco minutos, deve-se complementá-la. Essa dose deve anestesiar o animal por duas horas. Não se aconselha administração de doses ex-tras. Caso a anestesia se torne excessivamente superficial du-rante o procedimento, pode-se complementar a dose e contar a partir desse momento o período de uma hora que precede a lesão medular.
Deve-se cateterizar a veia jugular externa com cateteres de silicone, que precisam ser armazenados em solução de álcool a 75% para assegurar esterilidade. Devem ser lavados com solução salina estéril e instalados na veia jugular externa di-reita (lateral à jugular interna, menor).
A artéria caudal do rato deve ser canulada para monitori-zação de pressão sanguínea e gasometria. Um cateter de po-lietileno com 5cm de comprimento deve ser esticado manual-mente para criar uma ponta de menor diâmetro, o que facili-ta a inserção na artéria. O cateter deve ser conecfacili-tado a uma seringa de 1ml com um conector de três vias, sendo a 3ª via usada para o transdutor de pressão.
Em seguida, expõe-se a medula espinhal a fim de realizar a lesão experimental. Incisa-se a pele na linha média dorsal, expondo a coluna vertebral entre T8-12. Os músculos que se inserem ao nível de T10-11 devem ser dissecados, usando coagulação bipolar para estancar sangramentos, se necessá-rio. Os processos dorsais de T9-10 são removidos com mi-crossaca-bocados, sem lesar T8 ou a medula espinhal. A aber-tura deve acomodar a “cabeça” do Impactor com um espaço lateral superior a 2cm.
A lesão medular será feita através do Impactor. Entre as lesões, a ponta do Impactor deve ficar imersa em solução sa-lina isotônica e, logo antes de realizar a lesão, ser limpa com álcool a 95%.
O rato é posicionado sobre uma esponja no aparelho, com clampeamento dos processos dorsais de T8 e T11 (figura 1). O Impactor é preparado na posição zero, um fio de terra é ligado à ferida e o cateter arterial é lavado com SSI. O Impac-tor deve ser centrado entre o fim de T9 e o início de T10. Os
Fig. 1 Animal posicionado para lesão medular no sistema Impactor NYU
Fig. 2 – Fotomicrografia da medula normal: corpo neuronal com tamanho normal (HE x1000)
Fig. 3 – Fotomicrografia da medula 6 horas após a lesão: redução volumé-trica do corpo neuronal (HE x1000)
devidos ajustes devem ser feitos no aparelho e no programa de computador.
Uma vez ajustado o programa, a ponta do Impactor é libe-rada e causará a lesão. O rato deve ser então levado para um lugar aquecido, a fim de que se inspecione o local da lesão e seja feita hemostasia. O local deve ser lavado com SSI, segui-do de sutura por planos (muscular e pele).
Os ratos são então mantidos numa câmara com temperatu-ra constante por 48 hotemperatu-ras, recebendo medicação ou placebo por via endovenosa, conforme o protocolo estabelecido. Re-comenda-se que a bexiga seja esvaziada, mas não completa-mente, 5-6 horas após a lesão e após 24 horas; após esse pe-ríodo deve-se coletar amostra de urina (1-2ml), para dosagem de sódio e potássio, além de controle da excreção de medica-mentos administrados ao rato. Os ratos são sacrificados se-qüencialmente após a lesão e em intervalos de seis horas, até
que se completem 48 horas, a fim de avaliar a progressão dos eventos após a lesão medular.
Os ratos são pesados, a bexiga é espremida, sendo o volu-me volu-mensurado e 1ml armazenado para dosagem de sódio e potássio. Após anestesia com pentobarbital 50-60mg/kg EV ou intraperitoneal, o rato é decapitado e exsanguinado, cole-tando-se sangue num tubo de centrífuga heparinizado. Uma pequena porção do sangue deve ser transferida para uma mi-cropipeta para mensuração de hematócrito. O sangue deve ser centrifugado e 1ml de plasma armazenado a –70ºC. Devem ser avaliadas alterações macroscópicas, com foco em cistite/ cistite hemorrágica; infarto renal, hepático, cardíaco visíveis; infecção nos locais operados; hemorragia na cavidade abdo-minal; edema pulmonar.
Deve-se remover a coluna vertebral de C5 a L5, retirando o máximo de músculo; esta deve ser colocada num tubo (de cen-Fig. 4 – Fotomicrografia da medula 24 horas após a lesão: corpos
neuro-nais com volume bastante reduzido (HE x1000)
Fig. 5 – Fotomicrografia da medula 48 horas após a lesão: intensa degene-ração e vacuolização neuronal (HE x1000)
trífuga) e este é selado e rotulado. As peças passam então por um processo de descalcificação, para depois ser emblocadas em parafina e coradas com hematoxilina-eosina (HE) e luxol-fast-blue (LFB), para avaliação histológica.
RESULTADOS
Após diversas dificuldades técnicas, o modelo de lesão me-dular experimental foi reproduzido com sucesso. Uma lesão medular padronizada foi obtida, nenhum dos ratos foi a óbito ou apresentou sinais de infecção nas 48 horas após o experi-mento.
Foram também estudados os efeitos da progressão da área de necrose secundária, com estudos histológicos de medulas lesadas em condições idênticas, mas analisadas em diferentes prazos pós-impacção. Isso comprovou a ocorrência de altera-ções progressivas, já não dependentes do impacto inicial.
A figura 2 mostra a imagem de uma medula normal, não contundida, nas colorações com hematoxilina-eosina (HE), em que os corpos neuronais apresentam tamanho e coloração normais.
A figura 3 foi obtida de cortes de medula de rato sacrifica-do após seis horas sacrifica-do trauma e mostram redução volumétrica dos neurônios e alteração em sua coloração, agora mais clara, com menos impregnação pelo corante.
A figura 4, de medula com 24 horas pós-lesão, identifica neurônios bastante reduzidos e mostra indícios de vacuoliza-ção intraneuronal.
A figura 5, obtida após 48 horas do trauma, revela maior vacuolização da área lesada, ausência de neurônios corados e intensa degeneração neuronal.
Outros cortes histológicos foram obtidos após 48 horas do trauma, do segmento medular imediatamente distal à lesão; mostram o tecido absolutamente normal, comprovando que as lesões mostradas nas figuras anteriores, das áreas lesadas, são realmente produzidas pela impacção e não por qualquer outro fenômeno. São essas lesões progressivas, chamadas de dano neurológico secundário ao trauma, que as pesquisas pro-curam estudar e, pela melhor compreensão das alterações fi-siopatológicas, buscar tratamentos que interrompam o pro-cesso ou que possam revertê-lo.
DISCUSSÃO
Conseqüência direta do trauma, a LMT atinge principal-mente uma faixa etária mais exposta a acidentes, em geral também a mais produtiva. Cerca de 60% dos casos de LMT ocorrem em pessoas entre 16 e 30 anos de idade, mas a média
está aumentando com o crescimento da longevidade do ser humano, chegando aos 33 anos nesta última década.
Devido às peculiaridades econômicas brasileiras, é difícil obter dados estatísticos precisos a respeito da LMT, sendo as estimativas baseadas nas informações provenientes dos paí-ses desenvolvidos.
Nos Estados Unidos, existe desde 1937 o National Spinal Cord Injury Database, que registra informações oriundas de 21 centros federais de atendimento a pacientes com lesão medular.
Por seus dados, estima-se que a incidência anual de lesão medular traumática (LMT) está entre 30 e 40 casos novos por milhão de habitantes. Para uma população em torno de 158.000.000 de habitantes, poderíamos imaginar cerca de 6.000 casos anuais no Brasil.
A prevalência é estimada em torno de 700 casos por milhão de habitantes, o que daria uma população de 100.000 pessoas convivendo com esse problema em nosso país.
Em Curitiba, dados obtidos pelo Grupo Integrado de Apoio ao Paraplégico-Giapa, do Hospital Universitário Cajuru, mos-tram que em 119 de 240 casos nos quais foi possível determi-nar a causa de LMT, 42% foram vítimas de acidente de trânsi-to e 27% de violências que incluíam variadas formas de agres-são.
O custo econômico e social para o atendimento desse volu-me de pessoas é assombroso, pois soma o atendivolu-mento médi-co-hospitalar de urgência ao período de reabilitação.
É universal a aceitação de dois tipos de lesão que produ-zem o dano neurológico. O primeiro, produzido pelo trauma em si, com morte celular e liberação de eletrólitos, metabóli-tos e enzimas; esse é um processo mecânico, que independe do controle celular. O segundo surge como uma cascata de fenômenos, envolvendo edema, inflamação, isquemia, re-perfusão, fatores de crescimento, metabolismo do cálcio e peroxidase lipídica; essa forma particular de morte celular, apoptose, tem sido alvo de esforços científicos no sentido de obter seu controle.
Admite-se que o melhor animal para essas experiências se-ja o rato e que a única forma de comparar resultados é a partir de lesões padronizadas e em grande volume de espécimes.
Esses métodos de comprovada precisão, quando instalados, além de diminuir o número de animais sacrificados nos estu-dos, permitem a análise mais adequada dos parâmetros envol-vidos na produção da lesão e em sua preparação.
As lesões medulares experimentais abertas, isto é, com ex-posição da medula, são as que criam as melhores condições para estudo. As lesões fechadas produzem um sem-número
de fraturas cujos fragmentos alteram o curso natural que se pretende estudar.
A medula exposta diretamente pode ser seccionada ou con-tundida. A contusão reproduz com maior fidelidade as situa-ções reais provocadas por traumas que ocorrem com o ser humano. Além disso, a secção pode implicar alterações liquó-ricas que dificultam a sobrevivência do animal.
A padronização do método de contusão medular torna-se de evidente necessidade, quando se consulta a literatura sobre o tema. Nas publicações modernas ou atuais são poucos os relatos especificamente sobre detalhes técnicos do método utilizado para produzir a lesão e as explicações são em geral breves.
CONCLUSÕES
As possibilidades de estudo no campo da lesão medular são amplas. Esse modelo experimental mostrou-se aplicável em nosso meio, sem necessidade de grandes alterações à es-trutura de pesquisa já existente na maioria de nossas univer-sidades.
Este esforço permite-nos realizar um intercâmbio com ou-tros cenou-tros de pesquisa em lesão medular, facilitando o de-senvolvimento da pesquisa básica em nosso meio e futuras contribuições à comunidade científica.
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