Instruções de utilização – Meios em placas prontos a usar
PA-254032.07 Rev.: April 2013
BD Mueller Hinton II Agar
BD Mueller Hinton II Agar 150 mm
BD Mueller Hinton II Agar, Square
UTILIZAÇÃO PREVISTAO BD Mueller Hinton II Agar, disponível em diversos formatos de placas, é utilizado no procedimento normalizado de difusão de disco para determinação da sensibilidade de isolados clínicos de microrganismos aeróbios de rápido desenvolvimento aos agentes antimicrobiano conforme estabelecido em normas do Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI).1 PRINCÍPIO E EXPLICAÇÃO DO PROCEDIMENTO
Método microbiológico
Devido ao facto de, no princípio dos anos 60, os laboratórios microbiológicos clínicos estarem a utilizar uma grande variedade de procedimentos para determinar a sensibilidade das bactérias aos antibióticos e aos agentes quimioterapêuticos, Bauer, Kirby e outros investigadores desenvolveram um procedimento normalizado no qual o Ágar de Mueller Hinton, um meio inicialmente concebido para o isolamento de gonococos, foi seleccionado como o meio de teste.1-4 Um estudo de colaboração internacional posterior confirmou o valor do ágar de Mueller Hinton para esta finalidade devido à reprodutibilidade relativamente boa deste meio, à simplicidade da sua fórmula e à enorme quantidade de dados experimentais que foram acumulados com a utilização do mesmo.5
O CLSI elaborou uma norma de desempenho para o procedimento de Bauer-Kirby, devendo este documento ser consultado para se obterem mais pormenores.6 Foram desenvolvidas outras normas nacionais para os testes de sensibilidade antimicrobiana de acordo com o procedimento de Bauer-Kirby. Nessas normas, as densidades do inóculo, o método de inoculação, as dimensões das zonas resultantes e o modo de interpretação podem diferir da Norma CLSI. Embora não existam normas comuns europeias para os testes de sensibilidade, devem consultar-se as normas locais se as Directivas CLSI não se aplicarem.
O procedimento de Bauer-Kirby baseia-se na difusão através de ágar em gel de substâncias antimicrobianas impregnadas em discos de papel.7Contrastando com os métodos anteriores que utilizavam discos com concentrações baixas e elevadas de agentes antimicrobianos e que utilizavam a presença ou a ausência de zonas de inibição para a sua interpretação, este método utiliza discos com uma única concentração de agente antimicrobiano, sendo os diâmetros da zona correlacionados com as concentrações inibitórias mínimas (CIM).1,2,6,7 No procedimento de teste, uma suspensão padronizada do microrganismo é espalhada sobre toda a superfície do meio com o auxílio de uma zaragatoa. Os discos de papel impregnados com quantidades especificadas de antibióticos ou outros agentes antimicrobianos são, em seguida, colocados na superfície do meio, a placa é incubada e as zonas de inibição em redor de cada disco são medidas. A determinação da sensibilidade, resistência ou resistência intermédia do microrganismo a um agente é efectuada através da comparação das dimensões das zonas obtidas nas Tabelas 2A a 2D no Documento M100 (M2) do CLSI.6
Foram identificados vários factores que influenciam os testes de sensibilidade por difusão de disco. Estes incluem o meio, a excessiva humidade à superfície do meio, a profundidade do ágar, a potência do disco, a concentração do inóculo, o pH e a produção de beta-lactamase pelos microrganismos que estão a ser testados.5-8
O BD Mueller Hinton II Agar é fabricado de modo a conter níveis reduzidos de timina e timidina,9.10 e níveis controlados de cálcio e magnésio.11-13 Os níveis de timina e timidina dos materiais não tratados são determinados utilizando o procedimento de difusão de disco com
discos de trimetoprim-sulfametoxazol (SXT) e Enterococcus faecalis ATCC 33186 e/ou 29212. Os níveis de cálcio e de magnésio são controlados testando os materiais não tratados e suplementando com fontes de cálcio e/ou magnésio, conforme necessário para produzir os diâmetros de zona correctos com antibióticos aminoglicosídeos e Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853.
REAGENTES
BD Mueller Hinton II Agar
Fórmula* por Litro de Água Purificada Extracto de bovino 2,0 g Hidrolisado ácido de caseína 17,5
Amido 1,5 Ágar 17,0 pH 7,3 ± 0,2
*Ajustada e/ou suplementada conforme necessário para cumprir os critérios do desempenho. PRECAUÇÕES
. Apenas para uso profissional.
Não utilizar as placas que apresentem sinais de contaminação microbiana, descoloração, secura, fissuras ou outros sinais de deterioração. Um encolhimento excessivo deste meio devido a dessecação pode dar origem a resultados de sensibilidade falsos.
Consultar as INSTRUÇÕES GERAIS DE UTILIZAÇÃO para informação sobre os procedimentos de manuseamento asséptico, os riscos biológicos e os procedimentos de eliminação do produto usado.
ARMAZENAMENTO E PRAZO DE VALIDADE
Após recepção das placas, conservar no escuro a uma temperatura entre 2 e 8°C, dentro do invólucro original até ao momento da utilização. Evitar congelar e aquecer excessivamente. As placas podem ser inoculadas até ao prazo de validade (ver a etiqueta da embalagem) e incubadas durante o tempo de incubação recomendado.
As placas são fornecidas em pilhas de 10 placas e, quando uma destas pilhas é aberta, as respectivas placas terão de ser utilizadas no prazo máximo de uma semana, se forem conservadas em local limpo a uma temperatura entre 2 e 8°C.
CONTROLO DE QUALIDADE PELO UTILIZADOR
Para controlo de qualidade por parte do utilizador, devem consultar-se as normas CLSI6
apropriadas ou as normas nacionais, caso se apliquem. Principalmente, devem-se seguir-se os procedimentos descritos mais abaixo em Procedimento do Teste, incluindo as estirpes de referência mencionadas em Materiais não fornecidos. As placas de Mueller Hinton II Agar e os discos de agentes antimicrobianos utilizados devem ser testados, pelo menos, duas vezes por semana para confirmar o seu correcto desempenho.
Aspecto do meio não inoculado: incolor a âmbar claro. PROCEDIMENTO
Materiais fornecidos
BD Mueller Hinton II Agar (fornecido em vários formatos de placa diferentes; consultar Embalagem / Apresentação). Microbiologicamente controlados.
Materiais não fornecidos
1. Meio líquido para inóculo em tubos como, por exemplo, Meio líquido de soja BD
Trypticase (Meio líquido de soja-caseína digerida) ou Meio líquido de Mueller Hinton II
(ajustado para catiões), para preparação de um inóculo padrão, e um meio líquido estéril ou solução salina para diluição do inóculo.
2. Padrão de sulfato de bário para comparação (0,5 mL de 0,048 M BaCl2 [1,175% p/v BaCl2.
2H2O] a 99,5 mL de 0,18 M [0,36 N] H2SO4 [1% v/v]).
3. Um dispositivo de fotometria para ajustamento da turvação da suspensão do inóculo a um padrão 0,5 da escala de McFarland.
4. Como alternativa aos materiais acima indicados (1-3), pode utilizar-se o Sistema de
Inoculação BD Prompt (dispositivo volumétrico de preparação de inóculos).6,18
5. Culturas de controlo de Staphylococcus aureus ATCC 25923, Escherichia coli ATCC 25922, E. coli ATCC 35218 (apenas para combinações de inibidores de ß-lactam-ß-lactamase), Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 e Enterococcus faecalis ATCC 33186 ou ATCC 29212.6
6. Discos de papel impregnados com quantidades de agentes antimicrobianos especificadas6, tais como os discos do teste de sensibilidade BD Sensi-Disc.
7. Dispositivo de distribuição, tal como o Dispensador com 6, 8 ou 12 lugares BD Sensi-Disc. Um dispensador adequado também se encontra disponível para as placas Mueller Hinton II Agar Square.
8. Régua ou outro dispositivo para medir as dimensões das zonas em milímetros.
9. Meios de cultura auxiliares, reagentes e equipamento laboratorial, conforme necessário.
Tipos de amostra
Este produto é utilizado apenas para testes de sensibilidade de culturas puras isoladas a partir de amostras clínicas (consultar também CARACTERÍSTICAS DE DESEMPENHO E
LIMITAÇÕES DO PROCEDIMENTO). Foi proposto que os testes de sensibilidade directa aos
agentes antimicrobianos possam ser realizados em culturas de sangue e culturas de urina; no entanto, os testes devem ser repetidos e confirmados com culturas puras. 14-17
Procedimento do teste
Descrição do método de suspensão directa de colónias:6
1. Certificar-se de que se encontra disponível uma cultura pura e fresca (=de uma dia para o outro) proveniente de um meio não selectivo como, por exemplo, ágar de sangue.
2. Para os testes de sensibilidade de rotina, o inóculo pode ser preparado fazendo uma suspensão directa das colónias em soro fisiológico ou meio líquido.6 Ajustar imediatamente esta suspensão à turvação do padrão de sulfato de bário (padrão 0,5 à escala de
McFarland) sem incubação. A turvação do padrão e do inóculo de teste devem ser
comparados segurando os dois tubos diante de um plano de fundo branco sobre o qual se encontram desenhadas linhas pretas finas ou pode utilizar-se um dispositivo fotométrico. 3. Os métodos alternativos de preparação do inóculo, que envolvem dispositivos que
permitem a padronização directa dos inóculos sem ajustamento da turvação, tais como o Sistema de Inoculação BD Prompt, foram considerados aceitáveis para fins de testes de rotina.18
4. Decorridos 15 min após o ajustamento da turvação do inóculo, mergulhar uma zaragatoa estéril no inóculo correctamente diluído e rodar várias vezes, com firmeza, contra a parte superior da parede interna do tubo, para remover o líquido em excesso.
5. Inocular toda a superfície do ágar da placa três vezes, rodando a placa 60° entre cada série de riscos, para obter uma inoculação uniforme.
6. A tampa pode permanecer entreaberta durante 3 a 5 min e a placa pode ficar à temperatura ambiente por um período máximo de 15 min, para permitir a absorção de qualquer humidade à superfície antes de se aplicarem os discos impregnados com agente antimicrobiano.
7. Aplicar os discos utilizando um dispensador de discos de antimicrobiano, tendo cuidados de assepsia. Depositar os discos de forma a que o intervalo entre o seu centro seja de, pelo menos, 24 mm. Depois de os discos serem colocados no ágar, é necessário pressioná-los com uma agulha ou pinça estéreis para estabelecer contacto total com a superfície do meio. Esta etapa não é necessária se os discos tiverem sido colocados com Dispensadores Auto-Impactador BD Sensi-Disc.
8. Num período de 15 minutos após a aplicação dos discos, inverter as placas e colocá-las numa incubadora a uma temperatura de 35°C. As placas não devem ser incubadas em condições de maior concentração de dióxido de carbono.
9. Incubar as placas durante 16 a 18 h. É necessário incubar por um período completo de 24 h para que o Staphylococcus aureus com oxacilina detecte S. aureus resistente à
detecte estirpes resistentes à vancomicina. O desenvolvimento dentro da zona aparente de inibição é indicativo de resistência.20
Resultados
1. Após incubação, deve encontrar-se visível uma zona de crescimento confluente. Caso se verifique apenas crescimento de colónias isoladas, tal significa que o inóculo tinha uma concentração muito baixa e o teste deverá ser repetido.
2. Meça o diâmetro das zonas com inibição total (conforme observado a olho nu), incluindo o diâmetro do disco, arredondando ao milímetro, utilizando um compasso deslizante, uma régua ou um modelo preparado para este fim. O dispositivo de medição é colocado no fundo da placa invertida sobre um plano de fundo preto, não reflector, e iluminado por cima.
3. O valor final deve corresponder à área que não exibe qualquer crescimento visível detectável a olho nu. Ignorar o crescimento ténue de pequenas colónias, que pode ser detectado apenas com dificuldade no limite da zona de inibição evidente. O
Staphylococcus aureus, quando é testado com discos de oxacilina, é uma excepção, como
também o são os enterococos quando testados com vancomicina. Nestes casos, deve utilizar-se luz transmitida para detectar uma névoa de crescimento em torno do disco que é apresentada por estirpes MRSA "ocultas resistentes"19 ou enterococos resistentes à vancomicina.6 Com espécies de Proteus, se a zona de inibição for suficientemente distinguível para ser medida, ignorar qualquer proliferação existente no interior da zona. Com o trimetoprim e as sulfonamidas, os antagonistas do meio poderão permitir um crescimento ligeiro; assim, ignorar um crescimento ligeiro (inferior ou igual a 20% da extensão da zona de crescimento) e medir a margem mais óbvia para determinar o diâmetro da zona.
Cálculo e interpretação dos resultados
Os diâmetros das zonas medidos em torno dos discos devem ser comparados aos indicados nas Tabelas 2A a 2D no Documento M100 (M2) do CLSI.6 Os resultados obtidos com
microrganismos específicos podem, então, ser referidos como resistentes, dotados de resistência intermédia ou sensíveis.
Nota: Periodicamente são publicadas informações suplementares ao Documento M2 do CLSI, ou versões revistas, que contêm revisões de tabelas de discos de antimicrobianos e de padrões de interpretação. Para conhecer as recomendações actuais, deverão ser consultadas as últimas tabelas disponíveis. O padrão completo e os suplementos informativos podem ser encomendados ao Clinical and Laboratory Standards Institute, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, PA 19087-1898 EUA. Telefone: +1-610-688-1100.
CARACTERÍSTICAS DE DESEMPENHO E LIMITAÇÕES DO PROCEDIMENTO O Mueller Hinton Agar é o meio padrão utilizado para os testes de sensibilidade de bactérias facultativamente anaeróbias ou aeróbias em rápido desenvolvimento como, por exemplo, os estafilococos, os enterococos, os membros da família de Enterobacteriaceae e os bastonetes aeróbios gram-negativos (por exemplo, Pseudomonas spp). Foram desenvolvidos
procedimentos diferentes e outros meios e condições para testar espécies exigentes como, por exemplo, Haemophilus spp., Neisseria spp. e S. pneumoniae e estreptococos.
O procedimento padronizado do CLSI não se aplica aos testes a organismos obrigatoriamente anaeróbios, organismos que demonstrem uma taxa de crescimento fraca ou lenta em Mueller Hinton Agar, ou organismos que demonstrem uma acentuada variação de estirpe para estirpe relativamente à taxa de crescimento.6 Os organismos exigentes (por ex: Haemophilus
influenzae) devem ser testados conforme indicado no Documento M2 do CLSI.6
Com algumas combinações de microrganismos-agente antimicrobiano, a zona de inibição poderá não ter um limite bem demarcado, o que poderá conduzir a interpretações incorrectas. Uma concentração de inóculo inadequada poderá produzir resultados incorrectos. As zonas de inibição poderão ser muito pequenas se o inóculo for muito concentrado e poderão ser muito grandes e difíceis de medir se o inóculo for pouco concentrado.
O armazenamento incorrecto dos discos de antimicrobiano pode conduzir à perda de potência ou a um resultado de falsa resistência.
Um encolhimento excessivo deste meio devido a condições incorrectas de conservação pode dar origem a resultados de sensibilidade falsos.
A sensibilidade in vitro de um microrganismo a um agente antimicrobiano específico não significa, necessariamente, que esse agente será eficaz in vivo. Consulte as referências bibliográficas adequadas para orientações relativas à interpretação dos resultados.7,8 Poder-se-ão encontrar bactérias que requerem timina ou timidina.20,21 É possível que estes microrganismos não se desenvolvam de modo satisfatório em Mueller Hinton Agar que contém baixos níveis de timina ou timidina.
Foram desenvolvidos novos procedimentos que utilizam discos com um elevado teor de gentamicina (120 mg) e estreptomicina (300 mg) para rastreio de uma elevada resistência a aminoglicosídeos como uma indicação de que um isolado enterocócico não será afectado de forma sinergética por uma combinação de uma penicilina ou glicopeptídeo acrescido de um aminoglicosídeo.6,21,22
Para uma abordagem completa relativa à detecção de MRSA, enterococos resistentes, bacilos gram-negativos, produtores de ß-lactamase de largo espectro e outras limitações de testes, consultar os documentos M2 e M7 do CLSI.23
Foi demonstrado que o Mueller Hinton II Agar é um meio fiável para a detecção de MRSA que produz uma zona nebulosa de inibição em torno de discos de oxacilina.19 Em caso de dúvida, deve utilizar-se um método adicional como o BD Oxacillin Screen Agar.
O método de inoculação, interpretação e os limites das dimensões das zonas indicados neste documento e na norma CLSI podem diferir das normas nacionais. 6, 24
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EMBALAGEM / APRESENTAÇÃO
BD Mueller Hinton II Agar (placas Stacker de 90 mm; [Dimensão padrão])
Cat. No. 254032 Meios em placas prontos a usar, 20 placas Cat. No. 254081 Meios em placas prontos a usar, 120 placas
BD Mueller Hinton II Agar (150 mm)
Cat. No. 254062 Meios em placas prontos a usar, 20 placas
BD Mueller Hinton II Agar, Square (120 x 120 mm)
Cat. No. 254518 Meios em placas prontos a usar, 20 placas INFORMAÇÕES ADICIONAIS
Para obter informações adicionais, contacte o representante local da BD.
Becton Dickinson GmbH Tullastrasse 8 – 12 D-69126 Heidelberg/Germany Phone: +49-62 21-30 50 Fax: +49-62 21-30 52 16 [email protected] http://www.bd.com http://www.bd.com/europe/regulatory/
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