Departamento de Microbiologia Insti tuto de Ciências Biológicas Universidade Federal de Minas Gerais htt p://www.icb.ufmg.br/mic
O gênero Mycobacterium compreende bacilos longos (bastonetes), com extremidades fusiformes, aeróbios, imóveis (exceto a espécie Mycobacterium marinum, que tem se mostrado móvel no in-terior de macrófagos) não esporulados e de crescimento rápido ou lento; exibem nutrição relati va-mente simples, tendo a amônia como fonte de nitrogênio e o glicerol e acetato como única fonte de carbono e doador de elétrons. Quanto à genéti ca, as micobactérias apresentam um alto teor de guanina e citosina no seu DNA. Sua parede celular (fi gura 1) contém ácidos graxos de cadeia longa (C78 – C90), denominados ácidos micólicos, que se ligam covalentemente ao pepti dioglicano da parede micobacteriana, além disso, apresentam outras estruturas como polissacarídeos, lipoarabi-nomanano, fosfatí deos e lipídeos externos. O elevado teor lipídico (aproximadamente 60%) de sua parede celular torna as micobactérias álcool ácido-resistente. Devido a essa natureza hidrofóbica as micobactérias formam colônias densas, compactas e frequentemente rugosas e que, em meios sólidos, não se disseminam pelo Ágar.
Bacilo álcool-ácido resistentes (BAAR):
Gênero Mycobacterium
Morfologia e Fisiologia
A técnica de Ziehl Neelsen de coloração (Tabela 2 e Figura 2) é empregada na identificação de mico-bactérias que, como abordado anteriormente são bacilos álcool ácido-resistentes - BAAR (aquelas que, uma vez coradas com corantes básicos, não podem ser descoradas com soluções de álcool e ácido devido à constituição lipídica da parede celular).
Além de espécies de vida livre, o gênero Mycobacterium engloba microrganismos patogênicos, como M. tuberculosis, M. bovis, M. avium, M. intracellulare, e M. leprae, que causam doenças crô-nicas com lesões infecciosas granulomatosas
Corantes Procedimento Resultados
Fucsina
- Dissolver 3g de fucsina básica em 10 ml de etanol 90%-95% - Adicionar 90 ml de uma solu-ção aquosa de fenol a 5% Álcool – ácido
- Adicionar 3 ml de HCl concen-trado em 97 ml de etanol a 90%-95%.
Azul de Metileno
- Dissolver 0.3 g de cloreto de azul de metileno em 100 ml de água destilada.
- Fixar o esfregaço na lâmina, na chama do bico de Bunsen.
- Cobrir o esfregaço com a fucsina.
- Aquecer, sem deixar ferver, 3 a 4 vezes em um período de 5 min.
- Descorar com o álcool – ácido até remover todo o corante -2 min.
- Cobrir o esfregaço com azul de metileno – 2 min.
- Lavar com água. - Deixar a lâmina secar.
- Ler em microscópio óptico comum em objeti-va de imersão de 100x.
- Positivo: bacilos coram em vermelho, outras bactérias e células coram em azul.
- Negativo: não são observados bacilos em 300 campos exami-nados.
Tabela 1: Técnica de coloração Ziehl Neelsen
Figura 2: Bactérias do gênero Mycobacterium coradas pela técnica Ziehl-Neelsen. As bac-térias se apresentam em forma de bacilos longos corados em vermelho.
O M. tuberculosis agente etiológico da Tuberculose, em nível mundial, causa mais mortes do que qualquer outro agente microbiano. Aproximadamente um terço da população mundial encontra-se infectada por esse microrganismo. Anualmente,segundo estimativas da Organização Mundial de Saúde (OMS) 3 milhões de pessoas morrem devido a tuberculose, com ocorrência de 8 milhões de novos casos a cada ano.
Classificação de Runyon segundo a pigmentação das Micobactérias Grupo I:
Estão incluídas as micobactérias de crescimento lento. Produzem colônias com pigmentação de cor amarelada, quando expostas à luz. São, por isso, denominadas “fotocromógenas”, incluindo- se nes-se grupo M. kansasii, M. simiae e M. marinum.
Grupo II
Micobactérias de crescimento lento, que também produzem colônias com pigmentação de cor ama-relada, porém, independente de exposição à luz. São denominadas “escotocromógenas”, sendo re-presentantes desse grupo M. scrofulaceum, M. gordonae, M.flavescens lavescens e M. xenopi. Grupo III
Micobactérias de crescimento lento, que podem produzir pequena ou nenhuma pigmentação, mes-mo quando expostas à luz intensa. São denominadas acromógenas, sendo representantes desse grupo o complexo M. avium-intracellulare, M. terrae, M. triviale e M.gastri.
Grupo IV
Micobactérias de crescimento rápido (três a sete dias) que podem apresentar ou não pigmentação, sendo representante desse grupo o complexo M. fortuitum-chelonae. M. tuberculosis
Mycobacterium tuberculosis
Propriedades importantes
M. tuberculosis é um organismo aeróbico estrito, o que explica sua preferência por tecidos altamente oxi-genados, como o lóbulo superior do pulmão, e o fíga-do, apresentando manifestações clínicas nessas áreas. Apresentam crescimento lento, são imóveis, não espo-rulados, não encapsulados, resistentes ao ressecamen-to e com tempo de geração em ressecamen-torno de 15-20 horas. As formas saprofíticas tendem a crescer mais rapida-mente, proliferam bem entre 22°C e 33°C, produzem mais pigmento e são menos ácido-resistentes que as
outras formas patogênicas. Figura 3: Mycobacterium tuberculosis: coloração de Ziehl-Neelsen evidenciando disposição de cres-cimento em cadeias paralelas formando cordões (expressão do fator corda).
Uma característica importante do complexo M. tuberculosis é o agrupamento dos bacilos forman-do ramos alongaforman-dos e tortuosos, conheciforman-dos como cordas (a presença de ésteres de trealose - di-micolato de 6,6’-trealose - caracterizam o fator corda) (Figura 3). A observação de cordas ao exame microscópico (baciloscopia) é uma indicação de que se trata de bactéria do Complexo M. tubercu-losis. Este fator promove a agregação lateral e o entrelaçamento de longas cadeias de bactérias, as quais formam estruturas semelhantes a cordões, que podem ser facilmente visualizados em meios de cultura sólidos. O fator corda está relacionado à virulência do organismo, sendo que as cepas virulentas dos bacilos da tuberculose formam “cordões serpentiformes” microscópicos, enquanto as não virulentas não formam esses cordões.
Patogenia e Imunidade
A infecção é adquirida através da inalação de aerossóis infecciosos, que se propagam até as vias aéreas terminais. Possui período de incubação de 4 a 12 semanas. Os bacilos penetram nos ma-crófagos alveolares não ativados e as bactérias fagocitadas inibem a acidificação do fagossomo e a subseqüente fusão fagossomo-lisossomo. O M. tuberculosis se multiplica no interior de macrófa-gos e células dendríticas. Os macrófamacrófa-gos infectados podem se disseminar em direção aos linfono-dos locais ou pela corrente sanguínea, atingindo outros órgãos e tecilinfono-dos.
A tuberculose pulmonar é dividida em primária (primoinfecção) e secundária. A forma primária é a que ocorre em indivíduos que ainda não tiveram contato com o bacilo, sendo, portanto, mais comum em crianças. A forma secundária desenvolve-se a partir de uma nova infecção (reinfecção exógena) ou da reativação de bacilos latentes (reinfecção endógena).
Na primoinfecção, o Mycobacterium tuberculosis inalado atinge os alvéolos, onde ocorre um pro-cesso inflamatório inicial mediado por neutrófilos polimorfonucleares/macrófagos alveolares e a formação de um nódulo exsudativo. Se esse primeiro mecanismo de defesa não for suficiente para conter o avanço do bacilo, a fração lipídica e a tuberculoproteína do bacilo combinam-se aos recep-tores Fc dos macrófagos, tornando-os ativados e capazes de apresentar os antígenos do micro-or-ganismo aos linfócitos T no tecido linfóide associado aos brônquios. Nestes, os macrófagos ativados passam a secretar principalmente três tipos de citocinas: quimiotáxicas (p. ex.: leucotrieno B4 e interleucina 1), interferon e fator de crescimento de fibroblastos, constituindo-se assim uma rea-ção de hipersensibilidade. Os macrófagos ativados voltam aos alvéolos, aglomeram-se ao redor dos bacilos, transformando-se em células epitelióides, onde clones de células T formam um manguito periférico ao redor destas. Terminada a sua função fagocítica, as células epitelióides se agrupam e originam as células gigantes multinucleadas. Essa reação produtiva constitui o granuloma, cuja função básica é a de barreira à disseminação do bacilo a outros locais do tecido normal. O con-junto de granulomas formados recebe o nome de nódulo de Complexo de Ghon. Ao concon-junto de nódulo de Ghon, linfangite e linfadenite dá-se o nome de complexo primário da tuberculose que, dependendo do número e da virulência dos bacilos e do grau de hipersensibilidade e resistência do hospedeiro, pode evoluir para cura ou para doença.
A doença primária evolui a partir do foco pulmonar (processo pneumônico parenquimatoso) ou, com maior frequência, do foco ganglionar. Esses gânglios podem fistulizar-se para um brônquio adjacente e determinar a disseminação broncogênica da tuberculose. Com a expansão das lesões destrutivas, os bacilos atingem os vasos sanguíneos e disseminam-se para o pulmão e outros ór-gãos.
A lesão inicial parenquimatosa ou uma nova infecção originam a necrose central, liquefação e eli-minação do material por um brônquio de drenagem com a formação da cavitação. A partir da cavi-tação, os bacilos disseminam-se pelo pulmão por via brônquica (disseminação broncogênica) e, tal como na forma progressiva da infância, por via hematogênica (tuberculose miliar).
Diagnóstico
O principal método utilizado para o diagnóstico das formas clínicas da tuberculose é o microbiológi-co, envolvendo a pesquisa pelo método de Ziehl-Nielsen e a cultura do material em meio de Lowens-tein Jensen. Qualquer material, além do escarro (linfonodo, fragmento cerebral, osso, pleura etc.) deve ser encaminhado para a pesquisa direta e cultura, sendo este o padrão-ouro diagnóstico, pela maior sensibilidade do método, possibilidade de identificação da micobactéria e realização do perfil de sensibilidade. O tempo necessário para a cultura pode levar de 15 até 75 dias.
Métodos automatizados para hemocultura em meios de cultura específicos podem ser utilizados para melhora da sensibilidade e diminuição do tempo para positividade do exame. Pacientes imu-nodeprimidos que apresentam micobacteriemia possuem maior chance de positividade do exame. O diagnóstico histológico, a partir de qualquer fragmento tecidual, é bastante útil no diagnóstico. Muitas vezes, evidencia-se a presença do BAAR ou então a reação granulomatosa, às vezes com necrose caseosa, sugestiva da reação do hospedeiro frente à micobactéria. Deve-se lembrar que outras doenças infecciosas e não- infecciosas podem determinar a formação de granulomas muito semelhantes. A realização de exame imuno-histoquímico pode auxiliar o diagnóstico.
Exames radiológicos são fundamentais para o diagnóstico de todas as formas de tuberculose. Alte-rações sugestivas de tuberculose pulmonar em atividade como cavitações e árvore em florescência, podem ser evidenciadas em radiografias e tomografias de tórax. Alterações sugestivas podem ser evidenciadas em exames ultrassonográficos, tomográficos e de ressonância nuclear magnética, po-dendo ser utilizadas em diversas formas, como a tuberculose óssea, renal, intestinal etc.
O teste tuberculino é utilizado para evidenciar contato com a micobactéria, não evidenciando neces-sariamente doença em atividade. Há um grande número de condições que determinam resultados falso-negativos e falso-positivos do teste. Deve-se aplicar a PPD (Proteína Purificada Derivada do Ba-cilo da Tuberculose) no antebraço esquerdo, procedendo-se à leitura do maior diâmetro da indura-ção (não o eritema) determinada em 48 a 72 horas após a aplicaindura-ção. Considera-se reator o resultado acima de 10 mm em indivíduos imunocompetentes. Em indivíduos imunodeprimidos, considera-se reator valores acima de 5 mm. Em indivíduos com baixa probabilidade pré-teste e crianças com < 15 anos de idade, valoriza-se resultados acima de 15 mm.
Métodos de biologia molecular (PCR) em fragmentos de tecidos ou líquidos orgânicos são utilizados na tentativa de aumentar a sensibilidade diagnóstica e diminuir o tempo de execução do exame. Problemas com o custo do exame e padronização de técnicas são relacionados ao método.
Novos métodos imunológicos, ainda não disponíveis no Brasil, como o Quantiferon e o Elispot, po-dem constituir importante ferramenta no diagnóstico da infecção latente por micobactéria e da doença ativa.
Tratamento
A terapia com múltiplos fármacos é utilizada para prevenir a emergência de mutantes resistentes a fármacos durante a longa duração do tratamento (de 6 à 9 meses). A isoniazida (INH), um fármaco bactericida, corresponde à base do tratamento. O tratamento da maioria dos pacientes acometidos por tuberculose pulmonar é realizado com três fármacos: INH, rimfampicina e pirazinamida. INH e rifampicina são administrados por 6 meses, entretanto o tratamento com pirazinamida é interrom-pido após 2 meses. Em pacientes imunodeprimidos, que apresentam doença disseminada, ou que provavelmente albergam organismos resistentes a INH, um quarto fármaco, o etambutol, é acres-centado, sendo todos os quatro fármacos administrados por um período de 9-12 meses. Embora a terapia seja geralmente administrada durante meses, o escarro do paciente torna-se não infeccioso no período de 2-3 semanas após o início do tratamento. O tratamento prolongado deve-se aos se-guintes fatores:
- Localização intracelular do organismo;
- Presença de material caseoso, que bloqueia a penetração do fármaco; - Crescimento lento do organismo;
- Formas “persistentes” metabolicamente inativas no interior da lesão.
O tratamento de micro-organismos resistentes a mútiplos fármacos geralmente envolve o uso de quatro ou cinco fármacos, incluindo ciprofloxacina, amicacina, etionamida e cicloserina. As reco-mendações exatas dependem do padrão de resistência do isolado.
Profilaxia
O principal meio de prevenção da Tuberculose está associado à busca de casos novos de tuberculo-se e o tratamento adequado dos casos descobertos e o uso de máscaras e outros procedimentos de isolamento respiratório para impedir a disseminação da doença. Tanto a vacina quanto a quimio-profilaxia não protegem totalmente do adoecimento.
A vacina BCG reduz as formas graves da tuberculose na criança. A análise de 26 estudos prospecti-vos, caso-controle de vacina com BCG intradérmica, por COLDITZ5 , 1994, mostrou que a vacinação reduziria o risco de adoecer em 50,0% para a todas as formas da tuberculose. A vacina BCG está recomendada nos recém-nascidos, mesmo filhos de mães HIV +, desde que a criança não apresente sinais de imunodeficiência. Deve-se revacinar na idade escolar.
Na quimioprofilaxia a isoniazida deve ser considerada para as crianças menores de 5 anos, reato-res fortes ao teste tuberculínico, em contato com doente com tuberculose. Em maioreato-res de 5 anos, deve-se verificar o risco e o benefício da quimioprofilaxia, considerando-se a condição de crianças pertencentes ao grupo de risco. A pasteurização do leite e a eliminação do gado bovino infectado são também importantes formas de prevenção da tuberculose intestinal.
Mycobacterium leprae
Microrganismo descrito por Hansen em 1873. É o agente etiológico da hanseníase (lepra). São baci-los álcool-ácido-resistentes típicos encontrados normalmente em raspados de pele ou das mucosas em pacientes com hanseníase lepromatosa. O M. leprae não é cultivável em meios artificiais. Fisiologia
São parasitas intracelulares obrigatórios, com taxas de replicação extremamente lentas. O M. leprae é um organismo de baixa patogenicidade e somente algumas das pessoas supostamente infectadas desenvolvem a doença. Em exames histopatológicos os bacilos se apresentam dispostos em feixes paralelos, reunidos por uma substância de contenção não corável, chamada gléia.
Patogenia
A transmissão se dá provavelmente por perdigotos. A micobactéria parasita os macrófagos e as cé-lulas de Schwann, que formam a mielina dos nervos periféricos. O parasitismo intracelular resulta em deformidades principalmente nos tecidos mais frios do organismo (pele, membranas mucosas) e perda da sensibilidade nas partes afetadas. Os sintomas também podem incluir fraqueza mus-cular, lesões na planta dos pés, lesão das vias nasais, lesão dos olhos (podendo levar à cegueira), impotência e esterilidade em homens (os testículos podem ser afetados, reduzindo a produção de testosterona e espermatozóides).
limita-Diagnóstico
Exame histopatológico para detectar diretamente a sua presença no espécime clínico, o que é feito por coloração em lâmina da linfa proveniente das lesões pela técnica de Ziehl-Neelsen. Pode ser fei-ta fei-também uma PCR de pequenas quantidades do DNA da micobactéria para uma detecção direfei-ta das amostras clínicas. O teste de lepromina, embora tenha pequeno valor diagnóstico, é importante na avaliação do status imunológico do indivíduo.
Tratamento
Terapia de até 24 meses com dapsona (diaminodifenilsulfona), rifampicina e clofazimina. A terapia com múltiplas drogas tem alto índice de erradicação bacteriana (99,9%). Em alguns casos, podem ser necessários vários anos para o tratamento adequado da hanseníase.
Profilaxia
Tratamento dos doentes e administração de drogas quimioprofiláticas para crianças expostas à le-pra lepromatosa. Estudos tem sido realizados em primatas para avaliar a capacidade de imunização conferido pela administração intradérmica de BCG e BCG + bacilos M. leprae inativados ou mortos.
Outras Micobactérias
Na década de 50, Timpe e Runyon descobriram que outras micobactérias podiam causar doenças em seres humanos. Inicialmente, foram chamadas de micobactérias “atípicas” e, posteriormente, micobactérias não tuberculosas (MNTB), outras micobactérias que não o bacilo tuberculoso (MNBT) e micobactérias ambientais potencialmente patogênicas (MAPP). O grupo inclui várias espécies, que podem produzir uma variedade de condições clínicas semelhantes à tuberculose, afetando diversos órgãos.
Classificação
- Espécies do complexo M. avium (M. avium e M. intracellulare): doença pulmonar em pa-cientes imunocomprometidos.
- Espécies do complexo M. kansasii: causa mais comum de doença pulmonar causada por micobactéria NTB. O quadro clínico e o tratamento são semelhantes ao da tuberculose.
- Espécies do complexo M. fortuitum-chelonae: associadas às doenças de pele, pulmões, ossos, sistema nervoso central.
- M. marinum: causam nódulos subcutâneos róseos ou rosa-azulados. Granuloma da piscina. Afetam cotovelo, dedos e joelhos.
- M. ulcerans: causam úlceras cutâneas crônicas em pacientes que vivem nos trópicos. - M. scrofulaceum: linfadenite cervical em crianças.
- M. xenopi e M. szulgai: doença pulmonar semelhante à causada por M. tuberculosis, M. kansasii e do complexo M. avium.
Patofisiologia
O potencial patogênico para o ser humano varia entre as espécies de micobactérias. Em conjunto, são menos virulentos que M. tuberculosis. Englobam patógenos oportunistas em pacientes com outras doenças pulmonares, imunossuprimidos, ou com trauma percutâneo. Infecção disseminada normalmente é limitada aos pacientes imunossuprimidos. Em geral, são doenças de progressão
Diagnóstico
O diagnóstico de doença pulmonar é definido a partir de critérios clínicos, radiológicos e bacterio-lógicos. Os pacientes precisam apresentar sinais e sintomas compatíveis, como tosse, fadiga, perda de peso, hemoptise, suores noturnos, febre, raio X anormal.
No mínimo, devem ser colhidas três amostras de escarro ou lavado brônquico em um ano. Os re-sultados incluem três culturas positivas com esfregaço B.A.A.R. negativo, ou duas culturas positivas com esfregaço B.A.A.R. positivo.
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