Atividade antiviral de extratos de plantas do Cerrado contra herpesvírus

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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS

FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS

Atividade antiviral de extratos de plantas do

Cerrado contra herpesvírus

MARINA AIELLO PADILLA

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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS

FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS

Atividade antiviral de extratos de plantas do

Cerrado contra herpesvírus

Marina Aiello Padilla

Campinas, 2011

Tese apresentada ao programa de Pós-Graduação da Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas, área de concentração em Clínica Médica, para obtenção do título de Doutor em Clínica Médica, sob orientação da Profa. Dra. Clarice Weis Arns.

FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA POR ROSANA EVANGELISTA PODEROSO – CRB8/6652 BIBLIOTECA DA FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS

UNICAMP

Informações para Biblioteca Digital

Título em inglês: Antiviral activity of Brazilian Cerrado plants extracts against

Herpesvirus Palavras-chave em inglês: Antiviral agents Savannah Herpesviridae Alphaherpesvirinae Biological Products

Área de concentração: Ciências Básicas Titulação: Mestre em Clínica Médica Banca examinadora:

Clarice Weis Arns [Orientador] Eduardo Furtado Flores

Viviane Botosso

Data da defesa: 08-07-2011

Programa de Pós-Graduação: Faculdade de Ciências Médicas

Padilla, Marina Aiello, 1986-

P134a Atividade antiviral de extratos de plantas do Cerrado contra herpesvírus. / Marina Aiello Padilla. -- Campinas, SP : [s.n.], 2011.

Orientador : Clarice Weis Arns

Dissertação (Mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas.

1. Antivirais. 2. Savana. 3. Herpesviridae. 4. Alphaherpesvirinae. 5. Produtos Biológicos. I. Arns, Clarice Weis. II. Universidade Estadual de Campinas. Faculdade de Ciências Médicas. III. Título.

DEDICATÓRIA

AGRADECIMENTOS

À Deus, por toda força que me deu nessa jornada e por ter colocado em minha vida pessoas tão especiais.

À minha família linda! Meus pais: Telma e Miguel, meus irmãos: Tiago, Fabio e Rubens, minha avó Terezinha, minhas cunhadas e meus bichinhos. AMO MUITO !!!

À minha orientadora Profa_{. Dr}a_{. Clarice, pela oportunidade que me deu, pela força,} pela confiança, incentivo, ensinamentos, etc. Muito Obrigada!

À Profa_{. Dr}a_{. Isabela Simoni, por todo apoio, amizade, conversas e oportunidades} que deu.

Aos meus amigos-irmãos Flora, Juliana, João Pedro, Buchalla, Rodrigo, Priscila e aos japas pela amizade, paciência e cumplicidade.

Aos meus amigos do LVA (Lab. De Virologia Animal): Alyne, Bianca, Bruno, Daniel, Geneci, Juliana, Luciana H., Luciana K., Maria Angela, Matheus, Paula, Paulo Anselmo e Sônia. Além da amizade, agradeço pelas ajudas, conversas, pela paciência e pelos momentos de descontração que são sempre muito divertidos.

Aos amigos do Lab. de Bioquímica: Fernanda e Eduardo, além da força e amizade, pelos almoços e boas risadas no bandejão.

Aos meus anjinhos que olham e cuidam de mim: avô Cadorna, avô Miguel, avó Catharina e Kid.

À secretária Adriana do Curso de pós- graduação em Clínica Médica, por toda a ajuda e competência quando me surgiram dúvidas.

À coordenação do Curso de pós-graduação – Clínica Médica. À CAPES e FUNCAMP pelo suporte financeiro.

À UNICAMP pela formação científica.

À todos que de alguma forma me ajudaram a ser o que sou hoje: Muito Obrigada!!!

“Antes que a luz se apague Antes que o Sol se ponha Haverá alguém de estar Haverá alguém de ficar, para que outros venham, para que outros fiquem.”

SUMÁRIO

1.3 – Herpesvírus suíno tipo 1 (SuHV-1)...23

1.4 – Herpesvírus equino tipo 1(EHV-1)...26

1.5 – Vírus do herpes simplex tipo 1 (HSV-1)...28

1.6 – Produtos naturais e antivirais...31

1.7 – O Cerrado...36

2. OBJETIVOS...49

2.1. Objetivos gerais...40

2.2. Objetivos específicos...40

3. MATERIAL E MÉTODOS...41

3.1. – Amostras virais e linhagens celulares...42

3.2. – Material Vegetal...42

3.3. - Teste de Citotoxicidade...43

3.4. – Teste Antiviral...44

3.5. – Ensaio Colorimétrico com sal de tetrazolium (MTT)...45

3.7. – Teste Virucida...46

4. RESULTADOS...48

5. DISCUSSÃO...59

6. CONCLUSÕES...67

µg/mL Microgramas por mililitro mm Milímetro w/v Peso/volume g Grama min Minuto S South W West Kb Quilobases

mg/mL Miligrama por mililitro

nm Nanômetro

A Adenina

BoHV-1 Herpesvírus bovino tipo 1

CC50 Concentração do extrato que reduz em 50% o crescimento celular CMNT Concentração máxima não tóxica

CPE Efeito citopático

DA Doença de Aujeszky

DI Doses infectantes

DMSO Dimetilsulfóxido de sódio DNA Ácido desoxirribonucléico EHV-1 Herpesvírus equino tipo 1

G Guanina

gE Glicoproteína E

HIV-1 Vírus da imunodeficiência humana tipo 1 HSK Ceratite herpética estromal

HSV-1 Vírus do herpes simplex tipo 1 HSV-2 Vírus do herpes simplex tipo 2 IBDV Vírus da doença infecciosa da bursa

IC50 Concentração que inibe em 50% o crescimento celular IIV Índice de inibição viral

IN-19 Instrução normativa número 19

MAO Monoamino oxidase

MAPA Ministério da Agricultura Pecuária e Abastecimento MDBK Madin - Darby bovine kidney

MEM Meio essencial mínimo

MTT [3-(4,5-dimethylthiazol-z-yl) -2,5-diphenyltetrazolium bromide] OIE Organização Internacional de Saúde Animal

PAP Proteína antiviral pokeweed

PI% Percentagem de inibição

PRV Pseudoraiva

SDS Sódio dodecil sulfato

SFB Soro fetal bovino

SI Índice de seletividade

SNC Sistema nervoso central SuHV-1 Herpesvírus suíno tipo 1

Os herpesvírus s ão respons áveis por enfermidades import ant es em hum anos e anim ais . Em animai s, est ão ass oci ados a doenças que caus am grandes perdas econômicas . Em hum anos, a gravidade da enferm idade é maior quando os paci ent es são imunoss upri midos. Al ém di s so, j á exist em cepas mut ant es resistent es aos m edi camentes dis poníveis. Vi sto as difi cul dades as soci adas a prevenção e trat am ento das infecções por herpesví rus, a utiliz ação de produtos de plantas como anti vi rai s apres enta -se como alt ernativa. O Cerrado Brasil eiro é um biom a que local iza -s e prati camente todo no Brasil e apresenta mais de 10.000 es péci es de pl ant as . Ess as plant as podem pot enci alment e servi r de font e de compost os farm acologi cam ente ativos. As sim, o present e trabalho t eve como obj etivos avali ar a ati vidade antivi ral, ati vidade vi rucida e o índi ce de seletivi dade (S I) de extrat os de plantas do C errado contra os herpesvírus suíno t ipo 1 (SuHV -1), equino ti po 1 (EHV -1) e ví rus do herpes simplex ti po 1 (HS V -1). Ini ci alm ent e, os extratos liofilizados foram submetidos aos testes de citot oxicidade em célul as M DBK e Vero para det ermi nar a concent ração máxima não t óxica (CMNT). Dos extratos, quat ro apres entaram as m esm as CMNT`s em ambas as linhagens m as , em geral, os extrat os foram m ais citot óxicos para células Vero. A seguir, com bas e na CMNT, foram realiz ados os t est es de ativi dade antivi ral para os vírus HS V -1 e EHV-1 em célul as Vero, e S uHV -1 em MDBK. Os result ados demo straram que 50% dos extratos apres entaram ativi dade cont ra pelo m enos um dos herpesvírus estudados , com destaque para as espéci es Banist er iops is variabilis ,

herpesví rus, e o extrat o d a Str yphnodendron adstri ngens , at ivo cont ra o HSV-1 e SuHV -1. Os extrat os que apres ent aram ativi dade antivi ral foram ent ão t est ados quant o a at ividade vi ruci da e os res ult ados s ubm etidos ao cálculo do S I. O ext rat o foi consi derado ativo quando o índi ce de i nibi ção viral (IIV) foi m aior ou i gual a 1,5 ou apresentou P I% (porcent agem de inibi ção) maior ou i gual a 97%. Quant o ao S I, foram cons iderados ati vos os extratos que apres entaram val ores i guais ou superi ores a 4. A ativi dade viruci da foi observada em 75% dos ext rat os contra pel o m enos um dos herpesví rus t est ados . As es péci es que apresent aram os res ultados m ai s prom issores foram: B. vari abili s , X. aromat ica , S. adstringens e B.

intermedi a. Es ta últ ima foi ent ão uti lizada em t es tes adici onais com a

vari ação da concent ração, e demostrou ativi dade ant ivi ral e virucida em concent rações inferi ores a CMNT cont ra os herpesví rus t est ados. Ass im, o pres ent e t rabalho demonst ra o potencial de pl ant as do C errado com o fonte de compostos com ativi dade ant ivi ral e virucid a. Estudos adi cionais são necess ári os para avaliar os m ecanism os de ação e os compostos quími cos respons áveis pela at i vidade obs ervada.

Herpes virus es are responsi bl e for i mportant di seas es in humans and anim al s. In ani mals , the y are ass ociat ed wi th economi call y im portant diseases worldwide. In hum ans, the y represent s erious threats to public health, and the s everi t y of the illness increas es i n immunocompromi sed pati ent s. In addi tion , there are mut ant st rains t hat are resi stant to avail able drugs. Because of the di fficulti es associ at ed wit h the prevention and treatm ent of herpes virus infecti ons, the use of pl ant product s as antivirals can be an alternati ve. The Brazilian Cerrado is a biom e l ocat ed al most enti rel y in Brazil has over 10,000 speci es of pl ant s. These pl ants can pot enti all y be us ed as a s ource of pharmacologi cal l y acti ve compounds. Therefor, thi s study aim ed to evaluat e the anti viral acti vit y, virucidal activit y and the s el ectivit y index (S I) of extract s from C errado pl ants agains t suid herpesvirus t ype 1 (SuHV -1) equid t ype 1 (EHV -1) and herpes simpl ex virus t ype 1 (HS V -1). Ini tial l y, t he l yophi lized extracts were t est ed for c yt ot oxicit y in M DBK and Vero cells to identi f y t he m aximum nontoxic concent ration (M NTC). Of the extract s, four showed the s ame MNTC for both cell s, but the extracts were general l y more toxic to Vero cel ls. Then, based on the MNTC, antivi ral activit y t ests were perform ed agains t HSV -1 and EHV -1 in Vero cells and SuHV -1 in M DBK cells . The res ults dem onst rated that 50% of the extracts showed activit y agai nst at leas t one of t he herpes virus es studi ed. In particul ar, t he extracts from Banis teriopsis

vari abili s, Byrsoni ma i ntermedi a and Xylopi a aromati ca , were acti ve

agains t all of the herpesvi ruses, and t he extract from Str yphnodendron

showed antivi ral act ivit y were also test ed for virucidal act ivit y, and the S I was cal cul at ed. An extract was considered active when t he vi ral inhi biti on index (VII) was great er than or equal t o 1.5 or showed a P I% (percent inhibit ion) great er t han or equal to 97%. As for the S I, extract s were considered active when the displa yed values great er t han or equal to fo ur. Viruci dal acti vit y was obs erved in 75% of the extract s agai nst at l east one of the herpesvi ruses tested. The species that s howed t he m ost promising results were: B. vari abilis , X. aromati ca , S. adstr ingens and B. intermedi a . Was us ed for additional t es ting wi th var ying concentrations, and dem onst rated antiviral and virucidal acti vities at concentrati ons lower t han the MNTC agai nst the herpes viruses test ed. Therefore, this st ud y dem onst rates the potential of C errado as a s ource of compounds with anti viral and vi ruci dal acti viti es. Addi tional studi es are necess ar y t o evaluat e t he m echani sms of action and the chemi cal com pounds responsibl e for the obs erved acti vit y.

1. INTRODUÇÃO

1.1 – H erpes vi ridae

A famíli a Herpes viridae , da ordem Her pes vir al es , é um a grande fam íli a de vírus de DNA de cadei a dupl a linear (Dz abi c et al., 2010; Tischer e Ost erri eder, 2010) , com extensão que varia entre 130 -230 kb e codifi ca m ais de 70 produtos (Fiel d et al ., 2006). Os víri ons des sa famíli a caracteriz am -se pel a presen ça de uma nucl eoproteína (core) , um capsídeo icosaédri co, um a es trut ura t egument ar prot éi ca amorfa (tegumento) e um envel ope lipoprot éi co cont endo espículas de gli coprot eínas na superfí ci e (Fauquet et al. , 2005 ; Fiel d et al., 2006 ).

Os herpesvírus s ão responsáveis por i nfecções em quas e todas as espéci es ani mai s como hospedei ros naturai s. A famíli a Herpes viri dae t em com o caract erísti ca marcant e a capaci dade de est abel ecer dois ti pos de infecção: a l atent e e lítica. Na infecção latent e , não ocorre express ão gênica si gni fi cat iva do genoma vi ral devi do a i nt errupção do ci clo replicati vo (Paulus et al. , 2009). Al ém disso, durante es sa fas e não ocorrem sinais clíni cos no hospedeiro . A capacidade dos herpesví rus de caus ar l at ência duradoura nos hos pedei ros, sem causar a doença grave ou mort ali dade, possi bilit a a t ransmi ssão v iral ent re hos pedei ros de form a efi caz (Flores et

al., 2007). J á a infecção líti ca (produtiva) caract eriz a -se pel a express ão de

todos os genes virais, repl icação viral, produção de progêni e e , consequent em ent e, mort e celular (P aul us et al., 2009). Des sa form a, uma vez infect ado o hospedei ro torna -se por tador do ví rus por t oda a vida na

forma l at ent e com reativações causadas por situação de estress e que permit em a dis sem inação, cont aminando outros indi víduos ( Miranda et al ., 2002; Szpara et al. , 2010 )

Membro s dess a família apres entam al gumas caract erí st icas com uns ent re eles. Além da capacida de de est abel ecer l at ênci a, codificam muitas enzim as rel acionadas à repl icação viral , e por fim, a sí ntes e do DNA do vírus e a montagem do capsídeo ocorrem necess ari am ent e no núcl eo das célul as i nfect adas (Gershburg et al., 2008 ).

Os herpesví rus afet am tant o a saúde ani mal como a s aúde humana (Cos et al.,2006; Deruelle e Favoreel, 2011) . Os herpes vírus em anim ais ainda l evam a doenças e mortalidade caus ando prejuízos eco nômicos à pecuária (Siakallis et al. , 2009). M es mo em pl ant éis vacinados , o s eu impacto é part icul arment e acentuado em país es em des envolvi ment o (Cos et

al.,2006). J á os herpes vírus em hum anos interferem na qual idade de vida

dos i nfect ados, principalm ent e em paci ent es imunocom promet idos (Schnitzl er et al ., 2008) e recém -nas ci dos, podendo por vez es levar à mort e (Brandão et al., 2010). Al ém disso, um problema grave dos herpesví rus em hum anos é o desenvolvim ento de resistênci a vi ral à dr ogas disponívei s com erci alm ente (R uffa et al ., 2004; Okeke et al., 2005 ).

A famíli a Herpes vi ridae é subdivi dida em três s ubfam í lias:

Alphaherpes viri nae , Bet aherpes viri nae e Gammaherpes viri nae que di ferem

ent re si nas propri edades bi ológicas , na or ganiz ação e cont eúdo do genom a , quanto ao tipo celul ar no qual estabel ecem lat ênci a e na duração do ci clo

repli cat ivo (Fauquet et al. 2005; Pom eranz et al., 2005; Fiel d et al. , 2006; Pell ett e R oizman, 2007; Tis cher e Ost errieder , 2010).

Os herpes ví rus est udados no pres ent e trabal ho pert encem a subfam ília Al phaher pes vír inae .

1.2 – Al phaherpes vi rinae

Membros d a subfamíli a Al phaher pes vir inae apres entam

característ icas específicas , com o a l atênci a nos gângli os sensori ais e aut onômi cos, o ci cl o repli cativo curto e aparecim ent o do efeito c it opáti co em quest ão de hora s e a ampl a gam a de hospedei ros (Fauquet et al., 2005; Pomeranz et al., 2005).

Os al f aherpesví rus s ão di vidi dos em três gêneros : Simpl exvi rus ,

Mar divirus e Vari cellovi rus . O prim ei ro é res ponsável por infecções em

mamí feros com o, por exemplo, o HSV -1 (ví rus do herpes si mplex tipo 1). Os Mardi virus afet am aves e , por fim , os Vari cellovir us es tão associ ados princi pal mente a infec ções de import ância veterinári a (Flores et al., 2007; Deruell e e Favoreel, 2011 ).

Assim como as dem ais subfamíli as da Herpes vir idae, os vírus da

Alphaherpes viri nae apresent am : a i nfecção líti ca e a i nfecção lat ente

(Deruell e e Favoreel , 2011) . A prim eira ocorre preferenci alm ent e no l ocal de penet ração do ví rus no hos pedeiro , enquanto que a s egunda acontece princi pal mente em neurôni os (Flores et al., 2007; Szpara et al ., 2010). Após

a i nfecção prim ári a, o vírus é transport ado pel a i nervação de cél ul as neuronais e invade o sistema nervoso c entral (S NC) , estabelecendo o est ado de lat ênci a (Barreca e O´Hare, 2004; da S ilva et al ., 2005).

O pres ent e t rabal ho foi realizado com as espécies do ví rus do herpes si mpl ex tipo 1 (HSV -1), do gênero Simpl exvir us , o herpesví rus s uí no tipo 1 (S uHV-1) e equino ti po 1 (EHV -1), ambos do gênero Vari cellovir us (Fauquet et al. , 2005; Flores et al ., 2007; Pell ett e R oizman, 2007 ).

Nos herpesví rus de modo geral, a im unidade prot etora requer resposta humoral e celul ar (Yance y, 1993) . As divers as medidas sanit ári as adotadas para os animais envolvem o control e da doença pelo do uso de vacinas (Thi r y et al., 2005) . As inati vadas são consideradas s eguras embora induz am princi pal ment e imuni dade humoral, j á as vaci nas vi vas modi ficadas , est ão ass oci adas a abort os, les ões ovari anas e infertili dade (Yance y, 1993). Em hum anos, o probl ema no t rat amento dos herpesví rus est á associ ado ao desenvolvimento de resistência vi ral a droga s si ntéticas disponíveis , al ém de sua toxici dade (Gil bert et al ., 2002; P eng , 2010 ).

1.3 – H erpesví rus s uíno tip o 1 (SuH V -1)

A doença de Aujeszk y (DA) ou Pseudorai va (PR V) é um important e obst ácul o à expl oração e res ponsável por grandes perdas econômicas na sui nocult ura em todo o m undo, isso devi do ao alto índi ce de

let alidade em leit ões , queda da produtivi dade e redução do desenvolvimento dos ani mai s em cresciment o (Grof f et al., 2005; Fonseca J r. et al., 2010) .

O Bras il possui aproximadam ente 35 mil hões de s uínos (Sant ana e Olivei ra, 2005) . A s granj as regist radas com diagnósti co da infecção perdem a certifi cação para a venda de repr odut ores e de m ateri al genéti co , com o sêm en e em briões, bas eados na Ins trução Norm ativa Núm ero 19 (IN -19) do Minist ério da Agri cultura Pecuária e Abastecim ent o (M APA). Além dis so , a PRV est á list ada como noti ficação com pulsóri a no Códi go Zoos anitário da OIE (Organização Internacional de S aúde Anim al ) (Ci acci-Zanell a et al ., 2008).

O agente eti ológi co da doença de Auj esz k y (DA) é o herpesvírus suíno ti po 1 (SuHV-1) (Groff et al., 2005), que possui apenas um sorotipo mas apres ent a quat ro di ferent es genót ipos. No Brasil s ão encontrados os genótipos I e II, que est ão dist ribuídos m undi alm ent e. Os genótipos III e IV são restritos à Di nam arca e Tai lândia. A etiologi a da doença foi det erminada no i níci o do s éculo XX e a prim ei ra no tifi cação no Brasil foi em 1932 (da Silva et al., 2005; Fonseca J r. et al. , 2010 ).

O SuHV -1, assi m com o dem ais ví rus da famíli a Her pesvi r idae , poss ui genom a de DNA fit a dupla. O genom a apresent a aproximadam ente 150 k b (Nauw ynck et al., 2007) que codi fica 70 prot eí nas . S ão frequent ement e uti li zados como m odelo para o es tudo da biologi a dos herpesví rus em geral (Pom eranz et al., 2005; Sui et al., 2010 ).

Os hos pedei ros prim ári os do SuHV -1 são os suínos domésti cos e silvest res, em bora o vírus possa i nfectar out ras es péci es de mamíferos dom ésti cos , como gatos , cães e bovinos. Nest es anim ais , o SuHV -1 pode caus ar em infecções fat ai s , já que são hospedei ros acidentai s (Flores et al ., 2007; Fonseca J r. et al., 2010). Os sinais clínicos da infecção nos hospedei ros naturai s variam de acordo com fatores epidemi ológi cos , como endemi ci dade e sus cetibi lidade dos indivíduos . A ocorrênci a do SuHV-1 em áreas endêmi cas est á associ ada a manifestações reprodutivas . A introdução do ví rus em rebanhos livres result a em s inai s clí nicos caract erí sti cos , que vari am de acordo com a faixa et ári a , assi m co m o a mortalidade . Em anim ais jovens, h á sinais de com promet imento neurol ógi co e respi ratório , com t axas de mort alidade aproximando -se dos 100%. Ani mai s adult os apres ent am febre, taxas vari ávei s de aborto, reabsorção fetal , di fi cul dade respi ratória e event ual mente vômit os. A m ort ali dade nessa faixa et ária é geralm ent e baixa (Groff et al ., 2005). Entret ant o os anim ais considerados portadores podem excret ar o vírus peri odi cam ente e são im port antes na m anut enção da doença na form a endêm ica (d a Si lva et al., 2005; Fl ores et al ., 2007).

Al guns s urtos já foram descritos no Brasil , nos est ados de Sant a Cat ari na, Rio Grande do Sul, P araná, Minas Gerais e S ão P aul o (de Souz a et

al., 2002; da Silva et al. , 2005). Um a das maneiras de cont rolar a DA é a

identificação dos animai s port adores do vírus, at ravés da realiz ação de inquéritos s orológi cos . Nos casos de soropositi vidade, são adot adas medi das para el iminar os anim ais (da S ilva et al ., 2005) . A vacina m ais

utilizada é a que contém ví rus at enuados deletados para a gl icoproteí na gE (do envelope). Ent ret anto, a reati vação dos vírus l at ent es pode provocar novas t ransmi ssões nos pl antéi s e, além disso, javalis e suí nos s elvagens ainda repres ent am uma form a de reservatório da PRV (Nauw ynck et al. , 2007).

1.4 – H erpesví rus equino tip o 1 (E HV -1)

O abort o herpéti co equino é responsável por grandes im pactos econômicos (Moreira et al ., 1998), principalm ent e quando ocorrem abort os epizoóti cos (Diel et al., 2006; P ena et al., 2006). No Brasil, a soropreval ênci a da i nfecção pode chegar a 84,7% no Rio Grande do S ul (Cunha et al ., 2002; Diel et al ., 2006) e 57,3% em São P aul o (Morei ra et

al., 1998) .

O Brasil poss ui o t ercei ro m a i or rebanho de equinos do m undo (Di el et al. , 2006), assim, a prevenção e o cont rol e de infecções em equi nos é de necessi dade comercial e soci al . A equideocult ura é um import ante segm ento do agronegóci o brasi lei ro , visto que os equinos são ani mai s dom ésti cos e de com panhi a (Diel et al ., 2006), s endo am pl amente ut ilizados em di vers os s etores l igados ao l azer, cul t ura, esport e e ecoturismo (Fiel d et

al., 2006).

O agent e eti ológico do aborto h erpét ico equi no é o herpes vírus equino t ipo 1 (EHV -1) que poss ui DNA fi ta dupl a (150Kb) contendo 76

genes (M arconi et al., 2010). A infecção pel o EHV -1 é m uito comum no J apão, Austr áli a, Es tados Unidos e Europa. N o Brasil, a ocorrênci a foi des crit a pel a prim ei ra vez em 1964 (Cunha et al., 2002 ).

As infecções pelo EHV -1 est ão associ adas a abort os, mort ali dade perinat al, doença re spirat óri a e doença neurol ógi ca (Al len, 2002; P ena et

al., 2006). O aborto e a doença neonat al podem ocorrer em qualquer fas e da

gest ação, mas na m aiori a das vezes, de 20 a 40%, ocorrem no final (Cunha

et al ., 2002) . Os fet os podem se infect ar no út ero, levando a mort e ainda na

gest ação, ou, nascem muit o fracos e morrem depois (Reed e Toribio, 2004). Em potros recém -nas cidos, infect ados durant e o prim ei ro ano de vida, mani fest a-se a doença febri l e aguda que tam bém pode levar à morte, mas devido à infecções s ecundári as (Cunha et al. , 2002). As infecções clíni cas ou subclí nicas do trato res pi rat óri o não apresent am sinais caract er ísti cos e são simil ares aos si nais clínicos causados pel a i nfl uenza, com o febre aguda, secreção nas al e t os se (Pena et al ., 2006). Por fim, a infecção pelo EHV -1 pode acarret ar ain d a em doença neurológi ca em equi nos com qualquer idade, e é precedida por febre e doença respi ratória superior durante duas sem anas ant es do iní cio dos si nais neurol ógi cos (Cunha et al., 2002; R eed e Toribio, 2004) que vari am desde um a l eve at axia at é o de cúbito com pleto com paralis ia dos m embros (Pat el e Heldens, 2005) .

Al gum as cepas do EHV -1 vari am na s ua patogeni ci dade , princi pal mente com rel ação à capaci dade de caus ar abortos ou sinais clíni cos neurológicos (Pust erla et al. , 2009). At ualment e foram des c rit as

diferenças m ol eculares em cepas neuropatogênicas e não -neuropat ogêni cas em um a regi ão do genom a que est a diret am ent e rel aci onada com a habilidade de caus ar doença neurológi ca nos anim ai s infect ados. ( Frits che e Borchers, 2010) .

Est ão dis poní veis come rcialment e vaci nas vivas modifi cadas e inati vadas, entret an t o a efi cáci a delas contra os probl em as caus ados pel o EHV-1 é di scutível (Garré et al., 2007; Lunn et al., 2009). A i ndução de imunidade prot et ora cont ra o EHV -1 ai nda é um grande desafio, pois as vacinas dis poní veis nem s empre prot egem tot alm ent e e, mesm o ent re anim ais vacinados , pode haver a diss emi nação sist êmi ca dos vírus (Patel e Hel dens, 2005). As medidas adotadas visam a prevenção e redução da probabilidade de s urtos , pelo i sol am ent o dos anim ais que podem ou estão infectados , de fêm eas prenhas e reduzi r pos s íveis est ress es respons áveis pel a reat ivação do ví rus (M orei ra et al., 1998; Lunn et al. , 2009).

1.5 – Víru s do herp es si mpl ex tipo 1 (H SV-1)

As l esões causadas pelo HSV -1 foram descrit as pel a prim ei ra vez por Hipócrat es (460/ 377 a.C.) , e em 1968 foram classi ficados dois ti pos de herpes do gênero Si mpl exvi rus devido a difere nças anti gêni cas e biol ógi cas: herpes sim plex tipo 1 e tipo 2 (Laz arini et al ., 2006). O prim ei ro é respons ável por d oenças principalm ent e na mucos a oral e est abel ece lat ênci a nos gângl i os do nervo t ri gêmio, enquanto que o HS V-2 é o

princi pal c ausador do herpes genital e est abel ece infecção latente nos gânglios s acrais . Entretanto, o HS V -1 t ambém pode ser responsável por infecções geni tai s, assim com o o HS V -2 pode ser enc ont rado em infecções orofaciai s (Khan et al., 2005; Az wa e Barton, 2009 ).

O h erpes l abi al é um a infecção m uito comum no mundo t odo , com 45% a 98% da popul ação mundi al sendo soropos itiva (Xiang et al., 2008 ). A taxa de soropreval ênci a chega a 39% na i nfânci a e aum ent a na idade adult a (Conrad y et al., 2010). Além di sso, a prevalênci a do HS V -1 varia com a idade, raça, localização geográfica e st at us socioeconômi co (Miranda et at., 2002). No Brasil , a preval ên ci a de anti corpos para HS V -1 chega a 67,2% (Cl emens e Farhat, 2010).

O agent e etiológi co do herpes l abi al é o HS V -1. Os ví rions apresent am DNA fit a dupla, com tam anho de 152 k b e possui 71 genes (Conrad y et al ., 2010; Pl acek e Berger, 2010). Del es, 36 codifi cam pel o menos 84 poli peptídeos diferent es respons ávei s por prot eí nas que contri buem para a repli cação do vírus (Xiang et al ., 2008; Conrad y et al. , 2010). Os 35 genes resta nt es codi fi cam prot eí nas que não são es senci ai s para a replicação do vírus em cul tivo cel ular (Flores et al ., 2007).

O HSV -1 está ass oci ado princi palm ente a recorrent es infecções na face, boca e l ábios (Reggiori et al., 2008), m as com m enor frequênci a, pode também caus ar i nfecções genitais (Az wa e Barton, 2009) . A m aiori a dos problemas caus ados pel o HSV -1 são aut olimitad as, com presença de feri das e vesícul as na regi ão orofaci al (Al ché et al., 2002) . Ent retanto, podem ser

um grande probl em a em paci entes im unocomprom etidos , incluindo recém -nascidos (Harden et al., 2009), paci entes HIV po sitivos ou que são subm etidos a t rat am ent o imunossupressor, podendo caus ar graves doenças sistêmicas e ri sco de vida (Akhtar e Shukl a, 2009) . Al ém disso, o HSV -1 também est á as sociado a diversas doenças ocul ares como a ceratite herpéti ca est rom al (HSK) que pode causar ceguei ra (Brandão et al., 2010) . Os cas os de herpes geni tal causado pela infecção por HS V -1 são menos severos e t em m enor frequênci a de recorrências si ntom áti cas quando com parado ao HSV -2 (principal causador do herpes geni tal ) (Azwa e Barton, 2009). O herpes hum ano est abel ece i nfecção latente em neurônios sensoriais e causam les ões recorrent es perto ou no local da in fecção prim ária (Bloom et al., 2010).

A t ransmis são do HSV -1 ocorre por contato di ret o da m ucos a ou pel e com al gum tipo de abras ão com secreções que apres entam partí cul as virais . Após a ent rada do ví rus, ele é t ransportado ao l ongo dos neurônios sensoriais até o gângl io t ri gêm eo, onde est abel ece infecções lat entes por toda vi da do hos pedeiro (Brad y e Bernst ein, 2004) , podendo ser rea ti vado por estres se , físi co ou emocional (Akhtar e Shukl a, 2009) .

O uso de análogos de nucl eos ídeos como o Aci clovir, podem alivi ar os s intomas e reduzir a duração da excreção vi ral , m as não previne as recorrênci as (Ruffa et al ., 2004) . C ontudo, a ut ilizaç ão desses antivirais sint éti cos l evou ao s urgi mento de cepas mutantes resis tent es aos fárm acos (Gebre-Mari an et al. , 2006) e mesm o com a dos e habit ual recom ent ada para

o uso parent eral ou tópi co, foram rel at ados efeitos colat erais, t ai s como neurot oxicidad e e di sfunção renal (Mancini et al., 2009). Além disso, ainda existem est udos sobre a ut ilização de las er, mas est e t ambém não elimina o vírus, apenas mi ni miza o des confort o do infectado e seus efeitos temporariament e (Reggiori et al. , 2008).

1.6 – Produtos Naturais e An tivirais

As plant as m edicinais são recursos nat urais que correspondem as mais anti gas arm as empregadas no t ratament o de enferm idades hum anas e de anim ai s, pois funcionam com o fonte de novas subs tânci as ativas utilizadas frequentement e no t rat am ent o de vári as doenças , e ntre el as as caus adas por vírus (Olivei ra et al ., 2005; Michelin et al. ,2008).

A pesquis a de subst ânci as derivadas de plant as est á bas eada no pot encial dos m et abólitos secundários como fonte de produtos naturais (Mi chelin et a l., 2008), pri ncipalm ente nas florest as brasil ei ras que poss uem grande biodivers idade s endo que poucas es péci es de pl ant as já foram es tudadas deixando uma vasta font e de produtos nat urais pot encialment e út eis e grande núm ero de espéci es veget ai s que s ão qu ímica e farm acologi cam ent e des conhecidas (Si moni, 2003).

As plantas produzem a mai ori a dos compost os ess enci ais à s ua sobrevivênci a e des envolvim ento pel o met abol ismo primário ( Lourenço, 2003). Além dess es, produz em um a grande variedade de met abólit os

secundári os, porém em pouca quanti dade, os quais s ão os pri ncipais respons áveis pel as ativi dades farm acol ógi cas (Cos et al., 2006). Ess es com post os biologi cam ent e ativos apresent am um a ampl a divers idade quími ca de es truturas e t am anhos, s endo distribuí dos e en cont rados por todo o rei no veget al (Acamovic e Brooker, 2005) . A m aiori a deles, t ais como al cal óides , terpenói des , antocianinas, est eróides , fl avonói des , qui nonas, saponinas e li gninas (Chi ang et al ., 2002) possuem apli cações com erci ais com o fárm acos, corantes , arom a, ent re outros ( Lourenço, 2003) .

O uso de produtos naturais como mat éri a prim a para a síntese de subst ânci as bioati vas, especial ment e fárm acos, t em sido ampl am ent e rel at ado há s écul os. A própri a evolução dos conceitos de pl ant a m edi cinal e medi cam ento fitot erápi co traduz ess e desenvolvim ento, que levou a um a abordagem interdi sciplinar no estudo de vegetai s como fornecedores de mat éri as prim as de i nteress e t erapêuti co (Simões et al. 2010).

Até meados do s éculo XX, os medicam ent os de ori gem veget al eram a bas e da terapi a m edicam ent osa e o desenvol vim ento da sínt es e quími ca introduziu novas drogas na t erapêutica. A investi gação de pl ant as medi cinai s utiliz adas na etnofarm acol ogi a res ultou em avanços terapêuticos e atualm ent e cerca de 50% dos medicame nt os ut ilizados s ão de ori gem sint éti ca (Cl ark, 1996), 25% del es são proveni ent es de pl ant as, isol ados diret am ent e ou produzidos por s emi -sí ntes e, a parti r de um precursor veget al (Araújo et al ., 2009) e os 25% restantes são proveni entes de outras font es d e produt os naturais (Sousa et al ., 2008 ).

A quimioterapi a antiviral deve t er um cami nho m ais raci onal utilizando subst ânci as naturais proveni ent es de plant as com valor m edi cinal e que já s ão empregadas para t rat am ento de infecções na farm acopéi a popul ar (Simoni, 2003; Agra et al., 2008).

A descoberta de compostos anti virais pode ser comparada a revolução ocorrida na época do desenvol vimento dos anti biót icos e anuncia uma nova era na medicina at ual (Si moni , 2003).

Ainda que cent enas de pl antas que t enham p ot encial como agent es anti virais est ej am s endo est udadas , existem inúmeras pl ant as medi cinais pot encialment e út ei s es perando para s erem avali adas e exploradas na apli cação terapêuti ca cont ra di vers as famílias virais (Esim oni et al. , 2005; Brandão et al. , 2008).

O aumento do conhecim ento a respeito dos eventos m oleculares e bioquími cos da repli cação viral em m uit o cont ribui u para o surgim ento de novos compostos ant ivirais (C os et al ., 2006, Hazuda et al., 2009). Al guns dest es exempl os se encontram em pesqui sas que conduziram à des cobert a de vários compos tos ati vos, com o por exem plo, aquel es que ini bem enzim as -chave envol vidas na replicação do DNA dos ví rus herpéti cos e aqueles que inibem prot einas es do ví rus HIV (Robert s et al., 1990; Greco et al. , 2007; Bill aud et al., 2009).

O anti vi ral ideal deve int errom per s el etivam ent e al gum a et apa especí fica e ess encial do cicl o de repli cação, sem afetar de form a si gni fi cat iva o met abolismo da cél ul a hos pedei ra (But era, 2000). Dessa forma,

os com post os farm acologi cam e nt e at ivos devem com pl ement ar a imunidade celul ar e a res post a humoral (Sim oni , 2003) .

Produtos fitoquími cos ativos que apres entam potencial ativi dade anti viral cont ra herpes vírus têm sido des critos em grande núm ero na literatura como os alcalóides, prot e í nas, s aponinas , fl avonóides , entre muitos out ros (Khan et al. , 2005; Nai thani et al., 2010). P or exem plo, foi descrito s i gni fi cant e efeit o ini bidor in vitr o na repl icação do HS V -1 de flavonóides isol ados de folhas e caul e de V.album ssp. album

(Lorant haceae) (Orhan et al., 2010), bem com o a querceti na, encontrada em muitas plant as com o a Hyperi cum cordatum , é t ambém um com post o flavovonóide que apres ent a ati vidade anti viral (Dourado e Ladeira, 2008).

Além diss o, pode -se cit ar out ros exemplos, como ól eos es s enciais isol ados da pl ant a Santoli na insularis capaz es de ini bir a di s pers ão do HS V célul a– célul a (De Logu et al .,2000), compost os is olados de ervas como a

Psychotia s er pens e Limoni um si nens e capazes de i nibi r o HSV em várias

et apas de sua repli cação (Ku o et al ., 2001; Kuo et al., 2002), extratos isol ados de plant as da Tail ândi a que apresent aram efeito seletivo sobre o HSV-1 (Li pip un et al., 2003) e sust ânci as is ol adas da erva chines a

Pol ygonatum cytonema , as quais apresent aram ativi dade anti -HSV -2 em

cult ura celul ar (Li u et al., 2004).

Out ros experim entos descrevem a proteína denominada PAP (pokeweed anti viral prot ei n) proveni ent e do fracionamento dos extrat os de

apresentou ação anti vir al cont ra HIV -1. Além disso, os autores relataram que o t rat amento de sêm en de coelhos com a prot eína PAP foi efi caz contra o HIV -1, s em caus ar diminui ção da moti lidade dos espermat ozóides e s em ser tóxico ao trato genital m asculi no e feminino. O mesmo fo i observado em experim ent os com s êm en hum ano, proporcionando grande otimism o para utilização da P AP em reprodução as sisti da de hom ens portadores do ví rus HIV-1. Tais experi ment os dem ons traram a import ânci a da utiliz ação de anti virais não s ó para o t rat am en to de infecções virais j á instaladas, mas também para evit ar a transm issão do vírus, até m esm o em insem inação artificial tanto humana como em animais (D’Cruz et al., 2001 a,b).

No estudo de anti virais o ensai o mais empregado é o de tri agem, no qual é avali ada a ativi dade de extrat os de pl ant as (Wu et al., 2011) e, por fim, são s eleci onados os extratos que ap res ent am result ados prom issores (C os et al., 2006). Além dis so, a t ri agem permit e a realiz ação de ens ai os com um grande núm ero de extratos a s erem anal i s ados (Khan et

al., 2005, S imoni et al.,2007; Brandão et al., 2010) .

Os t est es ant ivi rais devem, es peci alm ent e o s de t ri agem, em pregar uma m etodologia que apresent e rel ati va si mpli cidade, m as com procedim ento confi ável, e gerar informações út eis sobre um ext rat o escolhido, a fim de realiz ar estudos m ai s elaborados (S imoni et al., 2003; Khan et al. , 2005; C os et al., 2006 ).

Ess es ens aios foram realiz ados in vitro , isso porque geralm ent e são t es tes mais rápi dos e m enos oneros os (C os et al ., 2006; Brandão et

al.,2010). Al ém dis s o, os t est es in vitr o possi bilit am realizar experim entos

controles, uti lizando as m esm as célul as de modo a elim inar as vari ações experim ent ais (R ogero et al ., 2003) . Out ra vant agem dos est udos in vitro é analis ar com mai s facilidade e feitos muit o import antes quando s e pret ende estudar m ais profundam ent e os m ecanismos de ação de extratos ou de princí pios ativos de ori gem veget al (C echinel Filho e Yunes, 1998; Sim oni, 2003).

Visto as difi culdades rel aci onadas as i nfecções caus adas pelos herpesví rus de m anei ra geral, o estudo de diferentes espéci es de pl antas que apresent am at ividade antivi ral é de suma import ânci a, al ém de s er um caminho prom issor (Balbi no et al., 2010; Simões et al., 2010) .

1.7 - Cerrad o

O Brasil é consi derado como u m dos país es de maior biodi versi dade do mundo com cerca de 10% de toda a biot a t errest re (Mitt ermeier et al. , 1997). Al ém do tam anho, o is ol amento geográfi co e a grande vari ação de ecossi st emas podem ser as razões que expli cam t al diversidade, e um ex empl o dessa riqueza é o c errado (C hat topadh ya y et al. , 2009).

O cerrado t em des pertado, nos últim os anos, grande int eres s e nas pesquisas ci entí fi cas (Simoni et al. ,2007) . Iss o se deve ao fato da vegetação de cerrado s er um a das m ai ores fl oras veget ais do mundo e cobri r 2 mil hões

de km2 (Duri gan et al., 2004; J unior et al., 2009) , cerca de 23% da superfí ci e do Brasil (M elo e Sil va et al., 2009) , al ém di sso, o cerrado é um tipo de vegetação confinado ao Brasil, com apenas al gumas extens ões que al cançam a Bolí vi a e o P araguai (Neto e Morais, 2003) . O cerrado t rat a -s e de um a veget ação s avânica m uito anti ga e alt am ent e diversifi cada, com um núm ero estim ado de 10.000 espéci es de plant as superi ores (J unior et al. , 2009).

A Savana brasil eira, com o tam bém é conheci do, é o s egundo maior e m ais import ante biom a do Brasil (Alves et al., 2000; de M es quit a et

al., 2005). Fica localizado bas icam ent e no pl analt o cent ral e as espécies

veget ais dess a regi ão s ão pouco conhecidas, ent retanto, sabe -s e que o Cerrado poss ui um a grande diversidade taxonômi ca, ou s ej a, possui um a ampl a di versi dade química a ser explorada (Neto e Morai s, 2003). Além disso, as pl antas nativas do Cerrado são muito util izadas pel a população local para o t rat am ento de diversas doenças i nfeccios as (Alves et al. , 2000). O clim a do cerrado é sazonal com experi ênci as de uma es tação seca pronunci ada. Além diss o, os s olos são ácidos, pobres em nut ri ent es e apresent am altos ní veis de s aturação de alumí nio. O cerrado tam bém sofre frequent es incêndios que consom em princ ipalm ent e a camada de solo gram ado (Si l berbauer, 2006). Tais est ress es estim ul am a produção dos met aból itos secundários , j á que ess es são produzidos e utilizados pel a planta como form a de adequação da espéci e veget al ao s eu m eio. (S imões et

Identi fi car espécies medi cinai s nat ivas dess e bioma brasil ei ro se tornou, nos últimos anos, um a import ante ta refa da pes quisa ci entífi ca (Duri gan et al. , 2004) . Resultados promissores foram des cri tos para o tratam ento de divers os problemas de saúde pública. D as espéci es que foram test adas , foi encont rada at ividade anti plasmódi o (de M esquit a et al. ,2007 ), anti viral (Sim oni et al., 2007; Brandão et al., 2010 ), anti -ul cerogêni ca, anti bact eriana , anti fúngi ca (J unior et al ., 2009), anti oxidant e, leis hm ani cida (Paula-J uni or et al ., 2006), ent re outras , todas de ext rat os proveni ent es de plantas tí picas do Cerrado (Flausino-J r. et al. , 2009; Pavan et al.,2009).

Devido a grande riquez a de compostos farm acol ogi cament e ativos e as ati vidades encontradas envol vendo as espé cies nativas da região, o Cerrado pode s er considerado um a font e important e de compostos quími cos (Neto e M orais , 2003; de Mesqui ta et al., 2009; P avan et al., 2009) que podem vi r a ser uti lizados no t ratament o e prevenção de doenças vi rais , princi pal mente aquel as caus adas pelo herpes vírus.

2. OBJETIVOS

2.1 - Objetivos Gerais

Tri agem in vitr o de extrat os obtidos de espécies vegetais do Cerrado que apresentem pot enci al atividade antivi ral sobre dois patógenos de int eress e veterinário e um hum ano : herpesví rus d e s uíno tipo 1 (S uHV -1), herpesvírus equi no tipo 1 (EHV -1) e ví rus do herpes s implex tipo 1 (HS V-1), respectivament e.

2.2 – Objetivos específicos

 Avaliar a citotoxicidade dos extratos nas linhagens celulares : Vero e MDBK

 Realizar triagem dos extratos que apresentam atividade a ntiviral contra o herpesví rus suíno tipo 1, herpesvírus e qui no t ipo 1 e vírus do herpes simpl ex tipo 1

 Avali ar a atividade v irucida dos extratos que foram ativos  Calcular o índice de s eletividade dos extratos ativos

 Testar a atividade antiviral e virucida em diferentes concentrações do extrato que apresent ar result ado mais promissor

3.1 - Amostras virai s e linhagens celul ares

Os vírus utiliz ados foram: herpesví rus equino (EHV -1), cepa A4/72 (Morei ra et al .,1998), ví rus do herpes simpl ex tipo 1 ( HSV -1), cepa KOS (Sil va et al., 2010) e o herpes vírus suí no (SuHV -1), cepa NP (Nova Prat a) (Fonseca et al ., 2010).

As linhagens celul ares ut ilizadas foram a Vero (African green monke y – ATCC C C L 81) e a MDBK (Madin - Darb y bovine kidne y – ATCC CC L 22) (Ha y et al ., 1994). A prim ei ra foi ut ilizada para a inocul ação do vírus EHV -1 e HSV -1, j á linhagem MDBK foi utiliz ada para a repli cação do SuHV -1. As linhagens celul ares foram m anti das a 37ºC em ambi ent e de CO2 a 5% em m eio essencial mínim o (M EM ), acrescidos de 10% de s oro fet al bovino (S FB) (Fernandes e Si moni , 1995).

3.2 - Materi al vegetal

As pl antas utiliz adas no present e t rabalho foram des cri tas ant eriorment e por Simoni et al . (2007) e col et adas em M ogi -Guaçu na Fazenda Campininha, São P aulo, Brasil (22º 18’S e 47 º20’W). As espécies foram i dentificadas pelo bot ânico Dr. Eduardo Luis M artins Cat harino através de comparações com exsi cat as pres ent es no herbári o do Inst itut o de Bot ânica, S ão P aul o. As s egui nt es espéci es foram utiliz adas: Banis teriopsis

xanthocarpa O. Berg, C as ear ia syl vestri s S w., Ciss us er osa Ri ch.,

Copaif er a langsdorff ii Desf., Erythroxylum deci duum A. St .-Hil., Gochnat ia

pol ymorpha (Les s.) Cabrera, Laci st ema hassl eri anum Choda t, Lithr ea

moll eoi des (Vell.) Engl. , Ocot ea pulchella (Nees ) M ez, Str yphnodendron

adstri ngens (Mart.) Covill e, St yrax f errugineus Nees & M art ., T rigonia

eriosperma ( Lam.) Fromm & J . Vera S., Trigoni a ni v ea Cam bes s., Xyl opia

aromati ca ( Lam .) M art .

Os extrat os foram preparados ant eriorment e por Si moni et al . (2007), a parti r de folhas s ecas t rituradas em água des til ada, filt rados e liofil izados. No moment o do us o, foram diss olvidos em part es i guais de água dei oniz ada estéril e meio essenci al mínimo (M EM) sem soro em um a concent ração de 4.000 µ g/m L, 5.000 µ g/m L.

3.3 - T es te d e ci totoxicid ade

O ens ai o foi realiz ado com as duas linhagens celul ares, Vero e MDBK, em m icroplacas de 96 ori fí ci os com 30.000 cél ul as em cada ori fí cio. Após 24 horas de i ncubação a 37ºC em ambi ente de CO2 a 5%, o meio foi descart ado e as células foram expost as a concent rações decres cent es na bas e 2 dos extrat os. Em seguida, as mi cropl acas foram incubadas novam ent e durante pelo m enos 7 2 horas . Foram realiz adas leituras di árias das micropl acas. A concent ração dos extratos que não induziu alt erações det ectáveis ao mi croscópio de l uz foi considerada a

concent ração m áxima não tóxi ca (C MNT) do extrat o. Foram us adas como controle monocam adas de cél ulas incubadas apenas com MEM sem soro.

3.4 - T es te an tiviral

Foram utiliz adas mi cropl acas com 96 ori fícios com 30.000 cél ulas em cada orifí cio. Os test es com as am ost ras vi rais de EHV -1 e HSV -1 foram realiz ados em célul as Vero. A linhagem celul ar M DBK foi ut ilizada para os test es com SuHV -1. As mi croplacas com as célul as em suspens ão foram incubadas por 24 horas a 37ºC em am biente de CO2 para a form ação de monocamada celul ar. Com o pass ar das 24 horas, o m eio s obrenadant e foi descartado e em cada o ri fí cio foi col ocado 100µl de extrato na C MNT obtida no teste de ci totoxici dade. Como controle, foi utiliz ada m onocam ada celul ar incubada apenas com MEM s em soro. As micropl acas foram incubadas por 1 hora a 37ºC em ambiente de C O2, em s eguida foi adi cionado 50 µl de suspensão vi ral em dilui ções l ogarí tmi cas na base 10, exceto no control e, e novam ent e i ncubadas na estufa. Foram feit as l eit uras diári as em mi cros cópio de l uz para a observação do efei to cit opático (EPC ), at é 72 horas após a realiz ação do ens aio . O tí tulo vi ral foi cal cul ado pelo método de Reed e Muench (1938) e expresso como dose infect ant e para 50% dos culti vos celul ares (TC ID50). A avali ação da ati vidade anti viral foi calculada pela diferença ent re o títul o do tratado, ou s ej a, células i nfecta das e t ratadas com extrat o (T), pelo títul o do controle, apenas células i nfect adas

(C). O resultado foi expresso pelo í ndi ce de i nibi ção vi ral (IIV = logT - logC). Os extrat os foram considerados ativos quando o IIV foi m aior ou igual a 1,5. Al ém disso, t am bém foi realizado a porcentagem de ini bição (P I% = [1 -(ant ilogT/antilogC)] X100) e foram consi derados at ivos os extratos que apresentaram P I% m aior ou i gual a 97% (Ni shimura et al. , 1997).

3.5 - En saio colori métri co com sal de tetrazoliu m (MTT )

Para o p rocedim ent o dest e ens aio, células Vero e M DBK foram manti das em pl acas de 96 orifí ci os. Em metade dos orifícios, as célul as foram m anti das em contat o com os extratos em diferentes concentrações e amostra viral na concent ração de 100DI (Doses infect antes ) e na outra met ade, som ente células e extrato. Al ém diss o, al guns orifíci os foram utilizados com o cont rol e. A mi cropl aca foi para a estufa por 72h a 37ºC em atmosfera com 5% de CO2. Após esse perí odo, adi cionou -se MTT a 5m g/m L. Após 4h de incubação a 37ºC ad i cionou -s e 100 µ L da solução de 10% de SDS , 0,01N de HCl e após 24h os ori fí cios foram analis ados em leitor de E LIS A a 540nm . Os resul tados foram analis ados comparando a absorbância dos ori fí cios t ratados com os controles celul ares , por anális e de regressã o (M osm ann, 1983). Os valores obtidos foram repres ent ativos de uma médi a de t rês experim entos realiz ados.

3.6 – Cál culo do SI (índi ce de seletividade)

A parti r da anális e dos resul tados obtidos no t est e com MTT foi possí vel encontrar os valores de CC5 0 %, que corres ponde a concentração do extrato que reduz em 50% o crescim ent o cel ular, e IC5 0 %, concentração do extrato capaz de ini bir em 50% a repli cação vi ral. C om es ses val ores é possí vel det erm inar o índi ce de sel et ividade (S I = CC5 0 %/ IC5 0 %), que expressa o índice de segurança da subst ânci a t est ada e, dess a form a possi bilit a a real ização de estudos post eri ores m ais detal hados t ant o in

vitro, quanto in vi vo (Coen e Ri chman 2007; Dez engrini et al., 2009 ). Os

val ores de S I aci ma de 4 s ão considerados positi vo s e quant o m aior é ess e val or, m ais promiss or é considerado o extrat o (Am oros et al. , 1992).

3.7 - T es te vi ru cida

O t est e vi rucida é realizado para identi fi car s e o extrat o t em ação diret a na partí cul a vi ral , ou s ej a, aval ia se a ação do extrato ocorre ant es da infecção viral das células hos pedeiras (S chuhm acher et al ., 2003). P ara is so são mist urados am ostras vi rais e ex tratos ant es da incubação em monocamada cel ul ar.

Novam ent e foram utilizadas mi cropl acas de 96 orifí ci os, com camada celul ar, e os ens a ios foram realizados em ambas as li nhagens

10- 8 em M EM s em s oro, foram misturadas a extratos na CM NT, e incubadas durant e 1 hora a 37ºC em am bient e de C O2. Após o t érmi no de incu bação das mist uras (extrat o + amost ra vi ral e MEM + amostra vi ral), foi reti rado da mi cropl aca o m ei o sobrenadant e e adi cionado as mist uras: amost ra vi ral e extrato (t ratado) e amos tra viral e MEM sem s oro (cont rol e). Em s eguida as mi cropl acas foram incuba das por no mínimo 72 horas e foram realizadas leituras di ári as para obs ervação de ECP . O tít ulo vi ral , o IIV e o P I% foram calculados como descrito no “Teste antiviral”.

4. RESULTADOS

O teste de citotoxici dade foi realiz ado para i denti ficar a concent ração máxima não t óxica (CMNT) dos extrat os nas li nhagens cel ul ares util izadas no pres ent e trabal ho, MDBK e Vero. Na Fi g.1 estão repres ent ados , em escala logarítmi ca, os res ult ad os desses ensai os .

Figu ra 1: C oncent rações m áximas não tóxicas (CMNT) dos extrat os nas

linhagens cel ulares MDBK e Vero C M N T : C o nc e n t r a ç ã o m á x i ma n ã o t ó x i c a

Os extrat os m enos cit otóxicos para as cél ulas Vero foram das espéci es S. adstringens e X. aromática, com CMNT de 1250µ g/ m L. J á na linhagem M DBK , a espéci e cuj o extrat o foi m enos ci totóxi co foi da espéci e

C. eros a, com CM NT de 2000 µ g/m L.

célul as Vero , com C MNT de 15,6 µ g/ m L. Os dem ais extrat os , em célul as Vero , apresent aram CMNT ent re 31,2µ g/ m L e 625µ g/m L, e para as célul as MDBK, as concentraç ões vari aram de 15 , 6µ g/m L a 625µ g/m L.

Dos d ezes sei s extratos t est ados, nove del es, apresentaram CMNT maior em Vero , e s omente t rês foram menos cit otóxicos em MDBK. Os quatro extratos rest ant es apresent aram a mesma C MNT em ambas as linhagens . Des sa forma, a m aiori a dos extrat os apres entou m aior citot oxicidade , ou s eja, m eno r C MNT, em célul as M DBK . Logo, a l inhagem celul ar Vero foi m ais resist ente que a MDBK à pres ença d ess es extrat os.

Com a det erminação das CM NT dos extrat os, ini ci aram -s e os test es anti virais . Ess es ens aios m ost raram se o s extrat os inibem , de al guma forma, a repli cação vi ral .

A Tab.1 corresponde aos res ult ados obti dos na atividade antiviral dos extratos , nas suas respecti vas CMNT´s, frent e o S uH V-1, EHV-1 e HS V -1. Foram consi deradas ativos os extratos que apres entaram o valor do ín di ce de inibi ção vi ral ( IIV) m aior ou i gual a 1,5 e a porcent agem de i nibi ção (P I%) m aior ou i gual a 97%.

Tabela 1: Triagem antiviral dos extratos frente o SuHV-1, EHV-1 e HSV-1

IIV: Índice de inibição viral; PI%: Porcentagem de inibição; SuHV-1: Herpesvírus suíno tipo 1; EHV-1: Herpesvírus equino tipo 1; HSV-1: vírus do herpes simplex tipo 1

Espécies Vegetais

SuHV-1 EHV-1 HSV-1 IIV PI(%) IIV PI (%) IIV PI(%) 1) Banisteriopsis variabilis 3,24 99 3,75 99 2,25 99 2) Byrsonima intermedia 5,45 99 4,87 99 3,25 99 3) Campomanesia xanthocarpa 2,0 99 0,62 76 0 0 4) Casearia sylvestris 0 0 0,76 83 0 0 5) Cissus erosa 1,74 99 0 0 0 0 6) Copaifera langsdorffii 0 0 0 0 0 0 7) Erythroxilum deciduum 1,16 93 0,26 45 1,0 90 8) Gochnatia polymorpha 0 0 0 0 0,25 44 9) Lacistema hasslerianum 2,0 99 0,26 45 0,5 68 10)Lithrea molleoides 0 0 0,25 44 0,5 68 11) Ocotea pulchella 1,76 99 0,26 45 0 0 12) Stryphnodendron adstringens 2,0 99 1,0 90 2,75 99 13) Styrax ferrugineus 1,16 93 0 0 0,25 44 14) Trigonia eriosperma 0 0 0,25 44 0,25 44 15) Trigonia nívea 0,5 68 0,26 45 0,25 44 16) Xylopia aromática 3,24 99 1,76 99 1,5 97

A tabel a mostra que os extratos das espéci es B.int er medi a , B.

vari abili s e X. ar omati ca foram ati vas frente a todos os herpes vírus

test ados. Al ém di ss o, o extrato da espéci e S. adst ringens foi ativa cont ra dois dos herpesví rus , o SuHV -1 e HS V-1.

Os extratos das espéci es C. er osa , C. xant hocar pa , L.

hassl eri anum e O. pulchella apres ent aram ativi dade som ent e cont ra o

SuHV -1. Os demai s extra tos não apresentaram valores i guais ou superiores a 1,5 no IIV e 97% em P I%.

Por fim , a Tab. 1, m ostra que o extrato da espéci e B. intermedi a apresentou os m aiores valores de IIV e P I% cont ra os t rês herpesví rus

.

Os ext rat os que apresentaram ati vidade antiv i ral foram subm etidos ao ens ai o com MTT , para o cálculo do índi ce de s el etivi dade (S I) a parti r dos val ores do CC5 0 (concentração do ext rat o capaz de reduzi r em 50% o cres cim ento celul ar) pelo valor de IC5 0 (concent ração do extrat o capaz de reduzi r em 50% a repl icação vi ral). Os valores de S I são considerados positivos quando são m aior es ou i guais a quatro, e quanto maior é ess e valor, mais promissor é considerado o extrato. Os res ult ados dos ensai os com M TT est ão dem ost rados na Tab.2.

Tabela 2: Índice de seletividade dos extratos com atividade antiviral frente o SuHV-1,

EHV-1 e HSV-1

*: Não foram testados; SI: Índice de seletividade; SuHV-1: Herpesvírus suíno tipo 1; EHV-1: Herpesvírus equino tipo 1; HSV-1: vírus do herpes simplex tipo 1

Extratos

Índice de Seletividade (SI)

SuHV-1 EHV-1 HSV-1 1) Banisteriopsis variabilis 307,85 ± 0,3 0,8 ± 0,05 0,5 ± 0,8 2) Byrsonima intermedia 193,97 ± 0,09 4,12 ± 0,1 41,76 ± 0,04 3) Campomanesia xanthocarpa 68,76 ± 0,05

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Dentre todos os ex tratos que foram at ivos frent e ao SuHV -1 , soment e o extrato de O. pulchel la não apres entou o valor de S I m aior que quatro. Os demai s extratos apresentaram valores promi ssores de S I, com

dest aque para o extrato da espécie S. adstringens , que apres ent ou val o r de S I de 1121,71±0,9, o maior valor encontrado cont ra o SuHV -1. Dos três extratos ativos na t ri agem antiviral cont ra o EHV -1, som ent e o extrato de B.

intermedi a apres ent ou val or considerado prom issor de S I. J á contra o HS V

-1, dos quat ro extratos ativos, dois del es apres ent aram valores acima de 4, os extratos da S. adst ringens e de B. intermedia , sendo q u e es te último apresentou o maior valor de S I cont ra o HSV-1 .

Logo, dos extratos escol hidos na triagem antivi ral, os das espécies

S. adst ringens , com o mai or valor de S I contra o SuHV -1, e B. int ermedia ,

com os m aiores valores de S I cont ra o EHV -1 e HS V -1, dest acaram -se neste ensaio como ext rat os mai s promi ssores.

Ess es m esm os extratos dos quais foram calculados os valores de S I, foram submet idos a ensaios de avali ação da atividade vi rucida nas CMNT´s , a fim de verificar se o extrat o poss ui ação di ret a na partí cul a viral. Os resultados obtidos nos t est es virucidas est ão demonst rados na Tab.3.

Os ens aios virucidas mostraram que os extratos de B.var iabil is e

B. i ntermedi a , apres ent aram ativi dade frent e ao SUHV -1, EHV -1 e HS V-1,

sendo do extrato de B. i ntermedi a os m ai ores valores de IIV e P I% contra os três herpesvírus Al ém diss o, o extrato da espéci e X.ar omati ca apres ent ou ativi dade virucida contra o SuHV -1 e HSV -1. J á o extrato de espécie S.

adstri ngens apres ent ou ati vidade vi rucida somente contra o HSV -1 . Por fim,

ent retanto, o s extrat os das espéci es C. xanthocarpa , L. has sleri anum e S.

adstri ngens não apres ent aram atividade vi rucida cont ra ess e mesmo

herpesví rus , ou sej a, es ses extratos não agem di ret am ent e na partí cul a viral.

Tabela 3: Atividade virucida dos extratos frente o SuHV-1, EHV-1 e HSV-1

*: Não foram testados; IIV: Índice de inibição viral; PI%: Porcentagem de inibição; SuHV-1: Herpesvírus suíno tipo 1; EHV-1: Herpesvírus equino tipo 1; HSV-1: vírus do herpes simplex tipo 1

Espécies Vegetais

SuHV-1 EHV-1 HSV-1

IIV PI(%) IIV PI(%) IIV PI(%)

1) Banisteriopsis variabilis 3,34 99 3,67 99 3,0 99 2) Byrsonima intermedia 6,15 99 6,12 99 4,5 99 3) Campomanesia xanthocarpa 0,1 2

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Dos result ados obti dos at é ent ão, as espécies que se des tacaram foram : B. vari abilis , com ativi dade antiviral e virucida contra os t rês herpesví rus est udados e result ado prom issor de S I frente ao SUHV -1; a

espéci e X. ar omati ca , com ati vidade antiviral cont ra os t rês herpesví rus, ativi dade vi rucida contra o SuHV -1 e HSV -1, e result ado positi vo de S I frent e ao SuHV -1; o extrat o da espéci e S. adstri ngens , que apres ent ou ativi dade ant ivi ral c ontra o SuHV -1 e HSV-1, ati vidade vi rucida cont ra o HSV-1 e o maior valor de S I cont ra o SuHV -1; e por fim , o extrat o da espéci e B.int er media , que obt eve os mel hores res ult ados, com os mai ores val ores de IIV e P I% nos ensai os anti virais e virucidas , contra os t rês herpesví rus est udados, al ém dos result ados mais promi ssores de S I cont ra o EHV-1 e HS V -1.

Port ant o, a es péci e que foi escolhi da para a realiz ação de ens aios anti virais e viruci das adi cionai s, com a vari ação da concent ração do extrato, foi a B. i nter medi a. Foram realizados ens ai os que t est aram a ativi dade ant ivi ral e viruci da de concent rações menores do que a CM NT. As concent rações vari aram de 1,9 µ g/m L a 250 µ g/m L, e os resul tados dos ensaios antivi rais e virucidas est ão repres ent ados nas Fi guras 2 e 3, respectivam ent e.

Nos ensai os ant ivi rais , foi possí vel verificar que o extrato de B.

intermedi a apres ent a ativi dade antivi ral em concent raç ões m enores que a

CMNT, cont ra os herpesví rus t est ados. Cont ra o SuHV -1, o extrat o apresentou val or de IIV acim a de 1,5 a parti r da concentração 31,2 µ g/m L, e frent e ao EHV -1 e HSV-1, o extrat o foi ativo a parti r da concent ração 62,5 µg/ m L.