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DANIELA AGUIAR DE SOUZA
ESTUDO MOLECULAR DOS DISTÚRBIOS DO
DESENVOLVIMENTO DO CÓRTEX CEREBRAL
CAMPINAS 2013
iii
UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS
DANIELA AGUIAR DE SOUZA
“
ESTUDO MOLECULAR DOS DISTÚRBIOS DO
DESENVOLVIMENTO DO CÓRTEX CEREBRAL
”Orientador(a): Profa. Dra. Iscia Teresinha Lopes Cendes Co-Orientador: Prof. Dr. Fábio Rossi Torres
Tese de Doutorado apresentada ao Programa de Pós Graduação em Fisiopatologia Médica da Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas para
obtenção do título de Doutora em Ciências.
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA TESE DEFENDIDA PELA ALUNA DANIELA AGUIAR DE SOUZA
E ORIENTADA PELA PROFA. DRA. ISCIA TERESINHA LOPES CENDES
Assinatura do Orientador ____________________
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Dedicatória Essa tese é dedicada aos meus pais, Jorge e Ivonete, pelo amor e pelos ensinamentos que serviram de base para me tornar quem sou hoje.
ix
AGRADECIMENTOS
Agradeço à FAPESP e à Capes pelo suporte financeiro;
À minha orientadora Iscia Lopes Cendes, por todo apoio e estrutura fornecida e pe-la confiança em mim depositada;
À todos os amigos do Laboratório de Genética Molecular, os velhos e os novos, pe-la ajuda nos momentos de desespero no pe-laboratório e principalmente pepe-la amizade: Ro-mênia, Zé Bola, Karina, Thaty, Alexandre, Marina, Dany, Secolin, Milena, Simoni... enfim todos que passaram pela minha vida durante o doutorado e deixaram sua contribuição especial; às técnicas Marilza e Madá, pela grande ajuda com os experimentos e pela diver-são da convivência;
À Luciana Bonadia pelos variados conselhos, desde os científicos até os amorosos e por sua grande amizade, sempre me ensinando as verdades da vida! À Simone Tsuneda e família, pela ajuda, pelo abrigo em Brasília e pela amizade de sempre;
À todo o pessoal da Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, Rogério, Marcos, Irene, Silas pela compreensão e apoio para a finalização do trabalho;
Aos meus pais, Ivonete e Jorge, pela ajuda em todos os momentos e pelo carinho e amor que sempre me deram forças para continuar; aos meus irmãos Danilo e Daniel, às minhas cunhadas, Carla e Cristina, meu sobrinho Danielzinho e à toda a minha família pela torcida e confiança;
À minha segunda família, Marinez, Francisco e Renan, pelo apoio e suporte que sempre me deram;
Ao meu noivo, Renê de Lima Barbosa, pelo seu amor, carinho, paciência e especi-almente pelos seus ensinamentos em Word 2010. Sem você, meu amor, minha vida não seria completa e minha tese não teria formatação;
Um agradecimento especial ao meu pai do laboratório, aquele que me ensinou desde as primeiras pipetagens na IC até os arrays do doutorado, Fábio Rossi Torres, obri-gada por tudo, essa tese não existiria sem você!
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SUMÁRIO
Agradecimentos ... ix
Lista de Figuras ... xvii
Lista de Tabelas ... xxiii
Lista de Abreviaturas ... xxv
Resumo ... xxix
Abstract ... xxxi
1. Introdução ... 33
1.1. O desenvolvimento do córtex cerebral ... 33
1.2. Malformações do desenvolvimento cortical ... 35
1.2.1. Malformações devido a anormalidades na migração neuronal (Grupo 2) ... 36
1.2.1.1. Heterotopia Nodular Periventricular ... 36
1.2.1.2. Espectro da Lissencefalia e Heterotopia Subcortical em Banda ... 38
1.2.1.3. Gene LIS1 e o espectro LIS/HSB ... 41
1.2.1.4. Gene DCX e o espectro LIS/HSB ... 41
1.2.1.5. Interação LIS1 e DCX ... 42
1.2.1.6. Gene TUBA1A e a lissencefalia ... 42
1.2.2. Malformações devido a distúrbios pós migracionais (Grupo 3) ... 43
1.2.2.1. Esquizencefalias ... 43
1.3. Separação de fases: um conceito defasado? ... 44
1.3.1. Gene TUBA1A ... 45
xii
1.3.3. Gene TUBA8 ... 45
1.4. Novas descobertas em distúrbios do SNC ... 46
2. Objetivos ... 49 2.1. Objetivos Gerais ... 49 2.2. Objetivos Específicos ... 49 3. Materiais e Métodos ... 51 3.1. Casuística ... 51 3.1.1. Caracterização da amostra ... 52 3.2. Extração de DNA... 65
3.3. Detecção de Mutações de Ponto e Pequenas Inserções/Deleções em Genes Candidatos 65 3.3.1. Amplificação por PCR ... 66
3.3.2. Sequenciamento (Sanger) ... 72
3.3.3. Clonagem em vetor ... 72
3.3.3.1. Ligação dos fragmentos de DNA ... 72
3.3.3.2. Transformação bacteriana ... 73
3.3.3.3. Extração de DNA plasmidial (Mini-Prep) ... 73
3.3.4. Análise das alterações encontradas: ... 74
3.3.4.1. Softwares para predições in sílico de mutações ... 74
3.3.4.2. Software para análise in sílico tridimensional da proteína ... 75
3.3.4.3. Software para busca in sílico de regiões de microRNA ... 75
3.3.4.4. Software para busca in sílico de regiões de splicing alternativo ... 76
3.3.4.5. Triagem das alterações com potencial patogênico em grupo controle ... 76
3.4. Detecção de Inserções/Deleções em Genes Candidatos ... 76
3.4.1. Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification - MLPA ... 76
xiii
3.4.1.2. Reação de Hibridação ... 77
3.4.1.3. Reação de ligação das sondas ... 77
3.4.1.4. Reação de PCR ... 77
3.4.1.5. Eletroforese capilar ... 78
3.4.1.6. Análise dos resultados ... 78
3.5. Detecção de Novas CNVs ... 78
3.5.1. Seleção dos pacientes ... 78
3.5.2. Purificação das Amostras de DNA ... 79
3.5.3. Digestão das amostras de DNA com a enzima NspI ... 79
3.5.4. Reação de ligação com adaptadores ... 79
3.5.5. Amplificação dos fragmentos por PCR ... 79
3.5.6. Purificação ... 80 3.5.7. Quantificação ... 80 3.5.8. Fragmentação ... 80 3.5.9. Marcação do DNA ... 81 3.5.10. Hibridação ... 81 3.5.11. Lavagem ... 81 3.5.12. Escaneamento ... 81 3.5.13. Análise ... 81 4. Resultados ... 83
4.1. Sequenciamento dos genes candidatos ... 83
4.1.1. Parte I- Variantes com Potencial Patogênico ... 83
4.1.1.1. Gene FLNA: Variante c.4543C>T ... 83
4.1.1.2. Gene FLNA: Variante c.1286C>T ... 84
4.1.1.3. Gene DCX: Variante c.993A>T ... 86
xiv
4.1.1.5. Gene TUBA8: Variante c.1513A>T ... 89
4.1.1.6. Gene TUBA8: Variante c.562C>T ... 91
4.1.1.7. Gene TUBA8: Variante c.323C>T ... 92
4.1.2. Parte II- Variantes neutras ... 94
4.1.2.1. Gene FLNA ... 94 4.1.2.2. Gene LIS1 ... 96 4.1.2.3. Gene DCX ... 96 4.1.2.4. Gene TUBA1A ... 97 4.1.2.5. Gene TUBB2B ... 98 4.1.2.6. Gene TUBA8 ... 101 4.1.2.7. Gene EMX2 ... 102 4.1.3. Regiões de microRNA ... 103
4.1.4. Regiões de splicing alternativo ... 103
4.1.5. Resumo das alterações de ponto identificadas ... 104
4.2. MLPA ... 108 4.2.1. Alterações em LIS1 ... 108 4.2.2. Alterações em FLNA ... 110 4.2.3. Alterações em DCX ... 110 4.3. SNP-Array ... 112 4.3.1. Seleção de pacientes ... 112 4.3.2. Resultados do SNP-Array ... 112 4.3.2.1. Caso 239/08 ... 116 4.3.2.2. Caso 904/01 ... 117 4.3.2.3. Caso 302/01 ... 117 4.3.2.4. Caso 283/01 ... 118 4.3.2.5. Caso 524/09 ... 119
xv
4.3.2.6. Caso 271/09 ... 122
4.3.2.7. Caso 1324/06 ... 122
4.3.2.8. Caso 523/01 ... 125
4.4. Resumo das alterações encontradas ... 127
5. Discussão ... 131
5.1. Heterotopia Nodular Periventricular ... 131
5.1.1. Paciente P3 ... 131
5.1.2. Paciente 524/09 ... 132
5.1.3. HNP e gene FLNA ... 134
5.2. O Espectro da Lissencefalia/Heterotopia Subcortical em Banda ... 135
5.2.1. Gene LIS1 ... 135
5.2.2. Gene DCX ... 136
5.2.2.1. Paciente 643/08 ... 136
5.2.2.2. Paciente 491/09 ... 137
5.2.2.3. Alterações estruturais no gene DCX ... 138
5.2.3. Espectro LIS/HSB e a frequência de alterações encontradas ... 138
5.3. Esquizencefalia e o gene EMX2 ... 139
5.4. Família das tubulinas e as MDC ... 140
5.5. A técnica de SNP-Array ... 142 5.5.1. Gene NCAPG2 ... 144 5.5.2. Gene HAUS7 ... 144 5.5.3. Gene PLXNA1 ... 145 5.5.4. Gene TSNARE1 ... 145 5.5.5. Gene DAAM1 ... 146 5.5.6. Gene ARX ... 146
xvi 5.6.1. Paciente 271/09 ... 147 5.6.2. Paciente 1324/06 ... 148 5.6.3. Paciente 523/01 ... 149 5.7. SNP-ARRAY: Perspectivas ... 149 6. Conclusão ... 151 6.1. HNP e FLNA ... 151
6.2. Espectro LIS/HSB, LIS1 e DCX ... 151
6.3. Achados nos genes da família das tubulinas ... 152
6.4. Relação esquizencefalia e gene EMX2 ... 152
6.5. Análise de CNV ... 152
7. Referências ... 153
8. Anexos ... 165
8.1. Anexo 1: Cromatogramas dos sequenciamentos mostrando variantes neutras ... 165
8.2. Anexo 2: Parecer do Comitê de Ética em Pesquisa da Faculdade de Ciências Médicas da UNICAMP ... 178
8.3. Anexo 3: Formulário de consentimento ... 180
xvii
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Padrão inside out de migração neuronal e transição morfológica dos neurônios. Os neurônios recém-chegados à placa cortical [2] ultrapassam os neurônios mais antigos [1], acumulando-se progressivamente em camadas mais superficiais [3]. Os estágios multipolar e bipolar [4] mostram a transição morfológica sofrida pelas células no início da migração (adaptado de Riken (6)). ... 34 Figura 2: A- indivíduo normal. B- paciente com HNP (setas) (cedido por Cendes, F). ... 36 Figura 3: A- indivíduo normal. B- paciente com agiria. C- paciente com paquigiria. D- paciente com HSB (cedido por Cendes, F). ... 39 Figura 4: A- corte histológico de uma paciente com lissencefalia. Esquema da laminação de um córtex com lissencefalia (B), mostrando as 4 camadas: camada I composta por neurônios Caja-Retzius, camada II composta por neurônios piramidais desorganizados, camada III composta por células variadas, camada IV composta por neurônios médios e pequenos. Esquema de um córtex normal (C) com 6 camadas: camada molecular (I), camada granular externa (II), camada piramidal externa (III), camada granular interna (IV), camada piramidal interna (V), camada fusiforme (VI). (adaptado de Guerrini, (16)). ... 40 Figura 5: A- Paciente com esquizencefalia de lábios abertos. B- Paciente com esquizencefalia de lábios fechados (seta preta) e heterotopia periventricular (cabeça de seta branca) (A- Cedido por Cendes, F; B- Adaptado de Merello et al. (42)). ... 43 Figura 6: A- Paciente P3 com HNP bilateral (setas). B- Cromatograma do sequenciamento mostrando a alteração c.4543C>T (círculo vermelho) no exon 27 do gene FLNA. ... 84 Figura 7: A- Paciente 524/09 com HNP (seta). B- Cromatograma do sequenciamento mostrando a alteração c.1286C>T (círculo vermelho) no exon 9 do gene FLNA. ... 85 Figura 8: Cromatograma do sequenciamento automático mostrando a substituição de uma adenina por uma timina (círculo vermelho) no exon 2 do gene DCX, A- em hemizigose no paciente, B- em heterozigose na mãe do paciente, C- individuo controle sem a substituição. ... 86 Figura 9: A- interações da lisina (posição 274) na proteína DCX. B- Ausência de interações da metionina (posição 274) na proteína DCX. ... 87
xviii
Figura 10: Cromatograma do sequenciamento automático mostrando a substituição de uma timina por uma citosina (círculo vermelho) no exon 2 do gene DCX. ... 88 Figura 11: Digestão enzimática de controles com a enzima MnlI para o exon 2 do gene DCX (M= marcador 1kb plus; 1=paciente heterozigoto para a mutação c.1047T>C; 2, 3, 4 e 5= indivíduos sem a mutação). ... 89 Figura 12: A- interações da leucina (posição 292) na proteína DCX. B- interações da prolina (posição 292) na proteína DCX. ... 89 Figura 13: Cromatograma do sequenciamento automático mostrando troca uma adenina por uma timina no exon 5 do gene TUBA8 (círculo vermelho). ... 90 Figura 14: Cromatograma do sequenciamento automático mostrando troca uma citosina por uma timina no exon 4 do gene TUBA8 (círculo vermelho). ... 91 Figura 15: A- interações da alanina (posição 128) na proteína TUBA8. B- interações da valina (posição 128) na proteína TUBA8. ... 92 Figura 16: A- Paciente 2364/04 com lissencefalia incompleta. B- Cromatograma do sequenciamento mostrando a troca de uma citosina por uma timina no gene TUBA8 (SNP rs115847686). ... 93 Figura 17: A- interações da arginina (posição 84) na proteína TUBA8. B- interações da cisteína (posição 84) na proteína TUBA8. ... 94 Figura 18: A- Imagem de ressonância magnética do paciente 500/09. Notar a presença de sulcos mais rasos nas regiões posteriores. B- Sondas (vermelho) abaixo da linha normal mostrando a deleção no exon 1 do gene LIS1. ... 108 Figura 19: A- Imagem de ressonância magnética do paciente 185/09. Notar a agiria de predomínio posterior. B- Sondas (vermelho) abaixo da linha normal mostrando a deleção nos exons 6 e 7 do gene LIS1. ... 109 Figura 20: Sondas (pontos vermelhos) abaixo da linha normal mostrando a deleção em todos os exons do gene LIS1. ... 109 Figura 21: A- Imagem de ressonância magnética do paciente 271/09. B- Sondas (vermelho) acima da linha normal mostrando a duplicação no exon 4 do gene FLNA... 110 Figura 22: A- Imagem de ressonância magnética do paciente 415/03. B- Sondas (pontos vermelhos) abaixo da linha normal mostrando a deleção em todos os exons do gene DCX. ... 111 Figura 23: Sondas (pontos vermelhos) acima da linha normal mostrando a duplicação no exon 3 do gene DCX. ... 111
xix
Figura 27: A- Paciente com esquizencefalia unilateral de lábios abertos, com a fenda localizada na região frontal direita (seta). B- Resultado do microarranjo do paciente 239/08 mostrando a duplicação no cromossomo 7q36.3 (barra azul representa a região duplicada, em rosa estão os genes envolvidos nesta região). ... 116 Figura 28: A- Paciente com esquizencefalia bilateral de lábios fechados com fendas de localização parieto occipital (seta). B- Resultado do microarranjo do paciente 904/01 mostrando a duplicação no cromossomo Xq28 (barra azul representa a região duplicada, em rosa estão os genes envolvidos nesta região). ... 117 Figura 29: A- Paciente com heterotopia nodular periventricular assimétrica a esquerda (seta). B- Resultado do microarranjo do paciente 302/01 mostrando a duplicação no cromossomo 8q24.3 (barra azul representa a região duplicada, em rosa estão os genes envolvidos nesta região). ... 118 Figura 30: A- Paciente com heterotopia nodular periventricular à direita (seta). Resultado do microarranjo do paciente 283/01 mostrando: B- a duplicação no cromossomo 3q21.3 e C- a duplicação no cromossomo Xq28 (barra azul representa a região duplicada, em rosa estão os genes envolvidos nesta região). ... 119 Figura 31: A- Paciente (524/09) com heterotopia nodular periventricular (seta). Resultado do microarranjo do paciente 524/09 mostrando: B- duplicação no cromossomo 14q23.1 e C- deleção no cromossomo Xp22.11(barra azul representa a região duplicada, barra vermelha representa a região deletada, em rosa estão os genes envolvidos nestas regiões). ... 121 Figura 32: A- Paciente com heterotopia subcortical em banda. B- Resultado do microarranjo do paciente 271/09 mostrando a duplicação no cromossomo X, que afeta os genes FLNA e EMD (barra azul representa a região duplicada, em rosa estão os genes envolvidos nesta região). ... 122 Figura 33: Resultado do microarranjo do paciente 1324/06 mostrando a deleção no cromossomo 1p36 (barra vermelha representa a região deletada, em rosa estão os genes envolvidos nesta região). ... 123 Figura 34: Resultado do microarranjo do paciente 1324/06 mostrando a duplicação no cromossomo 4p16.3 (barra azul representa a região duplicada, em rosa estão os genes envolvidos nesta região)... 124 Figura 35: Esquema mostrando CNVs patogênicas descritas dentro da região de 14Mb identificada no paciente 1324/06. ... 124
xx
Figura 36: A- Paciente com heterotopia subcortical em banda. B- Resultado do microarranjo do paciente 523/01 mostrando a deleção no cromossomo 3q29 que afeta 25 genes (barra vermelha representa a região deletada, em rosa estão os genes envolvidos nesta região). ... 127 Figura 37: Mutações descritas no gene FLNA (adaptado de Parrini et al. (14)). ... 131 Figura 35: Cromatograma do sequenciamento automático mostrando a alteração c.374-19G>A (círculo vermelho) no intron 2 do gene FLNA. ... 165 Figura 36: Cromatograma do sequenciamento automático mostrando as alterações c.869-41C>T e c.869-28C>G (círculos vermelhos) no intron 5 do gene FLNA. ... 165 Figura 37: Cromatograma do sequenciamento automático mostrando a troca de uma citosina por uma timina, c.7732+11C>T, (círculo vermelho) no intron 47 do gene FLNA. ... 166 Figura 38: Cromatograma do sequenciamento automático mostrando a troca de uma citosina por uma timina, c.1998C>T, (círculo vermelho) no exon 13 do gene FLNA. ... 166 Figura 39: Cromatograma do sequenciamento automático mostrando a troca de uma guanina por uma adenina, c.4920G>A, (círculo vermelho) no exon 29 do gene FLNA. ... 166 Figura 40: Cromatograma do sequenciamento automático mostrando a troca de uma timina por uma citosina, c.6075T>C (círculo vermelho) no exon 36 do gene FLNA. ... 167 Figura 41: Cromatograma do sequenciamento automático mostando a substituição de uma citosina por uma timina (círculo vermelho) no intron 6 do gene LIS1, c.568+27C>T. ... 167 Figura 42:Cromatograma do sequenciamento automático mostrando a substituição de uma citosina por uma timina, c.1805C>T, (círculo vermelho) no exon 11 do gene LIS1. ... 168 Figura 43: Cromatograma mostrando a substituição de uma guanina por uma adenina, c.948+29G>A, (círculo vermelho) no intron 2 do gene DCX. ... 168 Figura 44: Cromatograma do sequenciamento automático mostrando a troca de guanina para citosina, c.453G>C, (círculo vermelho) no exon 4 do gene TUBA1A. ... 168 Figura 45: Cromatograma do sequenciamento automático mostrando a troca de adenina por uma guanina, c.288A>G (círculo vermelho) no exon 3 do gene TUBA1A. ... 169 Figura 46: A - Cromatograma do sequenciamento automático mostrando a troca de uma timina por uma citosina, c.510T>C, (círculo vermelho) e a troca de uma guanina por uma adenina, c.522G>A, (círculo azul) no exon 4 do gene TUBA1A. B- Cromatograma de um indivíduo que possui a sequencia considerada normal. ... 169 Figura 47: Cromatograma do sequenciamento automático mostrando a troca de uma citosina por uma timina, c.73C>T, (círculo vermelho) no exon 1 do gene TUBB2B. ... 169
xxi
Figura 48: Cromatograma do sequenciamento automático mostrando a troca de uma timina por uma citosina, c.93T>C, (círculo vermelho) no exon 1 do gene TUBB2B. ... 170 Figura 49: Cromatograma do sequenciamento automático mostrando a troca de uma timina por uma citosina, c.141T>C, (círculo vermelho) no exon 1 do gene TUBB2B. ... 170 Figura 50: Cromatograma do sequenciamento automático mostrando a troca de uma timina por uma citosina, c.20T>C, (círculo vermelho) na região que precede o gene TUBB2B. ... 170 Figura 51: Cromatograma do sequenciamento automático mostrando a troca de uma citosina por uma guanina, g.1338C>G, (círculo vermelho) no intron 1do gene TUBB2B. ... 171 Figura 52: Cromatograma do sequenciamento automático mostrando a troca de uma guanina por uma citosina, g.1373G>C, (círculo vermelho) no intron 1do gene TUBB2B. ... 171 Figura 53: A- Cromatograma do sequenciamento automático mostrando um indivíduo com a deleção g.3784_3785delTG e B- Sequencia normal, sem a deleção dos nucleotídeos TG. ... 171 Figura 54: Cromatograma do sequenciamento automático mostrando troca de uma guanina por uma adenina, c.58-70G>A, no intron 3 do gene TUBB2B. ... 172 Figura 55: Cromatograma do sequenciamento automático mostrando troca de uma citosina por uma timina, c.166+22C>T, no intron 4 do gene TUBB2B. ... 172 Figura 56: Cromatograma do sequenciamento automático mostrando troca de uma guanina por uma timina, c.564G>T, no exon 6 do gene TUBB2B. ... 172 Figura 57: Cromatograma do sequenciamento automático mostrando a deleção de uma timina, g.8144delT, (círculo mostra a presença de 8 timinas ao invés de 9) no exon 6 do gene TUBB2B. 173 Figura 58: Cromatograma do sequenciamento automático mostrando a inserção de um CG, g.8341_8342insCG, e a mudança no quadro de leitura da sequencia no exon 6 do gene TUBB2B. ... 173 Figura 59: inserção de CC no gene TUBB2B, g.833_834insCC. ... 174 Figura 60: Cromatograma do sequenciamento automático mostrando deleção de três nucleotídeos (GGA), g.18639_18641delGGA, no intron 3 do gene TUBA8 e a mudança no quadro de leitura da sequencia. ... 174 Figura 61: Cromatograma do sequenciamento automático mostrando troca uma citosina por uma timina, c.2071C>T, no exon 5 do gene TUBA8 (círculo vermelho)... 175 Figura 62: Cromatograma do sequenciamento automático mostrando troca uma citosina por uma timina, c.1969C>T, no exon 5 do gene TUBA8 (círculo vermelho)... 175
xxii
Figura 63: Cromatograma do sequenciamento automático mostrando a alteração c.1613C>T no exon 5 do gene TUBA8 (círculo vermelho). ... 175 Figura 64: Cromatograma do sequenciamento automático mostrando a substituição de uma guanina por uma adenina (círculo vermelho) no exon 1 do gene EMX2, c.865G>A. ... 176 Figura 65: Cromatograma do sequenciamento automático mostrando a substituição c.1290C>A no exon 2 do gene EMX2 ... 176 Figura 66: Cromatograma do sequenciamento automático mostrando a substituição c.1370C>A no exon 2 do gene EMX2 ... 176 Figura 67: Cromatograma do sequenciamento automático mostrando a alteração c.592-10T>A (círculo vermelho) no intron 2 do gene EMX2. ... 177
xxiii
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Característica Clínicas do pacientes com Heterotopia Nodular Periventricular. ... 53 Tabela 2: Características Clínicas dos pacientes com o espectro da LIS/HSB. ... 56 Tabela 3: Características Clínicas dos pacientes com Esquizencefalia ... 60 Tabela 4: Resumo dos genes analisados para cada malformação cortical ... 66 Tabela 5: Primers utilizados para amplificação do gene FLNA (* uso de DMSO, **PCR touchdown). ... 67 Tabela 6: Primers utilizados para amplificação do gene DCX. ... 69 Tabela 7: Primers utilizados para amplificação do gene LIS1. ... 69 Tabela 8: Primers utilizados para amplificação do gene EMX2 (* uso de DMSO). ... 70 Tabela 9: Primers utilizados para amplificação do gene TUBA1A. ... 71 Tabela 10: Primers utilizados para amplificação do gene TUBA8. ... 71 Tabela 11: Primers utilizados para amplificação do gene TUBB2B. ... 71 Tabela 12: Algoritmos utilizados para a análise in sílico das alterações detectadas. ... 74 Tabela 13: Interpretação da confiança da hipótese do MutPred®. ... 75 Tabela 14: Classificação de valores para escala Grantham. ... 75 Tabela 15: Algoritmos utilizados para a análise das CNVs identificadas. ... 82 Tabela 16: Resultados das predições in sílico da mutação p.Thr429Met encontrada no exon 9 do gene FLNA. ... 85 Tabela 17: Predições in sílico da variante c.993A>T encontrada no exon 2 do gene DCX. ... 86 Tabela 18: Resultados das predições in sílico da variante c.1047T>C encontrada no exon 2 do gene DCX. ... 88 Tabela 19: Predições in sílico da variante c.1513A>T encontrada no exon 5 do gene TUBA8. ... 90 Tabela 20: Predições in sílico da variante c.562C>T encontrada no exon 4 do gene TUBA8... 92 Tabela 21: Predições in sílico da variante c.323C>T encontrada no exon 3 do gene TUBA8... 93 Tabela 22: Análise de sítios de microRNA. ... 103 Tabela 23: Alterações analisadas in sílico para regiões de splicing... 104 Tabela 24: Resumo das alterações encontradas. ... 105
xxiv
Tabela 25: CNVs com potencial patogênico encontrados em pacientes com MDC. ... 114 Tabela 26: Resumo das funções dos genes relacionados à CNV encontrada na região 3q29 ... 125 Tabela 27: Resumo das alterações patogênicas encontradas ... 128 Tabela 28: Sondas presentes no kit "Salsa MLPA P061 Lissencephaly probemix" ... 183
xxv
LISTA DE ABREVIATURAS
ARFGEF2: gene adenosine diphosphate-ribosylation factor guanine exchange factor 2 ARX: gene homeobox aristaless-related ligado ao X
ASD: autism spectrum disorder CNV: Copy Number Variation
CTCG: crise tônico-clônica generalizada
DAAM1: gene dishevelled-associated activator of morphogenesis 1
DAEs: drogas antiepiléticas
DCX: gene doublecortina
DGV: Database of Genomic Variants DMSO: dimetil sulfoxido
DNA: ácido desoxiribonucleico
EMX2: gene Empty Spiracles 2 FLNA: gene Filamina A
GO: Gene Ontology GTP: guanosina trifosfato
HAUS7: gene subunidade 7 do complexo augmin-like
HNP: Heterotopia Nodular Periventricular HSB: Heterotopia Subcortical em Banda IG: imunoglobulina
ISCA: The International Standards for Cytogenomic Arrays Consortium LIS: Lissencefalia
LIS/HSB: Espectro Lissencefalia/Heterotopia Subcortical em Banda
LIS1: gene lissencefalia 1
LNLS: Laboratório Nacional de Luz Sincrotron
xxvi MDC: Malformações do Desenvolvimento Cortical MLPA: Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification
NCAPG2: gene subunidade não-SMS 2 do complexo condensina II
NCBI: National Center for Biotechnology Information
NRP1: gene Neuropilina 1
OMIM: Online Mendelian Inheritance in Man OPD1: Síndrome Otopalatodigital tipo1 OPD2: Síndrome Otopalatodigital tipo2
PAFAH1b1: gene platelet-activating factor acetylhydrolase
Panther: Protein Analysis Through Evolutionary Relationships PCR: polymerase chain reaction
PLXNA1: gene plexina A1
Polyphen: Polymorphism Phenotyping
RFLP: Restriction fragment length polymorphism RM: ressonância magnética
RNA: ácido ribonucleico RNAm: RNA mensageiro SDS: dodecilsulfato de sódio
SEMA3A: gene Semaphorina III
SNAP: Screening for Non-Acceptable Polymorphisms SNC: sistema nervoso central
SNP: single nucleotide polymorphism
TSNARE1: gene t-snare domain-containing protein 1 TUBA1A: gene tubulina alpha 1A
TUBA8: gene tubulina alpha 8 TUBB2B: gene tubulina beta 2B UTR: untranslated region
WD: triptofano-aspartato
xxvii WHS: síndrome de Wolf Hirschhorn
Resumo
RESUMO
As malformações do desenvolvimento cortical (MDC) são distúrbios resultantes de defei-tos na embriogênese do córtex cerebral e estão entre as principais causas conhecidas de atraso do desenvolvimento e epilepsia. Dentre os principais tipos de MDC podemos citar a heterotopia nodular periventricular (HNP), o espectro lissencefalia/heterotopia subcorti-cal em banda (LIS/HSB) e a esquizencefalia. Alterações moleculares em genes que atuam em mecanismos que vão desde o controle da divisão celular até a migração neuronal fo-ram identificadas como responsáveis pela etiologia de vários tipos de MDC. Tais descober-tas, além de auxiliar na compreensão dos mecanismos envolvidos no desenvolvimento do córtex cerebral e doenças relacionadas, fornecem informações importantes para um me-lhor diagnóstico e tratamento dos pacientes. Neste contexto, o principal objetivo deste trabalho foi analisar do ponto de vista molecular um grande grupo de pacientes com MDC. A casuística foi composta por um grupo de 107 pacientes: 27 possuem HNP, 33 são afeta-dos por LIS/HSB e 47 possuem esquizencefalia. Em um primeiro momento, foi realizada triagem de mutações de ponto em genes candidatos (FLNA, DCX, LIS1, EMX2, TUBA1A,
TUBB2B e TUBA8) por sequenciamento (Sanger). Posteriormente, a técnica de MLPA (Mul-tiplex Ligation-dependent Probe Amplification) foi utilizada para detectar variações
estru-turais em regiões candidatas, incluindo os genes FLNA, DCX e LIS1. Finalmente, a técnica de SNP-Array foi utilizada para análise das variações no número de cópias alélicas em re-giões genômicas de alguns pacientes (copy number variation - CNV). Todas as mutações de ponto encontradas nas sequencias de DNA foram verificadas em um grupo de 200 indiví-duos controles. Através do sequenciamento, foram identificadas três alterações patogêni-cas localizadas nos genes FLNA e DCX, através do MLPA foram encontradas seis alterações estruturais patogênicas nos genes FLNA, DCX e LIS1. Os ensaios de SNP-Array permitiram a identificação de vários CNVs com potencial deletério, incluindo 12 pacientes com 17 novas CNVs ainda não descritas na literatura. Tais CNVs envolvem vários potenciais genes
candi-Resumo
datos para as MDC, incluindo os genes TSNARE, DAAM1, ARX, PLXNA1 e HAUS7. Concluin-do, nossos resultados mostram uma baixa frequência de mutações em genes candidatos previamente relacionados às MDC, somente 2.8% (n=3/107) dos pacientes possuem vari-antes deletérias nas sequencias dos genes analisados e 18% (n=6/33 testados) dos pacien-tes analisados possuem alterações estruturais em regiões candidatas. Porém, através da abordagem genômica para identificação de variações estruturais, foram identificadas vá-rias regiões/genes candidatos potencialmente envolvidos com a etiologia das MDC (12/40= 30%). Nossos dados mostram que as MDC apresentam grande heterogeneidade genética, porém uma proporção significativa dos pacientes possuem variações estruturais que podem ser identificadas pela técnica de SNP-Array.
Abstract
ABSTRACT
Malformations of cortical development (MCD) are disorders resulting from defects in the embryogenesis of the cerebral cortex and are one of the most important causes of devel-opmental delay and epilepsy. The main types of MCDs are periventricular nodular hetero-topia (PNH), lissencephaly/subcortical band heterohetero-topia spectrum (LIS/SBH) and schizen-cephaly. Mutations in genes acting in mechanisms ranging from control of cell division to neuronal migration were identified as responsible for several types of MCDs. These ad-vances not only improved our understanding about the mechanisms involved in the de-velopment of the cerebral cortex but have also provided relevant information that can be used for better diagnosis and management of patients. In this scenario, the main objective of this study was to access and perform a comprehensive molecular genetics study in a large cohort of patients with MCD. We have studied a total of 107 patients with MCDs divided in the following groups: 27 with PNH, 33 with LIS/SBH and 47 with schizencephaly. We first searched for sequence variations in candidate genes (FNLA, DCX, LIS1, EMX2,
TU-BA1A, TUBB2B and TUBA8) using the Sanger sequencing method. Subsequently, we
checked for structural variants in FLNA, DCX and LIS1 using Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA) technique. Finally, we took a genomic approach by using sin-gle nucleotide polymorphism (SNP)-array technology to studied copy number variations (CNV) in some patients. All sequence variants found were subsequently verified in a group of 200 control individuals. Our results showed 3 pathogenic sequence variants in FNLA and
DCX, as well as 6 pathogenic structural variants detected by MLPA in FLNA, LIS1 and DCX.
SNP-array technique detected 17 genomic regions, in 12 patients, containing new CNVs. These CNVs involve a number of potential new candidate genes for MCDs, including:
TSNARE, DAAM1, ARX, PLXNA1 and HAUS7. In conclusion, our results show a low
frequen-cy of mutations in candidate genes previously associated with MCDs, only 2.8% (n=3/107) of our patients have deleterious sequence variants and 18% (n=6/33) have abnormal
Abstract
structural variants in candidate regions. However, by using a genomic approach to look for CNVs we were able to identify several candidate regions/genes that have the potential to be involved in MCDs (12/40= 30%). Our data show that MCDs are genetic heterogeneous; however, it seems that a significant proportion of patients have structural abnormalities that can be identified by SNP-array technology.
Introdução
1. INTRODUÇÃO
Com aproximadamente 100 bilhões de neurônios que migram pelo encéfalo e se orga-nizam em um quadrilhão de sinapses, o desenvolvimento do córtex cerebral é um meca-nismo complexo que pode ser prejudicado por fatores genéticos e ambientais levando aos distúrbios do desenvolvimento cortical (1).
Tais malformações do desenvolvimento cortical (MDC) estão entre as principais causas de epilepsia e atraso de desenvolvimento. Os avanços nas técnicas de imagens de resso-nância magnética (RM) tem possibilitado a identificação de grandes grupos de indivíduos com malformações corticais. É estimado que mais de 40% de crianças com epilepsia refra-tária, possuam algum tipo de MDC (2).
Para analisar as causas das malformações corticais é importante entender as fases do desenvolvimento cortical.
1.1. O desenvolvimento do córtex cerebral
O córtex cerebral é uma estrutura modular cuja formação se dá por indução de gru-pos de neurônios na camada neuroepitelial. Estes neurônios irão se diferenciar, migrar e se organizar no córtex adulto (3). Desse modo, a formação do córtex cerebral pode ser dividida didaticamente em três estágios que se sobrepõem: proliferação, migração e or-ganização.
A fase de proliferação tem início na 5ª - 6ª semanas, ocorrendo até a 6ª - 20ª semanas de gestação. No início da corticogênese, células neuroepiteliais sofrem sucessivas divisões simétricas, aumentando a quantidade de células progenitoras. Posteriormente, as células neuroepiteliais se diferenciam em células da glia que, por sua vez, sofrem divisões assimé-tricas originando novas células gliais e progenitores intermediários. Estes últimos se divi-dem simetricamente para dar origem aos neurônios (4).
Introdução
Os neurônios recém-formados devem migrar para seus destinos finais, caracterizando a fase de migração, que ocorre da 6ª - 7ª a 20ª - 24ª semanas de gestação. A migração celular ocorre através da movimentação dos neurônios corticais, tanto radialmente pelas fibras radiais gliais, quanto tangencialmente paralelo à superfície pial. Durante os estágios iniciais da migração, as células passam por um estágio chamado de multipolar. Posterior-mente, os neurônios passam a adotar uma conformação bipolar e migram através das fibras radiais gliais. As primeiras células que migram formarão a pré-placa. As demais on-das migratórias de neurônios irão, então, formar a placa cortical que irá dividir a pré-placa em uma camada mais externa denominada de zona marginal e uma camada mais interna chamada de sub-placa. Ao chegarem à placa cortical, os neurônios se organizam em ca-madas que irão se desenvolver no córtex adulto. Este processo segue um padrão chamado de “inside-out”, no qual os neurônios recém-chegados à placa cortical ultrapassam os neu-rônios mais antigos, acumulando-se progressivamente em camadas mais superficiais (Figura 1) (5).
Figura 1: Padrão inside out de migração neuronal e transição morfológica dos neurônios. Os neu-rônios recém-chegados à placa cortical [2] ultrapassam os neuneu-rônios mais antigos [1], acumulan-do-se progressivamente em camadas mais superficiais [3]. Os estágios multipolar e bipolar [4] mostram a transição morfológica sofrida pelas células no início da migração (adaptado de Riken
Introdução
A fase de organização tem início na 16ª semana de gestação e ocorre mesmo após o nascimento (2). Nesta fase os neurônios atingem seus destinos finais e realizam suas co-nexões sinápticas pela extensão de seus axônios e dendritos, completando a organização das seis camadas.
O posicionamento correto dos neurônios é essencial para a função neocortical nor-mal, desta forma defeitos em qualquer uma das fases da embriogênese do córtex cerebral podem levar às MDC.
1.2. Malformações do desenvolvimento cortical
O termo malformações do desenvolvimento cortical foi introduzido inicialmente em 1996 por Barkovich et al. (7) e agrupava crianças com retardo mental e epilepsia.
Atualmente as malformações do desenvolvimento cortical formam um grupo hetero-gêneo, com anormalidades anatômicas focais ou difusas, determinadas por diferentes causas, que se desenvolvem durante períodos críticos da formação do córtex. Em muitos casos a etiologia das MDC continua desconhecida, porém avanços nas áreas da biologia molecular e genética humana têm contribuído para a identificação de causas específicas de alguns tipos de MDC (8).
Desse modo, os aspectos genéticos das MDC tem ganhado importância nas classifica-ções propostas e, devido aos avanços nas pesquisas, as atualizaclassifica-ções das classificaclassifica-ções são realizadas constantemente (3).
Segundo a última classificação proposta por Barkovich et al., em 2012, (3) as malfor-mações do desenvolvimento cortical podem ser divididas em três grandes grupos, de acordo com a fase de desenvolvimento afetada. O grupo 1 contempla as malformações devido a proliferação ou apoptose anormais de neurônios e células da glia. O grupo 2 agrupa as malformações da fase de migração neuronal e o grupo 3 contém as malforma-ções devido a anormalidades pós-migracionais.
No primeiro grupo encontram-se as microcefalias congênitas, megalencefalias e dis-genesias corticais com anormalidades na proliferação (Ex: esclerose tuberosa e displasia cortical focal tipo II).
Introdução
No grupo 2 estão incluídas as heterotopias, lissencefalias clássicas, heterotopias sub-corticais, lissencefalia coblestone e displasia sublobar.
No grupo 3 estão descritas as esquizencefalias, polimicrogirias, as displasias corticais focais tipo I e as microcefalias pós-migracionas.
Em seguida, iremos nos concentrar na descrição das malformações corticais que fo-ram alvo desta tese de doutorado.
1.2.1. Malformações devido a anormalidades na migração neuronal
(Gru-po 2)
Os principais distúrbios da fase de migração neuronal estudados foram: a Heterotopia Nodular Periventricular (HNP) e o espectro da Lissencefalia/Heterotopia Subcortical em Banda (LIS/HSB).
1.2.1.1.
Heterotopia Nodular Periventricular
As heterotopias são malformações corticais nas quais os neurônios falham em migrar para seus destinos finais, se estabelecendo em regiões inapropriadas do encéfalo.
Dentro das heterotopias, a HNP é a forma mais comum, sendo caracterizada pela pre-sença de nódulos de neurônios, de tamanhos variáveis, ao longo dos ventrículos laterais (Figura 2) e um córtex aparentemente normal.
Figura 2: A- indivíduo normal. B- paciente com HNP (setas) (cedido por Cendes, F).
Introdução
A principal manifestação neurológica da HNP é a epilepsia, geralmente não havendo nenhuma deficiência grave nas funções cognitivas. Nos casos familiares ocorre um padrão de herança ligado ao cromossomo X, no qual as mulheres são afetadas e os homens afe-tados normalmente não sobrevivem.
A região Xq28 foi identificada como responsável por HNP (9) e o gene foi identificado como FLNA (filamina) (10).
O gene FLNA codifica uma grande fosfoproteína (280kDa) que se liga com a actina ex-pressa no sistema nervoso e em outros tecidos. A proteína FLNA interage com mais de 30 proteínas, mas o processo fisiológico de boa parte destas ligações ainda é desconhecido. Devido à quantidade de interações, a FLNA participa de cascatas de sinalizações de quina-ses e fosfataquina-ses, interage com receptores transmembrana e moléculas de sinalizações, auxiliando no tráfego de vesículas devido a sua associação com o complexo de Golgi (11). A ligação da FLNA com a actina promove estabilização do citoesqueleto, formando uma rede de filamentos supostamente importantes para a migração celular.
Algumas formas muito raras de HNP associadas à microcefalia e grave atraso do de-senvolvimento estão relacionadas a alterações no gene ARFGEF2 (adenosine
diphosphate-ribosylation factor guanine exchange factor 2 ) (12).
Ferland et al., em 2009, (13) identificaram alterações na camada neuroepitelial ao longo da zona ventricular em tecidos pós-morte de pacientes com HNP. Os nódulos de neurônios analisados eram formados em grande parte por neurônios gerados mais tardi-amente no desenvolvimento, sugerindo que problemas externos às células, ocorridos mais tardiamente no desenvolvimento, estariam prejudicando a migração e levando a forma-ção dos nódulos, enquanto os primeiros grupos de neurônios formados migrariam nor-malmente para suas posições finais.
Camundongos expressando construções dominante-negativas que prejudicam a fun-cionalidade do gene FLNA e camundongos com inibição do gene ARFGEF2 apresentaram alterações na camada neuroepitelial, próxima aos ventrículos, indicando as interações dos produtos proteicos destes genes com o transporte de vesículas e sua relação com a ade-são celular. Desse modo foi sugerido que alterações nos genes FLNA e ARFGEF2
prejudica-Introdução
riam o transporte de vesículas envolvidas na adesão celular, o que traria problemas a in-tegridade da camada neuroepitelial próxima aos ventrículos, prejudicando a migração neuronal e levando à formação de nódulos (13).
A HNP é uma desordem clínica heterogênea, apesar de o gene FLNA ser responsável por 100% dos casos familiares, apenas 26% dos casos esporádicos são explicados por alte-rações nesse gene (14).
1.2.1.2.
Espectro da Lissencefalia e Heterotopia Subcortical em Banda
A Lissencefalia (LIS) é uma malformação causada por falhas na migração neuronal. O termo lissencefalia se refere à condição na qual os sulcos da superfície do córtex estão diminuídos ou ausentes, dando ao córtex uma aparência “lisa”. A ausência das circunvolu-ções caracteriza a forma mais grave de lissencefalia chamada de agiria (Figura 3b). Quando os giros estão reduzidos é caracterizada a forma intermediária da malformação chamada de paquigiria (Figura 3c) (15). A lissencefalia clássica (tipo I) é caracterizada pela presença de um córtex espesso (10-20mm vs 4mm - normal) sem outras malformações cerebrais associadas. O córtex apresenta quatro camadas: a camada I com neurônios de Cajal-Retzius, a camada II formada por neurônios piramidais desorganizados, a camada III que possui tipos celulares variados e espaçados e a camada IV, mais espessa e com neurônios pequenos e médios, estendendo-se profundamente no encéfalo (Figura 4) (16).A lissencefalia clássica está associada a profundo retardo mental e crises epilépticas intratáveis (17).
A heterotopia subcortical em banda (HSB) é considerada a forma mais branda do es-pectro LIS/HSB, sendo caracterizada pela presença de uma banda anormal de neurônios em meio a substancia branca, e um córtex aparentemente normal (Figura 3d). Esta banda de neurônios forma um “segundo córtex”, abaixo do córtex normal, por isso tal malforma-ção é também conhecida como “duplo córtex”.
Introdução
Figura 3: A- indivíduo normal. B- paciente com agiria. C- paciente com paquigiria. D- paciente com HSB (cedido por Cendes, F).
A B
Introdução
Figura 4: A- corte histológico de uma paciente com lissencefalia. Esquema da laminação de um córtex com lissencefalia (B), mostrando as 4 camadas: camada I composta por neurônios Caja-Retzius, camada II composta por neurônios piramidais desorganizados, camada III composta por células variadas, camada IV composta por neurônios médios e pequenos. Esquema de um córtex normal (C) com 6 camadas: camada molecular (I), camada granular externa (II), camada piramidal
externa (III), camada granular interna (IV), camada piramidal interna (V), camada fusiforme (VI). (adaptado de Guerrini, (16)).
Pacientes com HSB possuem geralmente atraso no desenvolvimento de leve a mode-rado e epilepsia refratária, porém alguns pacientes apresentam manifestações clínicas leves (18).
Reiner et al. (19) isolaram o gene LIS1 como responsável pela forma autossômica dominante de lissencefalia clássica. O gene LIS1 está localizado no cromossomo 17p13.3 e codifica a subunidade β da isoforma cerebral de uma acetil-hidrolase ativadora de plaque-tas (PAFAH1b1).
O espectro LIS/HSB também pode ser causado por alterações em um gene ligado ao cromossomo X: a doublecortina (DCX) (20). O gene DCX está localizado na região Xq22.3-q23 e possui 9 exons (6 codificantes).
Embora as características de neuroimagem dos pacientes com mutações patogênicas em LIS1 e DCX sejam similares, foi observado que indivíduos com alteração no gene LIS1
Introdução
possuem a região posterior do córtex mais afetada, enquanto pacientes com alteração no gene DCX possuem a região anterior mais afetada (21).
Geralmente mulheres com alteração no gene DCX desenvolvem HSB, e os homens lis-sencefalia. Porém, já foram relatados homens com HSB com mutações no gene DCX. D’Agostinho et al. (22) identificaram mutações no gene DCX em 29% de homens com HSB. Casos raros de deleção no gene DCX foram descritos em homens com o mesmo fenótipo (23). Ambos os casos sugerem mosaicismo somático para a explicação dos fenótipos en-contrados, e, no trabalho de D’Agostinho (22), há também a possibilidade de existir uma função residual da proteína mutada.
1.2.1.3.
Gene LIS1 e o espectro LIS/HSB
A proteína LIS1 forma um complexo com a proteína Nude1 regulando a atividade da dineína e consequentemente dos microtúbulos durante a migração neuronal (24).
Mei et al. (25) identificaram mutações no gene LIS1 em 44% de pacientes com lissen-cefalia com a região posterior do cérebro mais afetada que a anterior. Duplicações e dele-ções no gene LIS1 são encontradas em 35% a 50% dos pacientes com lissencefalia (26) (25).
Camundongos heterozigotos para mutação no gene LIS1 apresentaram desorganiza-ção laminar do córtex e defeitos no córtex hipocampal e cerebelar (27). Foram encontra-dos neurônios corticais e glia com morfologia alterada, além de defeitos na migração neu-ronal, em camundongos heterozigotos para deleção de parte do gene LIS1 (28).
1.2.1.4.
Gene DCX e o espectro LIS/HSB
A proteína DCX tem alta expressão nas células neuronais do córtex em desenvolvi-mento, possui domínios de ligação com as tubulinas, sendo responsável pela organização e estabilização dos microtúbulos, afetando diretamente a migração celular (29).
Mutações no gene DCX são encontradas em 80% de mulheres e em aproximadamente 25% de homens com HSB (30). Alterações no número de cópias do gene DCX são encon-tradas em 33% de mulheres com HSB (26).
Introdução
Estudos com RNA de interferência para o gene DCX durante o desenvolvimento de ra-tos bloquearam a migração radial de neurônios, levando a um fenótipo similar ao de hu-manos com mutações no gene DCX, alguns neurônios interromperam a migração gerando HSB, enquanto outros migraram para locais inapropriados do córtex (31).
1.2.1.5.
Interação LIS1 e DCX
As proteínas LIS1 e DCX são co-expressas no cérebro em desenvolvimento e além de se ligarem aos microtúbulos, elas interagem entre si, sugerindo um importante papel no desenvolvimento cortical (32).
Mutações e alterações no número de cópias envolvendo os genes DCX e LIS1 são res-ponsáveis por aproximadamente 85% dos pacientes com LIS/HSB (26). A maioria dos entes com lissencefalia possuem alteração no gene LIS1 (25) enquanto a maioria dos paci-entes com HSB possuem alteração no gene DCX (30).
Como as proteínas LIS1 e DCX tem relação direta com os microtúbulos, não é surpresa que alterações nos genes das famílias das tubulinas, componentes dos microtúbulos, tam-bém sejam responsáveis por malformações do córtex cerebral.
1.2.1.6.
Gene TUBA1A e a lissencefalia
O primeiro gene da família das tubulinas a ser implicado com malformações do córtex cerebral foi o gene TUBA1A. Este gene se encontra na região 12q13.12 e codifica uma su-bunidade estrutural de microtúbulos, que tem alta expressão no SNC (33). Estudos em modelos animais (34) mostraram que alterações no gene TUBA1A, componente de mi-crotúbulos, acarretavam em anormalidades hipocampais, além de problemas na migração neuronal em camundongos, sugerindo um novo gene candidato para as malformações do córtex cerebral.
Pacientes com diferentes graus de lissencefalia foram identificados com mutação no gene TUBA1A (33) (34) (35) (36). Fallet-Bianco et al., em 2008 (37), e Leucortois et al., em 2010 (38), descreveram casos de fetos portadores de mutações no gene TUBA1A que apresentaram quadros graves de lissencefalia que resultaram em aborto. Geralmente, pacientes com mutações no gene TUBA1A apresentam, além da malformação cortical,
Introdução
outras malformações associadas, como anormalidades cerebelares, hipocampais e do cor-po caloso (33) (39).
1.2.2. Malformações devido a distúrbios pós migracionais (Grupo 3)
1.2.2.1.
Esquizencefalias
A Esquizencefalia é caracterizada pela presença de fendas unilaterais ou bilaterais nos hemisférios cerebrais, com comunicação entre os ventrículos e o espaço extra-axial suba-racnóide (2). As fendas podem possuir as paredes separadas ou fechadas, caracterizando respectivamente a esquizencefalia de lábios abertos e a esquizencefalia de lábio fechados (Figura 5). Grandes porções dos hemisférios podem estar ausentes e substituídas por líqui-do cérebro-espinhal (40). É comum as fendas apresentarem polimicrogiria em suas pare-des, justificando a classificação da esquizencefalia como um distúrbio pós-migracional (fase de organização) (41).
Figura 5: A- Paciente com esquizencefalia de lábios abertos. B- Paciente com esquizencefalia de lábios fechados (seta preta) e heterotopia periventricular (cabeça de seta branca) (A- Cedido por
Cendes, F; B- Adaptado de Merello et al. (42)).
A esquizencefalia pode resultar de insultos ambientais como: traumas maternos, uso de drogas, infecções virais e problemas vasculares intra-uterinos (43). Geralmente a es-quizencefalia ocorre esporadicamente, mas já foram relatados casos familiares (44).
Introdução
dências de um comprometimento genético foram apresentadas por alguns estudos. Em 1996, Brunelli et al. (40) identificaram três pacientes com esquizencefalia que eram hete-rozigotos para mutações no gene EMX2. Em 1997, Faiella et al. (45) e Granata et al. (46) identificaram mutações no gene EMX2 em irmãos com esquizencefalia bilateral grave.
O gene EMX2 se localiza no cromossomo 10q25.3-q26.1, possui três exons e é consi-derado um gene homeobox, que codifica um fator de transcrição capaz de regular outros genes (47).
Bayatti et al. (48) mostraram um gradiente de expressão do RNAm do gene EMX2 no desenvolvimento do córtex humano, iniciando com alta expressão na zona ventricular e subventricular (oito semanas pós concepção), e depois passando a predominar na região da placa cortical (12 semanas pós concepção). Estudos em animais transgênicos com dife-rentes padrões de expressão do gene EMX2 apresentaram áreas primárias, motoras e sen-sitivas alteradas em tamanho e deslocadas rostrolateralmente (49) sugerindo que o gene
EMX2, junto com outros genes, é responsável pela definição da posição e do tamanho das
áreas corticais primárias.
Apesar dos trabalhos antigos sugerirem a relação do gene EMX2 com a esquizencefa-lia, trabalhos atuais não corroboram esta hipótese. Estudos recentes em grandes grupos de pacientes com esquizencefalia não identificaram alterações patogênicas no gene EMX2 (43) (42) (50). Tais achados além de questionar a validade dos trabalhos antigos, questio-nam a real importância do gene EMX2 para as malformações corticais.
1.3. Separação de fases: um conceito defasado?
A separação tradicional em que um gene estava relacionado a somente uma malfor-mação cortical, relacionada a um estágio do desenvolvimento, tem se tornado defasada atualmente. Trabalhos recentes mostram que um mesmo gene pode levar a malforma-ções corticais de “fases” diferentes. Novos genes têm sido identificados e a heterogenei-dade dos fenótipos pode ser explicada por um mesmo gene que afeta múltiplos estágios do desenvolvimento ou por vários genes que participam de um mesmo mecanismo (51).
Introdução
Recentemente, mutações no gene WDR62 foram identificadas como responsáveis por um amplo espectro de malformações corticais. Alterações no mesmo gene, e em alguns casos até a mesma mutação, causaram fenótipos diversos nos pacientes, como microcefa-lia, lissencefamicrocefa-lia, polimicrogiria, esquizencefalia e hipoplasia cerebelar e do corpo caloso (52).
Outro exemplo da complexidade dos mecanismos do desenvolvimento cortical são os genes da família das tubulinas (TUBA1A, TUBB2B, TUBA8) que recentemente foram relaci-onados a diversos tipos de MDC.
1.3.1. Gene TUBA1A
Os pacientes com mutações no gene TUBA1A frequentemente eram identificados com lissencefalia, possuindo geralmente outras malformações associadas (33) (39). Po-rém, recentemente, este gene foi relacionado a outras formas de MDC. Jansen et al. (53) identificaram duas novas mutações no gene TUBA1A, uma delas em um paciente com lissencefalia e a outra em três pacientes de uma família, dois deles com quadro de polimi-crogiria perisilviana.
1.3.2. Gene TUBB2B
O gene TUBB2B, localizado no cromossomo 6p25.2, faz parte da família de genes das β tubulinas, subunidade formadora da proteína tubulina. Assim como nos outros genes de tubulinas (α e β), recentemente mutações nesse gene foram relacionadas a malformações corticais. Romaniello et al. (54) identificaram uma mutação no gene TUBB2B no sítio de ligação com GTP da molécula de tubulina em um paciente portador de esquizencefalia e polimicrogiria. Jaglin et al. (55) encontraram mutações nesse gene em pacientes com po-limicrogiria.
1.3.3. Gene TUBA8
O gene TUBA8, localizado no cromossomo 22q11.21, apesar de pouco expresso no SNC, pode ter importante papel no desenvolvimento cortical. Abdollahi et al. (56) identi-ficaram um caso de síndrome autossômica recessiva causada por uma deleção de 14pb no
Introdução
gene TUBA8, encontrada em pacientes com polimicrogiria generalizada associada a hipo-plasia do nervo óptico.
1.4. Novas descobertas em distúrbios do SNC
As variações do genoma humano são fundamentais para se entender a diversidade de fenótipos. Estudos anteriores mostravam que os SNPs (single nucleotide polymorphism) eram a principal fonte de variação no genoma humano (57). Com os projetos genoma (58) e outras iniciativas (59) (60) foram identificados cerca de 12 milhões de SNPs, depositados em bancos de dados públicos.
Porém, com o avanço das tecnologias de triagem do genoma, tem se descoberto um grande grupo de alterações estruturais com tamanho variável, sendo muitas vezes altera-ções submicroscópicas, não detectadas por métodos de citogenética e/ou sequenciamen-tos tradicionais. Evidencias indicam que as alterações estruturais podem compreender milhões de nucleotídeos polimórficos em cada genoma, contribuindo para a diversidade humana e a susceptibilidade a doenças (57).
As variações do número de cópias (copy number variation – CNV) são as alterações estruturais mais prevalentes no genoma humano, e têm sido encontradas em alta fre-quência na população (61).
Apesar de ainda não numerosa, a literatura existente tem mostrado a relação das CNVs com distúrbios do sistema nervoso central (SNC). CNVs patogênicos são encontrados em 14-18% de pacientes com retardo mental e outros distúrbios relacionadas ao SNC (62). Um grande grupo de pacientes com diversos tipos de malformação cerebral, incluindo lissencefalia, polimicrogiria, displasia cortical focal e agenesia do corpo caloso foram anali-sados para detecção de CNVs. Foi encontrado pelo menos um CNV novo em 22.5% dos pacientes, e análises dessas regiões sugeriram novos genes candidatos para as malforma-ções (63).
Valduga et al. (64) analisaram fetos com malformações congênitas diversas e encon-trou CNVs patogênicas em 10% dos casos. CNVs foram encontradas em fetos com
agene-Introdução
sia do corpo caloso, dimorfismos faciais, retardo do crescimento e complexas malforma-ções cerebrais.
Griswold et al. (65) estudaram grandes grupos de pacientes com autismo (ASD –
Au-tism spectrum disorder) e controles caucasianos e, através de análises de CNVs,
identifica-ram novos genes candidatos para a doença.
Como as malformações corticais são caracterizadas por heterogeneidade genética, um número significativo de indivíduos afetados permanece sem etiologia molecular de-terminada. Deste modo, a identificação de variações estruturais (CNV) pode resultar na descoberta de regiões e genes candidatos, fornecendo pistas sobre os mecanismos mole-culares de malformações corticais de causa desconhecida.
Objetivos
2.
OBJETIVOS
2.1. Objetivos Gerais
Traçar um perfil molecular de um grupo de pacientes com algumas malformações do córtex cerebral,
2.2. Objetivos Específicos
Identificar a presença de mutações de ponto deletérias nos principais genes candi-datos para cada malformação,
Pesquisar alterações estruturais em regiões candidatas em pacientes com lissence-falia / heterotopia subcortical em banda,
Identificar alterações estruturais (“variações no número de cópias” - CNV) inéditas e com potencial patológico para a etiologia molecular das malformações corticais.
Materiais e Métodos
3.
MATERIAIS E MÉTODOS
3.1. Casuística
Os pacientes para esse estudo foram recrutados nos ambulatórios dos serviços de Neurologia do HC-UNICAMP e do HC-USP-RP pelos Profs. Drs.: Fernando Cendes, Marilisa M. Guerreiro, Maria Augusta Montenegro, Vera Terra, Antonio Carlos dos Santos e Améri-co Sakamoto. Os exames de neuroimagem dos pacientes foram analisados no Laboratório de Neuroimagem do Departamento de Neurologia da FCM-UNICAMP e no serviço de Ra-diologia do HC-USP-RP.
Um questionário foi utilizado para obter informações detalhadas sobre a história fa-miliar de epilepsia ou a presença de déficit neurológico em parentes de primeiro, segundo e terceiro grau e a ocorrência de qualquer evento pré-natal durante as primeiras 24 se-manas de gestação. Eventos pré-natais significantes incluem qualquer anormalidade re-portada pela mãe ou familiares durante as primeiras 24 semanas de gestação, como ten-tativa de aborto, uso de drogas, abuso físico, queda com trauma abdominal, hipertensão, febre, diabetes mellitus, exposição a raios X, infecção por citomegalovírus e gestação ge-melar.
Foram coletadas amostras de sangue de pacientes afetados por diferentes formas de MDC e que tiveram confirmação do diagnóstico por exames de neuroimagem. Sempre que possível os pais ou irmãos destes indivíduos também eram avaliados clinicamente e as amostras coletadas.
O grupo controle foi formado por cerca de 200 indivíduos normais não relacionados. A ausência de malformações no córtex cerebral nos indivíduos deste grupo foi confirmada por exames de RM quando possível.
Materiais e Métodos
3.1.1. Caracterização da amostra
A casuística foi composta por um total de 107 pacientes com malformações corticais. Este total de pacientes foi dividido em três grupos: I) pacientes com HNP, II) pacientes com o espectro LIS/HSB e III) pacientes com esquizencefalia.
O grupo de HNP (grupo I) possui 27 pacientes (Tabela 1), sendo 15 mulheres e 12 ho-mens. Dentre eles 9 possuem HNP bilateral (4 homens e 5 mulheres), 25 pacientes possu-em epilepsia, sendo predominante as crises parciais simples e complexas, com idade de início das crises variando de 10 dias de vida a 35 anos. O exame neurológico foi considera-do normal em 11 casos.
Materiais e Métodos
Tabela 1: Característica Clínicas do pacientes com Heterotopia Nodular Periventricular.
Registro-Gênero
Data nasci-mento
Neuroimagem Exame
neu-rológico
Início das crises Tipo de crise Frequência 283\01 - F 15/02/1981 HNP à direita, heterotopias focais, polimicrogiria normal 12 anos parciais 5 vezes por semana 302\01 - M 24/08/1948 HNP assimétrica à esquerda, lobos cerebrais
assimétricos com leve redução à esquerda
normal 17 anos CPC, raramente
CTCG
controlada
373\01 - F nd heterotopia transmanto normal 10 anos parciais semanal
521\01 - F nd HNP bilateral normal 2 anos parciais, CTCG uma vez por
mês 680\01 - F 22/07/1948 HNP à direita, assimetria hipocampal c/
diminui-ção do hipocampo direito, agenesia do corpo caloso e polimicrogiria
normal 35 anos parciais uma vez a cada
três meses 1032\01 -
M
20/12/1965 HNP em corno temporal direito normal 20 anos parciais, CTCG 8 a 10 vezes
por mês 173\02 - F 07/08/1965 HNP bilateral, colpocefalia e heterotopias na
substância branca
normal 29 anos parciais três vezes por
mês 874\02 - F 08/01/1980 HNP bilateral mais posterior em corno temporal,
nódulos bilaterais, porém não contíguos
normal 3 anos CPS, CPC, CTCG controlada
975\02 - M 21/04/1980 HNP bilateral normal 2 anos nd nd
160\03 - F 10/10/1962 HNP normal 13 anos CPS, CPC, CTCG uma vez por
mês 607\03 - F nd heterotopia mais lateralizada, posterior a
es-querda e subcortical
normal 5 anos parciais simples e complexas
uma vez por semana 258\08 - F nd HNP nos cornos posteriores dos ventrículos
late-rais
nd não têm crises não têm crises não têm crises
497\08 - M 10/12/2008 HNP nd 14 anos ausência, parciais e
CTCG
5 crises por mês 537\08 - M 01/02/1991 HNP, agenesia parcial de corpo caloso, atrofia
cerebral, hidrocefalia
tetraparesia espastica
Materiais e Métodos
Registro-Gênero
Data nasci-mento
Neuroimagem Exame
neu-rológico
Início das crises Tipo de crise Frequência
77\09 - M 09/03/1985 HNP nd 20 anos CPC, CTCG Uma ou duas
por mês
143\09 - F 04/12/1956 HNP à esquerda nd 1 ano CPC, CTCG Uma ou duas
por mês
P1 - F nd HNP nd 17 anos CPS, CTCG anual
P2 - M nd HNP nd 23 anos CPS, CPC uma por mês a
duas por ano P3 - F nd HNP bilateral, hipoplasia do vermis, focos
ines-pecíficos em T2
nd 20 anos CPS, CPC, CTCG mensal a
se-manal
P4 - F nd HNP bilateral nd 5 anos CPS, CPC, CTCG uma a duas por
mês
P5 - M nd HNP nd 16 anos CPS, CPC mensal
P6 - F nd HNP nd 18 anos CPS, CPC, CTCG anual
898/02 – M nd HNP bilateral Déficit grave 4 meses Típicas da síndrome
de West
controladas 899/02 – M 10/07/1998 HNP bilateral Déficit grave 4 meses Típicas da síndrome
de West
controladas
900/02 – M nd HNP bilateral Déficit grave 4 meses Típicas da síndrome
de West
controladas 524/09 - F 05/04/2002 HN subEpendimária à esquerda, duas fendas de
esquizencefalia de lábios fechados
Distúrbio de
aprendiza-gem
1 ano CPS, CPC, CTCG variada
579/09 – M nd HNP (possui síndrome Cerebro-Fronto-Facial) nd nd nd nd
F=Feminino, M= masculino, HNP= heterotopia nodular periventricular, CTCG= crise tônico-clônica generalizada, CPC= crise parcial complexa, CPS= crise parcial simples, nd=não disponível.
Materiais e Métodos
O grupo do espectro LIS/HSB (grupo II) foi composto por 33 pacientes (Tabela 2), sen-do 21 com lissencefalia (13 homens e 8 mulheres) e 12 com HSB (4 homens e 8 mulheres). Vinte e cinco pacientes do grupo possuem epilepsia, sendo predominante as crises parci-ais, com idade de início variando de 10 dias de vida a 25 anos. O exame neurológico dos pacientes variou de leve a grave retardo mental, sendo diagnosticado como normal em dois pacientes.
Materiais e Métodos
Tabela 2: Características Clínicas dos pacientes com o espectro da LIS/HSB.
Registro-Gênero
Data nasci-mento
Neuroimagem Exame neurológico Início das
crises
Tipo de crise Frequência 60/01 - M 14/02/1959 HSB com bandas finas difusas
mais acentuadas frontalmente e mais finas posteriormente
normal 18 anos possivelmente
atoni-cas
2 x por dia
66/01 - M 11/09/1991 paquigira difusa com predomí-nio anterior
retardo mental leve 2 anos parciais diárias
420/01 - F 23/02/1999 lissencefalia incompleta retardo do desenvolvimento neu-ropsicomotor
1 ano mioclônicas nd
457/01 - F 28/09/1980 paquigiria posterior e HSB ante-rior
retardo do desenvolvimento neu-ropsicomotor
7 anos parcial 2 x por mês
473/01 - M 18/01/1966 paquigiria difusa com predomí-nio posterior bilateral
retardo do desenvolvimento neu-ropsicomotor
6 meses parcial nd, não
controladas 523/01 - F nd HSB mais anterior, difusa
conti-nua e grossa
hemiparesia leve à esquerda e sd de liberação piramidal à esquerda
4 anos parcial diárias
599/01 - M 23/04/1997 agiria posterior e paquigiria anterior
sd de liberação piramidal, hipoto-nia, visão subnormal
3 meses parcial, CTCG diárias
868/01 - M 05/03/1995 lissencefalia incompleta tipo 1 retardo do desenvolvimento neu-ropsicomotor e síndrome de
libe-ração piramidal
2 meses vários tipos, Lennox-Gastaut
diárias
903/01 - F 25/05/1974 HSB difusa e descontínua mais à direita
normal 7 anos parcial 2 x por mês
1004/01 - M
26/09/1998 paquigiria difusa com predomí-nio posterior
tetraparesia não tem não tem não tem
1158/01 - F
23/10/1989 paquigira difusa com predomí-nio posterior
retardo do desenvolvimento neu-ropsicomotor
2 anos vários tipos, Lennox-Gastaut
diárias 1184/01 -
F
09/09/1987 lisencefalia incompleta tipo 1 retardo do desenvolvimento neu-ropsicomotor e síndrome de
libe-ração piramidal global
5 meses espasmos infantis (West), vários tipos
(Lennox-Gastaut)
