UNIVERSIDADE FEDERAL DE UBERLÂNDIA
Instituto de Ciências Biomédicas
Programa de Pós Graduação em Imunologia e Parasitologia Aplicadas
REATIVIDADE DE ANTICORPOS A FRAÇÕES ANTIGÊNICAS DE
Strongyloides venezuelensis NO DIAGNÓSTICO DIFERENCIAL DA
ESTRONGILOIDÍASE HUMANA
Henrique Tomaz Gonzaga
Uberlândia 2011
UNIVERSIDADE FEDERAL DE UBERLÂNDIA
Instituto de Ciências Biomédicas
Programa de Pós Graduação em Imunologia e Parasitologia Aplicadas
REATIVIDADE DE ANTICORPOS A FRAÇÕES ANTIGÊNICAS DE
Strongyloides venezuelensis NO DIAGNÓSTICO DIFERENCIAL DA
ESTRONGILOIDÍASE HUMANA
Dissertação apresentada ao Colegiado do Programa de Pós Graduação em Imunologia e Parasitologia Aplicadas como parte de obtenção do título de Mestre.
Henrique Tomaz Gonzaga
Profa. Dra. Julia Maria Costa Cruz
Orientadora
Prof. Dr. Jair Pereira da Cunha Junior
Coorientador
Uberlândia 2011
“Deus é a evidência invisível.”
Victor Hugo
“A ciência é uma coisa maravilhosa se você não depende dela para viver.”
A Deus, por me conduzir pelos caminhos da vida e conceder mais essa vitória.
À memória de meu pai, Reinaldo
Gonzaga e à minha mãe, Maria Helena Tomaz Gonzaga, verdadeiros
amigos que não mediram esforços para que eu chegasse a mais esta etapa da vida.
Ao meu irmão Humberto Tomaz
Gonzaga, pelo companheirismo.
À Priscila Silva Franco, pelo carinho, incentivo e muita compreensão.
Agradecimentos
À minha família pelo apoio e torcida em todos os momentos de minha vida.
À Profa. Dra. Julia Maria Costa-Cruz pela orientação e por acreditar no meu trabalho. Muito obrigado!
Ao Prof. Dr. Jair Pereira da Cunha Júnior pelo exemplo de profissionalismo e coorientação nas etapas essenciais da definição e discussão dos experimentos.
À Ms. Vanessa da Silva Ribeiro pelo exemplo de disciplina no trabalho, dedicação e disponibilidade integral.
À Ms. Marianna Nascimento Manhani por compartilhar a ideia de investigar a avidez na estrongiloidíase humana.
À Profa. Dra. Deise Aparecida de Oliveira Silva pela competência e colaboração no delineamento e análise dos experimentos de avidez.
À Profa. Dra. Marlene Tiduko Ueta, Universidade Estadual de Campinas, por ter cedido a cepa de
Strongyloides venezuelensis.
Aos Professores Dr. Cláudio Vieira da Silva, Dra. Denise Von Dolinger de Brito, Dra. Michele Aparecida Ribeiro de Freitas, Dra. Heliana Batista Oliveira, Dra. Fabiana Martins de Paula por aceitarem o pedido de avaliação dessa dissertação nas bancas de qualificação e defesa e pelas valiosas contribuições.
A todos os Professores da Pós-Graduação pelo ensino.
Aos colegas alunos dos Laboratórios de Imunologia, Histologia, Genética e Bioquímica pela disponibilidade em auxiliar e ensinar o uso de equipamentos. Só assim conseguimos prosseguir! Aos funcionários do Laboratório de Parasitologia e de Imunologia, em especial Maria do Rosário de Fátima Gonçalves Pires, Maria das Graças Marçal e Edilge Gouvêa pela paciência e disposição que sempre demonstraram.
Aos colegas da turma de mestrado por enfrentarem as mesmas situações com experimentos e seminários: Ester Cristina Borges Araujo, Mariana de Resende Damas Cardoso e Silas Silva Santana.
Aos colegas do Laboratório de Diagnóstico de Parasitoses, Nágilla Daliane Feliciano, Daniela da Silva Nunes e Ana Lúcia Ribeiro Gonçalves por partilharem da rotina de trabalho.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) e Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico Tecnológico (CNPq) pela publicação da portaria conjunta, n°1, de 15 de julho de 2010, que permite o recebimento de bolsa por alunos de pós-graduação, dedicados às atividades de sua área de formação, especialmente quando se tratar de docência como professores em qualquer nível de ensino.
À CAPES, CNPq e FAPEMIG pelo apoio financeiro para produtos e equipamentos.
Aos que ficaram da 62ª turma de Ciências Biológicas da UFU pela amizade e momentos de convivência!
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO 12
1.1 Classificação e morfologia do gênero Strongyloides 12 1.2 Aspectos do ciclo biológico de S. stercoralis 14
1.3 Epidemiologia da estrongiloidíase humana 16
1.4 Sintomatologia 17
1.5 Resposta imune do hospedeiro 18
1.6 Diagnóstico da estrongiloidíase 20
1.6.1 Avidez de anticorpos em testes diagnósticos 23 1.7 Antígenos heterólogos no diagnóstico imunológico da estrongiloidíase humana 25
1.8 Composição proteica e fracionamento antigênico de glicoproteínas de S. venezuelensis 27
2. OBJETIVOS 31
3. MATERIAL E MÉTODOS 32
3.1 Aspectos éticos 32
3.2 Amostras de soro 32
3.2.1 Amostras para validação dos testes diagnósticos 32 3.3 Obtenção de larvas filarioides (L3) de S. venezuelensis 34
3.4 Métodos parasitológicos 35
3.4.1 Coprocultura pelo método de Looss 35
3.4.2 Técnica de Rugai, Mattos e Brisola e processamento das larvas recuperadas 35
3.5 Produção de extrato de S. venezuelensis 36
3.5.1 Extrato salino 36
3.6 Cromatografia dos extratos salino e alcalino de S. venezuelensis 37 3.6.1 Cromatografia em agarose-concanavalina-A do extrato salino 37 3.7 Análise do perfil eletroforético das amostras antigênicas 38 3.7.1 Gel de poliacrilamida com dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE) 38
3.8 Testes sorológicos 39
3.8.1 Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) 39 3.8.1.1 ELISA (ES, FNL Con-A e FL Con-A) para IgG e IgA anti-Strongyloides 39 3.8.1.2 ELISA avidez (ES) para IgG anti-Strongyloides 40
3.8.2 Immunoblot avidez 42
3.9 Análise estatística 44
3.10 Normas de biossegurança 45
4. RESULTADOS 46
4.1 Obtenção das frações de S. venezuelensis não ligante e ligante de Con-A 46 4.2 Detecção de IgG e IgA por ELISA com ES, FNL Con-A e FL Con-A 49 4.3 Avidez de anticorpos IgG anti-Strongyloides 55
5. DISCUSSÃO 63
5.1 Detecção de IgG e IgA por ELISA com ES, FNL Con-A e FL Con-A 63 5.2 Avidez de anticorpos IgG anti-Strongyloides 68
6. CONCLUSÃO 74
LISTA DE ABREVIATURAS
– ou + – alto decréscimo na intensidade de reconhecimento (baixa avidez)
+, ++ ou +++ – intensidade de reconhecimento: baixa, média ou alta, respectivamente ++ ou +++ – baixo decréscimo na intensidade de reconhecimento (alta avidez)
% porcento; porcentagem (a) – verdadeiro positivo (b) – falso positivo (c) – falso negativo (d) – verdadeiro negativo l – microlitro l – micrômetro °C – graus Celsius 1D – unidimensional
4x – objetiva acromática 4x de aumento AUC – area under curve; área sob a curva BOD – Biochemical Oxygen Demand C6H4(NH2)2 – o-fenilenodiamina
CaCl2 – cloreto de cálcio
CD4+ – cluster of differentiation; grupo de diferenciação CEP/UFU – Comitê de Ética em Pesquisa/UFU
CEUA/UFU – Comitê de Ética na Utilização de Animais Con-A – concanavalina-A
cut-off – limiar de reatividade; ponto abosluto/ótimo de corte DAB – diaminobenzidina
DO – densidade ótica
DOU- – densidade ótica dos poços não tratados com ureia
DOU+ – densidade ótica dos poços tratados com ureia
EDTA – ácido etilenodiamino tetra-acético
ELISA – enzyme-linked immunosorbent assay; ensaio imunoenzimático Es – especificidade
ES – extrato salino total de larvas filarioides de Strongyloides venezuelensis FL Con-A – fração ligante de ES obtida em coluna com Con-A
FNL Con-A – fração não ligante de ES obtida em coluna com Con-A g – gravidade
G1 – grupo com diagnóstico parasitológico positivo para Strongyloides stercoralis G2 – grupo infectados por outros parasitos intestinais
G3 – grupo controle de indivíduos saudáveis
G4 – grupo com sorologia positiva para estrongiloidíase e negativo nos exames coproparasitológicos.
H2O2 – peróxido de hidrogênio
H2SO4 – ácido sulfúrico
HCl – ácido clorídrico
HIV – human immunodeficiency virus; vírus da imunodeficiência humana IA – índice avidez
IE – índice ELISA Ig – imunoglobulina IL – interleucina kDa – kiloDalton
kHz – kilohertz
L1 – larva rabditoide de primeiro estádio L2 – larva rabditoide de segundo estádio L3 – larva filarioide de terceiro estádio L4 – larva de quarto estádio
LR – likelihood ratio; razão de verossimilhança M – molaridade mA – miliamperagem mg – miligrama MgCl2 – cloreto de magnésio mL – mililitro MM – massa molecular mm – milímetro mM – milimolar MnCl2 – cloreto de manganês N – normalidade NaCl – cloreto de sódio
ND – não detecção; não reconhecimento das bandas nm – nanômetro
p – nível de significância
PAMP – pathogen-associated molecular pattern; padrão molecular associado a patógenos PBS – phosphate buffered saline; solução salina tamponada de fosfato
PBS-T – PBS contendo Tween 20 a 0,05% PBS-TL – PBS-T acrescido de leite desnatado PBS-T-U – PBS-T acrescido de 6 M de ureia pH – potencial hidrogeniônico
PMSF – fluoreto de fenilmetilsulfonil PPP – período pré-patente
r – teste de correlação de Pearson
RIFI – reação de imunofluorescência indireta ROC – receiver operating characteristic curve
rs – coeficiente de correlação de postos de Spearman
SDS – dodecil sulfato de sódio
SDS-PAGE – eletroforese em gel de poliacrilamida com dodecil sulfato de sódio Se – sensibilidade
síndrome da
TA – temperatura ambiente TE – tampão de equilíbrio
TEL – tampão de estoque e lavagem
TG-ROC – two-graph receiver operating characteristic curve Th2 – linfócitos T helper 2
TNF – fator necrose tumoral
Tris – tris(hidroximetil)aminometano U– – amostras não tratadas com ureia U+ – amostras tratadas com ureia 6M
UNICAMP – Universidade Estadual de Campinas UFU – Universidade Federal de Uberlândia
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Intervalos da avidez de anticorpos IgG anti-Strongyloides. 47
Tabela 2. Padrão de avidez de IgG nas reações com antígenos de Strongyloides venezuelensis por ELISA e immunoblot.
51
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Perfil cromatográfico do extrato salino total de larvas filarioides de Strongyloides venezuelensis em coluna de afinidade agarose concanavalina-A
(Con-A).
36
Figura 2. Perfil eletroforético do extrato salino total de larvas filarioides de Strongyloides venezuelensis (ES), fração não ligante de Con-A (FNL Con-A) e
fração ligante de Con-A (FL Con-A).
37
Figura 3. Detecção de anticorpos IgG e IGA anti-Strongyloides em amostras de
soros de pacientes com estrongiloidíase, outras infecções parasitárias e indivíduos saudáveis por enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) utilizando ES, FNL Con-A e FL Con-A.
39
Figura 4. Curva ROC indicando o ponto ótimo da reação (cut-off), sensibilidade
(Se), especificidade (Es), área sob a curva (area under curve; AUC) e razão de verossimilhança (likelihood ratio; LR).
41
Figura 5. Correlação e associação entre níveis séricos de IgG e IgA para extrato ES
e frações Con-A.
43
Figura 6. Índice avidez (IA) obtido de ELISA avidez IgG Strongyloides-específica em
pacientes positivos em reações imunoenzimáticas com eliminação de larvas ou negativos nos exames coproparasitológicos.
45
Figura 7. Comparação entre índices avidez (IA) calculados no IA de triagem e IA
médio.
46
Figura 8. Análise da intensidade da reação no immunoblot avidez e identificação das bandas antigênicas presentes no ES.
48
Figura 9. Immunoblot avidez frente ao ES utilizando amostras de soro
representativas de casos discrepantes do ELISA avidez.
RESUMO
Strongyloides stercoralis, nematódeo parasita intestinal, é um dos responsáveis pelas
infecções parasitárias mais prevalentes em humanos. A detecção precoce previne o desenvolvimento das síndromes clínicas de hiperinfecção e disseminação. Na procura por marcadores de resposta imune na estrongiloidíase, as propriedades antigênicas de componentes glicosilados de Strongyloides e o desempenho da avidez de anticorpos IgG foram testados em imunoensaios. Considerando a importância do imunodiagnóstico da estrongiloidíase e a capacidade de ligação a carboidratos das lectinas, como concanavalina-A (Con-A), foram testados o extrato salino total de larvas filarioides de
Strongyloides venezuelensis (ES) e suas frações obtidas em coluna com Con-A: não ligante
(FNL Con-A) e ligante Con-A (FL Con-A) na detecção de imunoglobulinas (IgG e IgA). A determinação de avidez de IgG foi realizada para detectar pacientes com estrongiloidíase e caracterizar origens de discrepância entre sorologia e coproparasitologia. Sensibilidade (Se), especificidade (Es), area under curve (AUC), likelihood ratio (LR) e coeficientes de correlação foram calculados; a análise estatística foi feita pelos testes de Mann Whitney e exato de Fisher. FNL Con-A mostrou os melhores parâmetros diagnósticos para detecção de IgG (Se 95,0%, Es 92,5%, AUC 0,99, LR 12,7) e alta correlação (r = 0,700) com o ES. As frações não demonstraram claramente utilidade na detecção de IgA. Índice avidez (IA) foi calculado para cada amostra de soro considerando: (a) IA de triagem (diluição 1:160) e (b) IA médio a diferentes diluições. Para diferenciar os grupos nos IA de triagem e médio foi estabelecido limiar de 75% (p < 0,001). Immunoblot avidez foi auxiliar para a análise de casos discrepantes no ELISA e serviu como ferramenta complementar na identificação de antígenos responsáveis pela maturação da afinidade. Concluiu-se que FNL Con-A demonstrou conter fonte importante de peptídeos específicos eficientes na detecção de IgG no imunodiagnóstico da estrongiloidíase; e o ensaio de avidez de IgG distinguiu infecção ativa por S. stercoralis com eliminação de larvas dos casos suspeitos ou falso positivos.
Palavras-chave: estrongiloidíase; Strongyloides stercoralis; glicoproteínas; avidez;
ABSTRACT
ANTIBODIES REACTIVITY TO Strongyloides venezuelensis ANTIGENIC FRACTIONS IN HUMAN STRONGYLOIDIASIS DIFFERENTIAL DIAGNOSIS
Strongyloides stercoralis, a human intestinal nematode, causes one of the most common
worldwide parasitic infections. Early detection prevines the development of disseminated and hyperinfection syndromes. In search for immune response markers for strongyloidiasis, antigenic properties of glycosylated components from Strongyloides and IgG avidity performance were tested in immunoassays. Considering sugar-binding capacity of lectins, as concanavalin-A (Con-A) and immunodiagnosis importance we tested total saline extract of Strongyloides venezuelensis filariform larvae (SE) and its fractions obtained in Con-A column: Con-A unbound (Con-A UF) and Con-A bound (Con-A BF) in immunoglobulin detection (IgG and IgA). IgG avidity determination was investigated to detect patients with strongyloidiasis and characterize sources of disagreement between serology and coproparasitology. Sensitivity (Se), specificity (Sp), area under curve (AUC), likelihood ratio (LR), and correlation coefficients were calculated, statistical analyzes were performed by Mann Whitney and Fisher exact test. Con-A UF showed the highest diagnostic parameters for IgG detection (Se 95.0%, Sp 92.5%, AUC 0.99, LR 12.7) and high correlation (r = 0.700) with SE. Con-A fractions did not clearly demonstrate usefulness for IgA detection. Avidity index (AI) was calculated to each serum considering: (a) screening AI (serum 1:160) and (b) mean of AI at different dilutions. To differentiate groups at screening and mean AI a value of 75% was established (p < 0.001). Avidity immunoblot was auxiliary for ELISA data analysis of discrepant cases and served as a complementary tool for identifying antigens responsible for affinity maturation. In conclusion, the results obtained demonstrate that Con-A UF is an important source of specific peptides efficient to detect IgG in strongyloidiasis immunodiagnosis and IgG avidity assay may distinguish active infection with
Strongyloides stercoralis larvae output from suspect or false positive cases.
Keywords: strongyloidiasis; Strongyloides stercoralis; glycoproteins; avidity; serodiagnosis.
1. INTRODUÇÃO
1.1 Classificação e morfologia do gênero Strongyloides
Espécies do gênero Strongyloides Grassi (1879) ocorrem na maioria dos mamíferos, mas também em aves, répteis e anfíbios (LEVINE, 1979). No gênero encontram-se parasitos de importância médica e veterinária. Inclui mais de 50 espécies, com duas delas acometendo o intestino do homem: S. stercoralis, com distribuição cosmopolita, principalmente nas regiões tropicais e subtropicais; e S. fuelleborni von Linstow (1905) encontrado na África, Filipinas e Ilhas de Nova Guiné, causando a estrongiloidíase ou anguilulose (SPEARE, 1989; PIRES; DREYER, 1993; GROVE, 1996). Em murinos cita-se S. ratti Sandground (1925) e S. venezuelensis Brumpt (1934) como espécies de relevância. Strongyloides venezuelensis foi isolado de ratos selvagens e é mantido em roedores de laboratório como modelos experimentais para a estrongiloidíase humana e fonte de obtenção de antígenos heterólogos utilizados no imunodiagnóstico (MACHADO et al., 2003, 2008b; NEGRÃO-CORRÊA; TEIXEIRA, 2006; RODRIGUES et al., 2007, 2009).
As espécies de Strongyloides apresentam duas gerações, uma de vida livre e outra parasitária, com dimorfismo sexual na primeira e a presença de apenas fêmeas na segunda (MORAES, 1948). Seis formas evolutivas: fêmeas partenogenética parasita e de vida livre, macho de vida livre, ovos e larvas rabditoides e filarioides são distintas morfologicamente (ANDERSON, 2000; COSTA-CRUZ, 2005).
A fêmea parasita partenogenética tem aspecto filiforme, com a extremidade posterior afilada. A de S. stercoralis mede cerca de 2,5 mm de comprimento por 40 µm de largura, enquanto a de S. venezuelensis tem até 3,2 mm por 41 µm. Revestimento formado por uma cutícula delgada, com estriações transversais. O
aparelho digestivo é formado por boca trilabiada; esôfago filariforme e longo; intestino simples; e orifício anal na extremidade posterior em posição transversal. Vulva ventral, posicionada no terço médio do corpo; dela parte o útero anfidelfo; seguem-se ovários, que dependendo da espécie são espiralados com o intestino; e ovidutos, com os ovos enfileirados em seu interior; estes órgãos formam o aparelho reprodutor que ocupa até 2/3 do organismo (MORAES, 1948; LEVINE, 1979; REY, 2001; COSTA-CRUZ, 2005).
A fêmea de vida livre ou estercoral é fusiforme, com a porção posterior afilada. Tanto a de S. stercoralis, quanto a de S. venezuelensis são menores que a fêmea partenogenética e medem até 1,2 por 0,07 mm e 1,2 por 130 µm no comprimento e largura, respectivamente. A cutícula é fina e com leves estrias marcando-a transversalmente. Nessa forma evolutiva, o aparelho digestivo também é simples e formado por boca pequena, esôfago curto e rabditoide, intestino simples e ânus próximo à extremidade posterior. O aparelho genital é organizado em vulva na região mediana do corpo, útero anfidelfo, ovários e receptáculo seminal. O número de ovos no interior do útero é maior em relação à fêmea parasita (MORAES, 1948; LEVINE, 1979; REY, 2001; COSTA-CRUZ, 2005).
O macho de vida livre possui o corpo afusado e menor que o das fêmeas. Mede 0,7 mm de comprimento por 0,04 mm de largura em S. stercoralis e 0,9 mm por 70 µm em S. venezuelensis. Tem revestimento similar ao das fêmeas. O sistema digestório é organizado em boca trilabiada, esôfago rabditoide e intestino simples terminando em cloaca na região caudal. A cauda é recurvada ventralmente e apresenta dois espículos copulatórios, sustentados pelo gubernáculo. A genitália é constituída pelos testículos, vesícula seminal e canais deferente e ejaculador (MORAES, 1948; LEVINE, 1979; REY, 2001; COSTA-CRUZ, 2005).
As larvas rabditoides são os primeiros estádios larvais (L1 e L2) das espécies de Strongyloides e medem de 200 a 300 µm no comprimento. As oriundas das fêmeas estercoral ou parasita são quase idênticas. Elas têm uma cutícula delicada e
hialina recobrindo-as. A boca é diminuta e o esôfago é do tipo rabditoide, com dilatações bulbiformes nas extremidades e constrição na parte mediana. O aparelho digestivo é continuado pelo intestino, que termina em abertura anal espaçada da extremidade posterior. Observa-se também um primórdio genital nítido formado por agregado de células (MORAES, 1948; REY, 2001; COSTA-CRUZ, 2005).
Após a segunda muda, as larvas diferenciam-se em L3, que são as larvas filarioides. As L3 são alongadas e finas e medem 0,05 mm de comprimento. Apresentam cutícula fina e estriada e cauda com detalhe entalhado característico. O vestíbulo bucal é curto, o esôfago filarioide e o intestino longo e estreito com ânus posterior. Podem seguir o curso evolutivo em vida livre ou ao penetrar no hospedeiro. Essa diferença acarreta algumas pequenas mudanças na morfologia deste estádio (MORAES, 1948; LEVINE, 1979; REY, 2001; COSTA-CRUZ, 2005).
Ovos das fêmeas parasitas e de vida livre assemelham-se, com diferença apenas no tamanho, sendo os da última maiores. São estruturas elipsoides, de parede translúcida que permite visualizar no momento da oviposição o embrião parcial ou totalmente desenvolvido (MORAES, 1948; GROVE, 1996).
1.2 Aspectos do ciclo biológico de S. stercoralis
As espécies de Strongyloides têm ciclos evolutivos complexos (ANDERSON, 2000; FERREIRA et al., 2007; VINEY; LOK, 2007). A maioria destes helmintos apresenta a habilidade de manter alternando gerações homogônicas ou diretas em etapas parasitárias e heterogônicas ou indiretas em repetidas proles de vida livre. Essas fases são comumente divididas nos ciclos parasitários partenogenético e no sexuado de vida livre, ambos monoxênicos (REY, 2001; COSTA-CRUZ, 2005; THOMPSON et al., 2005).
No ciclo direto os hospedeiros humanos tornam-se infectados por S.
stercoralis quando L3 penetram ativamente o tegumento – pele ou mucosas da boca e
esôfago. As larvas alcançam os vasos sanguíneos ou linfáticos e chegam aos pulmões. Nos capilares pulmonares diferenciam-se em L4, atravessam a membrana dos alvéolos e migram pela árvore brônquica até a faringe. As L4 são então expectoradas, pelo reflexo da tosse que provocam, ou deglutidas. Quando ingeridas atingem o intestino, se instalam na região do duodeno e jejuno, chegando à maturidade como fêmeas partenogenéticas parasitas que iniciam a oviposição (MORAES, 1948; REY, 2001). Os ovos de S. stercoralis são eliminados já larvados na mucosa intestinal e eclodem antes da eliminação das fezes. Esse fato torna difícil a visualização deles nas fezes de humanos infectados, a menos que o indivíduo esteja com diarreia grave (COSTA-CRUZ, 2005). O período pré-patente (PPP) – da penetração de L3 a oviposição da fêmea – para S. stercoralis em humanos é de aproximadamente a 8-25 dias (ANDERSON, 2000; COSTA-CRUZ, 2005).
A infecção ainda pode ocorrer pelos mecanismos de autoinfecção externa ou exógena em que as larvas rabditoides presentes na região perianal de indivíduos infectados diferenciam-se em larvas filarioides infectantes e aí penetram, completando o ciclo direto. Pode ocorrer também autoinfecção interna ou endógena, na qual larvas rabditoides presentes na luz intestinal (íleo ou cólon) de indivíduos infectados diferenciam-se em larvas filarioides. Por meio destes mecanismos a doença pode persistir por meses ou anos, mesmo que não ocorram novas infecções (LIU; WELLER, 1993; GROVE, 1996; COSTA-CRUZ, 2005).
Autoinfecção interna pode resultar na elevação do número de formas evolutivas de S. stercoralis no intestino e pulmões, quadro conhecido como hiperinfecção. Quando a infecção atinge sítios não usuais do ciclo no humano, como órgãos do sistema nervoso, é chamada disseminação (SIDDIQUI; BERK, 2001; COSTA-CRUZ, 2005).
possibilita a sobrevivência pelo ciclo indireto, desde que o substrato seja arenoso, úmido, aquecido com luz solar indireta e rico em matéria orgânica. No solo, as larvas rabditoides sofrem quatro diferenciações e resultam em machos ou fêmeas de vida livre. O encontro e a cópula destas formas de vida resulta em ovos que desenvolvem em larvas filarioides infectantes (MORAES, 1948; COSTA-CRUZ, 2005; THOMPSON et al., 2005).
1.3 Epidemiologia da estrongiloidíase humana
Parasitose de prevalência mundial, a estrongiloidíase tem distribuição heterogênea e estima-se que entre 30 e 100 milhões de pessoas encontram-se infectadas por S. stercoralis (PIRES; DREYER, 1993; SIDDIQUI; BERK, 2001; KOZUBSKI; ARCHELLI, 2004; VINEY; LOK, 2007; OLSEN et al., 2009). Entre as infecções causadas por geo-helmintos, a estrongiloidíase está entre as seis primeiras. Essa posição refere-se apenas as infecções ativas, uma vez que o número de pessoas potencialmente expostas ou com quadro de infecção sub-clínico é maior (BETHONY et al., 2006; ELLIOTT; SUMMERS; WEINSTOCK, 2007).
Foi definido por Stuerchler (1981 apud PIRES; DREYER, 1993) as regiões mundiais de acordo com a prevalência da infecção por S. stercoralis: esporádica (<1%), endêmica (1-5%) e hiperendêmica (>5%). As áreas hiperendêmicas estão situadas, principalmente, entre os trópicos, especialmente nos países em desenvolvimento da Ásia, América Latina e África Subsaariana (KOZUBSKY; ARCHELLI, 2004; FARDET et al., 2007; DEVI; BORKAKOTY; MAHANTA, 2011).
Nas regiões desenvolvidas do mundo, como Sudeste da América do Norte e Europa, as infecções são frequentes em trabalhadores do campo e também têm origem não autóctone em razão dos imigrantes e visitantes de áreas endêmicas (CELEDON et al., 1994; SIDDIQUI; BERK, 2001; MARCOS et al., 2008). Nos países desenvolvidos as
infecções helmínticas, incluindo a estrongiloidíase, podem ser controladas por programas de atenção básica à saúde e medidas de saneamento efetivo. Nos países em desenvolvimento, maiores regiões endêmicas, as helmintíases distribuem-se em larga extensão e mesmo o tratamento anti-parasitário não protege contra a rápida reinfecção (ANTHONY et al., 2007). Devido à baixa incidência em países industrializados o falso diagnóstico e os erros no tratamento médico podem ocorrer (BOULWARE et al., 2007).
No Brasil, a estrongiloidíase tem importância na saúde pública. As maiores taxas de prevalência foram encontradas nos estados do Amapá, Goiás, Rondônia e Minas Gerais (BRASIL, 2010). Em Uberlândia, Minas Gerais, foi reportado 13% de positividade em escolares (MACHADO; COSTA-CRUZ, 1998), 3,3% em crianças hospitalizadas (PAULA et al., 2000), 33,3% em alcoólatras (OLIVEIRA et al., 2002), 12% em pacientes infectados pelo vírus da imunodeficiência humana (HIV)/ síndrome da imunodeficiência adquirida (AIDS) (SILVA et al., 2005); os quatro trabalhos utilizaram os métodos de Baermann-Moraes (1917; 1948) e Lutz (1919). Ainda em Uberlândia, estudos realizados mostraram 3,8% de prevalência de estrongiloidíase em pacientes diabéticos (MENDONÇA et al., 2006), 9,1% em pacientes com câncer gastrointestinal (MACHADO et al., 2008a) e 4,4% em puérperas lactantes (MOTA-FERREIRA et al., 2009), com a mesma metodologia coprodiagnóstica. Esses resultados revelam que a cidade é área hiperendêmica.
1.4 Sintomatologia
Na estrongiloidíase há três possibilidades de evolução da infecção: erradicação, cronicidade e complicação (GENTA, 1992; GROVE, 1996; FARDET et al., 2007).
A maioria dos portadores de S. stercoralis são oligo ou assintomáticos. As alterações na estrongiloidíase manifestam-se de acordo com a migração do parasito
pelos órgãos do hospedeiro. Sinais cutâneos, decorrentes da penetração das larvas infectantes, como larva currens e urticária inespecífica são manifestações típicas. Os sintomas pulmonares mais comuns caracterizam a síndrome de Löeffer com tosse seca, dispneia e edema. As manifestações gastrointestinais incluem dor abdominal, vômito, náusea, diarreia, emagrecimento e obstipação (COSTA-CRUZ, 2005; LIU; WELLER, 1993; PIRES; DREYER, 1993; FARDET et al., 2007; KAKATI et al., 2011).
Nas formas graves são reportados sinais e sintomas cutâneos, pulmonares e gastrointestinais mais sérios. Na pele podem aparecer exantemas petequiais e purpúricos. O envolvimento pulmonar acarreta em tosse, hemoptise e sibilos decorrentes da migração larval. Nos casos mais graves há a possibilidade de ocorrer broncopneumonia, desenvolver cavitações e abscessos associados às infecções bacterianas. Em relação ao trato gastrointestinal, o caso grave de infecção pelo S.
stercoralis inclui sinais de esteatorreia, síndrome de má absorção, isquemia mesentérica,
enteropatia perdedora de proteínas, íleo paralítico e obstrução intestinal (ANDRADE-NETO; ASSEF, 1996; KEISER; NUTMAN, 2004; VAIYAVATJAMAI et al., 2008).
A cronicidade da infecção por S. stercoralis ocasiona exposição constante dos antígenos do parasito aos componentes celulares e humorais do sistema imune. O envolvimento de mecanismos imunológicos no processo fisiopatológico da estrongiloidíase não foi completamente elucidado (FOGAÇA et al., 1990; MACHADO et al., 2005; RODRIGUES et al., 2009).
1.5 Resposta imune do hospedeiro
Geralmente agentes infecciosos podem ser divididos em micropatógenos, como as bactérias, e macropatógenos, por exemplo, os helmintos. Diferente da maioria das infecções micropatogênicas, que são agudas e de período curto, infecções
macropatogênicas são prolongadas e crônicas (MAIZELS et al., 1993; MAIZELS; YAZDANBAKHSH, 2003). Helmintos estimulam no hospedeiro resposta dependente de linfócitos T CD4+ com perfil Th2 de produção de citocinas. A resposta imune neste perfil é caracterizada pela produção de interleucinas (IL) – IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10, IL-13, IL-21 – envolvidas na sinalização das células (OVINGTON; BEHM, 1997; ONAH; NAWA, 2000; MAIZELS, 2003; TURNER et al., 2003; COSTA-CRUZ, 2005; MONTES et al., 2009). As interleucinas produzidas induzem rápida resposta humoral mediada por anticorpos da classe E (IgE) antígeno-específica e resposta celular mediada por mastócitos, basófilos e eosinófilos (GENTA, 1996; WEINSTOCK; SUMMERS; ELLIOTT, 2005; NEGRÃO-CORRÊA et al., 2006).
No organismo humano desenvolvem-se respostas T-independente com produção de mediadores da inflamação antígeno-inespecífico pelos macrófagos. Estas moléculas são o fator necrose tumoral (TNF) e IL-1 que atuam nas células caliciformes do intestino ao estimularem a proliferação das mesmas com consequente aumento na produção de muco. O muco é secretado na luz intestinal e reveste as fêmeas parasitas, o que previne o estabelecimento na mucosa ou leva à expulsão delas. Assim, proteínas do muco gastrointestinal, as mucinas, são constituintes da primeira linha de defesa do hospedeiro contra os helmintos. As mucinas são glicoproteínas poliméricas ricas em resíduos de aminoácidos que se ligam a sítios para oligossacarídeos presentes no tegumento dos parasitos (MARUYAMA et al., 2000, 2002; ONAH; NAWA, 2000; MACHADO et al., 2005)
Anticorpos das classes IgM, IgA e IgG específicos, além de IgE, também são produzidos pelo hospedeiro humano na resposta imune contra helmintos, incluindo S.
stercoralis. IgG é a principal imunoglobulina do soro, correspondendo entre 70-75% do
total de anticorpos séricos. Entre as subclasses de IgG forma-se, principalmente, IgG1 e IgG4 na elaboração da resposta contra S. stercoralis (ATKINS et al., 1999; MACHADO et al., 2005; RODRIGUES et al., 2007). Credita-se à IgG4 o bloqueio na resposta protetora
promovida pela IgE, ou seja, modula as respostas alérgicas IgE-mediadas pela ligação em sítios dos mastócitos (ATKINS et al., 1997, 1999; RODRIGUES et al., 2007). É possível que o aumento nos níveis de IgG4, que se segue às infecções primárias, reduza a expulsão dos parasitos o que permite o estabelecimento das fêmeas parasitas. Dessa maneira, a estrongiloidíase crônica pode ser resultado da diminuição das respostas de hipersensibilidade (IgE-mediadas) para a persistente autoinfecção, com consequente redução dos efeitos imunopatológicos da anafilaxia constante (ATKINS et al., 1997). No entanto, nos casos de doença disseminada e de imunossupressão, os níveis de IgE podem estar normais (MARCOS et al., 2008).
IgA é o segundo anticorpo mais presente no soro humano e representa a classe mais proeminente nas mucosas e suas secreções. Por causa do ciclo do parasito envolver as mucosas pulmonar e intestinal, o hospedeiro pode elaborar resposta local e sistêmica mediada por imunoglobulina A (ATKINS et al., 1999; COSTA et al., 2003; COSTA-CRUZ, 2005; MOTA-FERREIRA et al., 2009; RIBEIRO et al., 2010). Pacientes com sintomatologia grave tem redução significativa da concentração de IgA e IgM, entretanto, não há alteração nos níveis de IgG (COSTA-CRUZ, 2005).
1.6 Diagnóstico da estrongiloidíase
O diagnóstico clínico da estrongiloidíase é incerto, pois a maioria dos casos são assintomáticos, ou quando com sintomatologia presente, os sintomas pulmonares e intestinais são comuns às outras parasitoses. Com isso, é necessária a utilização de exames parasitológicos e imunológicos complementares (LIU; WELLER, 1993; SIDDIQUI; BERK, 2001; AGRAWAL; AGARWAL; GHOSHAL, 2009).
Métodos parasitológicos diretos de diagnóstico consistem no encontro das formas evolutivas de S. stercoralis. Os parasitos, menos rotineiramente, podem ser
encontrados em fluidos de aspirado duodenal, lavado brônquico, escarro, urina, esfregaço de sangue periférico e líquor; ou amostras de tecido sólido, como de biópsia de pele e endoscopia do sistema digestório (ONUIGBO; IBEACHUM, 1991; LIU; WELLER, 1993; PIRES; DREYER, 1993; SUDRÉ et al., 2006; VAN DOORN et al., 2007; KAKATI et al., 2011). Esses métodos são associados aos casos graves de estrongiloidíase. O diagnóstico definitivo da estrongiloidíase, normalmente, é realizado pelo encontro de larvas nas fezes. Entretanto, na maioria dos casos a eliminação de larvas nas fezes é pequena e irregular, o que dificulta a detecção da infecção (LIU; WELLER, 1993; SUDRÉ et al., 2006).
Estudos demonstraram sensibilidade dos exames de fezes com variação de 15 a 24%, com uma amostra, aumentando entre 55 e 78% quando utilizadas três amostras. No intuito de aumentar a sensibilidade do exame coprológico, foram desenvolvidas técnicas de cultivo dos estádios larvais. Elas baseiam-se no desenvolvimento do ciclo indireto de Strongyloides, que permite a concentração do número de larvas (LIU; WELLER, 1993). Entre as técnicas de cultura estão a de cultura em papel filtro (HARADA; MORI, 1955) ou em placa de ágar (KOGA et al., 1991; STEINMANN et al., 2007).
Estádios larvais podem ser vistos em exame microscópico por métodos de recuperação de larvas em amostras fecais. Há apenas um relato de recuperação de estágios adultos, fêmeas e machos, em amostras de fezes (HONG et al., 2009). Os métodos de concentração de larvas de Baermann (1917), modificado por Moraes (1948) e o de Rugai, Mattos e Brisola (1954) são indicados, uma vez que se baseiam no termo e hidrotropismo das larvas. As vantagens desses métodos, além do aumento da sensibilidade, são simplicidade, rapidez de execução e uso de grande volume de material fecal (REY, 2001). Ainda assim, são necessárias sete amostras fecais, colhidas em dias alternados, para se alcançar 100% de sensibilidade (ANDRADE-NETO; ASSEF, 1996; UPARANUKRAW; PHONGSRI; MORAKOTE, 1999; SIDDIQUI; BERK, 2001). A dificuldade do exame com várias amostras fecais reside no tempo necessário para coleta,
inconveniência para o paciente e resistência do médico em solicitá-lo (HIRA et al., 2004). Deste modo, a falha em demonstrar larvas não pode ser interpretada erroneamente como ausência da infecção (SATO; KOBAYASHI; SHIROMA, 1995), sendo a próxima abordagem diagnóstica a realização de testes imunológicos (SIDDIQUI; BERK, 2001).
Os métodos de diagnóstico moleculares e imunológicos amplificam o material genético do parasito em amostras fecais ou detectam diferentes classes de imunoglobulinas específicas anti-Strongyloides ou coproantígeno. O desenvolvimento da biologia molecular permitiu o uso de antígeno recombinante de larva filarioide em reação imunoenzimática (RAVI et al., 2002) e, recentemente, padronizou-se reações em cadeia de polimerase para detecção de material genético de Strongyloides (VERWEIJ et al., 2009; KRAMME et al., 2010) ou de murino (MARRA et al., 2010). Ensaios para detecção de coproantígeno utilizando anticorpos policlonais contra coproantígeno de amostras fecais humanas, adultos de S. stercoralis (EL-BADRY, 2009) ou L3 de S.
venezuelensis (GONÇALVES et al., 2010) foram padronizados.
Os testes de reação de imunofluorescência indireta (RIFI), enzyme-linked
immunosorbent assay (ELISA) e o de imunoeletrotransferência ou immunoblot têm sido
empregados e são úteis no diagnóstico, na avaliação da resposta imune do humano e em estudos soroepidemiológicos, por terem elevada sensibilidade (ROSSI et al., 1993; LINDO et al., 1994; COSTA-CRUZ et al., 1997, 2003; PAULA et al., 2000; MACHADO et al., 2001, 2003; SILVA et al., 2003; RODRIGUES et al., 2007; VAN DOORN, 2007; MOTA-FERREIRA et al., 2009; BON et al., 2010; FELICIANO et al., 2010). Além disso, são vantajosos no monitoramento de pacientes submetidos a tratamento anti-helmíntico (BIGGS et al., 2009).
Estudos utilizando RIFI são direcionados para a pesquisa de diferentes classes de anticorpos com variações: (1) nas preparações antigênicas, como suspensão de larvas ou corte das mesmas em criostato; e (2) no protocolo de montagem das lâminas (COSTA-CRUZ et al., 1997; MACHADO et al., 2001, 2003; RIGO et al., 2008;
MOTA-FERREIRA et al., 2009). O ELISA é o mais conveniente, amplamente utilizado atualmente e que tem se verificado sensibilidade e especificidade elevadas (SIDDIQUI; BERK, 2001; VAN DOORN, 2007; MOTA-FERREIRA et al., 2009). A técnica de immunoblot é indicada como altamente sensível e específica no reconhecimento de frações proteicas imunodominantes de Strongyloides (LINDO et al., 1994; ATKINS et al., 1999; SILVA et al., 2003; RIGO et al., 2008; FELICIANO et al., 2010). A dificuldade de obtenção da quantidade considerável de S. stercoralis para produção dos extratos utilizados nos testes imunológicos fez a necessidade de padronização e utilização de antígenos heterólogos (COSTA-CRUZ et al., 1998; MACHADO et al., 2001, 2003).
1.6.1 Avidez de anticorpos em testes diagnósticos
Avidez ou afinidade funcional define o conjunto de forças de ligação entre um anticorpo e um antígeno. É dependente da multivalência do antígeno, fatores não específicos e afinidade. A afinidade dos sítios no anticorpo para ligação ao antígeno aumenta com tempo do desafio antigênico (TIJSSEN, 1985; GUTIERREZ; MAROTO, 1996; KAHN et al., 2009). Durante as infecções primárias, o estímulo antigênico induz, inicialmente, a produção de anticorpos de baixa avidez. Nos casos crônicos ou de reinfecção, ocorre produção de anticorpos específicos de alta avidez (ABBAS; LICHTMAN; POBER, 2003).
Ensaios baseados na avidez de anticorpos IgG foram propostos para avaliar as doenças infecciosas quanto à provável etiologia, momento da infecção primária, identificação de período pré-patente e para distinção entre as fases aguda e crônica (GUTIERREZ; MAROTO, 1996). Protocolos utilizando diferentes métodos, como aglutinação, fixação de complemento, RIFI e immunoblot foram padronizados, sendo o ELISA a técnica mais utilizada. A dissociação dos anticorpos de menor avidez dos
antígenos específicos é obtida por diluição da amostra com agentes desnaturantes, como dodecil sulfato de sódio, etanolamina, dietilamina, guanidina e ureia; ou por meio de eluição, após a formação do imunocomplexo, com etapa de lavagem em tampão acrescido de agente desnaturante (TIJSSEN, 1985; GUTIERREZ; MAROTO, 1996; STEWARD; CHARGELEGUE, 1996; BUTLER, 2000; KAHN et al., 2009).
A quantificação da avidez tem sido utilizada no diagnóstico de várias infecções, especialmente, nos casos em que a diferenciação de infecções recentes ou crônicas é crucial (DZIEMIAN et al., 2008). A determinação de avidez de IgG sérica é útil em doenças parasitárias, incluindo toxoplasmose (CAMARGO et al., 1991; CANDOLFI et al., 2007; BÈLA et al., 2008), esquistossomose (EL ZAYYAT et al., 1998; VIANA; RABELLO; KATZ, 2001; MOSTAFA; AWAD; SHALABY, 2002), hidatidose (STERLA; SATO; NIETO, 1999; STEFANIAK; KACPRZAK; PAUL, 2001), fasciolose (ABOU-BASHA et al., 2000), leishmaniose (REDHU et al., 2006), toxocaríase (HÜBNER; UHLÍKOVÁ; LEISSOVÁ, 2001; RYCHLICKI, 2004; DZIEMIAN et al., 2008) e neurocisticercose (MANHANI et al., 2009). Para esses parasitos testes avidez foram desenvolvidos, porém, não há relato na literatura do uso desta metodologia na estrongiloidíase.
Anticorpos anti-L3, utilizando antígenos homólogo ou heterólogo, são detectados em mais de 80% dos pacientes copropositivos (COSTA-CRUZ et al., 1998; VAN DOORN, 2007). Esses dados mostraram que o imunodiagnóstico é auxiliar, mas mesmo com altos valores de sensibilidade e especificidade, nem sempre distingue casos de infecção ativa por S. stercoralis daqueles casos em que os exames de fezes negativos e a sorologia é positiva (LIU; WELLER, 1993). Dessa maneira, são necessários avanços que facilitem o reconhecimento e diferenciação entre os casos de estrongiloidíase, por exemplo, com os métodos que avaliam a avidez de anticorpos como marcadores de fase de infecção.
1.7 Antígenos heterólogos no diagnóstico imunológico da estrongiloidíase humana
Espécies de Strongyloides já utilizadas como antígenos heterólogos no imunodiagnóstico da estrongiloidíase humanas incluem S. cebus Darling (1911), S. ratti e
S. venezuelensis (CAMPOS et al., 1988; SATO; KOBAYASHI; SHIROMA, 1995; COSTA-CRUZ
et al., 1997, 1998; MACHADO et al., 2001, 2003; RODRIGUES et al., 2007). O desenvolvimento e transmissão no gênero Strongyloides é similar, o que permite o uso de S. venezuelensis e S. ratti em modelos experimentais roedores para estudos da estrongiloidíase humana. Estes estudos têm auxiliado, além da padronização de novas técnicas de imunodiagnóstico, nas pesquisas referentes à biologia molecular, terapêutica e aspectos da interação parasito-hospedeiro: ecologia, patologia e imunologia (NORTHERN et al., 1989; ABE; SUGAYA; YOSHIMURA, 1998; COSTA-CRUZ, 2005; FERNANDES et al., 2008; GONÇALVES et al., 2008; RODRIGUES et al., 2009; CHIUSO-MINICUCCI et al., 2010; MACHADO et al., 2011).
A composição antigênica de S. ratti e S. venezuelensis foi comparada com a de S. stercoralis. Os estudos mostraram que a sensibilidade e a especificidade não têm diferença estatística significante quando comparados antígenos homólogo e heterólogo. Isso conferiu segurança e preferência ao uso destas espécies como fontes de antígenos no imunodiagnóstico da estrongiloidíase humana (COSTA-CRUZ et al., 1997, 1998; MACHADO et al., 2003, 2005, 2008b).
A obtenção de larvas filarioides suficientes de S. stercoralis é considerada a principal limitação para o uso do antígeno homólogo no desenvolvimento de ensaios imunológicos. Caso a amostra fecal não provenha de um paciente com hiperinfecção e considerável eliminação de S. stercoralis (SIDDIQUI; BERK, 2001), não se consegue número necessário de larvas para preparação antigênica. A consideração dos últimos autores é estendida para a possibilidade de não ocorrer a geração de quantidades de
larvas no processo de coprocultura (LOOSS, 1905 apud NEVES et al., 2005), seja para fazer o preparado antigênico ou para serem inoculadas no cão na manutenção experimental (GROVE; NORTHERN, 1982; GROVE, 1996). Além disso, mesmo com o método de coprocultura descrito, ele esbarra na dificuldade de acomodação e manutenção destes cães experimentalmente infectados. Apesar dos métodos de cultura em placa de ágar e papel filtro (HARADA; MORI, 1955; KOGA et al., 1991) e coprocultura serem sensíveis para o diagnóstico da estrongiloidíase e/ou para obtenção de larvas destinadas aos antígenos e inóculos, há dúvidas sobre a praticidade do uso na rotina laboratorial. São considerados métodos complexos, com demora na obtenção dos resultados e risco de infecção pela manipulação de larvas viáveis de S. stercoralis (ANDRADE-NETO; ASSEF, 1996).
Strongyloides ratti e S. venezuelensis são parasitos de roedores silvestres,
por exemplo, o rato marrom Rattus norvegicus Berkenhout (1769), e podem ser favoravelmente mantidos em ratos de linhagens desenvolvidas para uso na pesquisa. Ratos são animais facilmente sustentados em laboratório e eliminam considerável número de ovos nas fezes. A coprocultura não oferece risco de infecção para os manipuladores e o tempo na estufa é reduzido. Assim, pode-se manter a produção de antígeno no laboratório de forma constante e segura (GROVE; BLAIR, 1981; NORTHERN et al., 1989; SATO et al., 1995; COSTA-CRUZ et al., 1997; MACHADO et al., 2001, 2008b; NEGRÃO-CORRÊA; TEIXEIRA, 2006; MACHADO et al., 2011).
Outra limitação dos testes sorológicos é a reação cruzada com outros parasitos, atribuída à complexidade antigênica dos helmintos (GAM; NEVA; KROTOSKI, 1987, CONWAY et al. 1993, a,b; LINDO et al., 1994, 1996; ROSSI et al., 1993; SILVA et al., 2003; SUDRÉ et al., 2006). Com esse quadro, a caracterização e identificação de antígenos Strongyloides-específicos se fazem necessárias para o incremento da especificidade dos testes, especialmente, nos mais utilizados – ELISA e immunoblot (NORTHERN; GROVE, 1987; LINDO et al., 1994). Com baixa quantidade de larvas também
não é possível o fracionamento e análise dos antígenos para métodos sorológicos (ROSSI et al., 1993; RAVI et al., 2002). A disponibilidade de larvas, que podem ser conseguidas em grande quantidade em roedores experimentalmente infectados, facilitará a padronização e uso de testes sorológicos para o diagnóstico individual e em inquéritos epidemiológicos. Deste modo, a obtenção e identificação de frações antigênicas de alta especificidade e sensibilidade, a partir do fracionamento de extratos totais de S.
venezuelensis, por exemplo, auxiliarão nos estudos sorológicos no diagnóstico da
estrongiloidíase.
1.8 Composição proteica e fracionamento antigênico de glicoproteínas de S. venezuelensis
As glicoproteínas são proteínas com grupos de carboidratos ligados covalentemente e ocorrem em todos os organismos vivos. Desempenham várias funções, entre elas: transporte de compostos, estruturação da célula, adesão celular e reconhecimento celular, atuam como enzimas e têm papel imunológico como as imunoglobulinas (BERG; TYMOCZKO; STRYER, 2002; ABBAS; LICHTMAN; POBER, 2003). A abundância e diversidade de funções desses compostos nos organismos justificam estudos para o entendimento da bioquímica, incluindo o imunodiagnóstico. Glicoproteínas capazes de interagir com lectinas têm sido alvos da pesquisa, devido à afinidade das lectinas para grupos específicos de glicosilações (BERG; TYMOCZKO; STRYER, 2002; WEST; GOLDRING, 2003; DURHAM; REGNIER, 2006).
Lectinas (do latim lectus, ‘selecionar’) são proteínas ou glicoproteínas que se ligam especificamente à estrutura de carboidratos, ou seja, reconhecem e ligam-se às cadeias laterais de oligossacarídeos. O contingente de carboidratos apresentado nas superfícies celulares ou em componentes solúveis é favorável a essa interação com
lectinas. Não apresentam função catalítica e características estruturais imunológicas e estão disponíveis imobilizadas em suportes cromatográficos, que podem ser usados na separação de compostos glicosilados (LIS; SHARON, 1986; WEST; GOLDRING, 2003). Como ferramenta no imunodiagnóstico, as lectinas têm sido usadas no fracionamento de antígenos glicosilados para o diagnóstico de alergias provocadas por ácaros (ALVES et al., 2008), protozooses (ALMEIDA et al., 1993; GOMES-SILVA et al., 2008) e helmintíases (RODRIGUEZ-CANUL et al., 1997; MACHADO, 2008; OLIVEIRA, 2008; NUNES et al., 2010).
Concanavalina-A (Con-A) é uma lectina extraída da semente do feijão-de-porco Canavalia ensiformis (L.) DC. (Fabaceae) e foi a primeira isolada da família das leguminosas a ter a estrutura sequenciada e revelada por cristalografia (SUMNER; HOWELL, 1936; EDELMAN et al., 1972). A atividade de aglutinação de eritrócitos, inicialmente descrita, atualmente é somada a várias outras aplicações na biologia, como separação de enzimas lisossomais e glicoproteinases (WEST; GOLDRING, 2003). A Con-A tem ampla especificidade e liga-se aos resíduos de manose e glicose, com maior afinidade pelo α-D-manopiranosídeo com os grupos hidroxilas livres nos carbonos C3, C4 e C6 (LIS; SHARON, 1986; NAISMITH; FIELD, 1996; WEST; GOLDRING, 2003). A cromatografia em coluna com essa lectina, além de ser utilizada como um procedimento padrão para demonstrar presença de unidades de oligomanose, é empregada para separar compostos contendo oligossacarídeos complexos mais ramificados (LIS; SHARON, 1986).
Ao caracterizar-se a organização estrutural, por microscopia eletrônica, da cutícula de adultos e larvas de S. venezuelensis, foi demonstrado que a superfície tem composição glicídica (MARTINEZ; SOUSA, 1995, 1997). A investigação da adesão de S.
venezuelensis in vitro e in vivo revelou que há secreção de substâncias adesivas
mucinosas produzidas pelas glândulas esofágicas (MARUYAMA; NAWA, 1997; MARUYAMA et al., 2000, 2003). Foi comprovado que essas substâncias são necessárias para fixação dos parasitos à mucosa intestinal do hospedeiro, mas são bloqueadas por
glicosaminoglicanos de mastócitos (MARUYAMA et al., 2000). Além disso, a distribuição longitudinal das fêmeas parasitas é influenciada pelos carboidratos sulfatados da mucosa do hospedeiro (MARUYAMA; NAWA; OHTA, 1998; MARUYAMA et al., 2002). As substâncias mostraram perfil de adesão à lectinas de Helix pomatia Linnaeus (1758),
Agaricus bisporus (J.E.Lange) Imbach, , Grifonia simplicifolia (DC.) Baill., Sambucus sieboldiana (Miq.) Graebn. e C. ensiformis – Con-A – indicando natureza glicoproteica
(MARUYAMA; NAWA, 1997). Assim, as substâncias glicoproteicas de S. venezuelensis têm importância no estabelecimento do parasito e reconhecimento destas substâncias pelo hospedeiro.
Lectinas e enzimas glicolíticas foram empregadas na análise dos comportamentos termo e quimiocinético de S. ratti. O entendimento dos movimentos larvais é importante para análise de mecanismos como a penetração na pele do hospedeiro e posterior migração tecidual. Os tratamentos com Con-A e aglutininas de gérmen de trigo e soja alteraram a percepção das pistas ambientais (TOBATA-KUDO; KUDO; TADA, 2005 a,b). Os autores confirmaram os sítios de ligação de Con-A, por lectina-histoquímica, no complexo anfidial, parte do sistema neuro-sensorial. Sugeriram também, que o tratamento com as enzimas alterou parcialmente a função dos receptores glicoproteicos de membrana dos anfídios. Ainda que existam variações moleculares e estruturais nos carboidratos dos termo e quimiorreceptores das várias espécies do gênero, acredita-se que funções similares são mantidas em S. venezuelensis.
A composição proteica de S. venezuelensis e alterações neste perfil foram investigadas nas mudanças de estádios de larva infectante, nas fezes e no pulmão, e de fêmea partenogenética. Foram encontrados diferentes spots entre as formas evolutivas em eletroforese bidimensional (TSUJI et al., 1993). Houve aumento na expressão de um complexo de polipeptídeos entre 16-20 kDa e uma proteína de choque térmico com 70 kDa, com função de termotolerância e transformação de parasitos com ciclo de vida complexo (TSUJI; OHTA; FUJISAKI, 1997). A síntese dessas proteínas, durante a mudança
entre estágios, deve ser crucial para regulação da infectividade do parasito (TSUJI; OHTA; FUJISAKI, 1997). O sistema ubiquitina-proteassoma foi estudado tendo como modelo S.
venezuelensis para a detecção de atividade proteolítica em preparações de larvas e
fêmeas. Foi demonstrado que a atividade da via é regulada durante o desenvolvimento (PAULA et al., 2009). Em relação a larvas L3 de S. stercoralis os resultados obtidos de análise proteômica parcial identificou 26 diferentes proteínas, sendo a maioria representada por proteínas associadas à superfície (MARCILLA et al., 2010).
Os protocolos de fracionamento de antígenos totais de espécies de
Strongyloides já descritos incluem a utilização de técnica cromatográfica e diferentes
detergentes. Coluna de cromatografia de interação hidrofóbica octyl-sepharose foi utilizada para antígeno salino de S. venezuelensis (RIGO et al., 2008). O antígeno de larvas filarioides de S. stercoralis foi passado em coluna de gel filtração e as frações foram empregadas em um ensaio imunoenzimático para detecção de anticorpos (MANGALI et al., 1991). A separação em frações aquosa e detergente de antígeno salino de S.
venezuelensis é protocolada com uso de detergente zwiteriônico sintético (RIGO et al.,
2008). A aplicação de outros compostos surfactantes para recuperar antígenos de superfície e uso posterior em testes sorológicos é relatada para S. ratti e S. venezuelensis com detergentes aniônicos (deoxicolato de sódio e dodecil sulfato de sódio) (NORTHERN; GROVE, 1987; NORTHERN et al., 1989), catiônicos (cetrimida) e não-iônicos (Triton X100 e X114) (NORTHERN et al., 1989; FELICIANO et al., 2010). Diferenças quantitativas e qualitativas foram vistas nos perfis antigênicos depois do fracionamento e/ou solubilização com esses procedimentos.
2. OBJETIVOS
Objetivo geral
Analisar diferentes frações antigênicas de larvas filarioides (L3) de
Strongyloides venezuelensis no imunodiagnóstico diferencial da estrongiloidíase humana.
Objetivos específicos
1. Produzir extrato salino de S. venezuelensis;
2. Isolar componentes antigênicos de larvas filarioides de S. venezuelensis por cromatografia de afinidade em resina com a lectina concanavalina-A imobilizada;
3. Analisar o perfil eletroforético das frações antigênicas obtidas em gel de poliacrilamida unidimensional (1D);
4. Detectar anticorpos IgG e IgA anti-Strongyloides por ELISA, frente aos extratos antigênicos obtidos, em amostras de soro para o diagnóstico da estrongiloidíase humana;
5. Avaliar a avidez de anticorpos IgG séricos anti-Strongyloides, por ELISA e
immunoblot, em amostras de pacientes com liberação de larvas nas fezes
e indivíduos positivos em reações imunoenzimáticas para estrongiloidíase e negativos nos exames coproparasitológicos.
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Aspectos éticos
Este estudo foi realizado no Laboratório de Diagnóstico de Parasitoses, Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade Federal de Uberlândia (UFU), sob responsabilidade da Profa. Dra. Julia Maria Costa-Cruz. De acordo com o Comitê de Ética em Pesquisa/UFU (CEP/UFU) o presente projeto foi aprovado sob o registro Nº 188/2009. As amostras de soro, dos grupos de estudo, estavam disponíveis e armazenadas no Banco de Amostras Biológicas, no respectivo Laboratório de Diagnóstico de Parasitoses. A manutenção dos espécimes foi aprovada pelo CEP/UFU sob o protocolo de Nº 041/2008. A obtenção de Strongyloides venezuelensis foi aprovada sob o parecer do Comitê de Ética na Utilização de Animais (CEUA/UFU) de Nº 075/2008 para o projeto “Manutenção da cepa de Strongyloides venezuelensis em Rattus novergicus Wistar”.
3.2 Amostras de soro
3.2.1 Amostras para validação dos testes diagnósticos
Para validação do extrato total e das frações antigênicas foram utilizadas 160 amostras de soro. Os indivíduos foram divididos em quatro grupos:
Grupo 1 – 40 amostras de soros de pacientes com diagnóstico
parasitológico positivo para Strongyloides stercoralis.
parasitos intestinais, listadas abaixo.
Com intuito de verificar a possível reatividade cruzada com outros parasitos nos métodos sorológicos, foram utilizadas amostras de soro de pacientes com outras parasitoses. Testes para detecção de anticorpos com antígenos de Strongyloides sp. mostraram determinada reação cruzada para helmintos como:
Schistosoma sp., Ascaris lumbricoides e Trichuris trichiura (GAM et
al., 1987, CONWAY et al. 1993 a,b; LINDO et al., 1994, 1996; SILVA et al., 2003). Ancilostomatídeos (n = 8) Ascaris lumbricoides (n = 8) Enterobius vermicularis (n = 6) Giardia lamblia (n = 5) Schistosoma mansoni (n = 3)
Tenídeos (Hymenolepis nana e Taenia sp.; n = 3)
Trichuris trichiura (n = 2) Coinfecção: A. lumbricoides + ancilostomatídeo (n = 1) A. lumbricoides + H. nana (n = 1) A. lumbricoides + G. lamblia (n = 1) A. lumbricoides + T. trichiura (n = 2)
Grupo 3 – 40 amostras de soro controle de indivíduos saudáveis
Grupo formado por indivíduos sãos e negativos para parasitos intestinais em exames parasitológicos de fezes, realizados com três amostras, pelos métodos de Baermann-Moraes (BAERMANN, 1917; MORAES, 1948) e de Lutz (1919).
Grupo 4 – 40 amostras de soro de indivíduos com sorologia positiva para
estrongiloidíase e negativos nos exames coproparasitológicos.
Grupo testado em conjunto com o grupo I para análise da avidez de anticorpos IgG.
3.3 Obtenção de larvas filarioides (L3) de S. venezuelensis
A linhagem de S. venezuelensis foi isolada de roedor silvestre Necromys
lasiurus Lund (1840) (Rodentia, Cricetidae) em abril de 1986 e cedida pela Profa. Dra.
Marlene Tiduko Ueta do Laboratório de Parasitologia, Instituto de Biologia, Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP), São Paulo, Brasil. O parasito é mantido experimentalmente pela infecção em ratos da espécie Rattus norvegicus (Rodentia, Muridae) da linhagem Wistar Greenman & Donaldson (1906), pelo Laboratório de Diagnóstico de Parasitoses do Instituto de Ciências Biomédicas, UFU, Minas Gerais, Brasil.
Ovos e larvas rabditoides (L1 e L2) de S. venezuelensis presentes nas fezes dos ratos Wistar infectados foram mantidas em cultura de carvão mineral por 3 dias a 28°C, segundo Looss (1905 apud NEVES et al., 2005). Após este processo larvas filarioides (L3) foram recuperadas pelo método de Rugai, Mattos e Brisola (1954). As L3, depois de recuperadas, foram contadas e conservadas a –20°C até o momento das preparações antigênicas.
3.4 Métodos parasitológicos
3.4.1 Coprocultura pelo método de Looss
O material fecal foi cultivado pelo método de Looss (1905 apud NEVES et al., 2005) misturando-se partes iguais de fezes e carvão mineral úmido. Para a mistura foi utilizado béquer, bastão de vidro, luvas descartáveis e recipientes plásticos descartáveis (100 mL). Os recipientes foram cobertos com gaze cirúrgica. As culturas foram colocadas em estufa BOD – Biochemical Oxygen Demand (TE 390, Tecnal, Piracicaba, Brasil) à temperatura de 28°C e 70% de umidade por três dias. Após este procedimento as larvas foram recuperadas pelo método de Rugai, Mattos e Brisola (1954).
3.4.2 Técnica de Rugai, Mattos e Brisola e processamento das larvas recuperadas
A recuperação das larvas de S. venezuelensis, após a coprocultura pelo método de Looss (1905 apud NEVES et al., 2005), foi baseada no método de Rugai, Mattos e Brisola (1954). Cálices de sedimentação foram preenchidos com água corrente aquecida à temperatura de 40-45°C. Os recipientes de cultura, cobertos com gaze, foram embocados para o interior dos cálices, de modo que a água alcançasse toda a extensão da abertura. O sistema cálice e recipiente foi mantido em repouso por um período de 1 hora. O sedimento com larvas foi coletado com pipeta capilar longa e transferido para tubos de ensaio. Cada tubo de ensaio foi centrifugado a 1.000 x g por 15 minutos e submetido a cinco lavagens em solução salina tamponada de fosfato (PBS) (0,15 M, pH 7,2), durante três minutos para retirada dos resíduos. Após a última lavagem, o sedimento de larvas foi ressuspenso e 10 l desta suspensão foi diluída e analisada em microscópio óptico de luz em aumentos de 4x, para contagem das larvas filarioides
(Eclipse E200, Nikon Instruments, Melville, EUA). As L3 de S. venezuelensis, recuperadas e contadas, foram utilizadas para manutenção da cepa, em ratos experimentalmente infectados, ou foram distribuídas em alíquotas e mantidas a –20°C.
3.5 Produção de extrato de S. venezuelensis
3.5.1 Extrato salino
O extrato salino (ES) foi produzido a partir de alíquotas com aproximadamente 250.000 larvas filarioides de S. venezuelensis. As larvas foram descongeladas e ressuspendidas em 1 mL de PBS. Coquetel de inibidores de proteases foi utilizado e consistiu de 1 mM PMSF (fluoreto de fenilmetilsulfonil), 1 mM EDTA (ácido etilenodiamino tetra-acético), 1 mM benzamidina, 1 µg/mL aprotinina, 2 µg/mL leupeptina. Depois foram rompidas por criólise em 10 ciclos de banho de nitrogênio líquido (1 minuto; –196°C) seguidos de sonicação (5 minutos; 40 kHz; 37°C). Após esse procedimento larvas inteiras não foram visualizadas em microscópio. O preparado foi incubado sob agitação lenta por 18 horas à 4°C e em seguida, centrifugado a 12.400 x g por 30 minutos a 4°C.
O sobrenadante, extrato salino, foi analisado para dosagem proteica pelo método de Lowry et al., (1951) e dosagem de carboidratos pela reação fenol-ácido sulfúrico (MATSUKO et al., 2005). Foi obtido aproximadamente 1 mL de antígeno com concentração proteica média de 1.500 µg/mL e 1.000 µg/mL de carboidratos. O extrato salino obtido foi distribuído em alíquotas e armazenado a –20°C até o momento do uso.
3.6 Cromatografia do extrato salino de S. venezuelensis
3.6.1 Cromatografia em agarose-concanavalina-A do extrato salino
Extrato salino foi aplicado, para cromatografia de afinidade, à resina de agarose com concanavalina-A imobilizada (Sigma, St. Louis, EUA) para obter as frações não-ligante (FNL Con-A) e ligante (FL Con-A). Preparou-se a solução aquosa da resina para um volume final de 500 µL, após empacotamento em fluxo lento com tampão de estoque e lavagem (TEL) (1 M NaCl; 5 mM MgCl2, 5 mM MnCl2 e 5 mM CaCl2) gelado
(2-8°C). A coluna foi utilizada de acordo com as recomendações do fabricante, com modificações. Primeiramente, foi pré-lavada com TEL cinco vezes o volume da coluna; equilibrada com TEL diluído duas vezes em água − tampão de equilíbrio (TE) − (pH 6,5-7,5). Foram aplicados 2 mg de massa proteica de ES diluído em TE em fluxo lento; o conteúdo foi reaplicado seis vezes para a ligação dos glicoconjugados à lectina. FNL Con-A foi coletada em alíquotas de aproximadamente 1 mL e monitoradas quanto à presença de conteúdo proteico pelo método de Bradford (1976). A remoção completa foi feita com TE até que o conteúdo estivesse livre de proteína, quando a leitura atingiu valor próximo ao do tampão.
Procedeu-se a eluição com TE acrescido de α-D-manopiranosídeo (500 mM) (Sigma, St. Louis, EUA) incubado em repouso por 15 minutos. Em seguida a FL Con-A foi coletada e monitorada como descrito. Con-Após o uso, a resina foi lavada com TE para retirada do excesso de açúcar e regenerada com 2-3 ciclos de lavagem em tampão básico (0,1 M Tris, pH 8,5, 0,5 M NaCl) seguido de tampão ácido (0,1 M acetato de sódio, pH 4,5, 1 M NaCl) e estocada em TEL. Ao final, foi estocada em TEL e armazenada a 4°C.
Os tubos, com as frações, foram lidos em espectrofotômetro a 280 nm (432C, FEMTO, São Paulo, Brasil). As alíquotas que formaram os picos de absorbância
foram agrupadas – FNL Con-A e FL Con-A – e armazenadas –20°C. A dosagem proteica foi feita pelo método de Lowry et al. (1951).
3.7 Análise do perfil eletroforético das amostras antigênicas
3.7.1 Gel de poliacrilamida com dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE)
A técnica de eletroforese em gel de poliacrilamida com dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE) foi realizada para analisar perfil proteico do extrato salino e das frações antigênicas de S. venezuelensis. As amostras e os padrões de massas moleculares foram submetidos a SDS-PAGE, em condições desnaturantes e não redutoras, de acordo com Laemmli (1970).
O gel foi preparado em suporte do sistema completo de cuba eletroforética vertical para mini-gel (SE 250, GE Healthcare, Piscataway, EUA). Antes da aplicação no gel, o extrato e as frações foram diluídos em tampão de amostra (Tris-HCl 100 mM, pH 6,8, SDS 4%, azul de bromofenol 0,2% e glicerol 20%) e então submetidos a aquecimento por três minutos em banho-maria. As placas foram acopladas nas cubas contendo tampão de corrida Tris-glicina. A migração dos polipeptídeos ocorreu em corrente de 25 mA e voltagem de 150 V por, aproximadamente, duas horas. Padrão de massa molecular foi utilizado para o cálculo das massas moleculares relativas das bandas proteicas presentes nas amostras.
Geis de pente único foram submetidos à eletrotransferência, conforme descrito no item 3.8.2; geis com os preparados antigênicos foram corados. A coloração do gel foi realizada com nitrato de prata pelo método de Friedman (1982). O gel foi digitalizado em scanner para documentação. Massas moleculares das bandas
