UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia
Tese
Caracterização morfológica e molecular para o auxílio no melhoramento genético em gérbera
Daiane de Pinho Benemann
Pelotas, 2012
Daiane de Pinho Benemann
Caracterização morfológica e molecular para o auxílio no melhoramento genético em gérbera
Tese apresentada à Universidade Federal de Pelotas, sob a orientação do Prof. Dr. José Antonio Peters, como parte das exigências do Programa de Pós-graduação em Biotecnologia, como requisito parcial para obtenção do título de Doutor em Ciências.
Orientador: José Antonio Peters Co-orientador: Valmor João Bianchi
Pelotas, 2012
Dados de catalogação na fonte:
Ubirajara Buddin Cruz – CRB 10/901 Biblioteca de Ciência & Tecnologia - UFPel
B465c Benemann, Daiane de Pinho
Caracterização morfológica e molecular para o auxílio no melhoramento genético em gérbera / Daiane de Pinho Benemann. – 94f. : il color. – Tese (Doutorado). Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia. Universidade Federal de Pelotas. Centro de Desenvolvimento Tecnológico, 2012. – Orientador José Antonio Peters ; co-orientador Valmor João Bianchi.
1.Biotecnologia. 2.EST-SSR. 3.Melhoramento genético.
4.Caracteres morfológicos. 5.Correlação. 6.Gerbera jamesonii.
CDD: 582.13
Banca Examinadora
Valmor João Bianchi (Presidente) Antonio Costa de Oliveira (Titular) Rosa Lia Barbieri (Titular)
Monique Inês Segeren (Titular)
Aos meus pais Maria Elena de Pinho e João Carlos de Pinho Ao meu marido Tarso Benemann
Dedico
AGRADECIMENTOS
À Deus por me dar força, por sua fidelidade e por ter me sustentado em todos os momentos.
Aos meus pais, Maria Elena e João Carlos de Pinho, pelo incentivo na minha vida acadêmica e confiança em minha capacidade.
Ao meu marido, Tarso Benemann, pelo amor, carinho, paciência e compreensão em todos os momentos.
À Universidade Federal de Pelotas e ao programa de Pós Graduação em Biotecnologia pela oportunidade e estrutura para a realização deste trabalho.
Ao Prof. José Antonio Peters pela amizade, carinho, dedicação, ensinamentos e apoio.
Aos Professores Luciano Maia, Valmor João Bianchi e Willian Silva Barros, pela paciência e seus ensinamentos.
A Dr
aMonique Inês Segeren por ter cedido os acessos de gérbera utilizados nesse estudo.
Aos professores Teemu Teeri e Paula Elomaa por terem me recebido na Universidade de Helsinki para o estudo de transformação genética em gérbera.
Aos colegas e amigos que me ajudaram na realização deste trabalho, em especial, Luciana Rodrigues e Luis Willian Pacheco Arge.
À todos os colegas do Laboratório de Cultura de Tecidos, pelo convívio e apoio.
À todos meu amigos e familiares que compreenderam minha falta nas festas
de aniversário e passeios.
“Porque o Senhor dá a sabedoria, e da sua boca vem a inteligência e o entendimento”.
“O que adquire entendimento ama a sua alma; o que conserva a inteligência acha o bem”.
Provérbios 2:6 e 19:8
Resumo
BENEMANN, Daiane de Pinho. Caracterização morfológica e molecular para auxílio no melhoramento genético em gérbera. 2012. 94p. Tese de doutorado- Programa de Pós Graduação em Biotecnologia. Universidade Federal de Pelotas, Pelotas.
A gérbera é uma das plantas mais importantes no mercado mundial de ornamentais.
Dada a grande concorrência nesse mercado, a obtenção de genótipos diferenciados é uma necessidade constante, sendo assim, informações sobre a variabilidade genética desta espécie podem auxiliar programas de melhoramento, visando a seleção de novos genótipos promissores. No presente estudo buscou-se desenvolver marcadores EST-SSR para gérbera, com os objetivos de caracterizar molecularmente esta espécie, verificar a variabilidade genética entre acessos, por meio da análise multivariada utilizando caracteres morfológicos (qualitativos e quantitativos), analisar a correlação entre os caracteres morfológicos e moleculares para uma melhor elucidação da variabilidade genética de Gerbera spp.. Como resultados, 17 marcadores EST-SSRs foram desenvolvidos para uso em estudos de caracterização molecular. Estes foram altamente polimórficos e capazes de diferenciar todos os acessos de gérbera. A análise dos caracteres morfológicos (quantitativos e qualitativos), por meio de análise multivariada e componentes principais, possibilitou verificar a existência de ampla variabilidade genética entre os acessos de gérbera. Através da correlação entre os caracteres morfológicos, constatou-se que existe influência de alguns caracteres sobre outros. Na análise conjunta dos dados moleculares e morfológicos, por meio da soma das matrizes de dissimilaridade, foi possível obter um melhor agrupamento entre os acessos estudados. Os resultados obtidos neste estudo poderão auxiliar programas de melhoramento genético de gérbera na seleção de progênies promissoras para cruzamentos controlados.
Palavras-chave: EST-SSR, caracteres morfológicos, correlação, Gerbera spp.
Abstract
BENEMANN, Daiane de Pinho. Morphological and molecular characterization to support the breeding gerbera. 2012. 94p. PhD’s Thesis- Graduate Program of Biotechnology. Federal University of Pelotas, Pelotas, Brazil.
Gerbera is one of the most important plants in the global ornamental market. Due to fierce competition in this market, obtaining different genotypes is necessary.
Therefore, information on the genetic variability of this species may help breeding programs in order to select new promising genotypes. This study aimed to develop EST-SSR markers for gerbera, and to check the genetic variability among accessions by multivariate analysis using morphological (qualitative and quantitative), and molecular markers. Also to analyze the correlation between morphological and molecular markers to elucidate the genetic variability of Gerbera spp.. As a result, 17 EST-SSR markers were developed for use in studies of molecular characterization.
These were highly polymorphic and allowed the differentiate of all gerbera accessions. The analysis of morphological (quantitative and qualitative) characters, by means of multivariate analysis and principal components enabled the delection of a wide genetic variability among accessions of gerbera. The correlation analysis between morphological characters show that there is some influence on other characters. The analysis of molecular and morphological data, using the sum of the dissimilarity matrices, it was possible to obtain a better grouping of the accessions studied. The results of this study may assist gerbera breeding programs in the selection of parental genotypes for controlled crossings.
Key-Words: EST-SSR, morphological characters, correlation, Gerbera spp.
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO GERAL ... 9
1. ARTIGO - DIVERGÊNCIA GENÉTICA DE GENÓTIPOS DE GÉRBERA COM BASE EM CARACTERES MORFOLÓGICOS ... 13
RESUMO ... 14
INTRODUÇÃO ... 15
RESULTADOS ... 17
MATERIAL E MÉTODOS ... 23
REFERÊNCIAS ... 25
2. ARTIGO - IIENTIFICATION, CHARACTERIZATION AND VALIDATION OF SSR MARKERS FROM THE GERBERA EST DATABASE ... 33
ABSTRACT ... 34
INTRODUCTION ... 35
RESULTS ... 37
DISCUSSION ... 40
MATERIALS AND METHODS ... 44
ACKNOWLEDGEMENTS ... 47
REFERENCES ... 47
3. ARTIGO - ESTUDO COMPARATIVO ENTRE CARACTERES MORFOLÓGICOS E MARCADORES MOLECULARES NA ESTIMATIVA DA DIVERGÊNCIA GENÉTICA ENTRE ACESSOS DE GÉRBERAS ... 63
RESUMO ... 64
INTRODUÇÃO ... 65
MATERIAL E MÉTODOS ... 67
RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 68
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 72
4. CONCLUSÕES GERAIS ... 78
5. BIBLIOGRAFIA ... 79
6. ANEXO ...81
7. APÊNDICE 1...82
8. APÊNDICE 2 ...89
1. Introdução Geral
Atualmente, a floricultura brasileira insere-se num novo contexto econômico, social e cultural do país, reflexo da incorporação de valores ligados à melhoria das condições de vida e de bem-estar da população (Rezende, 2005).
O mercado mundial de flores e plantas ornamentais movimenta em torno de US$44 bilhões anualmente. Em 2010 as exportações brasileiras de flores e plantas ornamentais atingiram um total de US$28,58 milhões e nos primeiros cinco meses de 2011, US$7,60 milhões, sendo que os principais grupos de produtos setoriais exportados pelo Brasil foram o das mudas de plantas ornamentais (69,01%), seguido pelos bulbos, tubérculos, rizomas e similares em repouso vegetativo (12,14%). Os estados brasileiros que mais contribuíram para a exportação de plantas ornamentais no ano de 2010 foram: São Paulo (69,89%), Rio Grande do Sul (26,43%) e Santa Catarina (2,74%). Os principais países importadores foram:
Holanda (28,45%), EUA (26,12%), Itália (26,65%), Bélgica (6,94%), Japão (4,74%), Colômbia (2,39%), além de outros 13 destinos de menor expressividade de compras. Segundo o IBRAFLOR (Instituto Brasileiro de Floricultura), o mercado de plantas ornamentais conta com cerca de 8 mil produtores que geram 194 mil empregos diretos (Junqueira e Peetz, 2011).
Dentre as flores, a gérbera é uma das mais importantes quanto ao seu sucesso no mercado nacional e mundial. É uma planta de ciclo relativamente curto (8 meses), com ampla diversidade de cores e formato das flores. Praticamente todas as cultivares comerciais plantadas no Brasil foram desenvolvidas no exterior para onde os royalties da comercialização destas plantas são remetidos. Essa dependência de tecnologia é um motivo desafiador para o mercado nacional, criando a necessidade de linhas de pesquisa em melhoramento genético para atender essa demanda por novos genótipos, desenvolvidos em nosso país.
Atualmente são conhecidas cerca de 70 espécies de gérberas (Asteraceae), a maioria de origem da Ásia e da Africa do Sul. Dentre elas, Gerbera jamesonii é a mais importante que, juntamente com Gerbera viridifolia, deram origem a grande variedade de híbridos atualmente em comercialização (Bellé, 1998).
O melhoramento de gérbera é baseado na reprodução sexuada, envolvendo a
hibridação controlada e seleção. Os melhoristas em seus programas buscam
melhorar as propriedades estéticas (genótipos ricos em coloração e padrões de
coloração combinados, bem como morfologia da flor), a arquitetura planta (ordem e número de órgãos florais, simetria da flor e estrutura da inflorencência) e características econômicas como produtividade, cronograma e sincronia de florescimento, tempo de florescimento, vida de vaso (duração pós-colheita), resistência a pragas e doenças (Bellé, 1998).
O melhoramento convencional vem produzindo genótipos de elite ricos em coloração e padrões de coloração combinados com boas características produtivas, graças à variação genética existente entre as espécies do gênero Gerbera. No entanto, o método tradicional apresenta como desvantagem o tempo consumido e a laboriosidade necessária para o processo de melhoramento, além da alta heterozigosidade em gérbera. Devido a esse fato, alguns pesquisadores têm utilizado técnicas biotecnológicas e moleculares para realizarem a transferência de genes, a fim de realizar uma rápida introdução de novas características nos genótipos superiores, elite, sem alterar a boa combinação de propriedade e características já existentes (NAGARAJU et al., 1998; ELOMAA; TEERI, 2001). Para estudos utilizando técnicas biotecnológicas, foi realizado doutorado sandwich na Universidade de Helsinki, em Helsinki, Finlândia.
Essas características da espécie tem possibilitado criar um mercado que é extremamente dinâmico e demanda lançamento de novidades constantemente. Para suprir esta necessidade é fundamental o avanço de programas de melhoramento genético sincronizados com as exigências do mercado consumidor (Filliettaz e Andréa, 2007). O melhoramento genético de plantas ornamentais tem como objetivo a obtenção de plantas com novas características com valor comercial e que sejam superiores com as cultivares disponíveis no mercado, ou seja, os novos lançamentos devem ser mais vantajosos por algum motivo em relação as que estão em comercialização.
Sendo assim, o sucesso de um programa de melhoramento depende da variabilidade genética da espécie e do processo de seleção que se exerce sobre esta. Para que a variabilidade seja utilizada é necessário que os acessos sejam caracterizados, documentados e identificados quanto aos caracteres morfofenológicos, moleculares e agronômicos, para que o melhorista possa identificar os genótipos com potencial para uso em seu programa de melhoramento (Borém e Miranda, 2005).
A análise de variabilidade genética baseada na avaliação de características
morfológicas por si só, não é conclusiva, pois a maioria destas tem importância econômica e são fortemente influenciadas pelo ambiente e pelo estágio de desenvolvimento da planta. Apesar disso, os caracteres fenotípicos são usados com sucesso em estudos de variabilidade genética e no desenvolvimento de cultivares (Fufa et al., 2005). Em contraste, os marcadores moleculares baseados em polimorfismos de sequência de DNA não são afetados pelos fatores ambientais e apresentam bons índices de polimorfismo.
A técnica de marcadores moleculares é de grande aplicabilidade em estudos genéticos, pois auxilia na melhor compreensão sobre a organização dos genomas, pode ser utilizada em testes de paternidade, na caracterização da variabilidade genética para a elucidação de relações genética existentes entre genótipos, auxilia no desenvolvimento de metodologias para a manutenção da variabilidade genética existente em bancos de germoplasmas, e possibilita a identificação de genes ou a associação de marcas relacionadas a importantes características de interesse biológico e agronômico (Hayden et al., 2010).
Segundo Gupta et al. (2003), a ênfase na área de marcadores moleculares tem sido no uso de EST-SSR, os quais são obtidos pela utilização de ferramentas de bioinformática, sendo derivados de ESTs (Expressed Sequence Tags) ou genomas completos seqüenciados. Esses marcadores são utilizados para análise de regiões expressas do genoma e oferecem as seguintes vantagens em relação aos outros marcadores genômicos: detectam variação na porção expressa do genoma, assim podem ter uma perfeita associação com genes de interesse; podem ser desenvolvidos sem custo a partir de bases de dados de ESTs e uma vez desenvolvidos podem ser utilizados com sucesso em espécies relacionadas. Dessa maneira, Bonow (2004) destaca que os EST-SSR permitem a caracterização de genótipos com a finalidade de identificação de cultivares, a determinação da pureza genética em lotes de sementes, além de medir a diversidade genética para utilização em programas de melhoramento.
Neste contexto, as informações dos caracteres morfofenológicos e molecular
podem ser analizadas em conjunto pela aplicação de técnicas de análise
multivariada que consiste numa ferramenta alternativa para agrupar e/ou descrever
um grupo de indivíduos, uma vez que elas consideram, simultaneamente, todo o
conjunto de descritores avaliados. Essa estratégia é importante por considerar o
conjunto dos genótipos em relação a um complexo de variáveis de interesse para o
melhorista, possibilitando a seleção de genótipos sob vários aspectos, principalmente os de natureza agronômica (Castineiras, 1990). Técnicas, como regressão (Beale et al., 1967), análise discriminante (Mardia et al., 1979), componentes principais e variáveis canônicas (Cruz et al., 2004), são sugeridas para seleção ou descarte de variáveis, em auxílio ao melhoramento genético de plantas.
Considerando a importância que Gerbera spp. tem no mercado mundial de
flores e da necessidade de se conhecer a variabilidade para uso no desenvolvimento
de novos genótipos promissores, o presente trabalho teve como objetivo realizar a
caracterização morfológica e molecular de acessos de gérbera, bem como a análise
dessas características em conjunto, com a finalidade de auxilar em programas de
melhoramento genético do gênero.
1. Artigo - Divergência genética de genótipos de gérbera com base em caracteres morfológicos
(Será submetido a Revista Acta Physiologiae Plantarum)
Divergência genética entre genótipos de gérbera com base em caracteres morfológicos
Daiane de Pinho Benemann
1, Luis Willian Pacheco Arge
1, Willian Silva Barros
2, Valmor João Bianchi
1, José Antonio Peters
11
Laboratório de Cultura de Tecidos de Plantas. Instituto de Biologia, Departamento de Botânica, Universidade Federal de Pelotas, Pelotas, RS, Brasil. Campus UFPEL S/N. Capão do Leão, CEP: 96010-900, daiane_bio@yahoo.com.br;
2
Instituto de Física e Matemática, Departamento de Matemática e Estatística, Universidade Federal de Pelotas, Pelotas, RS, Brasil. Campus UFPEL S/N. Capão do Leão, CEP: 96010- 900, wsbarrros@hotmail.com
Resumo
A gérbera é uma das plantas importantes no mercado mundial de ornamentais. Informações sobre a variabilidade genética desta espécie podem auxiliar programas de melhoramento, visando a seleção de genótipos promissores. Este trabalho foi conduzido com o objetivo de avaliar e caracterizar a dissimilaridade genética de 32 acessos de gérbera baseado em caracteres morfológicos, utilizando a técnica de análise multivariada. Vinte e um caracteres foram analisados, sendo 9 quantitativos e 12 qualitativos, utilizando-se métodos de análise de agrupamento e componentes principais. Os caracteres quantitativos e qualitativos foram analisados separadamente, entretanto, a utilização conjunta destes caracteres permitiu uma interpretação mais confiável da variabilidade genética, possibilitando identificar ampla dissimilaridade entre acessos estudados. Com relação aos caracteres quantitativos, houve a formação de 4 grupos principais, ocorrendo uma concordância parcial com a análise da variáveis canônicas, enquanto a análise dos caracteres qualitativos revelou a formação de 5 grupos. A largura total das flores liguladas do raio interno e número de folhas foram os caracteres que mais contribuíram para a variabilidade em gérbera. Os dados obtidos no presente trabalho poderão ser diretamente utilizados para o melhor direcionamento de
cruzamentos controlados entre acessos de gérbera visando melhor explorar o efeito híbrido no processo de melhoramento genético da espécie.
Palavras chave: dissimilaridade, descritores morfológicos, Gerbera spp.
Introdução
A gérbera (Gerbera spp.) pertence à família Asteraceae e é originária do Sul da África e Ásia, sendo uma planta herbácea, vivaz, de aproximadamente 45 cm de altura. As folhas estão dispostas em roseta, são alargadas, podendo chegar a 40 cm de comprimento. Quando jovens são inteiras e em estádio adulto são ligeiramente fendidas ou partidas nas bordas, porém existem variações no tamanho e na coloração da lâmina foliar dependendo da cultivar. A partir da axila de algumas folhas evoluem os botões florais, que se desenvolvem sobre grandes escapos, com uma inflorescência terminal denominada capítulo. A haste floral é levemente pilosa com comprimento e diâmetro variado de acordo com a cultivar, idade da planta e condições de cultivo. Algumas cultivares com hastes longas podem alcançar cerca de 60 cm de altura e são próprias para o emprego como flor de corte, e outras mais compactas são utilizadas no cultivo em vaso (Infoagro, 2005).
A propagação pode ser sexuada (por sementes), ou assexuada (vegetativa), através de estolões originários da planta adulta e por micropropagação. A propagação vegetativa é uma das formas que possibilita manter as características das plantas de interesse, especialmente quando se trata de plantas híbridas (Souza et al., 2005).
Em se tratando de plantas ornamentais, o mercado brasileiro e mundial encontra-se em constante expansão. Levando em consideração apenas os primeiros 5 meses de 2011, as exportações brasileiras de espécies ornamentais atingiram US$ 7,60 milhões enquanto que as importações alcançaram cerca de US$ 15 milhões. Os principais grupos de produtos setoriais exportados pelo Brasil foram o das mudas de plantas ornamentais (69,01%), seguido pelo dos bulbos, tubérculos, rizomas e similares que apresentam repouso vegetativo (12,14%)
(Junqueira e Peetz, 2011).
Este mercado é extremamente dinâmico e demanda lançamento de novidades
constantemente. Para suprir esta necessidade é fundamental o avanço de programas de
melhoramento genético sincronizados com as exigências do mercado consumidor (Filliettaz e Andréa, 2007). O melhoramento genético de plantas ornamentais tem como objetivo a
obtenção de plantas com novas características com valor comercial e que sejam mais
competitivas com as cultivares disponíveis no mercado, ou seja, os novos lançamentos devem ser mais vantajosos por algum motivo em relação as que estão em comercialização.
Sendo assim, o sucesso de um programa de melhoramento depende da variabilidade genética da espécie e do processo de seleção que se exerce sobre esta. Para que a diversidade genética seja utilizada é necessário que os acessos sejam caracterizados, documentados e identificados quanto aos caracteres morfofenológicos, moleculares e agronômicos, para que o melhorista possa identificar os genótipos com potencial para uso em seu programa de
melhoramento (Borém e Miranda, 2005).
Neste contexto, a utilização das técnicas de análise multivariada apresenta-se como uma ferramenta alternativa para agrupar e/ou descrever um grupo de indivíduos, uma vez que elas consideram, simultaneamente, todo o conjunto de descritores avaliados. Essa estratégia é importante por considerar o conjunto dos genótipos em relação a um complexo de variáveis de interesse para o melhorista, possibilitando a seleção de genótipos sob vários aspectos, principalmente os de natureza agronômica (Castineiras, 1990). Técnicas, como regressão (Beale et al., 1967), análise discriminante (Mardia et al., 1979), componentes principais e variáveis canônicas (Cruz et al., 2004), são sugeridas para seleção ou descarte de variáveis, em auxílio ao melhoramento genético de plantas.
Como a caracterização morfológica é uma das primeiras etapas que envolvem a
identificação de acessos, o presente trabalho teve por objetivo caracterizar a variabilidade
genética dos acessos de gérbera, estimando a divergência genética e agrupando os acessos por
meio de análise multivariada de caracteres morfológicos quantitativos e qualitativos.
Resultados
Com o propósito de verificar a diversidade morfológica baseado nos descritores quantitativos foram analisadas médias, valores máximos e mínimos, desvio padrão e
coeficiente de variação (CV) de 9 caracteres morfológicos de 32 acessos de gérbera. Os dados foram coletados no mesmo período e em plantas cultivadas nas mesmas condições
ambientais, sendo que desta forma, pode-se inferir que os acessos constituem genótipos distintos, uma vez que foi detectado variabilidade morfológica entre os mesmos.
O maior coeficiente de variação foi observado para o número de capítulos (49%) e de folhas (47%) e o menor valor para o diâmetro do capítulo (12%) (Tabela 2). Segundo Rocha et al. (2006), o coeficiente de variação genética sugere a existência de variabilidade dos acessos avaliados e quanto maior for esse valor, maior será a herdabilidade,
consequentemente, maior é a facilidade de encontrar indivíduos superiores que irão
proporcionar ganhos genéticos durante o processo de seleção. Tal afirmativa foi confirmada por Ram et al. (2005), os quais obtiveram um alto valor de coeficiente de variação genotípica e altos valores de herdabilidade para altura de plantas, diâmetro de caule e número de
cápsulas por planta na espécie Silybum marianum G.
Com relação aos caracteres quantitativos, a distância média de Mahalanobis entre os
acessos (D2= 103) foi utilizada como critério para a formação dos grupos. No dendrograma
(Fig 1) houve a formação de quatro grupos principais, o primeiro formado pela maioria dos
acessos, incluindo: Igor (1, 5 e 17), Golden G. (4, 9, 10, 14, 20, 24 e 26) Cariba (16 e 22),
Terra Fame (2, 13, 18, 13, 25, 27 e 29), G32 (32), Pacific (45), Monique (34), Kozak (6) e
Mystique (19); o segundo formado pelos acessos de Orça (40 e 42); o terceiro pelos acessos
de Deranagem (12 e 15) e Pink Elegance (8) e, por último, o quarto grupo formado pelos
acessos de Tipo Selvagem (7 e 21). Os acessos parecidos, embora tenham tido uma certa
distância genética são clones de uma dada cultivar que representam indivíduos de uma
linhagem, oriundos de propagação vegetativa. O fato de não serem idênticos, pode estar relacionado a alguma mutacão após diversas propagações vegetativas.
Os caracteres morfológicos quantitativos com maior contribuição relativa foram: largura total do conjunto das flores liguladas do raio interno, número de folhas, diâmetro da haste, comprimento da folha, largura da flor ligulada do raio externo, comprimento da haste, número e diâmetro de capítulos (Fig 2). Os quatro primeiros caracteres citados acima, juntos, foram responsáveis por 69,22% da variabilidade presente no conjunto. Em trabalho conduzido com gérbera, Cardoso et al. (2007) também verificaram que a largura total das flores liguladas do raio interno foi um dos caracteres mais relevantes para a sua variabilidade.
Os acessos mais divergentes foram Tipo Selvagem (clone 21) e Pink Elegance (clone 8), apresentando uma distância média de 658, e os mais similares foram acessos 23 e 18, ambos Terra Fame, com uma distância de 1,04. A ampla divergência genética entre Pink Elegance e Tipo Selvagem também foi identificado por Cardoso et al. (2007), em estudos da divergência genética de 13 genótipos desta espécie.
Com relação a média da largura do conjunto de flores liguladas do raio interno, a maior divergência ocorreu entre o acesso 8 (53,17 mm) e o acesso 21 (15,07 mm). Para a média do número de folhas, o acesso Pink Elegance (8) apresentou 8 folhas e o Tipo Selvagem
apresentou 46 folhas. Para o caractere comprimento de folha, o acesso Pink Elegance apresentou uma média de 15,75 cm e o Tipo Selvagem 11 cm.
O caractere diâmetro da haste variou de 3,04 mm a 5,55 mm para Tipo Selvagem e Pink
Elegance, respectivamente. Segundo Hermans et al. (2006), o diâmetro da haste tem grande
importância para aumentar a resistência da flor ao tombamento no campo, causado por
ventos, durante o transporte do campo para o local de tratamento e seleção, à embalagem e à
durabilidade pós-colheita, visto que são mais rígidas. Além do aspecto de resistência ao
tombamento, em geral, nas flores de corte a reserva de carbono contida na haste é utilizada
para estender a longevidade potencial das flores, ou seja, quanto maior o comprimento e o diâmetro da haste, maior será a durabilidade pós-colheita.
Pela análise de correlação cofenética (r = 0,84) foi possível verificar a consistência da análise de agrupamento em relação a matriz de dissimilaridade. Embora o comprimento da haste não tenha contribuído de maneira significativa para a variabilidade, este caracter é muito importante para selecionar genótipos para uso como planta de corte.
Além dos dados de agrupamento, realizou-se análise complementar baseado em variáveis canônicas (VC), onde os caracteres com maior porcentagem de variância foram empregados para verificar a dispersão dos genótipos em coordenadas cartesianas, visando simplificar a visualização e interpretação dos resultados, conforme recomendado por Cruz e Carneiro (2006).
Na análise das variáveis canônicas (VC), verificou-se que cerca de 74,46% explicaram a variância total, sendo o VC1 responsável por 44,93%, o VC2 por 18,83% e o VC3 por
10,70%, adequando-se, nesse caso, a uma representação gráfica tridimensional (Fig 3). Houve uma concordância parcial entre a análise de agrupamento pelo UPGMA e as variáveis
canônica, quando é observada a distribuição dos genótipos em cada grupo, uma vez que alguns acessos foram agrupados juntos, independente do algoritmo utilizado, ocorrendo a formação de 4 grupos.
Os acessos 7 e 21 (Tipo Selvagem), agruparam-se próximos (Fig 3) e se mantiveram
distantes do restante, corroborando com os resultados do dendrograma (Fig 1). Resultado
similar foi verificado entre os acessos 8 (Pink Elegance), 12 e 15 (ambos Deranagem), que
também se agruparam próximos, nos 2 métodos de agrupamento. Os acessos 40 e 42 (ambos
Orça) ficaram agrupados próximos, de forma semelhante ao verificado no dendrograma,
porém os acessos 13 (Terra fame) e 6 (Kozak) que se mostraram distantes no dendrograma,
ficaram próximos de acordo com a análise das variáveis canônicas. O restante dos acessos,
pertencentes ao grupo um do dendrograma, formaram um único grupo de forma similar ao da análise das variáveis canônicas.
A variabilidade genética em gérbera registrada nesse trabalho também foi encontrada por Cardoso et al. (2007) ao estudar a divergência em 7 acessos, utilizando descritores qualitativos e quantitativos, alguns desses também utilizados neste trabalho.
Para complementação da análise da variabilidade de caracteres quantitativos, foi realizada a análise de dissimilaridade por meio de descritores qualitativos. Estes descritores são extremamente importantes para a identificação dos acessos com maior potencial
ornamental, assim como para utilizar em cruzamentos para a obtenção de cultivares de gérbera (Neitzke et al., 2010).
A análise dos dados qualitativos permitiu elaborar um dendrograma utilizando o algorítmo UPGMA (Fig 4), revelando a formação de cinco grupos com base na
dissimilaridade média entre os acessos estudados (DM= 0,28). O primeiro grupo foi o que
reuniu o maior número de acessos, entre eles: Orça, G32, Pacific, Igor, Cariba, Pink Elegance,
Terra Fame e Monique. Esses foram monomórficos para os caracteres pilosidade na face
superior da folha (presente); profundidade das incisões da porção mediana da lamina da folha
(pouco profunda) e nível do ápice das flores liguladas do raio externo em relação ao ápice do
invólucro (no mesmo nível), com excessão de Monique. No segundo grupo, estão todos os
acessos Golden G., monomórficos para quase todos caracteres, com excessão da profundidade
das incisões da porção mediana da lâmina da folha e pilosidade na face superior da folha. O
terceiro grupo foi formado pelos acessos Deranagem e Kozak, monomórficos para quase
todos os caracteres, com excessão da cor do disco escuro, cor principal do estigma, cor
principal das anteras e cor da flor. O quarto grupo foi formado pelos acessos Tipo Selvagem,
os quais não são acessos comercializados e são monomórficos para os caracteres intensidade
da cor verde da folha, nível do ápice das flores liguladas do raio externo com relação ao ápice
do invólucro e cor da flor. O quinto grupo, acesso Mystique, ficou isolado dos demais, sendo o único que apresentou duas cores nas flores liguladas do raio externo.
Foi obtido um coeficiente de correlação (r=0,81) muito próximo ao obtido com os dados quantitativos (r=0,84), revelando bom ajuste e consistência entre a análise de agrupamento e a matriz de dissimilaridade.
Os acessos mais próximos entre si foram: 2 (Terra Fame) e 12 (Deranagem); 2 e 29 (ambos Terra Fame); 4 e 9 (ambos Golden G.); 5 e 17 (ambos Igor); 12 e 15 (ambos Deranagem); 16 e 22 (ambos Cariba);18 e 29 (ambos Terra Fame); 20 e 24 (ambos Golden G.); 20 e 26 (ambos Golden G.) e, 24 e 26 (ambos Golden G.), com uma distância de 0,0. O acesso mais distante de todos foi Mystique, com uma distância de 0,5. Este se diferenciou do restante dos acessos por não apresentar pilosidade na face superior da folha.
Com base nos resultados obtidos, verifica-se a importância de se analisar tanto caracteres quantitativos quanto qualitativos, pois ambos tornam mais confiável a inferência sobre a variabilidade existente entre acessos.
A importância dos estudos de divergência genética para o melhoramento vegetal se deve ao fato de que a superioridade dos híbridos é proporcional à distância genética entre os seus respectivos genitores. Deste modo, nas espécies onde esta relação é verificada, os melhoristas podem contar com um critério rápido e fácil na escolha dos genitores para os programas de hibridação, conforme sugerido por Moreira et al. (1994). Infelizmente não há muitos trabalhos sobre divergência genética em gérbera, visto que a maioria dos genótipos melhorados vêm sendo tradicionalmente obtidos por empresas privadas (Sparjaaij, 1976).
Uma aplicação prática e rápida do tipo de análise realizada no presente estudo é auxiliar a tomada de decisão para a realização de cruzamentos entre os genótipos mais divergentes, uma vez que é esperado o maior efeito heterótico entre populações geneticamente mais
contrastantes (Falconer e Mackay, 1996).
Assim como neste trabalho, inúmeros outros, com diferentes espécies, têm comprovado que a análise da divergência genética através de procedimentos multivariados, como a
distância generalizada de Mahalanobis e a dispersão gráfica das variáveis canônicas concordantes entre si, é eficiente na discriminação de genótipos. Ao avaliar a divergência genética entre acessos de pimentas (Capsicum spp.), Sudré et al. (2006) confirmaram a eficiência das análises multivariadas na caracterização da variabilidade genética entre os diferentes acessos. Bertini et al. (2010), estudando a divergência genética entre genótipos de coentro (Coriandrum sativum L.), também obtiveram sucesso ao utilizar variáveis
multicategóricas na discriminação de genótipos. A aplicabilidade deste modelo de análise também foi comprovado por Ferrão et al. (2011), ao quantificarem a divergência genética entre acessos de pimenta, e por Amorin et al. (2007) ao estudar a divergência genética em genótipos de girassol.
Estas evidências experimentais comprovam que as análises multivariadas são eficientes para a discriminação genética de indivíduos, permitindo agrupá-los de tal forma que exista homogeneidade dentro do grupo e heterogeneidade entre grupos. Entretanto, a avaliação de características morfofenológicas demanda muito tempo e pode ser influenciada pelo ambiente.
Sendo assim, uma outra estratégia para auxiliar no estudo da varibalidade genética é a utilização de marcadores moleculares. Em gérbera, ainda são limitadas os estudos de variabilidade com uso marcadores moleculares, porém foram realizados trabalhos por Da Mata et al. (2009) e Rezende et al. (2009), os quais utilizaram marcadores RAPD. Além disso, Benemman et al. (2012) identificou 17 marcadores SSR polimórficos, a apartir de bancos de EST de gérbera, possibilitando a correlação com os caracteres morfológicos presentes nesse trabalho. Estudos com diversas espécies, entre elas ameixeira (Shimada et al., 1999),
amendoeira (Kadkhodaei et al., 2011), castanheira (Serdar et al., 2011) e oliveira (Zaher et al.,
2011), relatam a correlação entre dados moleculares e características morfológicas e agronômicas.
Diante dos resultados obtidos, foi possível concluir que existe ampla dissimilaridade genética para caracteres quantitativos e qualitativos entre os 32 acessos de gérbera avaliados;
as técnicas multivariadas utilizadas foram parcialmente concordantes entre si na
demonstração da variabilidade genética; os caracteres largura total das flores liguladas do raio interno e número de folhas foram os que mais contribuíram para a variabilidade; e que a variabilidade genética revelada nos 32 genótipos de gérbera pode ser explorada para conduzir cruzamentos controlados em programas de melhoramento genético com o objetivo de
desenvolver novas cultivares de gérbera.
Material e métodos
Para a realização deste trabalho, foram utilizados 32 acessos de gérberas (Tabela 1), provenientes do banco de germoplasma da empresa Pró-Clone-SP, Brasil (Apêndice 2). O material vegetal foi cultivado em vasos de plástico de 5L, mantidos em casa de vegetação semi-fechada na propriedade do agricultor João Carlos de Pinho, sitiada na cidade de Pelotas, RS, Brasil.
O delineamento experimental empregado foi inteiramente ao acaso, com 32 tratamentos (acessos) e duas repetições de cada acesso. As avaliações iniciaram por ocasião do
florescimento assim que atingiram o estádio comercial, ou seja, quando as duas fileiras de flores do disco estavam abertas.
A avaliação dos acessos foi feita mediante a caracterização morfológica, sendo 9
caracteres quantitativos e 12 qualitativos. Quanto aos caracteres quantitativos, as medidas
foram mensuradas de acordo com descritores oficiais de gérbera do MAPA (2005), (ver
anexo) conforme segue: 1- comprimento da folha; 2- largura do conjunto de flores liguladas
do raio interno; 3- comprimento da flor ligulada do raio externo; 4- largura da flor ligulada do raio externo; 5- número de folhas; 6- comprimento da haste; 7- diâmetro da haste; 8- diâmetro do capítulo; e 9- número de capítulos por acesso avaliado.
Para os caracteres qualitativos foram atribuídos códigos sequenciais numéricos de acordo com os descritores oficiais para gérbera (MAPA, 2005), modificado conforme segue:
1- profundidade das incisões da porção mediana da folha: pouco profunda (3), média (5), profunda (7); 2- pilosidade na fase superior da folha: presente (1) e ausente (2); 3-
intensidade da cor verde na fase superior da folha: claro (1) e escuro (2); 4- nível do ápice das flores liguladas do raio externo em relação ao ápice do invólucro: abaixo (1), no mesmo nível (2) e acima (3); 5- forma da flor ligulada do raio externo: estreito elíptica (1) e estreito
ovalada (2); 6- forma do ápice da flor ligulada do raio externo: agudo (1) e arredondado (2);
7- número de cores da flor ligulada do raio externo: uma (1) e duas (2); 8- disco escuro:
ausente (1) e presente (2); 9- cor principal do estigma: branco (1), amarelo (2), alaranjado (3), rosa (4), vermelho (5), roxo (6) e marrom (7); 10- cor principal das anteras: amarelo (1), alaranjado (2), rosa (3), vermelho (4), roxo (5) e marrom (6); 11- cor da flor: amarelo (1), branco (2), vermelho (3), laranja (4) e rosa (5); 12- tipo de capítulo: simples (1), semi- dobrado (2) e dobrado (3).
A análise estatística foi realizada separadamente para as características quantitativas e qualitativas. O primeiro requisito necessário para uma característica ser útil na diferenciação de cultivares é esta apresentar-se diferentemente entre os acessos. Com esse intuito, para características quantitativas, realizou-se a análise descritiva. Posteriormente, procedeu-se a análise multivariada, utilizando a distância de Mahalanobis (D2) (Hair, 2005) e o
agrupamento realizado pelo método Unweighted Pair-Group Methods Method Using an
Arithmetic Average (UPGMA) ( Sneath e Sokal, 1973), a fim de avaliar o potencial das
características na discriminação genotípica quando consideradas em conjunto. O agrupamento
também foi analisado por meio das variáveis canônicas e estimou-se a importância relativa dos caracteres pelo método de Singh (1981).
Para o agrupamento baseado nas características qualitativas, os valores registrados foram transformados em dados binários e aplicou-se o coeficiente de Simple Matching para análise do conjunto de dados. A matriz de dissimilaridade foi calculada para posterior
classificação pelo método hierárquico e formação de um dendrograma, utilizando o algoritmo UPGMA, conforme recomendado por Rohlf (1970).
Para testar a eficiência de cada método de agrupamento, foi calculado o coeficiente de correlação cofenética (CCC), pois quanto maior este valor, maior é a eficiência do método em questão. Todas as análises foram efetuadas com o programa Genes v 7.0 (Cruz, 2006).
Contribuição dos autores
Daiane de Pinho Benemann conduziu o experimento, fez as análises moleculares e
morfológicas, busca de literatura e redação; Luis Willian Pacheco Arge auxiliou na condução do experimento e nas análises; Willian Silva Barros auxiliou nas análises estatísticas e
interpretação dos resultados; Valmor João Bianchi auxiliou na interpretação das análises morfológicas, moleculares e correções da redação e José Antonio Peters auxiliou no estudo realizado, na busca de literatura e correção da redação.
Agradecimentos
A CAPES que financiou a bolsa do primeiro autor e a Dra. Monique Segeren que
disponibilizou os acessos de gérbera provenientes do banco de germoplasma da empresa PróClone, SP, Brasil (PIPE-FAPESP n 04/02908-0).
Referências
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Tabela 1. Tipo de inflorescência e cor do capítulo de 32 genótipos de gérbera utilizados para análise morfológica.
*Genótipo idênticos como clones de uma dada cultivar, representam indivíduos de uma linhagem, oriundos de propagação vegetativa daquele genótipo de referência.
Nome Genótipo Código da planta* Tipo de inflorescência Cor
Igor C1 Semi-dobrada Rosa
Terra Fame C2 Simples Amarelo
Golden G. C4 Semi-dobrada Amarelo
Igor C5 Semi-dobrada Rosa
Kozak C6 Semi-dobrada Laranja escuro
Selvagem C7 Simples Vermelho
Pink Elegance C8 Dobrada Rosa
Golden G. C9 Semi- dobrada Amarelo
Golden G. C10 Semi- dobrada Amarelo
Deranagem C12 Semi- dobrada Rosa
Terra Fame C13 Simples Amarelo
Golden G. C14 Semi-dobrada Amarelo
Deranagem C15 Semi-dobrada Rosa
Cariba C16 Semi-dobrada Vermelho
Igor C17 Semi-dobrada Rosa
Terra fame C18 Simples Amarelo
Mystique C19 Simples Laranja
Golden G. C20 Semi-dobrada Amarelo
Selvagem C21 Simples Laranja
Cariba C22 Semi-dobrada Vermelho
Terra Fame C23 Simples Amarelo
Golden G. C24 Semi dobrada Amarelo
Terra Fame C25 Smples Amarelo
Golden G. C26 Semi-dobrada Amarelo
Terra Fame C27 Simples Amarelo
Terra Fame C29 Simples Amarelo
Terra Fame C31 Simples Amarelo
G32 C32 Simples Amarelo
Monique C34 Semi-dobrada Vermelho
Orça C40 Simples Branco
Orça C42 Simples Branco
Pacific C45 Simples Branco
Tabela 2. Análise descritiva para 9 descritores quantitativos de gérbera.
Med- Média; Max- Máxima; Min- Mínimo; DP- Desvio Padrão; cv- Coeficiente de variação.
Caracteres Med Max Min DP cv (%)
Comprimento da folha (cm) 17,64 27,00 9,00 3,48 20,00
Largura do conjunto das flores liguladas do raio interno
(cm) 30,11 54,39 14,70 8,41 28,00
Comprimento da flor ligulada do raio externo (mm) 42,13 69,27 31,40 6,45 15,00 Largura da flor ligulada do raio externo (mm) 8,98 12,16 3,27 1,90 21,00
Número de folhas 19,48 61,00 6,00 9,09 47,00
Comp. haste (cm) 34,90 57,00 11,27 8,49 24,00
Diâmetro haste (mm) 5,61 10,90 2,27 1,19 21,00
Diâmetro capitulo (cm) 9,60 13,16 7,00 1,15 12,00
Número de capitulos 1,77 5,00 1,00 0,86 49,00
Figura 1. Dendrograma de agrupamento dos 32 acessos de gérbera, gerado pelo método UPGMA, com base na análise de caracteres quantitativos, utilizando a distância de Mahalanobis. DM= Dissimilaridade média.
DM
Figura 2. Contribuição relativa (%) das características quantitativas avaliadas em gérbera.
Figura 3. Gráfico de dispersão dos 32 genótipos de gérbera, utilizando as três primeiras variáveis
canônicas.
Figura 4. Dendrograma gerado pelo método UPGMA, a partir da dissimilaridade genética de caracteres qualitativos dos 32 genótipos de gérbera. DM=
Dissimilaridade média.
DM
2. Artigo - Identification, characterization and validation of SSR markers from the gerbera EST database
(Publicado na revista Plant Omics Journal)
Identification, characterization and validation of SSR markers from the gerbera EST database
Daiane de Pinho Benemann
1– Luciana Nogueira Machado
1– Luis Willian Pacheco Arge
1– Valmor João Bianchi
1–Antonio Costa de Oliveira
2– Luciano Carlos da Maia
2– José Antonio Peters
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Laboratory of Tissue Culture Plants. Institute of Biology, Department of Botany, Federal University of Pelotas, Pelotas, RS, Brazil. Campus UFPel S/N. Capão do Leão, CEP: 96010- 900 daiane_bio@yahoo.com.br
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