Instituto de Ciências Exatas e Biológicas Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas
Participação do óxido nítrico na infecção experimental
de cães pelo Trypanosoma cruzi
Participação do óxido nítrico na infecção experimental
de cães pelo Trypanosoma cruzi
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas do Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas da Universidade Federal de Ouro Preto, como parte integrante dos requisitos para obtenção do Título de Mestre em Ciências Biológicas, área de concentração Imunobiologia de Protozoários.
Orientadora: Profa Cláudia Martins Carneiro
VIEIRA,P.M.A Agradecimentos
À Professora Cláudia Martins Carneiro o meu agradecimento pela confiança depositada
em mim, pela orientação, pelas conversas, pelo exemplo de ética e profissionalismo.
Serei sempre uma eterna admiradora.
À “Mandinha” por ter compartilhado não só as aflições, mas as pequenas alegrias do
dia-a-dia, pela extraordinária amizade que em tão pouco tempo se tornou essencial para
mim. Obrigada por todo o apoio e compreensão minha amiga!
À Jú e Nadinha pela valiosa amizade e constante carinho. Obrigada pelo inestimável
apoio e por compartilhar momentos de efêmeras tristezas e grandes alegrias, com muitas
gargalhadas.
Ao Professor Alexandre Barbosa Reis pela colaboração, pelas criticas e sugestões tão
importantes, e acima de tudo porsua paciência em me ouvir.
À todos os amigos do Laboratório de Imunopatologia: Ana, Carol, Kátia, Raquel,
Bruno, Rodrigo, Henrique, Samuel, Sheler, Wendel e Rafael pela ótima convivência e
colaboração em todos os momentos.
Ao Professor Luiz Cosme Cotta Malaquias não só pela colaboração nesta dissertação,
mas pela orientação na iniciação científica, despertando em mim o desejo de ser
cientista.
Ao Rodolfo Giunchetti pela ajuda com as análises estatísticas e por ser sempre
VIEIRA,P.M.A Agradecimentos
À Maria Chaves pelos ensinamentos das técnicas histológicas e pela amizade.
À Cida pela prestatividade e disposição em resolver nossos problemas.
Aos meus pais e as minhas irmãs, Júlia e Eduarda, por permitirem que eu fizesse minhas
escolhas estando sempre presentes. Sigo firme meu caminho por que sei que quando
VIEIRA,P.M.A Sumário
1. Introdução... 1
1.1- Óxido nítrico... 2
1.2- Síntese de Óxido Nítrico ... 3
1.3- iNOS... 5
1.4 - NO produzido pela iNOS ... 6
1.5- Trypanosoma cruzi e a doença de Chagas ... 7
1.6- NO e o Trypanosoma cruzi... 11
1.7 - Participação do Baço e Linfonodo na infecção pelo T. cruzi... 13
1.8 – Modelo Canino na infecção pelo T. cruzi... 15
2. Objetivos... 16
2.1- Objetivo geral ... 17
2.2- Objetivos específicos ... 17
3. Material e Métodos ... 18
3.1 - Atividades previamente realizadas ... 20
3.1.1 - Animais... 20
3.1.2 - Infecção dos cães... 20
3.1.3 - Curva de parasitemia ... 21
3.1.4 - Coleta de soro ... 21
3.1.5 - Resposta imune celular ex vivo... 21
3.1.6 - Necrópsia, coleta, fixação e processamento do material para microscopia óptica ... 22
3.2 - Atividades realizadas neste estudo... 22
3.2.1 - Dosagem sérica do NO... 22
3.2.2 - Colorações empregadas ... 23
3.2.3 - Avaliação histopatológica do Baço e Linfonodo cervical... 24
3.2.4 Quantificação da inflamação na área cardíaca... 25
3.2.5 - Imuno-histoquímica para detecção do T. cruzi... 26
3.2.6 - Imuno-histoquímica para a detecção da expressão de iNOS... 27
3.2.7 Análise quantitativa da expressão de iNOS ... 29
3.2.8 - Análise Estatística ... 29
4. Resultados... 31
4.1 – Níveis Séricos de Óxido Nítrico ... 32
4.2 – Comparação entre os Níveis Séricos de Óxido Nítrico com as Curvas de Parasitemia ... 34
4.3 - Correlação entre os Níveis Séricos de Óxido Nítrico e o Fenótipo das Células do Sangue Periférico... 35
4.4 - Análise histopatológica ... 36
4.5 - Expressão de iNOS ... 50
4.6 - Comparação entre a expressão de iNOS e as alterações histopatológicas ... 55
4.7 - Correlação entre a expressão de iNOS e o parasitismo tecidual ... 56
4.8 - Correlação entre a expressão de iNOS tecidual e os níveis séricos de Óxido Nítrico... 56
5. Discussão... 57
6. Perspectivas ... 67
VIEIRA,P.M.A Lista de Figuras
Figura 1: Representação esquemática das reações catalisadas pelas NOS (GROVES e WANG, 2000). ... 3
Figura 2: Delineamento experimental, demonstrando as atividades previamente realizadas e realizadas neste trabalho. ... 19
Figura 3: Fotomicrografias do baço de cães não infectados e infectados com formas
tripomastigotas metacíclicas ou sangüíneas da cepa Be-78 do Trypanosoma cruzi. .... 39
Figura 4: Fotomicrografias do linfonodo cervical de cães não infectados e infectados com formas tripomastigotas metacíclicas ou sangüíneas da cepa Be-78 do
Trypanosoma cruzi. ... 43
Figura 5: Fotomicrografias do ventrículo direito de cães infectados com formas
tripomastigotas metacíclicas ou sangüíneas da cepa Be-78 do Trypanosoma cruzi. ... 46
Figura 6: Análise morfométrica do parasitismo tecidual nas diferentes regiões do
coração em cães infectados com formas tripomastigotas metacíclicas (TM: ) ou sangüíneas (TS: ) da cepa Be- 78 do Trypanosoma cruzi. ... 47
Figura 7: Fotomicrografias do átrio direito e septo interventricular de cães não infectados e infectados com formas tripomastigotas metacíclicas ou sangüíneas da cepa Be-78 do Trypanosoma cruzi. ... 48
Figura 8: Análise morfométrica do infiltrado inflamatório nas diferentes regiões
cardíacas em cães não infectados (Controle: ), infectados com formas tripomastigotas metacíclicas (TM: ) ou sangüíneas (TS: )... 49
Figura 9: Fotomicrografias do baço e linfonodo cervical de cães não infectados (Controle) e infectados com formas tripomastigotas metacíclicas (TM) ou sangüíneas (TS) da cepa Be-78 do Trypanosoma cruzi. ... 52
Figura 10: Fotomicrografias do ventrículo esquerdo baço de cães não infectados (Controle) e infectados com formas tripomastigotas metacíclicas (TM) ou sangüíneas (TS) da cepa Be-78 do Trypanosoma cruzi. ... 53
VIEIRA,P.M.A Lista de Tabelas
Tabela 1:Funções do Óxido Nítrico no Sistema Imunológico ... 7
Tabela 2:Avaliação histopatológica do baço... 24
Tabela 3: Avaliação histopatológica do linfonodo. ... 25
Tabela 4: Avaliação histopatológica do baço de cães não infectados (Controle), infectados com formas tripomastigotas metacílicas (TM) ou sangüíneas (TS) da cepa Be-78 do Trypanosoma cruzi. ↑↑↑↑ : Aumento e ↓↓↓↓ : Diminuição... 38
VIEIRA,P.M.A Lista de Gráficos
Gráfico 1: Cinética da dosagem dos níveis séricos de NO (Nitrato+Nitrito) em cães não infectados (Controle: ), infectados com formas tripomastigotas metacíclicas (TM:
) ou sangüíneas (TS: ) da cepa Be-78 do Trypanosoma cruzi. ... 32
Gráfico 2: Linha de tendência da cinética da dosagem dos níveis séricos de NO (Nitrato+Nitrito) em cães não infectados (Controle: ), infectados com formas
tripomastigotas metacíclicas (TM: ) ou sangüíneas (TS: ) da cepa Be-78 do
Trypanosoma cruzi. ... 33
Gráfico 3: Cinética da dosagem dos níveis séricos de NO (Nitrato+Nitrito) (TM: ;
TS: ) versus parasitemia (TM: ; TS: ) em cães infectados com formas
tripomastigotas metacíclicas (TM) ou sangüíneas (TS) da cepa Be-78 do Trypanosoma
cruzi... 34
Gráfico 4: Correlação positiva entre os níveis séricos de NO e o percentual de células T
CD5+ (A) e a subpopulação T CD4+ (B) em cães infectados com formas tripomastigotas
metacíclicas (TM) da cepa Be-78 do Trypanosoma cruzi. ... 35
VIEIRA,P.M.A Lista de Abreviaturas
AD – Átrio direito AE –Átrio esquerdo Be-78 - Cepa Berenice -78
cNOS - Enzimas óxido nítrico síntase constitutivas DAI - Dias após a infecção
DC - Doença de Chagas
eNOS - Enzima óxido nítrico síntase endotelial IL-10 - Interleucina-10
IL-12 - Interleucina -12 IL-13 - Interleucina-13 IL-4 - Interleucina -4
IFN-γ - Interferon gamma
iNOS - Enzima óxido nítrico síntase induzível
L-NMMA – Ng –monometil – L - arginina
NK - Célula Natural Killer
nNOS - Enzima óxido nítrico síntase neuronal
NO - Óxido Nítrico
NO-2 - Nitrito
NO-3 - Nitrato
PALS - Bainha linfóide periarteriolar PAP – peroxidase anti-peroxidase SMF - Sistema mononuclear fagocitário
TGF-β - Fator de crescimento beta
TM - Grupo de cães infectados com formas tripomastigotas metacíclicas
TNF-α - Fator de necrose tumoral alfa
TS - Grupo de cães infectados com formas tripomastigotas sangüíneas VD – Ventrículo direito
VIEIRA, P.M.A. Resumo
Durante a fase da aguda da infecção pelo Trypanosoma cruzi ocorre uma síntese
sistêmica de citocinas pró-inflamatórias, que ativam componentes da imunidade inata, como as células NK e macrófagos. Uma vez ativadas estas células passam a expressar iNOS e a produzir Óxido Nítrico (NO) que poderá contribuir no controle da parasitemia e do parasitismo tecidual. Este trabalho teve como objetivo avaliar a participação do NO durante a fase aguda da infecção de cães com formas tripomastigotas sangüíneas (grupo TS, n=4) ou metacíclicas (grupo TM, n=4) da cepa
Berenice-78 do T. cruzi em relação ao grupo Controle (n=4). A parasitemia foi
determinada diariamente a partir do 10º dia após a infecção (DAI) até sua negativação. Soro e sangue foram coletados no período que antecedeu a infecção e aos sete, 14, 21,
28 e 35
º
DAI para dosagem sérica de NO e fenotipagem (linfócitos T THY-1+, CD5+,CD4+ e CD8+, linfócitos B CD21+ e monócitos CD14+). Os animais foram
VIEIRA,P.M.A. Abstract
During the acute phase of Trypanosoma cruzi infection happens a systemic synthesis of
pro-inflammatory cytokines that activates some components of the innate immunity, such as NK cells and macrophages. Once activated, these cells start to express iNOS and to produce Nitric Oxide (NO) what may contribute in the parasitemia and tissue parasitism control. This study aimed to evaluate the participation of NO during the acute phase of dogs infected with blood (BT group, n=4) or metacyclic forms (MT group, n=4) of the Berenice-78 T. cruzi strain in relation to the Control group (n=4).
Parasitemia was followed since the 10th day after infection (d.a.i) up to negativation by fresh blood examination collected from the marginal ear vein. Serum and blood was collected before the infection and seven, 14, 21, 28 and 35 d.a.i. to determine the NO
seric level and phenotyping (lymphocytes T THY-1+, CD5+, CD4+ and CD8+,
lymphocytes B CD21+ and monocytes CD14+) respectively. The animals were
euthanized in the end of the acute phase. Spleen, cervical lymphnode and heart (right
and left atria and ventricle, interventricular septum and tip) were collected and
processed routinely for inclusion in paraffin. The animals of the MT group presented increase in the seric levels of NO throughout the infection when compared with the Control and BT groups and a delay in the parasitemia peak when compared with the BT
group. Only in the MT group a positive correlation was observed between the T CD5+
and CD4+ lymphocytes and the seric levels of NO. This suggests that these cells
contribute to the increase of the seric levels of NO found in this group. The same pattern observed in the serum was found in the spleen, where the MT group presented larger area marked for iNOS in relation to the Control and BT groups. However, in the cervical lymphnode the BT group revealed decrease of the area marked for iNOS when compared to the Control and MT groups. This fact can be related to the decrease of the macrophages numbers in the medullar zone of this group. Tissue parasitism was not observed in the spleen and cervical lymphnode. The heart of MT group presented smaller tissue parasitism and larger area marked for iNOS while the animals of the BT group presented higher inflammatory infiltrated, larger tissue parasitism and smaller area marked for iNOS, excepted to left ventricle. The results demonstrated that the source of the inoculum could interfere in the development of the acute phase of the Chagas disease. Apparently MT forms induce in the animals a more effective initial response that limits the parasitemia and the tissue parasitism, what reflects in smaller inflammatory response and tissue damage. On the other hand, BT forms seem not to be able to induce a more elaborated immune response in the beginning of the infection. Consequently animals infected with BT forms don't reach the fast control of the infection what probably contributes to the development of intense histological alterations, especially in the heart. Taken together, these results suggest that NO
presented an important immunoprotection role during acute phase of Be-78 T. cruzi
VIEIRA,P.M.A. Introdução 1.1- Óxido nítrico
O óxido nítrico (NO) é uma espécie reativa de nitrogênio, uma das menores
moléculas sinalizadoras com atividade biológica, sendo relativamente instável,
apresentando propriedades que facilitam sua difusão através das membranas celulares
sem o auxílio de transportadores específicos (MAYER & HEMMENS, 1997). É uma
molécula gasosa simples altamente reativa que desempenha várias funções fisiológicas
importantes como o relaxamento do endotélio, a regulação da pressão sangüínea basal, a
neurotransmissão e a citotoxicidade mediada por macrófagos. É incolor à temperatura
ambiente, pouco solúvel em água (QUEIROZ & BATISTA, 1999) e altamente reativo,
com vida média de 5 a 30 segundos devido a sua rápida oxidação e conseqüente geração
de Nitrito (NO
-2) e Nitrato (NO-3) (MARLETTA et al., 1988; MAYER et al., 1989;
HEVEL et al., 1991; STAMLER et al., 1992).
Até meados da década de 1980, o NO era considerado apenas membro de uma
família de poluentes ambientais indesejáveis e carcinógenos potenciais (DUSSE et al.,
2003). O interesse pelas funções biológicas do NO começou a partir de três linhas de
pesquisas distintas, que culminaram com a determinação do envolvimento desta
molécula em processos biológicos importantes: (1) investigação do papel do NO no
relaxamento do vaso sangüíneo (IGNARRO,1987; KATSUKI et al., 1977); (2)
produção de óxidos de nitrogênio pelos mamíferos (GREEN et al., 1981) e (3)
mecanismo de ação de neurotransmissores (BREDT et al., 1989; KNOWLES et al.,
1989). O desfecho comum dessas três linhas de pesquisas fez com que o NO passasse a
ser um dos mais importantes mediadores dos processos intra e extracelulares.
O NO também tem um importante papel no sistema imunológico. Ele está
envolvido na patogenia e controle de doenças infecciosas, tumores, processos
auto-imunes e doenças degenerativas crônicas (BOGDAN, 2001). Devido a sua variedade de
VIEIRA,P.M.A. Introdução
sua vasta produção (por três diferentes NO sintases - NOS) e o fato de que sua atividade
ser fortemente influenciada pela suas concentrações, o NO continua a surpreender
(BOGDAN, 2001).
1.2- Síntese de Óxido Nítrico
A síntese do NO é intermediada por um grupo de enzimas genericamente chamadas
de óxido nítrico sintases (NOS) a partir do aminoácido L-arginina. Tais sintases
catalisam a oxidação de uma molécula de L-arginina pelo oxigênio molecular obtendo
como produto final L-citrulina e uma molécula de NO (PALMER et al., 1988;
STUEHR et al., 1991; MARLETTA, 1994).
Nesta reação a L-arginina é transformada em um intermediário, a NG
-hidroxi-L-arginina com a presença de nicotinamida-adenina-dinucleotído-fosfato-hidrogênio
(NADPH) e Ca2+ sendo necessário mais NADPH e (O
2) para a formação de L-citrulina
e NO (FILHO et al., 2000).
Figura 1 - Representação esquemática das reações catalisadas pelas NOS (GROVES e WANG, 2000).
A NOS é uma proteína dimérica e o monômero de suas isoformas possui massa
VIEIRA,P.M.A. Introdução
designadas NOS neuronal (nNOS) e NOS endotelial (eNOS) (CERQUEIRA et al,
2002). As NOS diferem quanto ao peso molecular, a forma de ativação e a capacidade
de síntese de NO (MARLETTA, 1994).
A nNOS é expressa no tecido nervoso, tanto em neurônios adultos como nos
neurônios em desenvolvimento e também nos astrócitos. A eNOS é principalmente
expressa no endotélio, mas também pode ser encontrada em neurônios e miócitos
cardíacos (MARSDEN et al., 1993; BREDT & SNYDER, 1994; ABE et al., 1997;
CORK et al., 1998; GUIX et al., 2005).
As duas cNOS são classificadas como cálcio-dependentes, pois necessitam de
Ca2+ para sua ativação, ou seja, é necessária determinada concentração de Ca2+
intracelular para existir a atividade enzimática, caso ocorra queda no nível de Ca2+ as
enzimas tornam-se inativas. Já a iNOS é classificada como cálcio-independente, pois
sua ativação não é regulada pela presença de Ca2+ .
As NOS estão presentes no citosol, e requerem NADPH, tetrahidrobiopterina
(BH4), flavina adenina dinucleotídeo (FAD), flavina mononucleotídeo (FMN) e heme
como co-fatores (CERQUEIRA et al., 2002).
Todas as isoformas de NOS podem ser inibidas por análogos da L-arginina
N-substituídos, como a NG-monometil-L-arginina NMMA), N-imino-etil-L-ornitina
(L-NIO), NG-amino-L-arginina (L-AAA), NG-nitro-L-arginina (L-NA) e o metil éster
correspondente, o NG-nitro-L-arginina-metil-éster (L-NAME). Estes análogos
competem com a L-arginina e agem como inibidores estereoespecíficos da NOS. Além
destes inibidores, a aminoguanidina é também capaz de inibir a NOS e apresenta uma
VIEIRA,P.M.A. Introdução 1.3- iNOS
A iNOS não é expressa sob condições normais, é induzida por citocinas e/ou
endotoxinas em uma variedade de células, incluindo-se macrófagos, linfócitos T, células
endoteliais, células dendríticas, células Natural Killers (NK), miócitos, hepatócitos,
condrócitos, neutrófilos e plaquetas (MONCADA et al., 1991). Esta isoforma requer
algumas horas para ser expressa, mas, uma vez sintetizada, libera quantidades maiores
de NO que as cNOS e a produção deste continua indefinidamente até que a L-arginina
ou os co-fatores necessários para sua síntese sejam depletados ou ocorra morte celular
(DUSTING et al., 1995).
A expressão da iNOS é o resultado de uma resposta inflamatória localizada ou
difusa resultante de uma infecção ou dano tecidual (CERQUEIRA et al., 2002). As altas
concentrações de NO, tóxicas para micróbios, parasitos e células tumorais, podem
também lesar células saudáveis vizinhas, sendo este mecanismo responsável pela
maioria dos processos inflamatórios e auto-imunes (FILHO et al., 2000). Assim, onde a
resposta inflamatória é parte de uma resposta adaptativa (isto é, infecção ou sepse), a
expressão de iNOS é benéfica; quando a expressão da iNOS é parte da inflamação
anormal (não-adaptativa), a expressão de iNOS pode ser nociva, isto é, doença
auto-imune (CERQUEIRA et al., 2002).
A indução da iNOS é regulada positivamente por citocinas pró-inflamatórias
(IFN- e TNF- ) (DINARELLO, 2000) e negativamente por citocinas anti-inflamatórias
como o TGF- (VODOVOTZ, 1997) e a IL-10 (MOORE et al., 2001). Além destas
citocinas, a iNOS também é induzida por complexos imunes, produtos virais e
microbianos (proteínas, lipídeos, polissacarídeos).
Recentemente vários trabalhos têm demonstrado que algumas quimiocinas, como
VIEIRA,P.M.A. Introdução
NO e atividade tripanomicida dependente do NO pelos macrófagos murinos e miócitos
cardíacos (VILLALTA et al., 1998; ALIBERTI et al., 1999).
O fator de transformação de crescimento (TGF- ) inibe a expressão de iNOS
através dos mecanismos de transcrição, pós-transcrição e pós-tradução (VODOVOTZ et
al., 1993). Já a IL-10 inibe a via dependente de arginina que leva a síntese do NO
(OSWALD et al., 1992). Uma variedade de outras moléculas sinalizadoras, incluindo
IL-4 e IL-13, inibe a expressão de iNOS por mecanismos ainda desconhecidos.
1.4 - NO produzido pela iNOS
O NO resultante da ativação da iNOS possui ação citotóxica e citostática,
promovendo a destruição de microorganismos, parasitos e células tumorais (DUSSE et
al., 2003). Dentro dos fagolisossomos, o NO pode se combinar com peróxido ou
superóxido de hidrogênio, gerados pela fagócito-oxidase, para produzir radicais
peroxinitrito altamente reativos que podem eliminar microorganismos (BOGDAN,
2001).
Em processos infecciosos, células ativadas como macrófagos, neutrófilos e
células endoteliais secretam simultaneamente NO e intermediários reativos do oxigênio,
e a ação citotóxica indireta do NO consiste, principalmente, na sua reação com esses
intermediários do oxigênio (DUSSE et al., 2003). Na célula-alvo, o NO combina-se
com grupos metais de enzimas responsáveis pela síntese de DNA e pelo ciclo
respiratório, levando à morte celular (MONCADA & HIGGS, 1993).
O NO é uma molécula efetora bactericida do sistema imune inato podendo inibir
a síntese do DNA da bactéria através da inibição da ribonucleotídio redutase bacteriana
(FANG, 1997). O NO produzido pela iNOS também tem importante função na inibição
VIEIRA,P.M.A. Introdução
sendo as proteases virais o alvo do NO. As principais funções do NO no Sistema Imune
estão apresentadas na Tabela 1.
Tabela 1:Funções do Óxido Nítrico no Sistema Imunológico
Categoria Produtores de NO (exemplos) Efeitos do NO
Atividade antimicrobiana
Macrófagos, micróglia, neutrófilos, eosinófilos, fibroblastos, células endoteliais,
células epiteliais.
Elimina ou reduz a replicação dos agentes infecciosos
(vírus, bactéria, protozoários, fungos,
helmintos)
Atividade anti-tumoral Macrófagos, eosinófilos Elimina ou inibe o crescimento de
células tumorais Dano tecidual
(imunopatologia) astroglia, queratinócitos Macrófagos, micróglia, Necrose ou fibrose do parênquima
Segundo BOGDAN (2001).
A indução da síntese de NO por macrófagos ativados é crucial para o
desenvolvimento da imunidade contra grande número de patógenos. O efeito protetor do
NO aos microrganismos intracelulares tem sido evidenciado em vários modelos
experimentais como na leishmaniose onde, o mesmo foi demonstrado in vitro (GREEN
et al., 1990) e in vivo (LIEW et al., 1990). Em macrófagos murinos o NO produzido
pela iNOS é uma das moléculas mais importantes responsáveis pela morte da
Leishmaniain vitro e in vivo (SISTO et al., 2001).
1.5- Trypanosoma cruzi e a doença de Chagas
O protozoário T. cruzi é o agente etiológico da tripanossomíase americana,
denominada doença de Chagas que representa um problema de saúde pública na
América do Sul e Central, com uma estimativa de 13 milhões de pessoas infectadas, e
VIEIRA,P.M.A. Introdução
econômicas, transfusões sangüíneas e imigrações de pessoas infectadas para outros
continentes, aumentam ainda mais o risco de infecções.
O T. cruzi é um protozoário hemoflagelado pertencente à ordem Kinetoplastida,
família Tripanosomatidae que infecta o homem e uma grande variedade de mamíferos.
Os principais hospedeiros invertebrados, vetores da doença de Chagas, são insetos
hematófagos da subfamília Triatominae, popularmente conhecidos como “barbeiros”.
Este protozoário tem três diferentes estágios morfológicos. No hospedeiro
invertebrado são encontradas as formas epimastigotas e tripomastígotas metacíclicas,
enquanto, no hospedeiro vertebrado as formas tripomastigotas sangüíneas e amastigotas
são as formas infectantes e a de desenvolvimento intracelular, respectivamente. Ao se
alimentar com o sangue de mamíferos infectados pelo parasito, o triatomíneo ingere a
forma tripomastigota sangüínea do parasito. No estômago do inseto, as formas
tripomastigotas se transformam nas formas epimastigotas (não-infectivas) e seguem
para o intestino onde se reproduzem extracelularmente por divisão binária simples. Uma
vez que elas alcançam o reto, as epimastigotas se diferenciam em formas
tripomastigotas metacíclicas que são eliminadas nas fezesdurante o repasto sangüíneo,
penetrando pelo local da picada ou mucosa, infectando as células do sistema
mononuclear fagocitário (SMF). As formas metacíclicas infectam as células hospedeiras
e se transformam em amastigotas intracelulares, dando início a uma série de replicações.
Após vários ciclos de multiplicação as amastigotas se diferenciam em tripomastigotas,
que são liberadas na corrente sangüínea prontas para infectar outras células hospedeiras
e dar início a novas replicações, disseminando a infecção para os diferentes tecidos e
órgãos.
Os mecanismos de transmissão incluem as vias vetoriais, transfusional, congênita,
oral e por acidentes de laboratório (PRATA, 2001). A vetorial representa a principal e
VIEIRA,P.M.A. Introdução
os mais importantes vetores no ciclo doméstico da doença de Chagas (KOLLIEN &
SCHAUB, 2000).
Apesar de o hospedeiro vertebrado desenvolver uma resposta imune celular e
humoral, a infecção crônica é mantida por um número reduzido de formas
tripomastigotas circulantes no sangue periférico, dando origem a um problema de saúde
pública, que é a transmissão do parasito por transfusão sangüínea (SILVA et al., 1993),
transformando-se essa na segunda via mais importante de transmissão. Em 10 países da
América do Sul e três da América Central, quase 100% dos doadores de sangue são
monitorados. Taxas de infecção variam de 0,1 a 4,2% na Argentina, Brasil, Chile e
Uruguai, podendo chegar a 24,4% na Bolívia.
Diferentes trabalhos demonstraram que glicoconjugados na superfície das formas
tripomastigotas sangüíneas e amastigotas estariam envolvidos na iniciação da
inflamação e da resposta imune pela promoção da síntese de citocinas que ativariam
diferentes compartimentos do sistema imune, enquanto que as formas tripomastigotas
metacíclicas, aparentemente, não estariam envolvidas na iniciação da inflamação,
provavelmente devido a diferenças na composição antigênica (CAMARGO et al.,
1997a; COELHO et al., 2002).
Considerando que as formas infectantes tripomastigotas sangüíneas e metacíclicas
apresentam diferenças em vários aspectos torna-se importante realizar em modelos
experimentais avaliações parasitológicas e patológicas centradas nas formas infectantes,
uma vez que, as formas tripomastigotas metacíclicas, representam a infecção natural
pelo vetor e as formas tripomastigotas sangüíneas a infecção por transfusão de sangue
contaminado ou transmissão congênita, para uma melhor compreensão dos processos de
formação de lesão quando a transmissão do T. cruzi ocorre por essas distintas formas
VIEIRA,P.M.A. Introdução
Embora já tenha sido demonstrado que a resposta imune do hospedeiro é um
importante fator para determinar o curso da infecção, o conhecimento desta e suas
diferenças de ativação em indivíduos infectados com as formas tripomastigotas
metacíclicas e sangüíneas ainda é pouco conhecido o que justifica a realização destes
estudos em cães, uma vez que os mesmos reproduzem a doença humana.
A doença de Chagas humana é caracterizada por duas fases distintas. A fase
aguda, que dura aproximadamente dois a quatro meses, é geralmente assintomática,
entretanto, os sinais e sintomas quando presentes são mais frequentemente relacionados
ao estado imunológico do hospedeiro. Esta fase é caracterizada por uma elevada
parasitemia e parasitismo tecidual, processo inflamatório intenso, quadro toxêmico
febril e clínico fugaz (GOLGHER & GAZZINELLI, 2004). Nessa fase, as principais
lesões observadas nesse período ocorrem no tecido cardíaco e a gravidade das lesões
está relacionada diretamente aos níveis de parasitemia e à carga parasitária tecidual
(PARADA et al., 1997).
Após a fase aguda, inicia-se a fase crônica da doença, que se perpetua por toda a
vida do hospedeiro. Nessa fase os níveis de parasitemia tornam-se subpatentes, devido
ao controle da proliferação do parasito pelo sistema imune. Entretanto, as seqüelas das
lesões desenvolvidas na fase aguda podem ter conseqüências patofisiológicas na fase
crônica da doença (ANDRADE, 1991). A maioria dos indivíduos (70%) permanece na
forma indeterminada caracterizada pela ausência de alterações nos exames
eletrocardiográficos e radiológicos do tórax e abdômen. Porém, alguns indivíduos, cerca
de 20 a 35%, desenvolvem lesões irreversíveis no sistema nervoso autônomo do
coração, esôfago e/ou cólon, sendo estas as formas clínicas da doença de Chagas
(MONCAYO, 2003).
Embora grande parte dos casos crônicos apresente uma evolução lenta e benigna
VIEIRA,P.M.A. Introdução
a problemas cardiovasculares (TEIXEIRA et al., 1997). Na América Latina, a doença de
Chagas representa a primeira causa de lesão cardíaca em jovens e adultos em idade
economicamente produtiva (MONCAYO, 2003).
1.6- NO e o Trypanosoma cruzi
O mecanismo de ação pelo qual o NO realiza seu efeito citotóxico contra o T.
cruzi não está completamente esclarecido, mas parece que o NO é capaz de interferir
diretamente no metabolismo do parasito, como por exemplo, inibindo a atividade da
enzima cruzipaína que tem um importante papel na nutrição e invasão celular pelo T.
cruzi (VENTURINI et al., 2000).
Durante a fase da aguda da infecção pelo T. cruzi ocorre uma síntese sistêmica de
citocinas pró-inflamatórias, que ativam componentes da imunidade inata, como as
células NK (LIEKE et al., 2006) e macrófagos. Uma vez ativadas, estas células passam
a expressar iNOS e a produzir NO em altas quantidades que irão controlar a parasitemia
durante a fase aguda da doença.
A ativação precoce do sistema imune inato está aparentemente envolvida na
resistência do hospedeiro ao T. cruzi. A estimulação da síntese de IL-12 e TNF-α pelos
macrófagos ativam as células NK que passam a produzir IFN-γ e favorecendo a
diferenciação dos linfócitos T no fenótipo Th1, que consiste na principal população
celular produtora de INF-γ. Os macrófagos ativados pelo IFN-γ e TNF-α irão produzir
NO que é o principal responsável pelo controle da replicação do parasito na fase aguda
da doença (VESPA et al., 1994; ALIBERTI et al., 1996; HOLSCHER et al., 1998).
MICHAILOWSKY et al. (2001) avaliaram o papel endógeno da IL-12, IFN-γ e
iNOS na resistência de camundongos infectados pela cepa colombiana de T. cruzi. Eles
VIEIRA,P.M.A. Introdução
100% de mortalidade na fase aguda da doença, indicando que a IL-12, IFN-γ e iNOS
são essenciais para a resistência do hospedeiro à infecção por este parasito.
MACHADO et al. (2000) estudaram a participação dos cardiomiócitos na
atividade tripanosomicida dependente de NO. Os resultados indicam que os
cardiomiócitos estão ativamente integrados nos fenômenos inflamatórios, secretando
citocinas, quimiocinas e NO, o que pode atrair leucócitos para o foco inflamatório e
controlar a replicação intracelular dos parasitos.
Em modelo murino foi observado que o NO só é eficaz durante as primeiras duas
semanas da fase aguda da doença, tempo no qual as células NK são conhecidas por
controlar a infecção, tornando-se dispensáveis após este período, quando os níveis de
parasitemia são controlados pelas células CD8+ (SAEFTEL et al, 2001).
Entretanto, o NO, através do seu potencial oxidativo, pode ter um papel maléfico
na patogênese da doença de Chagas. Quantidades excessivas do NO têm efeitos
prejudiciais devido a sua atividade pró-inflamatória, causando por exemplo, a perda de
neurônios do plexo mientérico durante a fase aguda, o que posteriormente pode estar
relacionado com o megaesôfago na fase crônica da doença (ARANTES et al., 2004).
Estudos em modelo murino demonstraram que quantidades exacerbadas de NO
produzidas ao longo da infecção pelo T. cruzi, provocam dano no DNA das células do
coração e baço, causando a destruição das mesmas (RIBEIRO et al., 2007).
MARTINS et al. (1998) em seu estudo, quantificaram os níveis de apoptose em
esplenócitos durante a fase aguda, invitro e in vivo, em camundongos infectados pelo T.
cruzi. Eles observaram que os maiores níveis de NO nos sobrenadantes de cultura de
esplenócitos coincidiam com os picos de parasitemia e com o alto nível de apoptose. Já
quando se inibia a produção do NO por meio de L-NMMA houve uma redução no nível
de apoptose nos esplenócitos. Deste modo, eles concluíram que a apoptose nestes
VIEIRA,P.M.A. Introdução
1.7 - Participação do Baço e Linfonodo na infecção pelo T. cruzi
O baço e os linfonodos são órgãos linfóides secundários, onde as respostas dos
linfócitos aos antígenos estranhos são iniciadas e desenvolvidas, sendo os linfonodos os
órgãos nos quais as respostas imunológicas adquiridas são iniciadas e o baço o principal
local de respostas imunológicas a antígenos provenientes do sangue.
Localizado no abdômen, diretamente abaixo do diafragma e conectado ao
estômago, o baço é o maior filtro de sangue do corpo humano, composto por dois
compartimentos distintos morfologicamente e funcionalmente, a polpa vermelha e a
polpa branca (STEININGER & BARTH, 2000).
A polpa vermelha é um filtro de sangue que remove material estranho e
danificado. Também é local para estoque de ferro, eritrócitos e plaquetas. A estrutura
especializada do sistema venoso da polpa vermelha dá a esta área sua capacidade única
de filtrar o sangue e remover velhos eritrócitos.
A função linfóide é exercida na polpa branca. Esta é subdividida em bainha
linfóide periarteriolar (PALS), folículos e zona marginal, composta de linfócitos,
macrófagos, células dendríticas e plasmócitos. A correta organização e manutenção da
polpa branca é controlada por quimiocinas específcas que atraem as células T e B aos
seus respectivos domínios, desta forma estabelecendo zonas específicas dentro da polpa
branca.
As PALS são as zonas de células T, nesta região os linfócitos T interagem com
as células dentríticas e sofrem estimulação antigênica. Os folículos são as regiões das
células B, e estão interligados às PALS e são tipicamente encontrados em regiões de
bifurcação das arteríolas centrais. Os folículos podem conter centros germinais, que se
VIEIRA,P.M.A. Introdução
Os folículos estão cercados por uma borda de linfócitos e macrófagos, chamados
de zona marginal. Esta zona tem por função escanear a circulação sistêmica a procura
de antígenos e patógenos atuando efetivamente no processamento antigênico. Nesta área
há um grupo único de macrófagos, os macrófagos metalofílicos. Estes são importantes
na eliminação de microorganismos e vírus.
A total organização e imunofisiologia da polpa branca é extremamente similar à
estrutura e função dos linfonodos. Uma importante diferença é a maneira pela qual os
linfócitos entram nos dois órgãos linfóides. Nos linfonodos, a maioria dos linfócitos tem
acesso pelas veias endoteliais altas e vasos linfáticos aferentes enquanto que o acesso ao
baço se dá pela zona marginal (MEBIUS & KRAAL, 2005).
Os linfonodos são pequenos agregados de tecidos ricos em linfócitos localizados
em toda a extensão dos canais linfáticos ao longo do corpo. São divididos em três áreas
funcionais que dão suporte as respostas imunes adquiridas. Estas áreas são: (1) zona
cortical (composta predominantemente de folículos ricos em células B; (2) zona
paracortical: rica em células T e (3) medula: com sinusóides e cordões medulares,
compostos predominantemente por plasmócitos e macrófagos. Cada linfonodo está
cercado por uma cápsula fibrosa através da qual penetram inúmeros vasos linfáticos
aferentes que liberam a linfa em um seio subcapsular ou marginal.
Várias alterações do sistema imune são observadas durante a fase aguda da
infecção pelo T. cruzi. Nos órgãos linfóides secundários, alguns autores têm relatado
esplenomegalia e linfadenopatia, com ativação policlonal persistente de linfócitos T e B
VIEIRA,P.M.A. Introdução 1.8 – Modelo Canino na Infecção pelo T. cruzi
Atualmente, o modelo canino (Canis familiaris) consagrou-se pela alta
representatividade na investigação de diversos aspectos da doença, como elevada
susceptibilidade à infecção e similaridade nas manifestações das fases aguda e crônica
com os humanos, sendo possível reproduzir a fase aguda sintomática e a fase crônica
em suas formas indeterminada e cardíaca (ANDRADE & ANDRADE, 1980;
ANDRADE et al., 1984 ; LANA et al., 1988; LANA et al., 1992; GUEDES, 2001;
BAHIA et al., 2002).
A possibilidade de se avaliar aspectos parasitológicos e imunológicos
relacionados à patogênese da doença de Chagas, num modelo que reproduz a
cardiopatia chagásica de forma muito semelhante à humana, possibilitou que o nosso
grupo de pesquisa realizasse estudos para avaliar a resposta imune de cães infectados
com as formas TS ou TM da cepa Be-78. Os resultados da avaliação do sangue
periférico por citometria de fluxo revelaram que frente à infecção ocorre um aumento
no percentual de células T CD8+, aumento este maior nos animais infectados por formas
TM. Outro resultado interessante foi à diminuição no número de monócitos circulantes
(CD14+) em animais infectados com formas sangüíneas (CARNEIRO et al., 2007).
Diante do exposto, essa dissertação pretende investigar aspectos da participação
do NO, no decorrer da fase aguda da infecção experimental de cães por formas TM,
simulando a transmissão vetorial, e TS, simulando a transmissão transfusional (ou
qualquer mecanismo de transmissão que envolva as formas TS) da cepa Be-78 do T.
cruzi. Esta estratégia permitirá uma melhor compreensão dos mecanismos relacionados
VIEIRA,P.M.A. Objetivos
2.1- Objetivo geral
Avaliar a participação do NO durante a fase aguda da infecção de cães com formas
tripomastigotas sangüíneas ou metacíclicas da cepa Berenice-78 do T. cruzi.
2.2- Objetivos específicos
Determinar a cinética dos níveis séricos do NO e correlacioná-la à curva de parasitemia e aos
percentuais de células mononucleares (THY-1+, CD5+, CD4+, CD8+, CD21+, e CD14+) no
sangue periférico;
Determinar as alterações histopatológicas, o parasitismo e a expressão da enzima iNOS no baço, linfonodo cervical e diferentes regiões cardíacas (átrios e ventrículos esquerdo e direito, ponta e septo interventricular);
VIEIRA,P.M.A. Materiais e Métodos
Figura 2: Delineamento experimental, ilustrando as atividades previamente realizadas e àquelas realizadas neste trabalho.
Vacinaç ão sêxtupla : 30, 50, 70 e 90 dias Vermifuga ç ão 15, 30 e 45 dias
Dosagem sérica de NO Dias 0, 7,14,21,28 e 35 Imunofenotipagem Vacinaç ão sêxtupla : 30, 50, 70 e 90 dias
após o nascimento
Cães infectados com formas tripomastigotas sangüíneas
TS
(n= 4) TM
(n= 4)
Cães não infectados formas tripomastigotas metacíclicas Cães infectados com formas
Controle A tiv id a d e s p re v ia m e n te r e a liz a d a s A tiv id a d e s r e a liz a d a s n e s te e s tu d o Necropsia 42º dia após infecção
HE e Imuno-histoquímica anti-iNOS e
T. cruzi (Baço, Linfonodo cervical,
Átrios direito e esquerdo, Ventrículos direito e esquerdo, Septo e Ponta)
Análise estatística Obtenção das
ninhadas
(n= 4)
Parasitemia
10º dia após a infecção até a negativação
(THY-1+, CD4+, CD8+, CD14+, CD5+ e
CD21+)
VIEIRA,P.M.A. Materiais e Métodos
3.1 - Atividades previamente realizadas
3.1.1 - Animais
Foram utilizados 12 cães jovens sem raça definida, de ambos os sexos (seis
machos e seis fêmeas), nascidos na Maternidade do Biotério Central da Universidade
Federal de Ouro Preto.
Os filhotes foram mantidos com a mãe até o desmame. Neste período foi
realizado o controle de endo e ectoparasitoses e aos 30, 50, 70 e 90 dias de idade. Os
cães foram vacinados pela via subcutânea no dorso anterior, com a vacina Vanguard®
HTLP 5/CV-L Laboratório Pfizer LTDA, contra Parvovirose, Cinomose, Leptospirose
canina, Coronavírus, Adenovírus Tipo 2 e Parainfluenza. Com 120 dias de idade, os
animais foram divididos em três grupos experimentais de quatro animais cada: Controle,
Infectado com formas tripomastigotas metacíclicas (TM) e Infectado com formas
Tripomastigotas Sangüíneas (TS).
3.1.2 - Infecção dos cães
Os cães foram inoculados com 2000 formas tripomastigotas sangüíneas (TS) ou
metacíclicas (TM) por Kg de massa corporal pela via intraperitonial. As formas
sangüíneas foram obtidas de camundongos infectados pela cepa Be-78 (T. cruzi I), por
via intraperitonial e as formas metacíclicas de ninfas de Triatoma infestans provenientes
VIEIRA,P.M.A. Materiais e Métodos
3.1.3 - Curva de parasitemia
A parasitemia dos animais foi avaliada diariamente a partir do 10° dia após a
inoculação, através da coleta de cinco µl de sangue da veia marginal da orelha dos cães
e examinados ao microscópio óptico para quantificação dos parasitos utilizando a
técnica descrita por BRENER (1962). O período pré-patente, período patente e o pico
máximo de parasitemia foram determinados.
3.1.4 - Coleta de sangue e soro
O sangue e soro dos animais foram coletados no período que antecedeu a
infecção e aos sete, 14, 21, 28 e 35 dias após a infecção (DAI).
3.1.5 - Resposta imune celular ex vivo
O fenótipo das populações celulares do sangue periférico foi determinado até o
35º dia, conforme técnica estabelecida por Reis et al. (2005). As reações de
imunofenotipagem foram realizadas nos dias zero, sete, 14, 21, 28 e 35 após a infecção.
Foi avaliado o percentual médio das populações de linfócitos T (THY-1+ e CD5+) e suas
subpopulações (CD4+, CD8+), de linfócitos B (CD21+) e de monócitos (CD14+). Para
obtenção dos dados, foi utilizado um citômetro de fluxo (FACScalibur – Becton
Dickinson, San Jose, EUA) acoplado a computador onde os dados foram armazenados e
posteriormente analisados pelo programa Cell Quest (Becton Dickinson, San Jose,
VIEIRA,P.M.A. Materiais e Métodos
3.1.6 - Necrópsia, coleta, fixação e processamento do material para microscopia óptica
Os animais foram eutanasiados no 42° DAI (0,5 mL/Kg de massa corporal por
via endovenosa de tiopental sódico – 0,03g/ml de solução salina 0,8%) sendo procedida
a necrópsia.
Durante a necrópsia foram coletados fragmentos dos átrios direito e esquerdo,
ventrículos direito e esquerdo, ponta e septo interventricular do coração, baço e
linfonodo cervical in totum fixados em formol a 10% tamponado (pH 7.2). Os
fragmentos das várias regiões do coração, do baço e do linfonodo cervical foram
processados rotineiramente e incluídos em parafina.
3.2 - Atividades realizadas neste estudo
3.2.1 - Dosagem sérica do NO
A avaliação das concentrações do NO foi realizada pela medida de nitritos
(NO2) e nitratos (NO3-), segundo o método de GREEN et al., (1982). Os soros dos cães
infectados e normais foram codificados antes da execução dos experimentos de
dosagem do NO sérico e após as reações foram decodificados para análise dos dados
obtidos.
As amostras foram descongeladas e alíquotas de 50 l foram transferidas para
eppendorfs de 500µl e diluídas em 50 l de água destilada. Para a conversão de nitratos
a nitritos foram adicionados às amostras 30 l de um coquetel contendo 10 l de FAD
(Sigma), diluído 1:10 em água destilada , 10 l de NADPH (Sigma) e 10 l da enzima
VIEIRA,P.M.A. Materiais e Métodos
No dia seguinte foi realizada a desproteinização através da adição de 10 l de
sulfato de zinco (ZnSO4), seguida por cinco minutos de centrifugação a 5000 rpm. Após
esta etapa, as amostras foram plaqueadas em duplicata em placas de 96 poços de fundo
chato. Seguiu-se com a aplicação de 50 l do reagente de Griess, e incubação a
temperatura ambiente por 10 minutos. O reagente foi preparado na hora do uso,
misturando partes iguais de duas soluções A e B na proporção de 1:1. Sendo a solução
A composta de Sulfanilamida 1% (MERCK) e a solução B de Naftilenodiamino 0.7%.
A seguir foi determinada a absorbância a 570 nm em leitor de ELISA (Molecular
Devices, E Max, USA). A concentração do NO foi determinada utilizado-se como
padrão concentrações de 0,78 a 100 µM de nitrato de sódio (NaNO2) Os resultados
foram expressos em M de NO pela média de duas dosagens realizada em dias
alternados.
3.2.2 - Colorações empregadas
Os blocos de parafina obtidos foram submetidos à microtomia para a obtenção
de cortes com espessura de quatro µm. Foram confeccionadas quatro lâminas dos blocos
parafinizados do baço, do linfonodo cervical e das diferentes regiões cardíacas.
Dos três cortes obtidos para o estudo do baço, linfonodo cervical e das diferentes
regiões do coração, o primeiro foi corado pelo método de Hematoxilina-Eosina (HE)
para análise rotineira das alterações histopatológicas; o segundo e o terceiro foram
utilizados em reações imuno-histoquímicas para detecção do parasito e expressão de
VIEIRA,P.M.A. Materiais e Métodos
3.2.3 - Avaliação histopatológica do Baço e Linfonodo cervical
As análises histopatológicas do baço e linfonodo cervical foram realizadas
segundo ELMORE (2006a) e ELMORE (2006b), respectivamente. Esta avaliação
seguiu o descrito nas Tabelas 2 e 3 para cada um dos compartimentos destes órgãos. A
análise foi semi-quantitativa, sendo 0 = ausência de alteração; 1 = aumento/diminuição
discreta; 2 = aumento/diminuição moderada e 3 = aumento/diminuição intensa.
Tabela 2: Roteiro para avaliação histopatológica do baço. A ausência de alteração, o
aumento ou a diminuição discreta, moderada ou acentuada do tamanho, quantidade ou número foram avaliados na região da PALS (zona periarteriolar de linfócitos T), zona marginal, folículos e polpa vermelha esplênica.
Intensidade
PALS
Aumento/Diminuição do tamanho Aumento/Diminuição na quantidade
Aumento/Diminuição no número de linfócitos
Zona Marginal
Aumento/Diminuição do tamanho
Aumento/Diminuição no número de linfócitos
Folículos
Aumento/Diminuição na quantidade
Aumento/Diminuição no número de linfócitos Aumento/Diminuição dos centros germinais
Polpa vermelha
Aumento/Diminuição do tamanho
Aumento/Diminuição no número de macrófagos Aumento no número de células hematopoiéticas
Aumento nos números
Células plasmáticas Células apoptóticas
Macrófagos vacuolizados com corpos apoptóticos
VIEIRA,P.M.A. Materiais e Métodos
Tabela 3: Roteiro para avaliação histopatológica do linfonodo cervical. A ausência de
alteração, o aumento ou a diminuição discreta, moderada ou acentuada da área, tamanho, quantidade ou número foram avaliados na região do córtex ou medula do linfonodo cervical.
Intensidade
Córtex
Aumento/Diminuição da área
Aumento/Diminuição no número de folículos
Aumento/Diminuição no desenvolvimento do centro germinal Aumento/Diminuição no número de linfócitos
Aumento no número de: Células apoptóticas Células plasmáticas Macrófagos vacuolizados Necrose
Medula
Aumento/Diminuição da área
Aumento/Diminuição no número de linfócitos Aumento/Diminuição no número de macrófagos
Aumento/Diminuição no número de células plasmáticas Aumento no número de:
Células apoptóticas Macrófagos vacuolizados Necrose
3.2.4 Quantificação da inflamação na área cardíaca
Todos os núcleos celulares presentes nos fragmentos das diferentes regiões do
coração foram quantificados em 20 imagens (campos) aleatórias (área total percorrida
igual a 1,5 x 106 µm2). As imagens visualizadas pela objetiva 40x foram digitalizadas
através da microcâmera Leica DM5000B e do programa Leica Application Suite
(Verssão 2.4.0 R1). Para a análise das imagens obtidas foi utilizado o programa Leica
QWin V3. O processo inflamatório foi determinado pelo número de núcleos das células
presentes nos animais não-infectados ± desvio padrão, os animais infectados com o T.
cruzi com valores da quantificação de núcleos celulares acima desta média foram
VIEIRA,P.M.A. Materiais e Métodos
3.2.5 - Imuno-histoquímica para detecção do T. cruzi
Os cortes histológicos do baço, linfonodo cervical e das diferentes regiões
cardíacas foram desparafinizados em duas trocas de xilol de 15 minutos cada e
hidratados em concentrações decrescentes de álcool (100, 90, 80 e 70%) por cinco
minutos cada. Após a hidratação, ocorreu a lavagem dos cortes por cinco minutos em
em PBS (phosphate buffer saline) pH 7,2-7,4 também por cinco minutos.
Posteriormente, os cortes foram submetidos ao bloqueio da peroxidase endógena
em um banho de 30 minutos em PBS/Peróxido de Hidrogênio (240 ml de PBS e 10ml
de Peróxido de Hidrogênio 30%) à temperatura ambiente. Seguiu-se lavagem em PBS,
por três banhos consecutivos, de cinco minutos cada.
Para bloquear as reações cruzadas inespecíficas, aplicou-se o soro normal de
cabra diluído na proporção 1:50 em PBS, por 30 minutos em câmara úmida a
temperatura ambiente.
Em seguida, os cortes foram incubados com anticorpo primário (anti- T. cruzi
produzido em coelho – produção própria – diluição 1:1000 em PBS/Albumina 0,1%)
por 12hs a 18hs em câmara úmida a 4°C. Após a incubação com o anticorpo primário,
os cortes foram lavados em PBS, por três banhos de cinco minutos cada.
Os cortes foram, então, incubados com o anticorpo secundário (anti-IgG de
coelho, produzido em cabra, diluído 1:200 em PBS/Albumina 0,1%) em câmara úmida
por 30 minutos a 37°C. Os cortes retirados da câmara úmida receberam novamente três
banhos, de cinco minutos cada, em PBS.
Procedeu-se à aplicação do complexo peroxidase-antiperoxidase (PAP – SIGMA
– diluído 1:250 em PBS/Albumina 0,1%) e os cortes foram incubados em câmara úmida
VIEIRA,P.M.A. Materiais e Métodos
Para a revelação da reação, os cortes foram incubados por cinco minutos à
temperatura ambiente com a solução de DAB (50 mg de Diaminobenzidina em 250 ml
de PBS e 500 µl de Peróxido de Hidrogênio 30%). Os cortes foram, então, lavados por
cinco minutos em água corrente e contracorados com Hematoxilina de Harris por 10
segundos. Novamente foram lavados por cinco minutos em água corrente e desidratados
em duas passagens pelo álcool absoluto. As lâminas foram montadas com Bálsamo do
Canadá (Pró-Cito) e lamínulas.
Em cada bateria de imuno-histoquímica, para controle da reação foram incluídos
dois cortes obtidos de coração de camundongo infectado pelo T. cruzi e sacrificado na
fase aguda da doença. Em um deles, usado como controle negativo, o antisoro anti-T.
cruzi foi substituído por PBS e no outro, usado como controle positivo, procedeu-se à
técnica de imuno-histoquímica descrita anteriormente. Ainda como controle da reação,
os cortes do baço e linfonodo cervical de cães não-infectados foram incluídos na bateria.
O parasitismo do baço, linfonodo cervical e das diferentes regiões do coração foi
quantificado em 30 campos microscópios aleatórios (objetiva de 40X) nas lâminas
submetidas às reações imuno-histoquímicas.
3.2.6 - Imuno-histoquímica para a detecção da expressão de iNOS
Os cortes de baço, linfonodo cervical e das diferentes regiões cardíacas foram
desparafinizados em xilol (dois banhos de 15 minutos cada) e hidratados em
concentrações decrescentes de álcool (100, 90, 80 e 70%) em banhos de cinco minutos
cada. Em seguida, os cortes foram lavados em água corrente por cinco minutos e então
VIEIRA,P.M.A. Materiais e Métodos
Peróxido de Hidrogênio 30%) por 30 minutos à temperatura ambiente. Seguiu-se a
lavagem em PBS por três banhos de cinco minutos cada.
Para a recuperação antigênica foi utilizado o tampão citrato pH 6.0 em forno de
microondas por 10 minutos. Depois de retiradas do forno de microondas, os cortes
foram deixados à temperatura ambiente para ocorrer um resfriamento progressivo dos
mesmos ainda imersos no tampão citrato pH 6.0. Só então foram lavados em PBS, em
três banhos de cinco minutos cada.
Após a secagem das bordas dos cortes com papel absorvente, aplicou-se o soro
normal de cavalo (R.T.U. Vectastain Universal Elite ABC; Vector Laboratories, Inc.)
por 30 minutos em câmara úmida a 37°C, com o objetivo de bloquear sítios
inespecíficos. Em seguida, secou-se o excesso de soro normal de cavalo e os cortes
foram incubados por 12hs à 18hs em câmara úmida a 4°C com o anticorpo policlonal
IgG de coelho anti-iNOS (Rabbit anti-Mouse iNOS, SC-651, Santa Cruz
Biotechnology, INC.) diluído 1:200 em solução diluente de anticorpo com componentes
redutores de background (DakoCytomation, USA).
Posteriormente, os cortes foram lavados em PBS e incubados com o anticorpo
secundário biotinilado (R.T.U. Vectastain Universal Elite ABC; Vector Laboratories,
Inc.) por 30 minutos em câmara úmida a 37°C. Seguiram-se três banhos de cinco
minutos cada, em PBS. Os cortes foram então incubados com o complexo ABC (R.T.U.
Vectastain Universal Elite ABC; Vector Laboratories, Inc.) por 30 minutos em câmara
úmida a 37°C. Seguiu-se a lavagem em PBS, três banhos de cinco minutos cada.
A revelação da reação da peroxidase foi obtida através da incubação em solução
de DAB (50mg de Diaminobenzidina em 250 mL de PBS e 500 µl de Peróxido de
Hidrogênio 30%) durante cinco minutos. No intuito de interromper a revelação, os
contra-VIEIRA,P.M.A. Materiais e Métodos
coloração, foi utilizada a Hematoxilina de Harris por 10 segundos à temperatura
ambiente seguida pela lavagem dos cortes, por 5 minutos, em água corrente. O material
foi desidratado em álcool absoluto e seco em estufa 56°C. Após a secagem dos cortes na
estufa, as lâminas foram montadas com Bálsamo do Canadá (Pró-Cito) e lamínula.
Como controle da reação, foram incluídos dois cortes de pele obtidos de cão
inoculado com antígeno de Leishmania braziliensis e saponina. Em um deles, usado
como controle negativo, o anticorpo anti-iNOS foi substituído por PBS e no outro,
usado como controle positivo, procedeu-se a técnica imuno-histoquímica descrita
anteriormente. Os cortes assim obtidos foram utilizados para analisar a expressão de
iNOS no baço, linfonodo cervical e nas diferentes regiões cardíacas.
3.2.7 Análise quantitativa da expressão de iNOS
Estudos morfométricos da expressão de iNOS foram realizados através da análise
de imagem (obtidas por uma microcâmera Leica DM5000B e analisadas pelo programa
Leica QWin V3) pela medida da área marcada para iNOS em 20 imagens (campos)
aleatórias (área total percorrida igual a 1,5 x 106 µm2) no baço, linfonodo cervical e
diferentes regiões cardíacas. Todas as análises foram efetuadas na objetiva de 40x.
3.2.8 - Análise Estatística
Os testes estatísticos foram realizados com o apoio instrumental dos softwares
Minitab 13.20 para Windows (Minitab Inc., Pennsylvania, USA) e GraphPad Prism
VIEIRA,P.M.A. Materiais e Métodos
Para comparação dos níveis séricos de NO, do processo inflamatório e da área
marcada para iNOS foi realizada análise de variância (ANOVA one-way). Quando as
alterações foram significativas, o teste de Tukey foi realizado para determinar as
diferenças específicas entre as médias.
A parasitemia foi analisada pelo teste não paramétrico Kolmogorov-Sminorv
(KS), que compara a área sob a curva entre duas amostras (CONOVER, 1980).
As análises de correlação foram executadas através do teste de Spearman com
intervalo de confiança de 95%.
Para a análise das alterações histopatológicas do baço e linfonodo cervical foi
uitilizado o teste não paramétrico de Kruskal-Wallis, com pós-teste de Dunns.
Para a análise do parasitismo tecidual foi utilizado teste T de Student pareado.
Diferenças entre médias com valores de P menores que 0,05 foram consideradas
VIEIRA,P.M.A. Resultados
4.1 – Níveis Séricos de Óxido Nítrico
No Gráfico 1 estão apresentados os resultados da dosagem dos níveis séricos de
NO (Nitrito + Nitrato) realizada antes da infecção e aos 7, 14, 21, 28 e 35 DAI.
Observa-se que os animais pertencentes ao grupo TM apresentaram níveis
significativamente maiores de NO quando comparados aos animais dos grupos Controle
e TS no 14o e 28o DAI. Esta produção se iniciou no 7º e decaiu a partir do 28o DAI. Nos
animais dos grupos Controle e TS foram observados, ao longo do tempo, níveis
semelhantes de NO. Não foram observadas diferenças significativas na análise
longitudinal.
Gráfico 1: Cinética da dosagem dos níveis séricos de NO (Nitrato+Nitrito) em cães não
infectados (Controle: ), infectados com formas tripomastigotas metacíclicas (TM:
) ou sangüíneas (TS: ) da cepa Be-78 do Trypanosoma cruzi.
* diferença significativa do grupo TM em relação aos grupos Controle e TS. 0 10 20 30 40 50
0 7 14 21 28 35
Dias após a infecção
N it ri to + N it ra to (µµµµ M ) * * 0 10 20 30 40 50
0 7 14 21 28 35
Dias após a infecção
VIEIRA,P.M.A. Resultados
A análise de regressão linear (Gráfico 2) demonstrou aumento significativo dos
níveis séricos de NO ao longo do tempo para o grupo TM (y= 0,515x + 22,28 r2= 0,08).
Nos grupos Controle e TS verificou-se redução dos níveis séricos de NO ao longo do
tempo (Controle: y= -1,4946x + 17,379 r2= 0,3866 e TS y= -1,0603x + 18,688 r2=
0,308).
Gráfico 2: Linha de tendência da cinética dos níveis séricos de NO (Nitrato+Nitrito) em cães não infectados (Controle: ), infectados com formas tripomastigotas
metacíclicas (TM: ) ou sangüíneas (TS: ) da cepa Be-78 do Trypanosoma.
cruzi.
y = 0,515x + 22,28 R2= 0,008
y = -1,0603x + 18,688 R2= 0,308
y = -1,4946x + 17,379 R2= 0,3866 0 10 20 30 40 50
0 7 14 21 28 35
Dias após a infecção
N it ri to + N it ra to ( µµµµ M )
y = 0,515x + 22,28 R2= 0,008 y = 0,515x + 22,28
R2= 0,008
y = -1,0603x + 18,688 R2= 0,308 y = -1,0603x + 18,688
R2= 0,308
y = -1,4946x + 17,379 R2= 0,3866 y = -1,4946x + 17,379
R2= 0,3866 0 10 20 30 40 50
0 7 14 21 28 35
Dias após a infecção
VIEIRA,P.M.A. Resultados
4.2 – Comparação dos Níveis Séricos de Óxido Nítrico com as Curvas de Parasitemia
No Gráfico 3 está representada a comparação entre os níveis séricos de NO e as
curvas de parasitemia dos animais dos grupos TM e TS. Não foram observadas
diferenças significativas da área sob a curva de parasitemia entre os grupos TM e TS.
No entanto, a produção mais precoce de NO nos animais do grupo TM pode estar
relacionada ao pico de parasitemia mais tardio neste grupo.
Gráfico 3:Cinética da dosagem dos níveis séricos de NO (Nitrato+Nitrito) (TM: ;
TS: ) versus parasitemia (TM: ; TS: ) em cães infectados com formas
tripomastigotas metacíclicas (TM) ou sangüíneas (TS) da cepa Be-78 do Trypanosoma
cruzi.
Dias após a infecção
0 10 20 30 40 50 60 70 80 N it ri to + N it ra to ( µµµµ M )
0 7 14 21 28 35
0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 N úm er o de p ar as it os /0 ,1 m ld e sa ng ue
Dias após a infecção
0 10 20 30 40 50 60 70 80 N it ri to + N it ra to ( µµµµ M )
0 7 14 21 28 35
