Desenvolvimento de método para determinação de resíduos de pesticidas na planta medicinal Transagem (Plantago major L.) utilizando as técnicas de DMFS e CLAE-UV/DAD

Texto

(1)Universidade Federal de Sergipe Pró-Reitoria de Pós-Graduação e Pesquisa Programa de Pós-Graduação em Química. ÉRICA SILVIA DOS SANTOS. DESENVOLVIMENTO DE MÉTODO PARA DETERMINAÇÃO DE RESÍDUOS DE PESTICIDAS NA PLANTA MEDICINAL TRANSAGEM (Plantago major L.) UTILIZANDO AS TÉCNICAS DE DMFS E CLAE-UV/DAD. São Cristóvão - Sergipe 2012.

(2) ÉRICA SILVIA DOS SANTOS. DESENVOLVIMENTO DE MÉTODO PARA DETERMINAÇÃO DE RESÍDUOS DE PESTICIDAS NA PLANTA MEDICINAL TRANSAGEM (Plantago major L.) UTILIZANDO AS TÉCNICAS DE DMFS E CLAE-UV/DAD. Dissertação apresentada ao Programa de PósGraduação em Química da Universidade Federal de Sergipe, como um dos requisitos para a obtenção do título de Mestre em Química.. ORIENTADOR: Prof. Dr. Sandro Navickiene. São Cristóvão - Sergipe 2012.

(3) FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA BIBLIOTECA CENTRAL UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE. S237d. Santos, Érica Silvia dos Desenvolvimento de método para determinação de resíduos de pesticidas na planta medicinal transagem (Plantago major L.) utilizando as técnicas de DMFS e CLAE-UV/DAD / Érica Silvia dos Santos ; orientador Sandro Navickiene. – São Cristóvão, 2012. 74 f. : il. Dissertação (Mestrado em Química) – Universidade Federal de Sergipe, 2012.. 1. Química analítica. 2. Análise cromatográfica. 3. Pesticidas. 4. Plantas medicinais. 5. Plantaginácea. I. Navickiene, Sandro, orient. II. Título. CDU 543.54:582.933.

(4) Este trabalho é dedicado especialmente aos meus queridos pais, Adelson e Sidrônia, pela força, apoio, incentivo, compreensão e pelos seus sacrifícios. Pais iguais a vocês não há!.

(5) “Para todas as coisas tenho força em virtude daquele que me confere poder.” (Filipenses 4:13).

(6) AGRADECIMENTOS. Hoje mais do que nunca, agradeço primeiramente a Jeová Deus, por ter me dado forças além do normal para vencer todos os obstáculos. Um agradecimento especial ao meu orientador Prof. Dr. Sandro Navickiene pela dedicação, sugestões, paciência, humildade e competência, que muito contribuíram para o meu desenvolvimento profissional. Foi uma honra tê-lo como orientador! Aos meus pais que me ofereceram sempre o melhor que puderam me dar, através de um olhar de apoio, de uma palavra de incentivo, de um gesto de compreensão, de uma atitude de segurança, mesmo quando me veio o desânimo. Sou grata aos meus irmãos – Arlyson, Arlecson e Silvio – pelo carinho, atenção, companhia e ajuda. As minhas tias Daci, Cleonice e Selma, pelo estímulo e força. E a minha prima Débora pelos momentos de descontração. A Juliana por me receber de braços abertos no seu lar nos momentos que mais precisei. Aos meus colegas de mestrado: Vilma, Danielle, Emanuel, Givanilton, Alan, Aldair, Santiago, Michel Rafael, Tarcísio e Pedro Ernesto, pela agradável convivência e colaboração mútua. Aos colegas do LCP: Tamires, Jordana, Valéria, Adriano Aquino, Alain Gaujac, Cybelle, Daniela Lima, Elissandro, Sérgio, Fabrício, Luana, Michel Rubens, Paloma e Nicallen pelos momentos compartilhados. A Cyntia Barbosa pela grande ajuda no estágio de docência. Ao Núcleo de Pós-Graduação e o seu corpo docente por proporcionar a oportunidade de realização do curso de Mestrado em Química. Ao CNPq pelo financiamento do projeto intitulado "Cooperação Acadêmica UFSUFSCar para o Fortalecimento do Programa de Pós-Graduação em Química aplicado ao Estudo de Recursos Naturais Renováveis do Estado de Sergipe", processo nº 620212/2008-8, sob a coordenação do Prof. Péricles Barreto Alves. A CAPES pela bolsa de mestrado concedida. Aos meus amigos pela amizade e apoio. Enfim, a minha gratidão se estende a todos os familiares e amigos que me incentivaram a construir esse sonho e que com certeza sentem-se felizes por eu ter conseguido mais essa vitória..

(7) SUMÁRIO LISTA DE FIGURAS............................................................................................................ viii. LISTA DE TABELAS........................................................................................................... x. LISTA DE ABREVIATURAS OU SIGLAS........................................................................ xi. RESUMO............................................................................................................................... xiii. ABSTRACT........................................................................................................................... xiv. 1. INTRODUÇÃO................................................................................................................. 15 2. OBJETIVOS...................................................................................................................... 18 2.1. Objetivo geral.................................................................................................................. 18. 2.2. Objetivos específicos...................................................................................................... 18 3. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA..................................................................................... 19. 3.1. Plantas medicinais........................................................................................................... 19. 3.1.1. Transagem (Plantago major L.)................................................................................... 20. 3.2. Pesticidas......................................................................................................................... 22. 3.2.1. Pesticidas selecionados neste estudo............................................................................ 24. 3.2.1.1. Cresoxim-metílico..................................................................................................... 25. 3.2.1.2. Clofentezina.............................................................................................................. 26 3.2.1.3. Flumetralina.............................................................................................................. 27 3.3. Dispersão da matriz em fase sólida................................................................................. 28. 3.3.1. Adsorventes alternativos utilizados para a extração dos pesticidas............................. 32. 3.3.2. Aplicação da dispersão da matriz em fase sólida em plantas medicinais.................... 32 3.4. Cromatografia líquida de alta eficiência ........................................................................ 34 3.5. Validação do método analítico........................................................................................ 37. 3.5.1. Seletividade.................................................................................................................. 38. 3.5.2. Exatidão....................................................................................................................... 38 3.5.3. Precisão........................................................................................................................ 39 3.5.4. Linearidade................................................................................................................... 41. 3.5.5. Limite de detecção (LOD)........................................................................................... 42. 3.5.6. Limite de quantificação (LOQ).................................................................................... 42. 4. EXPERIMENTAL............................................................................................................. 43. 4.1. Materiais.......................................................................................................................... 43. 4.2. Reagentes e adsorventes.................................................................................................. 43. 4.3. Padrões dos pesticidas..................................................................................................... 43.

(8) 4.4. Equipamentos.................................................................................................................. 43. 4.5. Preparação da planta medicinal....................................................................................... 46. 4.6. Preparação das soluções padrão dos pesticidas............................................................... 47. 4.7. Preparação da curva analítica.......................................................................................... 47. 4.8. Preparação da amostra testemunha................................................................................. 47 4.9. Limpeza da vidraria........................................................................................................ 47 4.10. Condições cromatográficas de análise.......................................................................... 48 4.11. Método de extração por DMFS..................................................................................... 49. 5. RESULTADOS E DISCUSSÃO..................................................................................... .. 51. 5.1. Otimização das condições cromatográficas por CLAE.................................................. 51 5.2. Otimização do procedimento de extração por DMFS usando diferentes adsorventes.... 53. 5.2.1.Ensaios com amostras desidratadas de transagem para seleção do suporte sólido....... 53. 5.2.2. Ensaios com amostras in natura de transagem............................................................ 56. 5.2.3. Eficiência de extração de pesticidas em amostras desidratadas com o polímero de coordenação [Zn(BDC)(H2O)2]n e aminopropil.................................................................... 6. VALIDAÇÃO DO MÉTODO........................................................................................... 58 60. 6.1. Seletividade..................................................................................................................... 60 6.2. Exatidão e precisão......................................................................................................... 61 6.3. Linearidade..................................................................................................................... 6.4. Limite de detecção (LOD) e limite de quantificação (LOQ)......................................... 7. CONSIDERAÇÕES FINAIS............................................................................................ 8. REFERÊNCIAS................................................................................................................. 64 67 67 69.

(9) viii. LISTA DE FIGURAS Figura 1.. Planta medicinal transagem (Plantago major L.)............................................ 20. Figura 2.. Esquema de dispersão da matriz em fase sólida.............................................. 29. Figura 3.. Esquema da estrutura da sílica gel. Em destaque os grupos silanol geminal (1), silanol vicinal (2) e siloxano (3)................................................................ 30. Figura 4.. Balança analítica (Sartorius TE2145)............................................................... 44. Figura 5.. Evaporador rotatório (Fisatom 802D).............................................................. 44. Figura 6.. Sistema para SPE Vacuum Manifold............................................................... 44. Figura 7.. Sistema de ultrapurificação de água (Milli-Q)................................................. 45. Figura 8.. Cromatógrafo líquido de alta eficiência com detector espectrofotométrico com arranjo de fotodiodos................................................................................ Figura Figura 9. 9.. 45. Lavadora ultra-sônica (Unique)....................................................................... 45. Figura 10. Transagem in natura: (a) Folhas e pecíolos e (b) Folhas e pecíolos triturados........................................................................................................... 46. Figura 11. Transagem desidratada: (a) Folhas e pecíolos e (b) Folhas e pecíolos triturados........................................................................................................... 46. Figura 12. Etapas do procedimento de extração dos pesticidas......................................... 50. Figura 13. Cromatograma obtido por CLAE-UV/DAD da solução padrão de pesticidas em acetonitrila na concentração de 2 µg g-1..................................................... 51. Figura 14. Espectro de UV do pesticida cresoxim-metílico obtido por CLAE-UV/DAD 52 Figura 15. Espectro de UV do pesticida clofentezina obtido por CLAE-UV/DAD......... 52. Figura 16. Espectro de UV do pesticida flumetralina obtido por CLAE-UV/DAD.......... 52. Figura 17. Eficiência na recuperação (%) dos pesticidas utilizando diferentes adsorventes (n=2)............................................................................................. 54. Figura 18. Cromatograma obtido por CLAE-UV/DAD do branco da amostra de transagem desidratada...................................................................................... 55.

(10) ix. Figura 19. Cromatograma obtido por CLAE-UV/DAD com extrato de amostra de transagem fortificada........................................................................................ 55. Figura 20. Eficiência da recuperação (n=4) e desvio padrão relativo (DPR%) em amostras de transagem in natura...................................................................... 57 Figura 21. Cromatograma obtido por CLAE-UV/DAD do branco da amostra de transagem in natura.......................................................................................... 57 Figura 22. Eficiência da recuperação (n=2) e desvio padrão relativo (DPR%) em amostras de transagem desidratada usando o polímero de coordenação [Zn(BDC)(H2O)2]n........................................................................................................................................ 58 Figura 23. Eficiência da recuperação (n=2) e desvio padrão relativo (DPR%) em amostras. de. transagem. desidratada. usando. o. aminopropil...................................................................................................... Figura 24. Superposição dos cromatogramas da amostra forticada e do branco............... 59 61. Figura 25. Cromatograma obtido por CLAE-UV/DAD com extrato de amostra de transagem fortificada com 1 µg g-1.................................................................. 63 Figura 26. Cromatograma obtido por CLAE-UV/DAD com extrato de amostra de transagem fortificada com 1,5 µg g-1............................................................... 63 Figura 27. Cromatograma obtido por CLAE-UV/DAD com extrato de amostra de transagem fortificada com 2 µg g-1.................................................................. 64 Figura 28. Curva analítica obtidas no solvente acetonitrila e analizados por CLAEUV/DAD do cresoxim-metílico....................................................................... 65 Figura 29. Curva analítica obtidas no solvente acetonitrila e analizados por CLAEUV/DAD do clofentezina................................................................................. 66. Figura 30. Curva analítica obtidas no solvente acetonitrila e analizados por CLAEUV/DAD da flumetralina................................................................................. 66.

(11) x. LISTA DE TABELAS. Tabela 1.. Classificação toxicológica dos agrotóxicos em função do DL50........... Tabela 2.. Dados da literatura sobre aplicação de dispersão da matriz em fase. 24. sólida para a extração de resíduos de pesticidas em plantas medicinais............................................................................................. Tabela 3.. 34. Programação de eluição da fase móvel no modo gradiente do CLAEUV/DAD otimizada para análise dos pesticidas selecionados em planta medicinal transagem................................................................... Tabela 4.. Tempo de retenção dos pesticidas......................................................... Tabela 5.. Eficiência da recuperação (n=4) e desvio padrão relativo (DPR%) em três. níveis. de. concentração. dos. pesticidas. estudados. 48 51. em. transagem............................................................................................... Tabela 6.. Valores dos coeficientes de correlação e equações da reta.................... Tabela 7.. Valores dos limites de detecção (LOD) e limites de quantificação (LOQ)..................................................................................................... 62 65. 68.

(12) xi. LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS. ACN - Acetonitrila ANVISA - Agência Nacional de Vigilância Sanitária C8 - Fase sólida à base de sílica modificada com grupos octil C18 - Fase sólida à base de sílica modificada com grupos octildecil CV - Coeficiente de variação DAD – Detector de arranjo de fotodiodos DDT - Diclorodifeniltricloroetano DL50 - Dose letal para 50% da população EMBRAPA – Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária CG - Cromatografia à gás CG-EM – Cromatografia à gás acoplada à espectrometria de massa CG-ECD – Cromatografia à gás com detector por captura de elétrons CG-DNP - Cromatografia à gás com detector nitrogênio-fósforo CLAE - Cromatografia líquida de alta eficiência CLAE-UV/DAD - Cromatografia líquida de alta eficiência com detector espectrofotométrico de absorção no ultravioleta/visível com arranjo de fotodiodos IBAMA - Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e dos Recursos Naturais ICH – Protocolo harmonizado internacional (International Conference on Harmonisation) INMETRO – Instituto Nacional de Metrologia, Normalização e Qualidade IUPAC - União Internacional de Química Pura e Aplicada (International Union of Pure and Applied Chemistry) CL-EM/EM – Cromatografia líquida acoplada a espectrometria de massa seqüencial LOD - Limite de detecção (limit f detection) LOQ - Limite de quantificação (limit of qualification) EM –Espectrometria de massas DMFS – Dispersão da matriz em fase sólida OMS – Organização Mundial da Saúde r - coeficiente de correlação DPR - Desvio padrão relativo (Relative Standard Deviation).

(13) xii. s – Estimativa do desvio padrão absoluto SPE- Extração em fase sólida (do inglês, Solid Phase Extraction) UV-Vis – Ultravioleta visível..

(14) xiii. RESUMO. O uso terapêutico de plantas medicinais tem base na tradição familiar e tornou-se prática generalizada na medicina popular. Contudo não há uma garantia para a grande maioria dos produtos comercializados quanto à qualidade e eficácia, visto que as plantas medicinais estão sujeitas a diversos tipos de contaminação, como por exemplo, resíduos de pesticidas. Estes produtos químicos são utilizados no controle e combate de pragas e ervas daninhas, porém são potencialmente tóxicos ao homem. Em vista disso, este trabalho tem como objetivo o desenvolvimento de método baseado nas técnicas da dispersão da matriz em fase sólida (DMFS) e cromatografia líquida de alta eficiência com detector espectrofotométrico com arranjo de diodos para determinar resíduos dos pesticidas cresoxim-metílico, clofentezina e flumetralina em amostras desidratadas e in natura de transagem (Plantago major L.). O método por dispersão da matriz em fase sólida foi desenvolvido utilizando amostras desidratadas, testando-se diferentes adsorventes (alumina neutra, Florisil®, sílica, C18, Basolite®), na proporção matriz/adsorvente 1:1 (m/m). Os melhores valores de recuperações para os pesticidas em análise por CLAE-UV/DAD foram obtidos com sílica, utilizando um volume de 20 mL de diclorometano com valores médios de recuperação variando de 45,5 a 90,3%, e coeficientes de variação na faixa de 6,1 a 18,5% para os níveis de concentração de 1,0; 1,5 e 2,0 µg g-1. Coeficientes de correlação entre 0,9992 e 0,9997 foram obtidos para um intervalo de concentração entre 0,2 e 5,0 µg g-1. Os limites de detecção e quantificação ficaram na faixa de 0,60 a 0,90 µg g-1 e 1,0 µg g-1, respectivamente. Também foram feitos testes de recuperação dos pesticidas com a planta desidratada utilizando os adsorventes aminopropil e o polímero de coordenação [Zn(BDC)(H2O)2]n. Foram realizadas análises pela técnica de CLAE-UV/DAD com a planta in natura, utilizando o adsorvente sílica, com valores de recuperação dos pesticidas na faixa de 78,3 a 110,1% e coeficientes de variação entre 9,9 e 15,6% para o nível de concentração de 2,0 µg g-1.. Palavras-chave: pesticidas; DMFS; CLAE-UV/DAD; planta medicinal; transagem; Plantago major L..

(15) xiv. ABSTRACT The therapeutic use of medicinal plants is based on family tradition and became widespread in folk medicine. Yet there is a guarantee for the vast majority of products sold on the quality and effectiveness, since medicinal plants are subject to various types of contamination, such as pesticide residues. These chemicals are used to control and combat pests and weeds, but are potentially toxic to humans. As a result, this study aims to develop techniques based on the method of the matrix solid-phase dispersion (MSPD) and high performance liquid chromatography with UV detection with a photodiode array to determine pesticide residues kresoxim-methyl, and clofentezine and flumetralina in samples of dried and fresh transagem (Plantago major L.). The method of the matrix solid-phase dispersion was carried out using samples dried, testing different adsorbents (neutral alumina, Florisil ®, silica, C18 and Basolite®), in ratio matrix / sorbent 1:1 (m / m). The optimum recoveries for pesticide analysis HPLC-UV/DAD were obtained with silica (adsorbent), using a volume of 20 mL of dichloromethane with average recovery ranging from 45.5 to 90.3%, and coefficients variation in the range 6.1 to 18.5% for concentrations of 1.0, 1.5 and 2.0 µg g-1. Correlation coefficients between 0.9992 and 0.9997 were obtained for a concentration range between 0.2 and 5.0 µg g-1. The limits of detection and quantification were in the range 0.60 to 0,90 µg g-1 and 1.0 µg g-1, respectively. Tests were also made with the recovery of pesticides using the dried plant using the adsorbing aminopropyl and coordination polymer [Zn(BDC)(H2O)2]n. Were carried out by the analysis technique HPLC-UV/DAD with the plant in nature, using silica adsorbent with recovery values of pesticides in the range 78.3 to 110.1% and coefficients of variation between 9.9 and 15.6% for the concentration level of 2.0 µg g-1.. Keywords: pesticides; MSPD; HPLC-UV/DAD; medicinal plant; transagem; Plantago major L..

(16) 15. 1. INTRODUÇÃO. A Organização Mundial da Saúde (OMS) define planta medicinal como sendo “qualquer vegetal que possui, em um ou mais órgãos, substâncias que podem ser utilizadas com fins terapêuticos ou que sejam precursores de fármacos semi-sintéticos (COSTA et al., 2011). A utilização de plantas com fins medicinais para tratamento, cura e prevenção de doenças é uma das mais antigas formas de prática medicinal da humanidade (VEIGA JUNIOR et al., 2005). O Brasil é um dos maiores centros de biodiversidade vegetal do planeta, com diversos ambientes e floras específicas e abriga centenas de grupos étnicos, que introduziram na cultura popular a utilização de muitas espécies para os mais diversos fins, entre eles o uso medicinal. Além da assimilação dos conhecimentos indígenas, as contribuições trazidas pelos escravos e imigrantes representaram papel importante para o surgimento de uma rica medicina popular (COSTA et al., 2011). Segundo a Organização Mundial da Saúde, 80% da população mundial faz uso de medicamentos derivados de plantas medicinais. No Brasil pesquisas demonstram que 91,9% da população fizeram uso de algum tipo de planta medicinal, sendo que 46% mantêm cultivo caseiro dessas plantas (ETHUR et al., 2011). O termo fitoterapia vem do idioma grego e quer dizer “tratamento” (therapeia) “vegetal” (phyto). Dessa forma, a fitoterapia constitui-se em uma alternativa terapêutica mais econômica em relação aos medicamentos alopáticos, uma vez que caracteriza-se pela utilização direta de plantas no tratamento das doenças (CARVALHO et al., 2002). Os fatores da expansão da fitoterapia devem-se aos eventuais efeitos adversos de fármacos sintéticos, à preferência dos consumidores por tratamentos “naturais”, à crescente validação. científica. das. propriedades. farmacológicas. de. espécies. vegetais,. ao. desenvolvimento de novos métodos analíticos para o controle de qualidade, ao desenvolvimento de novas formas de preparação e à administração dos produtos e ao relativo baixo custo (MOREIRA et al., 2010). A fitoterapia é encarada como opção na busca de soluções terapêuticas, utilizada principalmente pela população de baixa renda, já que se trata de uma alternativa eficiente, baixo custo e culturalmente difundida (OLIVEIRA et al., 2007). As observações populares sobre o uso e a eficácia de plantas medicinais contribuem de forma relevante para a divulgação das potencialidades terapêuticas das plantas, e também desperta o interesse de pesquisadores de áreas como a Botânica, Farmacologia e Fitoquímica,.

(17) 16. enriquecendo o conhecimento científico e intensificando a utilização de muitas plantas (COSTA et al., 2011). Dentre as plantas medicinais, a tanchagem (Plantago major L.), também conhecida como tansagem, transagem ou língua de vaca, da família Plantaginaceae, tem grande importância terapêutica. Estudos demonstram ação curativa desta planta como analgésica e antiinflamatória, bem como contra tumores, problemas digestivos e cutâneos (FREITAS et al., 2008). As plantas medicinais assim como outras culturas agrícolas, estão sujeitas ao ataque de pragas como insetos, ácaros e fungos, sendo necessária a utilização de pesticidas para controlar este tipo de ação, que inviabiliza a comercialização destes produtos e podem ocasionar perdas econômicas significativas (GRISOLIA, 2005). Pesticidas de diferentes grupos químicos e classes toxicológicas são aplicados para controlar ação destas pragas. Todavia, este tratamento pode deixar resíduos que venham a comprometer a saúde dos consumidores. A Legislação Brasileira demonstra preocupação com a qualidade dos fitoterápicos, porém pode-se constatar que muitos destes medicamentos disponíveis no mercado não apresentam controle adequado do teor de princípios ativos e de compostos tóxicos como os pesticidas (CARVALHO et al., 2010). Nas últimas décadas, laboratórios públicos e privados vêm desenvolvendo métodos para a determinação de resíduos de pesticidas, desempenhando um papel importante para a estimativa da exposição humana e do meio ambiente a estes compostos (VIDAL JL et al., 2006). Um método apropriado para análise de resíduos de pesticidas tem de apresentar sensibilidade, seletividade, exatidão, precisão e ser de baixo custo, aplicável para uma variedade de pesticidas em matrizes diversas (MICHEL et al., 2004). A dispersão da matriz em fase sólida (DMFS) oferece diversas vantagens, incluindo a simplicidade e o consumo relativamente baixo de solventes orgânicos. Esta técnica possibilita efetuar as etapas de rompimento da estrutura da matriz, homogeneização, extração e purificação em uma única etapa, permitindo assim, a posterior análise dos extratos obtidos (DÖMÖTÖROVÁ et al., 2005). A análise de resíduos de pesticidas em plantas medicinais é tradicionalmente realizada utilizando-se técnicas cromatográficas. Estas técnicas são muito importantes na análise química por serem eficazes em efetuar as separações, identificar e quantificar os analitos presentes na amostra. A quantificação das amostras pode ser realizada com a utilização de.

(18) 17. detectores cromatográficos, tais como detector por captura de elétrons, fluorescência, ultravioleta-visível, ionização de chama (GALLI et al., 2006). Neste contexto, a proposta deste trabalho é desenvolver um método analítico simples, sensível e confiável para a determinação de resíduos de pesticidas em amostras desidratadas e in natura da planta medicinal transagem (Plantago major L.), utilizando o método de dispersão da matriz em fase sólida e a técnica de cromatografia líquida de alta eficiência com detector espectrofotométrico com arranjo de diodos..

(19) 18. 2. OBJETIVOS 2.1. Objetivo geral. Desenvolver um método analítico para determinar resíduos de pesticidas de diferentes classes químicas em amostras desidratadas e in natura da planta medicinal transagem (Plantago major L.), utilizando as técnicas de dispersão da matriz em fase sólida e cromatografia líquida de alta eficiência com detector espectrofotométrico com arranjo de diodos (CLAE–UV/DAD). 2.2. Objetivos específicos Selecionar os pesticidas que podem estar presentes na planta medicinal; Obter as condições cromatográficas de análise dos pesticidas selecionados por CLAE-UV/DAD; Desenvolver um método para determinação de resíduos dos pesticidas selecionados utilizando a técnica por dispersão da matriz em fase sólida (DMFS);. Validar o método desenvolvido;.

(20) 19. 3. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA 3.1. Plantas medicinais. As plantas medicinais têm sido utilizadas pelo homem há milhares de anos e continuam tendo o seu valor não apenas nas comunidades tradicionais, como também são objetos de estudos interdisciplinares na busca de novos fármacos (COSTA et al., 2011). Segundo a Organização Mundial de Saúde, 70% a 80% da população mundial, especialmente em países em desenvolvimento, ainda confiam nos produtos a base de plantas medicinais no tratamento de suas doenças, ou utiliza a medicina tradicional na atenção primária à saúde (SILVEIRA et al., 2008). Nos países mais desenvolvidos têm crescido a utilização pela medicina ortodoxa ou medicina convencional desde o início do século 19. No entanto, na era atual de rápidos avanços na ciência biomédica e da tecnologia, é surpreendente que o público nesses países desenvolvidos gastam uma quantidade significativa de seus ganhos em produtos naturais e terapias não convencionais (CHAN, 2003). O Brasil detém a maior diversidade biológica do mundo, contando com uma rica flora, despertando interesses de comunidades científicas internacionais para o estudo, conservação e utilização racional destes recursos. O bioma cerrado contém mais de 6.000 plantas vasculares, muitas delas com valor alimentício e medicinal. No setor da medicina, as plantas tropicais fornecem material para a produção de analgésicos, tranquilizantes, diuréticos, laxativos, antibióticos entre outros (SOUZA et al., 2006). Com o desenvolvimento científico e tecnológico, as plantas medicinais estão tendo seu valor terapêutico pesquisado e ratificado pela ciência e vem crescendo sua utilização recomendada por profissionais de saúde. A necessidade exige e a ciência busca a unificação do progresso com aquilo que a natureza oferece, respeitando a cultura do povo em torno do uso de produtos ou ervas medicinais para curar os males (ARNOUS et al., 2005). Com o objetivo de minimizar a carência de informações sobre plantas medicinais, pesquisadores de equipes multidisciplinares com o apoio da Organização Mundial da Saúde investigam as melhores condições para manter a qualidade, a eficácia e a segurança desses medicamentos. As principais ciências envolvidas são a Botânica, a Química e a Farmacologia e, as que estão relacionadas aos costumes, cultura e utilização das plantas são a Antropologia, a Agronomia e a Biotecnologia (SOUZA et al., 2008)..

(21) 20. Algumas características desejáveis das plantas medicinais são sua eficácia, baixo risco de uso, assim como reprodutibilidade e constância de sua qualidade. O aproveitamento adequado dos princípios ativos de uma planta exige o preparo correto, ou seja, para cada parte a ser usada, grupo de princípio ativo a ser extraído ou doença a ser tratada, existe forma de preparo e uso mais adequados. Os efeitos colaterais são poucos na utilização dos fitoterápicos, desde que utilizados na dosagem correta. A maioria dos efeitos colaterais conhecidos, registrados para plantas medicinais, são extrínsecos à preparação e estão relacionados a diversos problemas de processamento, tais como: identificação incorreta das plantas, necessidade de padronização, prática deficiente de processamento, contaminação, substituição e adulteração de plantas, preparação e/ou dosagem incorretas (ARNOUS et al., 2005).. 3.1.1. Transagem (Plantago major L.). A planta em estudo (Figura 1) é conhecida popularmente por transagem ou tanchagem de nome científico Plantago major L. É nativa da Europa e naturalizada em todo o sul do Brasil. É uma pequena erva bianual ou perene, ereta, acaule, e cresce entre 20 e 30 cm de altura. Folhas dispostas em roseta basal, com pecíolo longo e lâmina membranácea com nervuras bem destacadas, de 15 a 25 cm de comprimento. Flores muito pequenas, dispostas em inflorescências espigadas eretas sobre haste floral de 20 a 30 cm de comprimento. Estas transformam-se em frutos (sementes) que são facilmente colhidas raspando-se entre os dedos toda a inflorescência. Multiplica-se apenas por sementes (LORENZI et al., 2002). No Brasil é considerada diurética, anti-diarréica, expectorante, hemotática e cicatrizante, sendo empregada contra infecções das vias respiratórias superiores, bronquite crônica e como auxiliar no tratamento de úlceras pépticas. Seu extrato metanólico é usado no tratamento de câncer. Nos países do Caribe esta planta é usada, também, no tratamento caseiro de hipertensão e de inflamações (LORENZI et al., 2002; DOUSSEAU et al., 2008). O uso tradicional da planta transagem na cicatrização de feridas é bastante antigo. Da "Saga Volsuga" sabe-se que os Vikings usavam as folhas de transagem para a cicatrização de feridas. Ela também foi descrita nos séculos 12 e 13 pelo autor islâmico Ibn El Beithar tendo adotado o conhecimento da medicina grega. Foi também usada na época de Shakespeare e é mencionada em 'Romeu e Julieta' seu jogo, Ato I, Cena II do período 1592-1609 (SAMUELSEN, 2000)..

(22) 21. Além do valor medicinal, a transagem é considerada hortaliça em potencial, por ser rica em fósforo, cálcio e vitaminas A e C (MARTINS et al., 1998; SILVA FILHO et al., 1994). Um estudo sobre as quantidades de proteínas, açúcares, vitaminas e minerais classifica suas folhas como alimentícias (LORENZI et al., 2002). Na sua composição estão presentes flavonóides, esteróides, mucilagens, taninos, saponinas, ácidos orgânicos e alcalóides (LORENZI et al., 2002).. Figura 1. Planta medicinal transagem (Plantago major L.). (LORENZI et al., 2002).

(23) 22. 3.2. Pesticidas. Nas últimas décadas, o interesse público em terapias com produtos naturais, ou seja, fitoterapia, tem crescido tanto nos países desenvolvidos como naqueles em desenvolvimento (ROGRIGUES et al., 2007). No entanto, em comparação com preparações sintéticas, produtos naturais exibem um número ímpar de problemas relacionados com a qualidade. Estes problemas se originam da complexidade desses remédios, que podem variar muito em composição química devido a uma variedade de fatores e compostos (como os pesticidas), aos quais as plantas são expostas durante o seu crescimento, armazenamento e diferentes fases de manipulação (ZUIN et al., 2003). Pesticidas ou agrotóxicos e afins são definidos no Decreto nº 4074, de 04 de janeiro de 2002, do Ministério da Agricultura como: produtos e agentes de processos físicos, químicos e biológicos, destinados ao uso nos setores de produção, no armazenamento e beneficiamento de produtos agrícolas, nas pastagens, na proteção de florestas, nativas ou plantadas e de outros ecossistemas e de ambientes urbanos, hídricos e industriais, cuja finalidade seja alterar a composição da flora ou da fauna, a fim de preservá-la da ação danosa de seres vivos considerados nocivos, bem como as substâncias e produtos empregados como desfolhantes, dessecantes, estimuladores e inibidores de crescimento (ZENEBON et al., 2008). O uso de pesticidas tem se difundido muito na agricultura, especialmente no Brasil, que se tornou um dos maiores consumidores desses produtos, ficando atrás somente do Japão e dos Estados Unidos. Seu emprego indiscriminado, sem as devidas precauções e cuidados em relação a manipulação, produção, estocagem e destino final, põem em risco não só o meio ambiente, mas também a saúde das pessoas que de alguma forma entram em contato com tais produtos (DAMS, 2006). Apesar dos benefícios no controle e/ou combate às pragas que evitam a queda de produção de alimentos, os pesticidas são apontados como poluentes do ambiente. Estimativas indicam que menos de 0,1% dos pesticidas efetivamente aplicados alcançam as pragas, ou seja, 99,9% têm potencial para se translocar para outros compartimentos ambientais, podendo resultar em efeitos adversos a saúde humana e no ambiente. Especialmente a partir da década de 1960, grande atenção tem sido dispensada por pesquisadores, órgãos governamentais reguladores e pela própria opinião pública ao impacto dos pesticidas sobre a saúde humana e ao ambiente (RIBEIRO et al., 2008). Devido a sua persistência os pesticidas podem ser encontrados nos diferentes compartimentos ambientais..

(24) 23. No ar, são originários dos procedimentos de pulverização na forma de aerossóis. No solo, são encontrados devido a derramamentos ou descartes inadequados, que por percolação podem atingir lençóis de águas subterrâneas. Em águas superficiais são originários pelo carregamento através de chuvas, derramamentos ou usos em campanhas de saúde pública (KOMATSU et al., 2004). Os pesticidas podem ser classificados de acordo com vários critérios. Assim sendo, de acordo com o tipo de praga que eles combatem podem ser classificados como inseticidas (controlam os insetos), fungicidas (agem sobre os fungos), herbicidas (combatem as plantas invasoras), bactericidas (controlam as bactérias), acaricidas (eliminam os ácaros), nematicidas (agem sobre os nematóides do solo), moluscidas (combatem as lesmas) e raticidas (agem sobre os ratos) (BAIRD, 2002; FRÓES, 2010). Cronologicamente, segundo seu aparecimento e desenvolvimento, os pesticidas podem ser classificados de acordo com uma sucessão de gerações, sendo que na primeira geração temos: os inorgânicos, orgânicos vegetais e minerais. Na segunda: os orgânicos sintéticos, organoclorados, organofosforados, carbamatos e piretróides. Na terceira: os microbianos e os feromônios sexuais. Na quarta: os hormônios juvenis. E na quinta geração: os anti-hormônios vegetais e microrganismos (ZENEBOM et al., 2008). Do ponto de vista toxicológico, os pesticidas são classificados quanto à periculosidade ambiental em classes, (Tabela 1), que variam de I a IV em: extremamente, altamente, moderadamente ou pouco tóxicos, respectivamente, de acordo com a dose letal (DL50) oral e dérmica para ratos e outros indicadores relacionados a danos na córnea, lesões na pele e concentração letal inalatória (CL50) para ratos, segundo a Portaria nº 3, do Ministério da Saúde, de 16 de janeiro de 1992 (ZENEBOM et al., 2008)..

(25) 24. Tabela 1. Classificação toxicológica dos pesticidas em função do DL50. Classe toxicológica I II III IV. Descrição Extremamente tóxicos (DL50 < 50 mg/kg de peso vivo) Muito tóxicos (DL50 – 50 a 500 mg/kg de peso vivo) Moderadamente tóxicos (DL50 – 500 a 5000 mg/kg de peso vivo) Pouco tóxicos (DL50 > 5000 mg/kg de peso vivo). Faixa indicativa de cor Vermelho vivo Amarelo intenso Azul intenso Verde intenso. (EMBRAPA, 2003) Quanto a forma de atuação, os pesticidas podem ser sistêmicos ou não sistêmicos. Os não sistêmicos têm ação de contato (via dérmica), penetração, ingestão (via oral) e fumigante (via respiratória). Os pesticidas sistêmicos surgiram como um aperfeiçoamento na seletividade do combate à praga, com a intenção de não matar os insetos não nocivos. É transportado pela seiva do vegetal em quantidade letal para o inseto, sem prejudicar a planta (PINHEIRO, 2004). Quanto a origem, os pesticidas se dividem em inorgânicos e orgânicos. Os inorgânicos (chumbo, arsênio, mercúrio) foram usados por muito tempo, mas foram substituídos pelos compostos orgânicos, que se subdividem em: pesticidas de origem animal (óleos minerais), de origem vegetal (óleo vegetal, nicotina, piretrinas) e organo-sintéticos (clorados, fosforados, piretróides, carbamatos etc) (PINHEIRO, 2004). 3.2.1. Pesticidas selecionados neste estudo. A escolha dos pesticidas estudados neste trabalho (Cresoxim-metílico, Clofentezina e Flumetralina) foi fundamentada, principalmente, em sua utilização em escala nacional em diferentes culturas. As características gerais dos compostos abaixo apresentadas foram obtidas na IUPAC FOOTPRINT PESTICIDES PROPERTIES DATABASES (IUPAC, 2011) e na Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA, 2011)..

(26) 25. 3.2.1.1. Cresoxim-metílico. Fórmula Estrutural. Grupo químico: Estrobilurina Nome químico: (methyl (E)-methoxyimino [α-(o-tolyloxy)-o-tolyl] acetate) Fórmula química: (C18H19NO4) Pressão de vapor 25°C (mPa): 0,0023 Modo de ação: Fungicida Classe toxicológica: III-Medianamente tóxico Aplicação: Foliar Ponto de fusão (°C): 102 Massa molar (g/mol): 313,35 Solubilidade em água (mg/L): 2,0 Log Kow*: 3,4 *Coeficiente de partição octanol:água, pH-7 e 20°C Solubilidade em solventes orgânicos (g/L, 20°C): -n-heptano: 1,7 -metanol: 14,9 -acetona: 217,0 -acetato de etila: 123,0 -diclorometano: 939,0.

(27) 26. 3.2.1.2. Clofentezina. Fórmula Estrutural. Grupo químico: Tetrazina Nome químico: (3,6-bis (2-chlorophenyl)-1,2,4,5-tetrazine) Fórmula química: (C14H8Cl2N4) Pressão de vapor 25°C (mPa): 0,0014 Modo de ação: Acaricida Classe toxicológica: III-Medianamente tóxico Aplicação: Foliar Ponto de fusão (°C): 183 Massa molar (g/mol): 303,15 Solubilidade em água (mg/L): 0,002 Log Kow*: 4,1 *Coeficiente de partição octanol:água, pH-7 e 20°C Solubilidade em solventes orgânicos (g/L, 20°C): -acetona: 9,3 -etanol: 0,5 -acetato de etila: 5,7 -diclorometano: 37,0.

(28) 27. 3.2.1.3. Flumetralina. Fórmula Estrutural. Grupo químico: Dinitroanilina Nome químico: (N-(2-chloro-6-fluorobenzyl)-N-ethyl-α,α,α-trifluoro-2,6-dinitrop-toluidine) Fórmula química: (C16H12ClF4N3O4) Pressão de vapor 25°C (mPa): 0,032 Modo de ação: Regulador de crescimento Classe toxicológica: I-Altamente tóxico Aplicação: Foliar Ponto de fusão (°C): 102 Massa molar (g/mol): 421,73 Solubilidade em água (mg/L): 0,07 Log Kow*: 5,5 *Coeficiente de partição octanol:água, pH- 7 e 20°C Solubilidade em solventes orgânicos (g/L, 20°C): -acetona: 560,0 -etanol: 18,0 -n-hexano: 14,0 -diclorometano-Solúvel -tolueno: 400,0.

(29) 28. 3.3. Dispersão da matriz em fase sólida (DMFS). A técnica dispersão da matriz em fase sólida (DMFS) foi empregada pela primeira vez em 1989 por Barker e colaboradores, com o intuito de isolar resíduos de drogas em tecidos animais. Denominada, originalmente, dispersão em fase sólida. Na prática, ela consistia em uma modificação da técnica de extração em fase sólida (SPE) para aceitar amostras sólidas e semi-sólidas, como matrizes biológicas (LANÇAS, 2004). Dispersão da matriz em fase sólida (DMFS) encontrou particular aplicação como um processo analítico para preparação, extração e fracionamento de amostras sólidas, semisólidas e/ou altamente viscosas (BARKER, 2007). Essa técnica usa um suporte sólido, geralmente contendo uma fase quimicamente ligada, como um abrasivo para produzir uma ruptura na amostra, facilitando o processo de extração. A amostra sofre dispersão na superfície do material suporte, formando uma nova fase mista o que proporciona o isolamento de analitos presentes em várias matrizes. O suporte sólido possui várias funções. Em primeiro lugar, age como um abrasivo que promove a ruptura da arquitetura geral da amostra. Em segundo lugar, quando uma fase lipofílica do tipo C18 é empregada, ela age como um solvente que ajuda na ruptura das membranas celulares. Em terceiro lugar, o material misturado também pode ser usado como empacotamento de uma coluna e pode ser eluído sequencialmente com solvente (LANÇAS, 2009). A extração e a purificação combinadas numa mesma etapa é uma notável vantagem da técnica DMFS, além do menor tempo requerido para preparação da amostra. O processo é simples, requer pouco volume de solvente orgânico, amostra e sorvente e muitas vezes fornece um extrato pronto para a análise cromatográfica (MORZYCKA et al., 2002). Na prática, o processo de DMFS pode ser dividido em duas etapas, sendo que a primeira consiste no preparo do cartucho contendo a amostra e a segunda, na eluição dos analitos de interesse. A fase sólida é pesada com auxílio de uma balança analítica e transferida para um recipiente adequado para posterior trituração. A amostra é adicionada à fase sólida e ambos são triturados até uma pasta homogênea ser obtida (30 – 60 segundos, tipicamente). Este sistema irá conter a amostra distribuída uniformemente sobre a superfície da fase sólida. A amostra é, então, colocada no cartucho. A seguir o solvente é adicionado e a eluição é realizada com auxílio de uma pequena pressão para diminuir o tempo de extração. O extrato obtido poderá ser analisado diretamente, caso já esteja na forma, pureza e concentração adequados, ou sofrer outras operações como centrifugação, filtração, derivatização,.

(30) 29. concentração, dependendo da técnica analítica a ser empregada (LANÇAS, 2009). A Figura 2 ilustra as etapas envolvidas no processo de dispersão da matriz em fase sólida.. Figura 2. Esquema de dispersão da matriz em fase sólida (Adaptado de LANÇAS, 2004). Na eluição, existem duas possibilidades: (i) os analitos são retidos na coluna, sendo os interferentes eluídos e, em seguida, elui-se os analitos com outro solvente ou (ii) os interferentes são retidos na coluna e os analitos eluídos diretamente (KRISTENSON et al., 2006). Dentre os suportes sólidos mais empregados em processos de extração por dispersão da matriz fase sólida, pode-se citar:. Sílica gel (SiO2)n-OH: A sílica gel é um polímero inorgânico inerte, resistente, amorfo, com alta porosidade. A sílica apresenta-se em unidades tetraédricas SiO4 distribuídas aleatoriamente (Figura 3) e unidas por ligação siloxano, Si-O-Si (3), em seu interior e contém grupos silanóis vicinais, Si-OH (2), e geminais, HO-Si-OH (1), dispersos na superfície, os quais são sensíveis às reações que possibilitam as modificações químicas desta matriz..

(31) 30. Figura 3. Esquema da estrutura da sílica gel. Em destaque os grupos silanol geminal (1), silanol vicinal (2) e siloxano (3). Fonte: (PRADO et al., 2005).. A presença de grupo silanóis em sua superfície permite sua modificação química, no sentido de produzir novos materiais. Assim, a sílica gel desempenha um papel importante na função de suporte para uma grande variedade de substâncias com extensa aplicabilidade prática. A modificação da sílica permite a obtenção de compostos de maior versatilidade e com propriedades específicas. A sílica possui superfície ligeiramente ácida que facilita a retenção dos compostos básicos. Sob o ponto de vista cromatográfico, os grupos silanóis são os mais importantes, devido à sua polaridade, facilidade de fazer ligação de hidrogênio e capacidade de induzir dipolos em outras moléculas. Esses grupos silanóis se comportam como ácido fraco de Brφnsted – Lowry, sendo responsáveis pela reatividade da sílica, e desempenhando um papel importante nos processos relacionados à sua superfície (LANÇAS, 2004; PRADO et al., 2005). Alumina (Al2O3)n: Relacionando com a sílica é o segundo adsorvente mais utilizado. Possui caráter anfótero. Tem características alcalinas, embora possa também ser preparada para apresentar características neutra ou ácida. É geralmente empregada na separação de compostos lipofílicos e, pelo fato de poder ser preparada com características ácida, neutra ou alcalina, é bastante útil na separação de substâncias que apresentam variações dessas caracteríticas (COLLINS, 2006). Florisil [Mg.Al(SiO4)n]: É um sorvente de caráter polar e deve ser utilizado com reservas quando se analisa compostos polares, uma vez que poderá provocar adsorção irreversível em sua superfície e o analito de interesse não ser removido com os eluentes.

(32) 31. comumente empregados nesta técnica. É muito utilizado na extração de pesticidas de diferentes matrizes (LANÇAS, 2004). Octadecilsilano (C18): Possui caráter apolar. A característica lipofílica do C18 facilita o rompimento, dispersão e retenção de espécies lipofílicas (KRISTENSON, 2006). Tereftalato de alumínio (MIL-53(Al) ou Al(OH)[O2C-C6H4-CO2]): Conhecido comercialmente por Basolite® A100, é um organometálico microporoso. Os organometálicos microporosos se destacam devido ao fato de terem uma área superficial grande e por serem formados por um cluster metálico e um ligante orgânico. Esta combinação resulta em uma estrutura relativamente pouco rígida e em alguns casos pode mudar de tamanho e simetria dependendo das espécies adsorvidas. Muitos organometálicos têm uma estrutura microporosa e um arranjo cristalino bem determinado. A família destes materiais é numerosa, pois é possível realizar inúmeras combinações entre ligantes orgânicos e unidades inorgânicas. Sabendo-se que é possível obter inúmeros tipos de organometálicos e consequentemente inúmeras estruturas cristalinas distintas, conclui-se que estes materiais podem ser utilizados para distintas aplicações devido as suas diferentes propriedades (JAMES, 2003; FEREY, 2009).. Dentre as principais forças químicas atuantes entre as moléculas do analito e do sorvente (fase sólida), destacam-se: as forças iônicas; ligações de hidrogênio; interações do tipo dipolo-dipolo; dipolo-dipolo induzido; dipolo induzido-dipolo induzido (LANÇAS, 2009). A seletividade de um procedimento por DMFS depende da combinação sorvente/solvente. A natureza desta combinação é determinada principalmente pela polaridade dos analitos de interesse e a natureza da matriz (KRISTENSON, 2006). O uso de quantidades pequenas de amostras, combinado com baixo consumo de solvente, fazem do DMFS competitivo em relação a outros métodos e deve ser considerada uma alternativa quando um novo método analítico é desenvolvido (BARKER, 2007). Atualmente, DMFS tem sido aplicada com sucesso na extração de diferentes classes químicas de medicamentos, pesticidas, constituintes naturais, e outros compostos a partir de uma grande variedade de amostras complexas de plantas e animais (QÍ et al., 2010)..

(33) 32. 3.3.1. Adsorventes alternativos utilizados para a extração dos pesticidas. Neste trabalho foi avaliada a eficiência de dois materiais não comumente usados na extração de pesticidas de planta medicinal. Foi testado o aminopropil e o material polimérico [Zn(BDC)(H2O)2]n na extração dos pesticidas da planta medicinal transagem. O polímero de coordenação [Zn(BDC)(H2O)2]n é um material constituído por interações covalentes e intermoleculares fracas. Estas interações motivaram estudos para a aplicação deste material em dispositivos eletromagnéticos, estudos de catálise e em processos de separação (LI-NA et al., 2002). O aminopropil comercialmente disponível como fases aminopropil são preparados a partir do trimetoxi ou tri-etoxi-aminopropilsilano. O grupo NH2 é muito reativo e pode reagir com aldeídos e cetonas a partir de iminas, ou ele pode ser oxidado, por exemplo, por peróxidos. Além disso, ele retém fortemente os ácidos orgânicos. Em água, uma hidrólise parcial pode ocorrer como resultado do ambiente fortemente alcalino nos poros do aminopropil (NEUE, 1997).. 3.3.2. Aplicação da dispersão da matriz em fase sólida em plantas medicinais. A literatura relata algumas aplicações da técnica de dispersão da matriz em fase sólida para a extração de resíduos de pesticidas em plantas medicinais. CARVALHO e colaboradores (2010) desenvolveram um método por DMFS para a determinação de resíduos dos pesticidas acefato, clorprofam, pirimicarbe, bifentrina, tetradifona e fosalona da planta medicinal Cordia Salicifolia, utilizando cromatografia a gás acoplada a espectrometria de massas no modo de monitoramento de íons selecionados. O método consistiu em homogeneizar 0,5 g da amostra com 0,5 g do material adsorvente (turfa). O homogeneizado foi eluído com 30 mL de ciclohexano:diclorometano (3:1, v/v). Considerando que a Legislação Brasileira não estabelece limites máximos de resíduos para plantas medicinais, a recuperação foi avaliada em dois níveis de concentração (0,5 e 1,0 mg kg-1), resultando em valores de recuperação entre 64% e 118%, com coeficientes de variação entre 5,6% e 26,4% para a turfa. Os limites de detecção variaram entre 0,10 e 0,15 mg kg-1, enquanto que os limites de quantificação, entre 0,15 e 0,25 mg kg-1 para os pesticidas estudados. O método desenvolvido foi linear no intervalo de 0,1 a 5,0 μg g-1, com coeficientes de correlação entre 0,9975 e 0,9986. A comparação entre a turfa natural e o sorvente.

(34) 33. convencional (alumina neutra) apresentou desempenho similar da turfa na recuperação dos seis pesticidas. QÍ (2010) desenvolveu um método por DMFS para a determinação de resíduos dos pesticidas promicidona, pentacloronitrobenzeno, pentacloroanilina e metilpentaclorofenil sulfeto no extrato da planta medicinal ginseng (Panax ginseng C.A. Meyer) por cromatografia a gás. Foram homogeneizados 5 mL de extrato aquoso de ginseng (10%, m/v) com Florisil (10 g). A eluição foi realizada utilizando 10 mL da mistura de solventes acetato de etila:nhexano (7:3, v/v). As recuperações médias foram de 83,5% a 97,4% com desvio padrão relativo inferior a 10%. ABHILASH e colaboradores (2007) desenvolveram um método baseado na dispersão da matriz em fase sólida (DMFS) para determinar a presença de resíduos dos isômeros do hexaclorociclohexano (α-, β-, γ-, δ-) em matrizes de diferentes plantas, incluindo legumes, frutas, folhas, grãos e raízes, por cromatografia gasosa com detecção por captura de elétrons. O método consistiu em homogeneizar 5 g da amostra com Florisil. O homogeneizado foi eluído com 10 mL de n-hexano:acetato de etila (70:30, v/v). Recuperações médias variaram entre 91% e 98%. AQUINO e colaboradores (2010) desenvolveu um método por DMFS utilizando o polímero de coordenação [Zn(BDC)(H2O)2]n como adsorvente, para a determinação de resíduos dos pesticidas pirimetanil, ametrina, diclofluanida, tetraconazol, flumetralina, cresoxim-metílico e tebuconazol da planta medicinal Hyptis pectinata, utilizando cromatografia a gás acoplada a espectrometria de massas no modo de monitoramento de íons selecionados. O método consistiu em homogeneizar 0,5 g da amostra com 0,5 g do polímero [Zn(BDC)(H2O)2]n, o homogeneizado foi eluído com 20 mL de diclorometano. Considerando que a legislação brasileira não estabelece limites máximos de resíduos para plantas medicinais, a recuperação foi avaliada em três níveis de concentração (0,1; 0,5 e 1,0 µg g-1), resultando em valores de recuperação entre 73% e 97%. O método desenvolvido foi linear no intervalo de 0,04 a 14,0 μg g-1, com coeficientes de correlação entre 0,9987 e 0,9998. TANG e colaboradores (2006) desenvolveram um método por DMFS para determinar resíduos de seis pesticidas nas plantas medicinais Isatis indigotica e Paeonia lactiflora Pall. A determinação dos pesticidas foi feita por CG-ECD-FID. O método consistiu na homogeneização de 0,5 g de planta medicinal com o adsorvente sílica-gel e acetona como solvente de eluição. Os resultados de recuperação para os ensaios fortificados com soluções padrão nas concentrações de 0,1 a 5 mg kg-1 foram de 80 a 110% com valores de DPR na.

(35) 34. faixa de 0,43% a 17,6%. Os limites de quantificação para os pesticidas metalaxyl, triadimefon e paclobutrazole foi de 0,01 mg kg-1 e de 0,05 mg kg-1 para os pesticidas vinclozolina, tebuconazol e fenatimol.. Tabela 2. Dados da literatura sobre aplicação de dispersão da matriz em fase sólida para a extração de resíduos de pesticidas em plantas medicinais. Referência. Matriz. Solvente de extração. Sorvente. Análise instrumental. Carvalho e colaboradores, (2009). Cordia salicifolia. Ciclohexano/ diclorometano. Turfa. CG-EM. Qí, (2010). Ginseng. acetato de etila/ hexano. Florisil. CG-ECD. ABHILASH e colaboradores (2007). Várias amostras de plantas, incluindo legumes, frutas, folhas, grãos e raízes. Hexano/acetato de etila. Florisil. CG-ECD. Hyptis pectinata. Diclorometano. Polímero [Zn(BDC) (H2O)2]n. CG-EM. Isatis indigotica e Paeonia lactiflora Pall. Acetona. Sílica gel. CG/DNP. AQUINO e colaboradores (2010) TANG e colaboradores (2006). 3.4. Cromatografia líquida de alta eficiência. A cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) é um importante membro de toda uma família de técnicas de separação, que emprega colunas recheadas com materiais especialmente preparados e uma fase móvel, eluída sob alta pressão. Ela tem a capacidade de realizar separações e análises quantitativas de uma grande variedade de compostos presentes em diversos tipos de amostras. Durante a passagem da fase móvel sobre a fase estacionária, os componentes da mistura são distribuídos pelas duas fases de tal forma que cada um deles é seletivamente retido pela fase estacionária, o que resulta em migrações diferenciais desses componentes (COLLINS et al., 2006). Considerando o estado físico da fase móvel, distingue-se a cromatografia gasosa, na qual a fase móvel é um gás inerte, a cromatografia líquida, na qual a fase móvel é um líquido que pode interagir com os solutos, participando da separação, e a cromatografia supercrítica, na qual se usa como fase móvel um vapor pressurizado, em temperatura e pressão acima de.

(36) 35. seu ponto crítico, com as vantagens de ter viscosidade menor que um líquido, mas mantendo as propriedades de interação com os solutos (COLLINS et al., 2006). A cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) tem a capacidade de realizar separações e análises quantitativas de uma grande variedade de compostos presentes em diversos tipos de amostras. Somente a partir da década de 1970, conseguiu-se um avanço considerável da cromatografia líquida moderna, que até então era subdesenvolvida e baseavase nos experimentos sobre cromatografia em coluna, hoje chamada “cromatografia líquida clássica”, iniciada nos primeiros anos do século XX (COLLINS et al., 2006). A separação de uma mistura por CLAE se dá por uma ou mais interações entre o soluto, a fase estacionária e a fase móvel, as quais podem ser ligação de hidrogênio, interações eletrostáticas e hidrofóbicas ou forças de Van der Walls entre outras (SNYDER et al., 1997). O equipamento básico de CLAE é constituído de reservatório de fase móvel, bombas de alta pressão, válvula de injeção, coluna, detector e sistema de aquisição de dados. O solvente, também denominado eluente ou fase móvel, acondicionado em um frasco apropriado, é impulsionado, ou aspirado, por uma bomba de alta pressão em direção à coluna. No caminho, a amostra é introduzida na fase móvel, por uma válvula de introdução de amostra (ou válvula de injeção) e arrastada para a coluna, onde ocorre a separação. O efluente da coluna é direcionado para um detector, que acusa a presença dos analitos eluidos da coluna. O sinal gerado pelo detector é captado por um software apropriado, tratado no computador, e um cromatograma é gerado, mostrando a variação do sinal do detector em função do tempo de análise (LANÇAS, 2009). A técnica de cromatografia líquida é complementar à cromatografia a gás, pois somente os gases e cerca de 20% dos compostos orgânicos conhecidos podem ser analisados por CG, sem modificar suas estruturas para aumentar a volatilidade. Independentemente da limitação da volatilidade ou estabilidade térmica, a CLAE requer somente que a amostra seja solúvel na fase móvel. Assim, a CLAE é o método ideal para a separação de espécies iônicas ou macromoléculas de interesse biológico e produtos naturais lábeis, bem como uma imensa variedade de outros compostos de massa molar alta e/ ou estabilidade térmica baixa (COLLINS et al., 2006). Quando a fase estacionária contém grupos polares (por exemplo, fases contendo grupos como cianopropil ou aminopropil quimicamente ligados à sílica), o sistema é denominado fase normal (normal phase, NP). Neste caso, o eluente é, usualmente, menos.

(37) 36. polar (hexano, diclorometano, éter de petróleo) para que ocorra a partição do analito entre as duas fases, e a separação desejada seja obtida. Empregando-se fases estacionárias contendo grupos apolares tais como: octadecil (C18), octil (C8) ou hexil (C6), o processo é denominado fase reversa (reversed phase, RP); neste caso, a fase móvel será mais polar, usualmente empregando solventes como metanol ou acetonitrila misturado com água (LANÇAS, 2009). Eluição é a maneira mais usual como ocorre o desenvolvimento da separação da amostra em CLAE, a qual pode ser efetuado em dois modos: isocrática ou por gradiente. Eluição isocrática é aquela na qual a força cromatográfica da fase móvel permanece constante durante toda a separação. Na eluição por gradiente a composição da fase móvel varia durante a separação, de modo que a força cromatográfica aumenta gradativamente. Com isso, obtémse maior simetria para os picos cromatográficos, melhor resolução e detectabilidade e menor tempo de análise (COLLINS et al., 2006). O detector mais utilizado em CLAE é o espectrofotométrico, cujo principio baseia-se na absorvância da luz por parte dos analitos da amostra ao passar através dela radiação eletromagnética; normalmente isso ocorre desde a região do ultravioleta até o infravermelho, em um dado comprimento de onda. Existem três tipos de detectores de absorvância: o fotométrico, que funciona com um ou dois comprimentos de onda fixos; o de comprimento de onda variável (espectrofotômetro), que não só é de aplicação mais variada, mas também mais caro; e aquele por arranjo de diodos, que detecta vários comprimentos de onda simultaneamente (COLLINS et al., 2006). Esses detectores apresentam como principal atrativo o fato de se poder escolher diferentes comprimentos de onda; permitem a análise de amostras complexas com compostos que absorvem em diferentes comprimentos de onda; assim como permitem a obtenção do espectro completo de um pico cromatográfico eluído da coluna (LANÇAS, 2009)..

(38) 37. 3.5. Validação do método analítico. A necessidade de se mostrar a qualidade de medições químicas, através de sua comparabilidade, rastreabilidade e confiabilidade, está sendo cada vez mais reconhecida e exigida. Dados analíticos não confiáveis podem conduzir a decisões desastrosas e a prejuízos financeiros. Para garantir que um novo método analítico gere informações confiáveis e interpretáveis sobre a amostra, ele deve sofrer uma avaliação denominada validação (RIBANI et al., 2004). Segundo a ANVISA, a validação deve garantir, por meio de estudos experimentais, que o método atenda às exigências das aplicações analíticas, assegurando a confiabilidade dos resultados. Para tanto, deve apresentar especificidade, linearidade, intervalo, precisão, sensibilidade, limite de quantificação, exatidão, adequados à análise (ANVISA, 2003). A validação do método analítico envolve um procedimento que comprova que o método oferece os resultados esperados com credibilidade, precisão e exatidão adequados. Apesar de não existir um consenso sobre quais parâmetros devem ser incluídos no processo de validação de um método analítico, os seguintes são, normalmente, incluídos (LANÇAS, 2009): Exatidão: Expressa a concordância entre o valor encontrado e o valor aceito como verdadeiro ou aceito como referência. Precisão: É a expressão da concordância entre vários resultados analíticos obtidos para uma mesma amostra. Linearidade: É a resposta obtida em função da concentração do analito, a qual deve ser estudada em um intervalo de concentração apropriado. Limite de detecção (LOD): Corresponde a menor quantidade de um analito que pode ser detectada, porém, não necessariamente, quantificada como um valor exato. Limite de quantificação (LOQ): Corresponde à menor quantidade de um analito que pode ser quantificada com exatidão e com fidelidade determinada. Especificidade: Capacidade de medir o analito “livre de interferências”. Robustez: É uma medida da capacidade de um método de não sofrer alterações devido a pequenas variações, deliberadamente introduzidas nos parâmetros do método. Seletividade: Capacidade de medir com exatidão e sem interferentes vários analitos em uma mistura..