Análise biológica da hidroxiapatita
após implantação em tíbias de ratos
*Biological analysis of hydroxyapatite
after tibial rat implantation
ANA CRISTINADE RESENDE1, LUCIANO REZENDEDA CUNHA2, SYBELE SASKA1, ELENY BALDUCCI-ROSLINDO3, ANA MARIA MINARELLI-GASPAR4
* Trabalho realizado no Departamento de Morfologia da Faculdade de Odon-tologia da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” – UNESP – Araraquara (SP), Brasil.
1. Acadêmica de Odontologia, Faculdade de Odontologia da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” – UNESP – Araraquara (SP), Brasil.
2. Pós-Graduando em Cirurgia e Traumatologia Buco-Maxilo-Facial, Facul-dade de Odontologia da UniversiFacul-dade Federal de Uberlândia – UFU – Uber-lândia (MG), Brasil.
3. Professor Doutor da Disciplina de Histologia, Departamento de Morfolo-gia, Faculdade de Odontologia da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” – UNESP – Araraquara (SP), Brasil.
4. Professor Doutor da Disciplina de Anatomia, Orientadora, Departamento de Morfologia, Faculdade de Odontologia da Universidade Estadual Pau-lista “Júlio de Mesquita Filho” – UNESP – Araraquara (SP), Brasil.
Endereço para correspondência: Rua Humaitá, 1.680 – 14801-903 –
Arara-quara (SP) – Brasil. Tel.: (16) 3301-6490. E-mail: anamaria@foar.unesp.br Recebido em 4/5/05. Aprovado para publicação em 14/3/06.
Copyright RBO2006 RESUMO
Objetivo: Avaliar o comportamento biológico do mate-rial sintético hidroxiapatita, através da análise histológi-ca, após a implantação em tíbias de ratos. Métodos: Fo-ram utilizados 20 ratos machos (Rattus norvegicus Holtzman). Sob anestesia após assepsia, foi realizada incisão de 15mm em cada perna, expondo a região anterior da tíbia. Utili-zando um micromotor e um disco de aço, foi feita uma fissura longitudinal (15mm a 2mm) no osso, onde foi apli-cada uma pasta de hidroxiapatita na tíbia direita (lado tratado). Na tíbia esquerda (lado controle), nenhum ma-terial foi aplicado. Os animais foram sacrificados após 10, 20, 30 e 45 dias. As tíbias removidas foram fixadas em
solução de Bouin por 72 horas e processadas histologica-mente segundo técnica rotineira para inclusão em parafi-na e cortes semi-seriados de 6mm, corados em HE. Resul-tado: Na análise dos cortes histológicos não foi observada reação inflamatória em nenhum período, tanto no grupo controle como no tratado: a hidroxiapatita apresentou bio-compatibilidade ao contato direto com o tecido ósseo. Descritores – Durapatita/análise; Tíbia; Materiais biocompatíveis;
Ratos
ABSTRACT
Objective: To assess the biological behavior of hydroxyapatite, a synthetic material, through histological analysis after tibial rat implantation. Methods: A total of 20 male rats (Rattus norvegicus Holtzman) were employed. Under anesthesia and after prepping, a 15-mm long incision was placed to each leg, so that the anterior tibial region could be exposed. A longitudinal fissure (15 mm to 20 mm) was created with a micro burr and steel disk to the right tibia (treated side), where hydroxyapatite paste was applied. No material was applied to the left tibia (control side). Animals were sacrificed after 10, 20, 30, and 45 days, when tibiae were removed and fixed in Bouin’s solute for 72 hours, and then histologically processed according to standard paraffin inclusion technique, with semiserial 6-mm cuts stained with H.E. Result: Upon histological cuts, no inflammatory reaction was seen in any period, both for the control group and for the treatment group. Hydroxyapatite presented biocompatibility to bone tissue direct contact.
Keywords – Durapatite/analysis; Tibia; Biocompatible materials; Rats
Análise biológica da hidroxiapatita após implantação em tíbias de ratos 133
INTRODUÇÃO
Um implante ideal, segundo Constantino et al, deve pos-suir oito características: ser resistente a infecções; forte o ciente para resistir a algum trauma na região; capaz o sufi-ciente de contornar algum defeito; permanecer estável por longo tempo; produzir o mínimo de respostas inflamatórias; ser radiopaco para visualização em diagnósticos de imagem; não ser alérgico e nem carcinogênico; além disso, ser sintéti-co, o que eliminaria a possibilidade de transmissão de doen-ças por não ter a participação de doadores no processo(1).
Apesar de alguns materiais sintéticos terem alcançado um estágio de sucesso em procedimentos cirúrgicos, a maioria de suas dificuldades é a respeito da biocompatibilidade origina-da durante a aplicação ou após a implantação. A hidroxiapati-ta, uma matriz mineral que constitui o osso, é material bio-compatível e pode ser implantada sob a forma de blocos ou grânulos(2-3). O cimento de hidroxiapatita facilita o contorno
ósseo, além de ser clinicamente usado como uma biocerâmi-ca reparadora de osso pela sua similaridade com a composi-ção do osso mineral e pela capacidade de sua osteoinducomposi-ção (4-5). Sepulveda et al mostraram que a hidroxiapatita apresenta
alto potencial de osteoindução, promovendo uma estrutura po-tente para ser usada em substituição óssea em ortopedia, rurgia reconstrutiva craniofacial, implante dentoalveolar e ci-rurgias orais em geral(6).
A densidade mineral do osso foi medida em pacientes tra-tados cirurgicamente com hidroxiapatita aplicada no tornoze-lo e os resultados demonstraram que houve aumento na den-sidade óssea no lado onde se aplicou o material. Concluiu-se que a hidroxiapatita estimulou a osteogênese e o aumento da densidade óssea parece ser um fenômeno duradouro(7).
Andrade et al realizaram incisuras na superfície anterior e medial do fêmur de ratos e preencheram com hidroxiapatita densa (fêmur esquerdo) e com hidroxiapatita porosa (fêmur direito). Observaram, por meio de análise histológica e mi-crorradiológica, a presença de osso trabecular ao redor e so-bre os implantes e que este mostrou decréscimo na sua densi-dade após a segunda semana como resultado do processo de remodelação óssea(8).
Grânulos de hidroxiapatita foram utilizados na reparação de tecido ósseo em fêmur de humanos e a análise histológica revelou que a periferia da área implantada ficou completa-mente rodeada por osso; em algumas áreas, os grânulos fica-ram parcialmente em contato com o osso existente e o restan-te foi rodeado por restan-tecido fibroso(9). Tachibana et al concluíram
que os grânulos de hidroxiapatita estão sujeitos ao processo
de biodegradação e que não ocorrem, nesses casos, reações de corpos estranhos(9).
O sucesso no uso do cimento de hidroxiapatita em cirurgia do osso temporal foi observado em 97% dos defeitos ósseos em que a reconstrução permaneceu estável e a reparação foi adequada(10).
O objetivo deste trabalho foi avaliar o comportamento bio-lógico do material sintético hidroxiapatita, através da análise histológica, após a implantação em tíbias de ratos e sua rela-ção com a regenerarela-ção óssea.
MÉTODOS
Foram utilizados 20 ratos machos (Rattus norvegicus
Hol-tzman) de aproximadamente 200g que foram anestesiados com
o medicamento Rompun® (0,01ml/100 gramas do peso
cor-poral – Bayer) associado ao medicamento Ketmaina Agener®
(0,1ml/100 gramas do peso corporal – Agener União). Após assepsia e remoção dos pêlos na região anterior das pernas do animal, foi praticada uma incisão longitudinal de 15mm em cada uma, expondo a região anterior da tíbia, seguindo-se des-colamento do periósteo.
Utilizando um micromotor e um disco de aço, foi realizada uma fissura longitudinal de 15mm a 2mm na cortical anterior das tíbias. A hidroxiapatita sintetizada pelo método de crista-lização direta, procedimento realizado no laboratório do De-partamento de Engenharia Química da Universidade Federal de São Carlos, foi dissolvida em água deionizada e a pasta resultante colocada na tíbia direita (lado tratado). Na tíbia es-querda (lado controle), nenhum material foi aplicado. Poste-riormente, os animais foram devidamente suturados, transfe-ridos para gaiolas isoladas e sua recuperação foi acompanhada diariamente com as corretas condições de alimentação, água, higiene. Administramos como analgésico pós-operatório o ácido acetilsalicílico na dosagem de 120-300mg/kg em dose única por via oral pós-efeito anestésico, como recomendado pela Canadian Council on Animal Care (CCAC). Após os pe-ríodos de 10, 20, 30 e 45 dias, os animais foram sacrificados, as tíbias removidas e fixadas em solução de Bouin por 72 horas. Posteriormente, as peças foram lavadas em água cor-rente, descalcificadas em solução de Morse (partes iguais de citrato de sódio a 20% e ácido fórmico a 50%), seguindo-se por várias lavagens em solução tampão fosfato de sódio (pH 7,0) e processadas segundo técnica rotineira para inclusão em parafina em que os cortes foram semi-seriados de 6µm e cora-dos em HE. Após a obtenção dos cortes, estes foram analisa-dos e fotografaanalisa-dos no fotomicroscópio Zenaval® (Zeiss),
per-Figura 1 – Grupo controle (10 dias). Observa-se a cavidade
cirúr-gica sem sinais de reparação tecidual (200x, HE).
Figura 2 – Grupo controle (20 dias). O periósteo invade a
cavida-de óssea, iniciando a reparação tecidual; observam-se músculo e uma proliferação angioblástica no interior da cavidade (200x, HE).
Figura 4 – Grupo controle (45 dias). A cavidade óssea está
total-mente reparada por tecido ósseo neoformado (200x, HE).
Figura 3 – Grupo controle (30 dias). A cavidade óssea está quase
totalmente preenchida por tecido ósseo neoformado com vários osteócitos (200x, HE).
tencente ao Departamento de Morfologia da Faculdade de Odontologia de Araraquara.
Este trabalho foi aprovado pelo Comitê de Ética na Experi-mentação Animal da Faculdade de Odontologia de Araraqua-ra/UNESP em 22/03/2004.
RESULTADOS Grupo controle (GC)
Aos 10 dias não foram observados sinais de reparação teci-dual (figura 1). Aos 20 dias notou-se o periósteo preenchendo a cavidade criada pela cirurgia e iniciando a formação óssea (figura 2). Aos 30 dias, observou-se que o tecido ósseo neo-formado preenchia a lesão cirúrgica quase totalmente, sendo notados inúmeros osteócitos na matriz (figura 3). Aos 45 dias,
a cavidade estava totalmente reparada por tecido ósseo (figu-ra 4). Em nenhum dos períodos fo(figu-ram observadas células in-flamatórias.
Grupo tratado (GT)
Aos 10 dias observou-se a cavidade cirúrgica e o periósteo preenchendo-a (figura 5). Aos 20 dias foram notados sinais de reparação com o início de formação óssea no interior da cavidade (figura 6). Aos 30 dias, observou-se o fechamento da cavidade por uma delgada camada óssea, porém sem o preenchimento total desta (figura 7). Aos 45 dias, o fecha-mento da cavidade foi constatado, havendo preenchifecha-mento por matriz óssea com osteócitos no seu interior (figura 8).
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Figura 5 – Grupo tratado (10 dias). A cavidade está recoberta por
tecido de granulação iniciando a reparação óssea (200x, HE).
Figura 6 – Grupo tratado (20 dias). Uma camada delgada de
pe-riósteo recobre a cavidade cirúrgica e observa-se o início da re-paração tecidual (200x, HE).
Figura 7 – Grupo tratado (30 dias). Observa-se uma ponte de
tecido ósseo neoformado cobrindo a cavidade cirúrgica e, no interior desta, tecido de reparação (200x, HE).
Figura 8 – Grupo tratado (45 dias). O tecido ósseo está
totalmen-te reparado, onde se observam ostotalmen-teócitos no intotalmen-terior da matriz óssea (125x, HE).
DISCUSSÃO
Na instalação de implantes endósseos podem ocorrer três possíveis respostas teciduais segundo Krauser: processo in-flamatório agudo ou crônico, que resultará na perda precoce do implante ou encapsulação por tecido conjuntivo fibroso, que originará resposta positiva, com formação de tecido ós-seo vivo em torno do implante, com característica previsível e duradoura, estabelecendo um contato mecânico – ancoragem do implante – condição denominada osteointegração(11). Nos
nossos resultados observamos que a evolução no processo de neoformação óssea se faz com ausência de reação inflamató-ria, que tal processo de reparação foi gradativo ao longo dos períodos, e que não houve aceleração da neoformação óssea. Resultados, também, observados por diversos autores(3,8-10,12-14).
No primeiro período de observação (10 dias), os dois gru-pos (GC e GP) se comportaram de forma semelhante, com au-sência de reparação óssea e presença de cavidade cirúrgica. Aos 20 dias o grupo controle mostrou sinais de reparação mais avançados que o grupo tratado e este comportamento se man-teve nos períodos subseqüentes; após esse período, a forma-ção óssea foi semelhante e aos 45 dias a reparaforma-ção estava com-pleta, nos dois grupos.
Concordamos com vários autores, que descrevem que a hi-droxiapatita é um material biocompatível(3,4,8-10,12-14).
Discor-damos de Damien et al, que afirmam que o material acelera a reparação óssea(5).
É importante mencionar o papel do periósteo na reparação do tecido ósseo, visto que oferece células capazes de induzir a
neoformação óssea. Em alguns animais em que havia sido acidentalmente retirado o periósteo, houve o processo de re-modelação a partir do endósteo.
CONCLUSÃO
Segundo a proposição e a metodologia utilizada neste tra-balho, podemos concluir que:
– A hidroxiapatita apresentou biocompatibilidade frente ao contato direto com o tecido ósseo; houve evolução no proces-so de neoformação óssea, mas não ocorreu aceleração desse processo frente a esse material em comparação com o grupo controle;
– Em nenhum período, nos dois grupos analisados, foi ob-servada reação inflamatória.
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