PLATELIA ASPERGILLUS EIA 96 TESTES 62796

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(1)PLATELIA™ ASPERGILLUS EIA 96 TESTES. 62796. O PLATELIA™ ASPERGILLUS EIA É UM ENSAIO IMUNOENZIMÁTICO EM MICROPLACA TIPO SANDUÍCHE PARA DETECÇÃO DO ANTIGÉNIO GALACTOMANNAN DE ASPERGILLUS NO SORO..

(2) 1- DESCRIÇÃO O Platelia™ Aspergillus EIA é um ensaio imunoenzimático em microplaca tipo sanduíche para detecção do antigénio galactomannan de Aspergillus em amostras de soro.. 2- INDICAÇÕES DE UTILIZAÇÃO O Platelia™ Aspergillus EIA é um teste que, quando utilizado em simultâneo com outros processos de diagnóstico, nomeadamente cultura microbiológica, exame histológico de amostras de biopsia e evidência radiográfica, pode actuar como ajuda no diagnóstico de aspergilose invasiva.. 3- RESUMO E EXPLICAÇÃO As infecções por Aspergillus ocorrem habitualmente após a inalação de esporos de Aspergillus que se encontram no ambiente. As formas invasivas, que têm registado um crescimento durante os últimos 10 anos, constituem as formas mais graves de infecção. Tais infecções ocorrem principalmente em doentes neutropénicos (após tratamento oncológico) e outros submetidos a tratamentos com imunosupressivos (transplantes de órgãos, sobretudo transplantes de medula óssea) e corticosteróides 7. O Aspergillus isola-se raramente da cultura sanguínea. O diagnóstico baseia-se com frequência no diagnóstico não específico ou na evidência radiológica (sintomatologia clínica, TAC, radiografia torácica, etc.) Na actualidade, o teste para detecção do antigénio galactomannan solúvel no soro parece constituir um método serológico capaz de contribuir para o diagnóstico da aspergilose invasiva 6, 9, 14, 34, 39.. 4- DESCRIÇÃO DO PROCEDIMENTO. 27. O Platelia™ Aspergillus EIA é um ensaio imunoenzimático em microplaca tipo sanduíche de fase 1 que detecta o galactomannan no soro humano. O ensaio utiliza os anticorpos monoclonais de rato EBA-2, que são dirigidos contra o Aspergillus galactomannan, e foram caracterizados em estudos anteriores 16, 28. Os anticorpos monoclonais são utilizados, (1) para revestir os poços da microplaca e ligar o antigénio, e (2) para detectar o antigénio ligado à microplaca sensibilizada (reagente conjugado: anticorpos monoclonais ligados a peroxidase). As amostras de soro são sujeitas a um tratamento térmico na presença de EDTA para dissociar complexos imunes e para precipitar proteínas séricas que possam eventualmente interferir no teste 15. As amostras de soro tratadas são adicionadas nos poços revestidos com anticorpos monoclonais e incubadas. É formado um complexo anticorpo monoclonal - galactomannan – anticorpo monoclonal / peroxidase na presença do antigénio galactomannan. As tiras são lavadas para eliminar qualquer vestígio de material não ligado. Seguidamente, é adicionada a solução de substrato, que reagirá com os complexos ligados ao poço para formar uma reacção de cor azul. A reacção enzimática é interrompida através da adição de ácido, que provoca a alteração de cor de azul para amarelo. A absorbância óptica das amostras e controlos é determinada através de um espectrofotómetro regulado para um comprimento de onda de 450 e 620 nm.. 5- REAGENTES Platelia™ Aspergillus EIA: produto Nº. 62796 (96 Testes) Armazene o kit a uma temperatura de 2-8°C. Coloque todos os reagentes à temperatura ambiente (18-25°C) antes de os utilizar. Restabeleça a temperatura de todos os reagentes, excepto controlos, para 2-8°C imediatamente após o uso. Após a reconstituição, o controlo negativo, o controlo cut-off e o controlo positivo devem ser congelados à temperatura de -20°C. Volte a colocar as tiras/placas não utilizadas na carteira e volte a fechar. Não retire o dessecante. As tiras devem ser utilizadas até 5 semanas após a abertura e selagem da carteira. Após a diluição, a solução de lavagem pode ser conservada durante 14 dias a 2-8°C. Todos os restantes reagentes permanecem estáveis até à data de validade após abertura. Os reagentes são fornecidos em quantidade suficiente para realizar 96 testes num máximo de 9 lotes.. 94.

(3) Componente Microwell Strip Plate. R1. Conteúdo Microplaca : - 96 poços (12 tiras de 8 poços cada ) revestidas com anticorpos monoclonais anti-galactomannan. Quantidade 1 Placa / 12 x 8 poços 1 x 100 mL. R2. Concentrated Washing Solution. R3. Negative Control Serum. Soro de controlo negativo: - Soro humano congelado e desidratado negativo para galactomannan - Negativo para anticorpos anti-HIV-1, anti-HIV-2, anti-HCV e antigénio HBs. 3 x qbp* 1 mL. R4. Cut-off Control Serum. Soro de controlo cut-off: - Soro humano congelado e desidratado com galactomannan - Negativo para anticorpos anti-HIV-1, anti-HIV-2, anti-HCV e antigénio HBs. 3 x qbp* 1mL. R5. Positive Control Serum. Soro de controlo positivo: - Soro humano congelado e desidratado com galactomannan - Negativo para anticorpos anti-HIV-1, anti-HIV-2, anti-HCV e antigénio HBs. 3 x qbp* 1 mL. R6. Conjugate. Conjugado (pronto a utilizar): - Anticorpo monoclonal anti-galactomannan / peroxidase etiquetado - Conservante: Timerosal a 0,01%. R7. Serum Treatment Solution. Solução de Tratamento à Base de Soro (pronto a utilizar): - Solução ácida EDTA. R8. TMB Substrate Buffer. Tampão/Substrato TMB (pronto a utilizar): - Solução de ácido cítrico e acetato de sódio - Peróxido de hidrogénio a 0,009% - Dimetilsulfóxido (DMSO) a 4%. 1 x 60 mL. R9. Chromogen: TMB Solution. Solução de cromogénio TMB (concentrada): - Solução de dimetilsulfóxido a 90% (DMSO) com. 1 x 1 mL. R10. Stopping Solution Plate sealers. Solução de lavagem concentrada (10X): - Tampão Tris NaCl - Tween® 20 a 1% - Timerosal a 0,01%. 1 x 8 mL. 1 x 10,5 mL. ♦. tetrametilbenzidina (TMB) a 0,6% Solução de paragem (pronta a utilizar): - Ácido sulfúrico 1,5 N (H2SO4) - Folhas adesivas para microplacas. 1 x 12 mL 1 x 8 folhas. ♦ Nota: A TMB (Tetrametilbenzidina) é um cromogénio anticarcinogénico e antimutagénico para peroxidase. *Nota: qbp: Quantidade que baste para. 6- AVISOS AOS UTILIZADORES 1. Para utilização em diagnóstico in vitro. 2. Reservado a profissionais. 3. A utilização deste kit com amostras que não sejam de origem humana não é recomendada. 95.

(4) 4. O Controlo Positivo, o Controlo de Cut-Off e o Controlo Negativo são realizados a partir de soro humano testado e considerado como não reactivo para o antigénio Hbs e anticorpos ao VIH-1, VIH-2 e VHC, em testes com a marcação CE. Contudo, todos os reagentes devem ser manuseados como se tivessem capacidade de transmitir a infecção. Todos os testes devem ser realizados de acordo com a Norma OSHA [Occupational Safety and Health Administration – organismo para a segurança e saúde ocupacional] sobre patogénios transmitidos pelo sangue, biossegurança de nível 2 ou outras práticas de biossegurança apropriadas. 5. Usar vestuário protector, incluindo uma bata de laboratório, equipamento de protecção para os olhos e a face e luvas descartáveis (recomenda-se a utilização de luvas sintéticas, sem látex) e manusear os reagentes do kit e as amostras do paciente cumprindo o requisito das boas práticas laboratoriais. Lavar muito bem as mãos após efectuar o teste. 6. Não pipetar com a boca. 7. Não fumar, beber ou comer nas áreas onde as amostras ou os reagentes do kit estão a ser manipulados. 8. Evitar os salpicos de amostras ou de soluções. 9. Os derrames biológicos que não tenham ácido devem desinfectante eficaz. Os desinfectantes que podem ser solução de lixívia a 10% (solução de hipoclorito de sódio Plus™ a 0,5%. Os materiais utilizados na limpeza dos eliminados como resíduos biológicos.. ser cuidadosamente limpos com um utilizados incluem (entre outros) uma a 0,5%), etanol a 70% ou Wescodyne derrames poderão necessitar de ser. ATENÇÃO: Não coloque soluções com lixívia na autoclave. 10. Os derrames que contenham ácido devem ser adequadamente absorvidos (limpos) ou neutralizados com bicarbonato de sódio, devendo a área afectada ser lavada e seca; caso contenham materiais biológicos, a área deve ser limpa com um dos desinfectantes químicos. 11. Eliminar todas as amostras e materiais utilizados para efectuar o ensaio como se contivessem um agente infeccioso. Os resíduos químicos e biológicos laboratoriais devem ser manuseados e eliminados de acordo com todos os regulamentos locais, regionais e nacionais. 12. ATENÇÃO: A lista seguinte apresenta os potenciais perigos químicos associados a alguns componentes do kit (consultar a secção 5 – REAGENTES): A solução de paragem à base de ácido sulfúrico (7.2% H2SO4) a 1,5 N é corrosiva, podendo provocar queimaduras nos olhos e na pele; pode ser nociva se ingerida ou quando em contacto com a pele; pode provocar lesões oculares graves, incluindo a perda permanente da visão ou cegueira. C - Corrosivo Manter afastado de bases fortes e de agentes redutores. O R34-41 provoca queimaduras. Risco de lesões oculares graves. S24/25-26-30-36/37/39-60. Evitar o contacto com a pele e os olhos. Em caso de contacto com os olhos, lavar imediata e abundantemente com água e consultar um especialista. Nunca adicionar água a este produto. Usar vestuário de protecção, luvas e equipamento protector para os olhos e a face adequados. Este produto e o seu recipiente devem ser eliminados como resíduos perigosos. Os resíduos deste material são considerados como resíduos ácidos perigosos. No entanto, se tal for permitido pelos todos os requisitos aplicáveis, o mesmo pode ser neutralizado para o pH 6,9 para eliminação segura, se o utilizador tiver formação e estiver equipado para o fazer. O Timerosal a 0,01% (Mertiolato de Sódio), um conservante biocida à base de mercúrio orgânico que afecta o sistema nervoso central (SNC), é um tóxico reprodutivo e um sensibilizador significativo; a exposição prolongada ou repetida a esta substância pode provocar reacção alérgica em indivíduos predispostos; existem múltiplos casos de sensibilização resultante da exposição a soluções de Timerosal diluído. Evitar a libertação no ambiente; risco de efeitos cumulativos. As soluções utilizadas que contenham mercúrio numa concentração superior a 0,2 ppm devem ser eliminadas como resíduos perigosos segundo a lei federal RCRA [Resource Conservation and Recovery Act – lei relativa à gestão de resíduos perigosos] dos Estados Unidos da América (D009); contudo, todos os resíduos devem ser eliminados de acordo com todos os requisitos aplicáveis. 96.

(5) (Nota: a molécula de Timerosal é composta em 49,55% por mercúrio (Hg), pelo que um componente com Timerosal a 0,01% contém aproximadamente 0,005% (~ 50 ppm) de mercúrio p/v). Em caso de contacto com a pele, lavar imediatamente com água abundante. Atenção: no estado da Califórnia, o Timerosal é considerado um causador de toxicidade reprodutiva. 13. A Ficha de Dados de Segurança (FDS) está disponível mediante solicitação.. 7- PRECAUÇÕES PARA OS UTILIZADORES 1. AS AMOSTRAS DE SORO CONGELADAS EM CONDIÇÕES DESCONHECIDAS PODERÃO PRODUZIR RESULTADOS POSITIVOS FALSOS DEVIDO A CONTAMINAÇÃO POR FUNGOS E/OU BACTÉRIAS. 2. Não utilize o kit ou quaisquer reagentes do kit após a data de validade indicada. 3. Para além da solução de lavagem concentrada (R2) e da solução de paragem (R10), não misture reagentes de outros kits com números de lotes diferentes. 4. Coloque todos os reagentes à temperatura ambiente, pelo menos 15 minutos antes de os utilizar. 5. Misture completamente durante a reconstituição dos reagentes, tendo cuidado para evitar a contaminação microbiana. 6. Não realize o teste na presença de vapores reactivos (ácidos, alcalinos, aldeídos) ou poeira, pois podem afectar a actividade enzimática do conjugado. 7. Use recipientes limpos descartáveis em polipropileno para preparar a solução de reacção de substrato-cromogénio. Se for obrigatório o uso de óculos de protecção, deverá primeiro lavá-los com ácido clorídrico 1N, enxaguá-los com água destilada e por fim secos. 8. Para a pipetagem manual de controlos e amostras, utilize pontas de pipetas individuais para evitar a contaminação de amostras. 9. De modo a garantir a lavagem adequada dos poços, execute o número de ciclos de lavagem recomendado e certifique-se de que todos os poços são completamente cheios e depois completamente vazios. A lavagem não deve ser efectuada manualmente com um esguicho. 10. Não deixe a microplaca secar entre o final do ciclo de lavagem e a adição de reagentes. 11. Não utilize o mesmo recipiente para o conjugado e para as soluções de substrato. 12. Não deixe as soluções de conjugado ou de reacção de substrato-cromogénio entrar em contacto com metal ou iões metálicos. 13. Evite a exposição do cromogénio ou da solução de reacção de substrato-cromogénio à luz forte durante a fase de armazenamento ou incubação. Não permita que as soluções de cromogénio entrem em contacto com um agente oxidante. 14. Evite o contacto da solução de paragem com qualquer agente oxidante. Não deixe que a solução de paragem entre em contacto com metal ou iões metálicos. 15. Utilize materiais limpos e sem pó (tubos, pontas, recipientes, etc.) para minimizar a possibilidade de contaminação com esporos de Aspergillus do meios ambiente. Em virtude de o galactomannan ser estável ao calor, a esterilização do material utilizado não garante a ausência de antigénio contaminante. Os materiais sem pirogénio são óptimos, mas o material habitual pode ser utilizado com as precauções adequadas. 16. Limite a exposição de soluções (soros, solução de tratamento, conjugado) ou a abertura de recipientes (placas, tubos, pipetas) ao ar. 17. Não volte a colocar nenhuma quantidade de conjugado por utilizar no recipiente original. 18. A solução de reacção de substrato-cromogénio deve ser incolor. O surgimento da cor azul após a diluição indica que o reagente se encontra contaminado, não podendo por isso ser utilizado. Elimine-o e prepare um novo reagente.. 97.

(6) 8- PREPARAÇÃO E ARMAZENAMENTO DO REAGENTE Placa / tira com micropoços (R1) Depois de abrir a carteira das placas, as tiras de micropoços permanecem estáveis durante 5 semanas quando armazenadas à temperatura de +2-8°C no respectivo saco original com dessecante no seu interior.. Solução de lavagem de trabalho (R2): Prepare a solução de lavagem de trabalho de acordo com o necessário, adicionando uma parte de solução de lavagem concentrada para 9 partes de água desionizada esterilizada ou água destilada. A solução de lavagem de trabalho pode ser armazenada durante 14 dias à temperatura de 2-8°C. Prepare uma quantidade suficiente de solução de lavagem de trabalho para concluir a série (80 mL para uma tira: 8 mL de R2 + 72 mL de água destilada). Após a abertura, a solução de lavagem concentrada, armazenada à temperatura de +2-25°C, sem contaminação, permanece estável até à data de validade indicada na etiqueta.. Soro de controlo negativo (R3) Reconstitua o conteúdo de um frasco de controlo com 1000 µL (1 mL) de água purificada esterilizada (de preferência, água sem pirogénio). Os soros devem ser rehidratados precisamente antes da realização do teste. Misture completamente depois de um período de 2-3 minutos para rehidratação do soro. Aliquote 300 µL em cada um dos 3 tubos de microcentrifugação em polipropileno. Congele imediatamente à temperatura de -20°C os restantes tubos de centrifugação em polipropileno que serão utilizados após a rehidratação. Nota: Os soros de controlo que foram previamente rehidratados e imediatamente congelados à temperatura de -20°C podem ser descongelados e utilizados sem necessidade de nova rehidratação. Os controlos rehidratados congelados podem ser armazenados até cinco semanas à temperatura de -20°C. Manuseie os soros de controlo do mesmo modo que as amostras dos doentes (300 µL de soro + 100 µL de solução de tratamento, etc...).. Soro de controlo cut-off (R4) e soro de controlo positivo (R5) Prepare de acordo com a descrição acima relativa ao soro de controlo negativo.. Solução de reacção de substrato-cromogénio (R8 + R9) Prepare a solução de reacção de substrato-cromogénio, adicionando uma parte de solução TMB de cromogénio concentrada, R9, para 50 partes de tampão de substrato TMB, R8. Prepare 2 mL de solução de reacção de substrato-cromogénio por tira: 40 µL de R9 + 2 mL de R8. A solução permanece estável durante 6 horas quando armazenada no escuro à temperatura ambiente (+18-25°C). Após a abertura, os reagentes R8 e R9 armazenados à temperatura de +2-8°C, sem contaminação, permanecem estáveis até à data de validade indicada na etiqueta.. Conjugado (R6), solução de tratamento à base de soro (R7) e solução de paragem (R10) Após a abertura, os reagentes R6, R7 e R10 armazenados à temperatura de +2-8°C, sem contaminação, permanecem estáveis até à data de validade indicada na etiqueta.. 9- COLHEITA DE AMOSTRAS Realize a colheita de amostras de sangue de acordo com os procedimentos laboratoriais de rotina. O teste é realizado no soro. As amostras de soro não devem estar contaminadas com esporos fúngicos e/ou bactérias. Transporte e armazene amostras em tubos selados e não expostos ao ar. Enquanto não forem abertas, as amostras podem ser armazenadas à temperatura de 2-8°C até 5 dias antes da realização dos testes. Após a abertura inicial, as amostras podem ser armazenadas à temperatura de 2-8°C durante 48 horas antes da realização dos testes. Para um armazenamento mais prolongado, guarde o soro a -70°C. As amostras de soro podem ser sujeitas a um máximo de 4 ciclos de congelamento / descongelamento. As amostras congeladas previamente devem ser devidamente misturadas após o descongelamento antes da realização dos testes. 98.

(7) Os resultados não são afectados por amostras que contenham 20 mg/L de bilirrubina, amostras lipémicas que contenham o equivalente a 2 g/L de trioleina (triglicéridos) ou amostras hemolisadas que contenham 165 mg/L de hemoglobina. Não foram testadas interferências relacionadas com o excesso de albumina. Não descomplemente os soros.. 10- PROCEDIMENTO Materiais fornecidos Consulte a secção REAGENTES.. Materiais necessários, mas não fornecidos 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8.. 9.. 10. 11. 12. 13.. 14. 15. 16. 17. 18.. Água destilada esterilizada ou desionizada para diluição da solução de lavagem. Água purificada estéril para reconstituição dos soros de controlo. Papel absorvente. Luvas descartáveis. Óculos de protecção. Hipoclorito de sódio (lixívia) e bicarbonato de sódio. Pipetas ou multipipetas, reguláveis ou fixas, para medir e dispensar 50 µL, 100 µL, 300 µL e 1 000 µL. Tubos de microcentrífugação em polipropileno de 1,5 mL com rolhas herméticas, com capacidade para suportarem temperaturas até 120°C (bloco de aquecimento) ou 100°C (banho em água a ferver). a. Tubos com tampa roscada: Tubos cónicos de 1,5 mL, Bio-Rad Cat. Nº. 224-0100 ou equivalente. b. Tubos com tampa de encaixe: Tubos de ensaio EZ Micro, 1,5 mL, Bio-Rad Cat. Nº. 2239480 ou equivalente. Microtubos com tampa de segurança (VWR Cat. Nº. 6054001 ou equivalente). Estes “eppendorfs” vedam com segurança os tubos com tampa de encaixe impedindo a abertura das tampas em condições de mudança de temperatura e de pressão, permitindo também que os tubos sejam facilmente retirados do bloco de aquecimento ou do banho de água a ferver. Centrifugador de bancada de laboratório para tubos em polipropileno de 1,5 mL com capacidade para 10 000 g. Rack de microcentrífugação flutuante redonda para proveta de 1 L. Agitador de vórtice. Bloco de aquecimento. São recomendados os seguintes modelos de blocos de aquecimento: a. Modelo do bloco 1: Grant Cat. Nº. QBD1 (VWR Cat. Nº. 460-0074) b. Modelo de bloco 2: Grant Cat. Nº. QBD2 (VWR Cat. Nº. 460-0076) Bloco para o bloco de aquecimento: ambos os blocos de aquecimento devem ser utilizados com o bloco Grant Cat. Nº. QB-E1 (VWR Cat. Nº. 460-8517) Banho em água em ebulição a 100°C Incubador de microplaca a 37 ± 1°C. Dispositivo de lavagem de microplacas automático ou semi-automático. Leitor de microplacas equipado com filtros de 450 nm e 620 nm.. Comentários para procedimentos Os controlos negativos, positivos e cut-off devem ser testados em cada série para validação dos resultados do teste.. Tratamento dos soros Todos os soros de controlo: negativo(R3), cut-off(R4) e positivo(R5) devem ser processados ao mesmo tempo como amostras de teste: 1. Pipete 300 µL de cada soro de teste e controle em tubos de polipropileno individuais de 1,5 mL. 99.

(8) 2. Adicione 100 µL de solução de tratamento à base de soro (R7) em cada tubo. 3. Misture bem os tubos vigorosamente ou no agitador de vórtice. Feche hermeticamente o tubo para impedir a abertura durante o aquecimento; para tubos com tampa de encaixe: utilize um “eppendorf”. Não perfure a rolha. 4. Opção com bloco de aquecimento: Aqueça os tubos durante 6 minutos num bloco de aquecimento a 120oC. Os tubos devem ser colocados no bloco apenas quando for atingida a temperatura indicada.(*) OU Opção com banho-maria: Se utilizar banho em água a ferver: aqueça os tubos durante 3 minutos a 100oC. (*) 5. Remova cuidadosamente os tubos quentes do bloco de aquecimento ou do banho de água em ebulição e coloque num centrifugador. Centrifugue os tubos a 10 000 x g durante 10 minutos. 6. O líquido sobrenadante é utilizado para detecção do antigénio galactomannan. 7. Teste os líquidos sobrenadantes utilizando o seguinte procedimento. Após a preparação, o líquido sobrenadante pode ser removido e armazenado a 2-8°C até 48 horas antes de ser testado. Se a análise dos resultados indicar que é necessário repetir o teste, será necessário tratar outra alíquota de soro para testar. (*) É essencial um cumprimento rigoroso da temperatura indicada e do período de validade indicado, bem como a utilização do material recomendado. Não confie na temperatura registada no dispositivo; certifique-se de que a temperatura está em conformidade com as especificações utilizando um termómetro calibrado, que será instalado num tubo com óleo mineral: Deve ser alcançada uma temperatura de 120°C no interior do tubo inserido num bloco de aquecimento e uma temperatura de 100°C num banho de água em ebulição.. Procedimento EIA Cumpra rigorosamente o protocolo proposto. Cumpra as boas práticas laboratoriais. 1. Coloque os reagentes à temperatura ambiente (18 - 25°C), pelo menos 15 minutos antes de os utilizar. 2. Prepare a solução de lavagem, a solução de reacção de substrato-cromogénio e os controlos negativo, positivo e cut-off. 3. Prepare uma tabela para identificação de soros de teste e controlos na microplaca. Utilize um poço para o soro de controlo negativo (R3), dois poços para o soro de controlo cut-off (R4) e um poço para o soro de controlo positivo (R5). 4. Remova o suporte de placas e as tiras de micropoços (R1) da carteira das placas. Coloque novamente na carteira todas as tiras que não sejam utilizadas, com o dessecante, e feche novamente a carteira. 5. Misture o conteúdo do frasco de conjugado (R6) invertendo antes de utilizar. Adicione 50 µL de conjugado (R6) em cada poço. De seguida, adicione 50 µL de soro sobrenadante tratado em cada poço, conforme acima indicado. Não adicione amostras de soro nos poços antes do conjugado. 6. Tape a placa com o selante de placas, ou outro meio para impedir a evaporação, certificando-se de que toda a superfície fica coberta e impermeável. 7. Incube a microplaca num incubador de microplacas seco durante 90 ± 5 minutos a 37°C (± 1°C). 8. Remova o selante de placas. Aspire o conteúdo de todos os poços para um recipiente de resíduos (com hipocloreto de sódio). Lave a placa 5 vezes, utilizando no mínimo 370 µL de solução de lavagem de trabalho. Após a última lavagem, inverta a microplaca e bata levemente no papel absorvente para remover o líquido restante. 9. Adicione rapidamente 200 µL de solução de reacção de substrato-cromogénio (R8 + R9) em cada poço, evitando a exposição à luz forte. 10. Incube a microplaca no escuro à temperatura ambiente (18 a 25°C) durante 30 ± 5 minutos. Não utilize película adesiva durante esta fase de incubação. 11. Adicione 100 µL de solução de paragem (R10) em cada poço utilizando a mesma ordem para a adição da solução de substrato. Misture bem. 12. Limpe bem o fundo de cada placa. 100.

(9) 13. Leia a densidade óptica de cada poço a 450 nm (filtro de referência de 620 nm). As microplacas devem ser lidas no período de 30 minutos após a adição de solução de paragem.. 11- CONTROLO DE QUALIDADE (CRITÉRIOS DE VALIDADE) Controlo cut-off: A DO de cada soro de controlo cut-off deve ser ≥ 0,300 e ≤ 0,800. Controlo positivo: O índice do soro de controlo positivo deve ser superior a 2,00. DO controlo positivo (R5) I= > 2,00 DO média do controlo cut-off Controlo negativo: O índice do soro de controlo negativo deve ser inferior a 0,40. DO controlo negativo (R3) I = DO média do controlo cut-off< 0,40 Caso algum dos controlos não cumpra os critérios de validade supracitados, o ensaio perderá a validade e os resultados da amostra do doente não deverão ser reportados. O operador poderá optar por repetir o ensaio, depois de rever o procedimento, ou então contactar o fabricante para obter assistência. Caso o ensaio seja repetido, será necessário utilizar uma nova alíquota da mesma amostra.. Exemplo de cálculo: Amostra DO do controlo negativo (R3). Absorbância (DO) 0,117. DO do controlo cut-off (R4). 0,596 0,576. DO do controlo positivo (R5). 2,602. Cálculos Valor médio do controlo cut-off Para calcular a DO média do controlo cut-off (R4), adicione os valores da DO para cada réplica do controlo cut-off e divida o resultado por 2: (0,596 + 0,576) ÷ 2 = 0,586 Índice do controlo negativo Para calcular o índice do controlo negativo, divida a DO do controlo negativo pela DO média do controlo cut-off: I=. 0,117 = 0,20 0,586. Índice do controlo positivo Para calcular o índice do controlo positivo, divida a DO do controlo positivo pela DO média do controlo cut-off: I=. 2,602 = 4,44 0,586. Validade No exemplo acima: • Cada DO do controlo cut-off é ≥ 0,300 e ≤ 0,800 indicando que o controlo cut-off é válido. • O índice do controlo negativo é < 0,40, indicando que o controlo negativo é válido. • O índice do controlo positivo é > 2,00, indicando que o controlo positivo é válido. A série de testes neste exemplo é considerada válida visto que os resultados cumprem os critérios de validade para cada controlo. 101.

(10) 12- INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS A presença ou a ausência de antigénio galactomannan na amostra de teste é determinada pelo cálculo de um índice para cada amostra de doentes. O índice (I) é o valor da DO da amostra dividida pela densidade óptica média dos poços que contêm soro de controlo cut-off. Cálculo da densidade óptica média do controlo cut-off: Adicione as densidades ópticas dos dois poços que contêm soro de controlo cut-off (R4) e divida o total por 2. Cálculo de um índice (I) para cada soro de teste: Calcule o seguinte índice para cada soro de teste: Amostra DO I= DO média do controlo cut-off Os soros com um índice < 0,50 são considerados negativos para antigénio galactomannan. Nota: Um resultado negativo pode indicar que o resultado do doente se encontra abaixo do nível detectável do ensaio. Nota: Os resultados negativos não excluem o diagnóstico de aspergilose invasiva. Recomendase a repetição do teste se o resultado for negativo, mas se houver suspeita de doença. Os soros com um índice ≥ 0,50 são considerados positivos para antigénio galactomannan. Para todos os pacientes com resultados positivos, recomenda-se a repetição de uma alíquota da mesma amostra, bem como a colheita de uma nova amostra do paciente para teste de seguimento. Nota: Um valor de absorvência inferior a 0,000 pode indicar um erro no procedimento ou dos instrumentos, o qual deve ser avaliado. Esse resultado não é válido e a amostra deve ser novamente processada. Recomenda-se o rastreio regular (duas vezes por semana) dos pacientes de alto risco para aumentar a sensibilidade e a positividade precoce do teste. Nota: O teste EIA Platelia™ Aspergillus destina-se a ser utilizado como auxiliar no diagnóstico da aspergilose invasiva. Os resultados positivos obtidos com o teste EIA Platelia™ Aspergillus devem ser considerados em conjunto com outros procedimentos de diagnóstico como, por exemplo, culturas microbiológicas, exames histológicos de amostras de biopsias e dados radiográficos.. Exemplo de cálculo: Amostra DO do controlo negativo (R3). Absorbância (DO) 0,117 0,596 0,576 2,602 0,134 0,436 1,196. DO do controlo cut-off (R4) DO do controlo positivo (R5) Amostra do doente nº 1 Amostra do doente nº 2 Amostra do doente nº 3. Cálculos Consulte a secção Controlo de Qualidade (Critérios de Validade) para obter exemplos de cálculos que permitem determinar a validade dos controlos de ensaio. Valor médio do controlo cut-off Para calcular a DO média do controlo cut-off (R4), adicione os valores DO para cada réplica do controlo cut-off e divida o resultado por 2: (0,596 + 0,576) ÷ 2 = 0,586 Amostra do doente nº 1 Para calcular o índice da amostra do doente nº 1, divida a DO da amostra do doente nº 1 pela DO média do controlo cut-off: I= 102. 0,134 = 0,23 0,586.

(11) Neste exemplo, a amostra do doente nº 1 é negativa, visto que o índice de 0,23 é < 0,50. Amostra do doente nº 2 Para calcular o índice da amostra do doente nº 2, divida a DO da amostra do doente Nº 2 pela DO média do controlo cut-off: 0,436 = 0,74 0,586 Neste exemplo, a amostra do doente nº 2 é positiva, visto que o índice de 0,74 é ≥ 0,50. I=. Amostra do doente nº 3 Para calcular o índice da amostra do doente nº 3, divida a DO da amostra do doente nº 3 pela DO média do controlo cut-off: 1,196 = 2,04 0,586 Neste exemplo, a amostra do doente nº 3 é positiva, visto que o índice de 2,04 é ≥ 0,50. I=. 13- LIMITAÇÕES DO PROCEDIMENTO 1. Um teste negativo não pode excluir o diagnóstico de aspergilose invasiva. Os doentes em risco de contraírem aspergilose invasiva devem ser submetidos a testes duas vezes por semana. 2. O procedimento Platelia™ Aspergillus EIA e a interpretação dos resultados devem realizar-se quando se testarem amostras para detecção de antigénio galactomannan. Recomenda-se que o utilizador do kit leia atentamente a bula antes de realizar o teste. O procedimento de teste deve ser seguido atentamente, sobretudo quanto à pipetagem da amostra e do reagente, lavagem das placas e tempo dos procedimentos de incubação. 3. Caso não se adicione amostra ou reagente conforme indicado no procedimento, pode obterse um teste com um resultado negativo falso. Deve considerar-se a repetição do teste de amostras adicionais quando houver a suspeita clínica de aspergilose invasiva ou erro de procedimento. 4. Há a possibilidade de contaminação de poços de amostras de doentes negativos por poços de amostras de doentes/controlos positivos caso ocorra o derrame do conteúdo de um poço para outro devido a um manuseamento descuidado da microplaca ou a uma má técnica de pipetagem durante a adição dos reagentes. 5. O desempenho do Platelia™ Aspergillus EIA não foi avaliado com amostras de soro de recém-nascidos ou pediátricas. 6. O Platelia™ Aspergillus EIA pode proporcionar uma reduzida detecção de galactomannan em doentes com doença granulomatosa crónica (DGC) e síndroma de Job 36, 37. 7. A utilização concomitante de terapêutica antifúngica activa em alguns doentes com aspergilose invasiva pode provocar uma reduzida sensibilidade com o Platelia™ Aspergillus EIA 20. 8. O Platelia™ Aspergillus EIA foi avaliado para utilização com plasma ou outros tipos de amostras tais como urina, BAL ou CSF. 9. O desempenho do Platelia™ Aspergillus EIA não foi determinado para a leitura manual e/ou determinação de resultados visuais. 10. Outros géneros de fungos como, por exemplo, Penicillium, Alternaria, Paecilomyces, Geotrichum e Histoplasma mostraram reactividade com os anticorpos monoclonais EBA-2 de ratos utilizados em ensaio para detecção de Aspergillus galactomanano. Deve ser considerada a histoplasmose em áreas endémicas, incluindo partes dos Estados Unidos 23, 32, 38. 11. Reacções positivas sem sinais clínicos: Tendo em consideração a detecção precoce do antigénio galactomannan no soro mesmo antes do aparecimento de sinais clínicos e/ou radiológicos, geralmente observam-se reacções positivas sem sinais clínicos: correspondem a testes "positivos verdadeiros" em doentes para quem é determinado posteriormente tarde o diagnóstico de aspergilose invasiva comprovada ou provável. 103.

(12) No entanto, em alguns casos particulares, deverão ser considerados alguns factores aquando da interpretação do teste: a. Foram reportadas reacções positivas sem sinais clínicos, sobretudo em crianças pequenas 26. Apesar de alguns destes casos poderem estar relacionados com a circulação real de antigénios Aspergillus 5, a maioria dos casos podem ser considerados falsos positivos. b. A galactofuranose foi demonstrada em vários alimentos, particularmente em cereais, produtos à base de cereais e sobremesas com natas 1, 17. Ao contrário do leite humano, é frequente os leites humanizados conterem elevadas concentrações de galactomannan 10. Por conseguinte, o factor dietético deve ser levado em consideração no que concerne à interpretação do desenvolvimento da antigenemia em crianças pequenas e, na generalidade, em todos os doentes com barreira intestinal alterada 4, 10. Qualquer caso de antigenemia positiva não acompanhada por sinais clínicos deve ser interpretado ainda com mais cuidado nesta população de doentes 17. c. Existem relatos de resultados de testes de galactomannan positivos em doentes tratados com piperacilina / tazobactam . Também existem relatos de alguns lotes ou grupos de piperacilina / tazobactam que foram considerados positivos quanto a antigénio galactomannan. Por conseguinte, os resultados de testes positivos em doentes tratados com piperacilina / tazobactam devem ser interpretados com cuidado e confirmados por outros métodos de diagnóstico. Também foi relatada a detecção de galactomannan em alguns lotes de amoxicilina associada a preparações injectáveis de ácido clavulânico. Por conseguinte, os tratamentos com b-lactam semi-sintética devem ser levados em consideração ao interpretar o teste 1, 21. Não obstante, visto que o Platelia™ Aspergillus EIA pode detectar antigénio galactomannan muito antes de surgirem sinais clínicos ou radiológicos, a ocorrência de aspergilose invasiva não pode ser excluída. Por conseguinte, os doentes tratados com piperacilina/tazobactam com resultados de testes positivos devem ser acompanhados atentamente. d. Potencialmente, podem ser observadas reacções positivas na ausência de sinais clínicos nos pacientes que recebam, por via parentérica ou oral (na presença de uma alteração da barreira intestinal), produtos contendo galactomanano. A presença de galactomanano nestes produtos deve-se frequentemente à utilização de um processo de fermentação a partir de microrganismos fúngicos. Todavia, só será observado um resultado positivo no paciente caso a concentração sérica de galactomanano exógeno atinja ou ultrapasse o limite de detecção do teste. Deste modo, na presença de um resultado positivo suspeito com ausência de outros sinais indicadores, recomendamos que se informe sobre os produtos administrados ao paciente e, em particular, sobre os seus processos de fabrico e a origem das matériasprimas utilizadas 11, 24, 31.. 14- VALORES ESPERADOS A prevalência esperada de aspergilose invasiva varia com a população de doentes; foram reportadas taxas de 5-20% 7, 13. Realizou-se um estudo clínico num total de 4 873 amostras de soro de 239 episódios (203 doentes) com malignidade hematológica ou transplante de estaminais diagnosticadas com e sem aspergilose invasiva em dois centros de testes na Europa para determinar as características de desempenho do Platelia™ Aspergillus EIA. Visto que um doente podia ser incluído no estudo em mais do que uma ocasião, a análise foi realizada de acordo com os episódios por tratamento. Considera-se um episódio o período de tempo que rodeia um evento clínico (p. ex., transplante, GVHD (enxerto contra hospedeiro), etc.). Por conseguinte, pode ter sido observado mais do que um episódio para um único doente. A taxa de prevalência média para este estudo foi de 16% (38/239). A distribuição dos índices para estas populações é representada nas seguintes tabelas.. 104.

(13) Doentes diagnosticados sem aspergilose invasiva (população de controlo) Distribuição do valor do índice de soro da população de doentes de controlo N=3691 3500. Número de soros. Foi testado um total de 3 691 amostras de soro obtidas de 201 episódios (168 doentes) em dois centros de testes na Europa com o teste Platelia™ Aspergillus EIA. A distribuição dos valores do índice é apresentada na seguinte tabela.. 3240. 3000 2500 2000 1500 1000 330. 500. 54. 32. 13. 4. 4. 3. 0. 1. 0. 0. 3. 1. 6. 0. 0. Índice. POPULAÇÃO DE CONTROLO: DISTRIBUIÇÃO DO ÍNDICE/EPISÓDIO (N= 201 episódios de 168 doentes) 2. 1,5 Índice. Este gráfico de dispersão ilustra os resultados do ensaio galactomannan para as 3 691 amostras de soro de 201 episódios (168 doentes de controlo) neste estudo (doentes submetidos a terapia imunosupressiva para TCTH (transplante de células-tronco hematopoéticas) ou para tratamento da malignidade hematológica).. 1. 0,5. 0 0. 20. 40. 60. 80. 100. 120. 140. 160. 180. 200. Número do episódio. Este gráfico de dispersão ilustra os resultados do ensaio galactomannan para as 1 182 amostras de soro de 38 episódios (35 doentes) neste estudo aos quais foi diagnosticada aspergilose invasiva comprovada ou provável de acordo com as definições da EORTC/NIAID.. Índice. Doentes a quem foi diagnosticada aspergilose invasiva ASPERGILOSE INVASIVA COMPROVADA / PROVÁVEL: DISTRIBUIÇÃO DO ÍNDICE / EPISÓDIO (N= 38 episódios de 35 doentes). 10,0 9,0 8,0 7,0 6,0 5,0 4,0 3,0 2,0 1,0 0,0. Cut-off 0,5. 0. 5. 10. 15. 20. 25. 30. 35. 40. Número do episódio. Não se prevê que todas as amostras de soro de cada doente sejam positivas. A prevalência esperada de aspergilose invasiva varia com a população de doentes; foram relatadas taxas de 5-20% 7, 13. A taxa de prevalência para este estudo foi de 16%. Os seguintes gráficos representam exemplos de um doente sem sinais clínicos de aspergilose invasiva (negativo para Aspergillus) e de um doente com aspergilose invasiva comprovada (positivo para Aspergillus) respectivamente.. 105.

(14) Doente negativo :. DOENTE DE CONTROLO 1,6 1,4 Índice. 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 0. 10. 20. 30. 40. 50. 60. Dias. Doente positivo : DOENTE COM ASPERGILOSE INVASIVA COMPROVADA. índice. 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 0. 10. 20. 30. 40. 50. 60. Dias. 15. CARACTERÍSTICAS DE DESEMPENHO ESPECÍFICO A. Estudos de reprodutibilidade A variabilidade inter-ensaio e intra-ensaio para o Platelia™ Aspergillus EIA foi determinada num estudo utilizando um painel de 6 amostras de soro de doentes em pools (uma negativa, uma positiva baixa, duas positivas e duas altamente positivas) obtidas em três locais de ensaios clínicos na América do Norte. Todos os 6 membros do painel foram testados em triplicado (x3) em 3 dias diferentes, num lote, em dois locais (número total de réplicas em cada local = 9). Todos os 6 membros do painel foram testados em duplicado (x2) em três dias diferentes, em 1 lote, num terceiro local (número total de réplicas no terceiro local = 6). Um (1) operador realizou todos os testes de precisão em cada local. Os dados foram analisados de acordo com as normas da Comissão Nacional para a Normalização de Laboratórios Clínicos (NCCLS - National Committee for Clinical Laboratory Standards). A densidade óptica (DO) média e o valor médio do índice, o desvio padrão (DP), o coeficiente de variação percentual (%CV), a precisão do intervalo de referência (intra-ensaio) e a precisão no local (inter-ensaio) para cada membro do painel são ilustrados nas seguintes tabelas.. 106.

(15) 107. -.. -.. ! -. ! -.. . ! . -.. !. -.. ! . ! #. . ! -.. . -.. !. ! -.. . !. -.. ! . ! # . . ! #. . ! . ! -.. . -.. !. ! . . ! " ! . ! $. ! . !#. $!/. ! . ! %. !#/ !%. $!/. ! $. !%. !#. !$. !. ! %. !". !"/ !/. ! %. !". "!$/. !". %!$/. !%. $!/. !. !#. ! #. %!/. ! %. !% . !". %!/. !#. !$. . !"/. ! "$. $!"/. ! #". ! . . #!$/. ! ##. ! % "!/. ! ". ! . #!/. !. #!#/. !"/. !". #!%/. ! . ! . NCCLS EP5-A, Vol. 19, N°2, Página 25, Equação (C3) e Equação (C4). $!/. ! %. %!/. ! #. !"%. !/. !". %!/. ! . !#.

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(40) B. Reactividade cruzada Realizou-se um estudo para avaliação do efeito de condições clínicas que podem interferir, não relacionadas com a aspergilose invasiva, com um lote do kit Platelia™ Aspergillus EIA. Utilizou-se o Platelia™ Aspergillus EIA para testar as seguintes amostras de soro relativamente à reactividade cruzada. Foram testados um total de 151 soros. Patologia. Nº de amostras testadas. Nº de positivas. Factor reumatóide. 10. 0. Anticorpo anti-nuclear. 10. 0. Hipergamaglobulinemia IgG. 10. 0. Hipergamaglobulinemia IgM. 10. 0. Cancro*. 11. 0. Cirrose não viral (sobretudo biliar; provocada pelo álcool; provocada por drogas). 10. 0. Várias transfusões. 10. 0. Mulheres multíparas. 10. 0. VHA. 10. 0. VHC. 10. 0. Rubéola. 10. 0. CMV. 10. 0. Sífilis (RPR+). 10. 0. Toxoplasmose. 10. 0. Micoplasma. 10. 0. * Da bexiga, da mama(2), do cólon, endometrial, do pulmão, da próstata, renal e escamoso(3).. C. Ensaio clínico Realizou-se um ensaio clínico para avaliar a sensibilidade, a especificidade e o valor preditivo do Platelia™ Aspergillus EIA em dois locais na Bélgica e na Holanda. O estudo foi realizado retrospectivamente utilizando um total de 4 873 amostras de soro recolhidas de 203 doentes das seguintes populações*: • doentes sem sinas de aspergilose invasiva (doentes de controlo) • doentes com aspergilose invasiva provável • doentes com aspergilose invasiva comprovada * O Invasive Fungal Infection Cooperative Group (IFICG) da European Organization for Research and Treatment of Cancer (EORTC - Organização Europeia para a Investigação e Tratamento do Cancro) e o Mycosis Study Group (MSG) do National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIAID Instituto Nacional de Alergias e Doenças Infecciosas dos Estados Unidos) definiram os critérios para o diagnóstico da aspergilose invasiva (IA) em doentes com malignidade hematológica ou transplante das células estaminais hematopoéticas 2. A aspergilose invasiva comprovada é definida como pelo menos um critério microbiológico, e um critério clínico principal ou dois secundários de um local consistente com infecção, num hospedeiro com sintomas atribuídos à infecção fúngica. A aspergilose invasiva provável é definida como pelo menos um critério microbiológico, e um critério clínico principal ou dois secundários de um local consistente com infecção, num hospedeiro com sintomas atribuídos à infecção fúngica. A aspergilose invasiva possível é definida como pelo menos um critério microbiológico, ou um critério clínico principal ou dois secundários de um local consistente com infecção, num hospedeiro com sintomas atribuídos à infecção fúngica.. 108.

(41) Considerando a relativa raridade da aspergilose invasiva provável ou comprovada, tecemos a seguinte definição de sensibilidade e especificidade clínica para as finalidades deste estudo.. SENSIBILIDADE Os resultados deste estudo foram analisados em termos de sensibilidade do doente. Realizou-se um ensaio de sensibilidade utilizando o Platelia™ Aspergillus EIA em dois locais num total combinado de 38 episódios de 35 Transplantes de medula óssea (TMO) e doentes com leucemia com aspergilose invasiva comprovada ou provável diagnosticada.. 1. Aspergilose comprovada (conforme determinado pelo IFICG / EORTC ; ver acima) Locais combinados N = 19 episódios de 16 doentes Sensibilidade: 100% (19/19). Nota: Não foi possível calcular o intervalo de confiança de 95% devido ao tamanho insuficiente da amostra.. 2. Aspergilose provável (conforme definida pelo IFICG / EORTC ; ver acima) Locais combinados N = 19 episódios de 19 doentes Sensibilidade: 94,7% (18/19). Nota: Não foi possível calcular o intervalo de confiança de 95% devido ao tamanho insuficiente da amostra.. 3. Aspergilose comprovada e provável combinadas (conforme definida pelo IFICG / EORTC ; ver acima) Locais combinados N = 38 episódios de 35 doentes Sensibilidade: 97,4% (37/38). O intervalo de confiança de 95% é de 86,2 – 99,9%.. ESPECIFICIDADE Realizou-se um ensaio de especificidade utilizando o Platelia™ Aspergillus EIA em dois locais num total combinado de 3 691 amostras obtidas de 201 episódios (168 doentes) sem sinais de aspergilose invasiva (doentes de controlo). Local 1: N = 3 060 amostras, de 103 episódios (70 doentes) Especificidade : 92,2% (95/103) O intervalo de confiança de 95% é de 85,3 – 96,6%. Local 2: N = 631 amostras de 98 episódios (98 doentes) Especificidade : 88,8% (87/98) O intervalo de confiança de 95% é de 80,8 -94,3%. Locais combinados N = 3 691 amostras de 201 episódios (168 doentes) Especificidade : 90,5% (182/201) O intervalo de confiança de 95% é de 85,6 -94,2%.. VALOR PREDITIVO Os valores preditivos positivos e negativos (VPP, VPN) foram analisados para a população de doentes destes estudo, com base na média real da taxa de prevalência de 16% observada neste estudo. VPP: 66,1% (37/56) VPN: 99,4% (182/183) A análise também foi realizada considerando resultados positivos quando 2 amostras consecutivas apresentaram um índice superior ou igual a 0,5. O desempenho é resumido na seguinte tabela: VPP. VPN. Locais combinados considerando 1 amostra ≥ 0,5. Sensibilidade* Especificidade 97,4% (37/38). 90,5% (182/201). 66,1% (37/56). 99,4% (182/183). Locais combinados considerando 2 amostras consecutivas ≥ 0,5. 92,1% (35/38). 97,5% (196/201). 87,5% (35/40). 98,5% (196/199). *: a sensibilidade foi calculada na aspergilose invasiva comprovada e provável. 109.

(42) 16- CONTROLO DE QUALIDADE DO FABRICANTE Todos os reagentes fabricados são preparados em conformidade com o nosso Sistema de Qualidade, começando na recepção da matéria-prima até à comercialização final do produto. Todos os lotes são sujeitos a avaliações de controlo de qualidade e apenas serão lançados no mercado depois de cumprirem critérios de aceitação predefinidos. Os registos relacionados com a produção e o controlo de cada lote individual são mantidos na Bio-Rad.. 17- BIBLIOGRAFIA Veja a versão Inglesa.. 110.

(43) 17- BIBLIOGRAPHY 1. Ansorg, R., R. Van Den Boom, and P. M. Rath. 1997. Detection of Aspergillus galactomannan antigen in foods and antibiotics. Mycoses 40: p. 353-7. 2. Ascioglu, S., J. H. Rex, B. De Pauw, J. E. Bennett, J. Bille, F. Crokaert, D. W. Denning, J. P. Donnelly, J. E. Edwards, Z. Erjavec, D. Fiere, O. Lortholary, J. Maertens, J. F. Meis, T. F. Patterson, J. Ritter, D. Selleslag, P. M. Shah, D. A. Stevens and T. J. Walsh. 2002. Defining opportunistic invasive fungal infections in immunocompromised patients with cancer and hematopoietic stem cell transplants: an international consensus. Clin. Infect. Dis. 34: p. 7-14. 3. Aubry, A., R. Porcher, J. Bottero, S. Touratier, T. Leblanc, B. Brethon, P. Rousselot, E. Raffoux, J. Menotti, F. Derouin, P. Ribaud and A. Sulahian. 2006. Occurrence and kinetics of false-positive Aspergillus galactomannan test results following treatment with beta-lactam antibiotics in patients with hematological disorders. J. Clin. Microbiol. 44 (2): p. 389-94. 4. Blijevens, N. M., J. P. Donnelly, J. F. Meis, P. E. Verweij, and B. E. De Pauw. 2002. Aspergillus galactomannan antigen levels in allogeneic haematopoietic stem cell transplant recipients given total parenteral nutrition. Transpl. Infect. Dis. 4: p. 64-65. 5. Chambon-Pautas, C., J. M. Costa, M. T. Chaumette, C. Cordonnier, and S. Bretagne. 2001. Galactomannan and polymerase chain reaction for the diagnosis of primary digestive aspergillosis in a patient with acute myeloid leukaemia. J. Infect. 43: p. 213-214. 6. De Repentigny, L., L. Kaufman, G. T. Cole, D. Kruse, J. P. Latge, and R. C. Matthews. 1994. Immunodiagnosis of Invasive Fungal Infections. J. Med. Vet. Mycol. 32: p. 239-252. 7. Denning, D. W. 1998. Invasive Aspergillosis. Clin. Infect. Dis. 26: p. 781-803. 8. Dupont, B., M. Richardson, P. E. Verweij, and J. F. G. M. Meis. 2000. Invasive Aspergillosis. Medical Mycology 38: p. 215-224. 9. Erjavec, Z. and P. E. Verweij. 2002. Recent progress in the diagnosis of fungal infections in the immunocompromised host. Drug Resist. Updat. 5: p. 3-10. 10. Gangneux, J. P., D. Lavarde, S. Bretagne, C. Guiguen, and V. Andemer. 2002. Transient Aspergillus antigenaemia: think of milk. Lancet 359: p. 1251. 11. Hage,C. A., J. M. Reynolds, M. Durkin, L. J. Wheat, K. S. Knox. 2007. Plasmalyte as a Cause of false-positive results for Aspergillus galactomannan in bronchoalveolar lavage fluid. J. Clin. Microbiol. 45: p. 676-677. 12. Herbrecht, R., V. Letscher-Bru, C. Oprea, B. Lioure, J. Waller, F. Campos, O. Villard, K. L. Liu, S. Natarajan-Ame, P. Lutz, P.Dufour, J. P. Bergerat, and E. Candolfi. 2002. Aspergillus galactomannan detection in the diagnosis of Invasive Aspergillosis in cancer patients. J. Clin. Oncol. 20: p.1898-1906. 13. Herbrecht, R., D. Denning, T. Patterson, J. Bennett, R. Greene, J. Oestmann, W. Kern, K. Marr, P. Ribaud, O. Lortholary, R. Sylvester, R. Rubin, J. Wingard, P. Stark, C. Durand, D. Caillot, E. Thiel, P. Chandrasekar, M. Hodges, H. Schlamm, P. Troke, B. DePauw. 2002. Voriconazole Versus Amphotericin B for Primary Therapy of Invasive Aspergillosis. N. Engl. J. Med. 347, 6: p. 408-415. 14. Latge, J. P. 1995. Tools and trends in the detection of Aspergillus fumigatus. Curr. Top. Med. Mycol. 6: p. 245-281.. 17.

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(46) 20.

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