CARACTERIZAÇÃO FÍSICO-QUÍMICA DE ÓLEOS VEGETAIS

UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ INSTITUTO DE TECNOLOGIA

PROGRAMA DE PÓS GRADUAÇÃO EM ENGENHARIA QUÍMICA – MESTRADO DISCIPLINA: PROCESSO DE TRANSFORMAÇÃO DE ÓLEOS VEGETAIS

PROFESSOR: DR. LUIZ FERREIRA DE FRANÇA

CARACTERIZAÇÃO FÍSICO-QUÍMICA DE ÓLEOS VEGETAIS

Discente:

Ádina Lima de Santana - 2011010M0001

BELÉM 2011

ROTEIRO

 INTRODUÇÃO

 OBJETIVO

 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA:

REAÇÕES QUÍMICAS

ANÁLISES

 CONCLUSÃO

 REFERÊNCIAS

INTRODUÇÃO:POR QUE CARACTERIZAR?

•REAÇÕES QUÍMICAS → Forma de avaliar a qualidade;

•CONSUMO HUMANO → Não pode conter substâncias dissolvidas em níveis tóxicos e nem transportar em suspensão microrganismos patogênicos que provocam doenças;

•Padrões (Normas/Métodos) →AOAC, AOCS, ASTM, ABNT.

CARACTERIZAÇÃO FÍSICO-QUÍMICA DOS ÓLEOS VEGETAIS

•ÍNDICE DE ACIDEZ

•ÍNDICE DE PERÓXIDO

•POTENCIAL ANTIOXIDANTE (ORAC)

•ÍNDICE DE IODO

•ÍNDICE DE SAPONIFICAÇÃO

•CROMATOGRAFIA GASOSA

•CAROTENÓIDES TOTAIS

•ÍNDICE DE REFRAÇÃO

•VISCOSIDADE

•DENSIDADE

NEUTRALIZAÇÃO

- PRINCÍPIO: Neutralizar grupo carboxílico com uma base forte [NaOH ou KOH]:

R-COOH + NaOHRCOO-Na

+ H

O

– Utilizada na análise de ácidos graxos totais livres;

– O n^o de equivalentes de –OH necessário para neutralizar os ácidos graxos livres será o mesmo n^o de equivalentes destes ácidos presentes no óleo;

– Estimativa de acidez do óleo/gordura.

NEUTRALIZAÇÃO

ÍNDICE DE ACIDEZ AOCS Cd 3d-63

•DEFINIÇÃO: peso de hidróxido de potássio, em mg, necessário para neutralizar um grama de amostra;

•FINALIDADE: mede a presença de ácidos graxos livres e está relacionado à qualidade do processo.

•APLICAÇÃO: óleos vegetais brutos e refinados e gordura animais.

•MATERIAIS E REAGENTES: Solução 1:1 de Isopropanol- Tolueno, solução indicadora fenoftaleina e solução de hidróxido de sódio (NaOH) ou de potássio (KOH), 0,1N.

PROCEDIMENTO :

1- Determinar a quantidade de amostra pela tabela a seguir:

2-Pesar a quantidade especifica de amostra em uma balança analítica;

ÍNDICE DE ACIDEZ (mgKOH/g) MASSA DE AMOSTRA (g)

0-1 20

1-4 10

4-15 2,5

15-75 0,5

75 ou mais 0,1

Tabela 1: Relação entre a quantidade de massa a ser pesada e suposto índice de acidez.

3- Add 125 ml de uma mistura solvente, em partes iguais (50% v/v), de Isopropanol e Tolueno.;

4-Add fenolftaleína e titular com KOH 0,1 N (branco)

5- Anotar o volume gasto na titulação do branco; add o branco à amostra e titular; anotar o volume do titulado

CÁLCULO

AMOSTRA

KOH KOH

KOH

m

f . .PM

B).N ) (A

KOH/g de

(mg Acidez

de

Índice  

Onde:

A – volume de KOH usado na titulação da amostra, mL;

B – volume de KOH usado na titulação do branco, mL;

N – normalidade da solução de KOH (0,1);

PM_KOH – Peso molecular do KOH (56,1 g/mol);

f_KOH - Fator de correção do KOH;

m_AMOSTRA – massa da amostra, g.

OXIDAÇÃO

• Peróxidos → produtos primários da oxidação lipídica;

• Óleos e gorduras→ são oxididados quando entram em contato com o O_2(g);

• O_2(g) → pode estar no espaço livre do recipiente e dissolvido no óleo;

• Produtos da oxidação → sabor e odor desagradáveis; pode afetar o valor

nutricional do óleo; ácidos graxos essenciais como o linoléico e linolênico são destruídos e certas vitaminas lipossolúveis desaparecem;

• ÁCIDOS GRAXOS → Oxidados pelos mecanismos: AUTOXIDAÇÃO E FOTOXIDAÇÃO

OXIDAÇÃO

• AUTOXIDAÇÃO → ausência de ar por espécies de O₂(g) reativos ou

´´radicais livres´´;

• Temporariamente prevenido por antioxidantes naturais contidos no óleo que absorvem esses radicais livres;

• Quando os antioxidantes estão desgastados, o óleo degrada rapidamente.

• FOTOXIDAÇÃO → ocorre quando o óleo é exposto a fontes de luz natural e artificial (incluindo luzes halogenias e de estocagem). → deterioração séria no óleo, e pode ocorrer cerca de 30000 vezes mais rápido que a autoxidação;

• Quanto mais rançoso ou oxidado for o óleo, maior índice de peróxido ele terá;

OXIDAÇÃO /AUTOXIDAÇÃO

•Processo de cadeias de radicais, p.ex., os intermediários são radicais (espécies ímpares de elétrons) e a reação envolve iniciação e a sequência de propagação, que continua até a operação de uma ou mais etapas de finalização.

Iniciação

Propagação (Reação rápida)

(Etapa de taxa determinante) Terminação

Figura: Autoxidação de olefinas (RH representa uma molécula olefínica, na qual o H é anexado num átomo de carbono alílico

Fonte:HAMM; HAMILTON, 2000.

FOTOXIDAÇÃO

•Interação entre uma ligação dupla e uma molécula altamente ativada de O₂ produzido por um O₃;

•Energia da luz é transferida para o oxigênio via um sensitizador, como a clorofila.

•Espécies reativas de O₂ reagem com olefinas resultando em hidroperóxidos alílicos.

ÍNDICE DE PERÓXIDO

•DEFINIÇÃO: todas as substâncias, em termos de miliequivalentes de peróxido por 1000 g de amostra, que oxidam o iodeto de potássio.

•FINALIDADE: devido a sua ação oxidante, os peróxidos orgânicos, formados no início da rancificação, atuam sobre o iodeto de potássio liberando iodo que será titulado com tiossulfato de sódio, em presença de amido como indicador.

•APLICAÇÃO: óleos vegetais brutos e refinados e gordura animais.

•MATERIAIS E REAGENTES: Óleo; Solução de Iodeto de potássio;

Solução indicadora de amido; Solução de Ácido Acético Glacial/Clorofórmio; Tiosulfato de sódio (Na₂S₂O₃);

PROCEDIMENTO

• Pesar 5 ± 0,05g da amostra no erlenmeyer de 250mL com tampa esmerilhada;

• Adicionar 30 mL da solução ácido acético glacial/clorofórmio 3:2 e misturar com leve agitação;

• Adicionar com uma pipeta, 0,5mL da solução de KI→repouso por 1 minuto → 30mL de água destilada;

• Titular com solução de tiossulfato 0,1 N com agitação constante até a cor do iodeto ter quase desaparecido;

• Adicionar cerca de 2mL da solução indicadora de amido → Continuar titulação com agitação constante especialmente próximo do ponto final para liberar todo o KI da camada de solvente;

• Adicionar a solução de tiossulfato gota a gota até a cor azul desaparecer

CÁLCULO

AMOSTRA O Cr K

m

.1000 B).N

) (S 000g Peróxido/1

(mEq Peróxido

de

Índice  ^{2 2 7}



Onde:

S – volume de tiossulfato usado na titulação da amostra, mL;

B – volume de tiossulfato usado na titulação do branco, mL;

N – normalidade da solução de K₂Cr₂O₇; m_AMOSTRA – massa da amostra, g.

ORAC

•PRINCÍPIO: Transferência dos átomos de O₂(Radical Livre); trata-se de uma simulação da reação que rotineiramente ocorre no corpo humano (combate dos radicais livres pelos agentes antioxidantes).

Oxygen Radical Absorbance Capacity

MATERIAIS:

1 – Óleo (1g);

2 - Solução de AAPH (2,2´-azobis (2-amidino-propano) dihidrocloreto);

3 - Solução de fluoresceína (representando o corpo humano) preparada com 0,0167g de fluoresceína sólida, dissolvidas em 100mL da solução tampão de pH=7,4. A

solução tampão de KH₂PO₄ (ácido) e KHPO₄ (base) de pH=7,4. O pH é desse valor por ser equivalente ao do plasma sanguineo. A fluoresceína emitirá fluorescência

mediante a reação;

1 - Pesar 1g de óleo em tubo de ensaio;

PROCEDIMENTO

2 - Junto ao óleo pesado transferir uma alíquota de 4mL de acetona;

3 - Tapar o tubo de ensaio com papel parafina;

4 - Agitar o tubo com a amostra e a acetona;

5 - Transferir a mistura agitada em eppendorfes e centrifugar numa temperatura de 4^oC, numa rotação de 8000 rpm, durante 20 minutos;

6 - Saturar a mistura com N₂ gasoso durante 10 segundos.

PROCEDIMENTO

- Linhas B e C: Construção da curva de calibração da reação, estando os poços 1, 2 e 3 ocupados pela solução tampão (branco). Poços 4 e 5 → o primeiro ponto da curva, numa concentração de 1μmolar de trolox (análoga à vitamina E, essa substância tem a função de montar a curva de calibração.

Poços 6, 7 e 8 foi inserida uma concentração de 2 μmolar de trolox. Nos poços 9 e 10 foi inserida uma concentração de 4 μmolar de trolox. Nos poços 11 e 12 foi inserida uma concentração de 8 μmolar de trolox.

LEITURA: Microplaca branca constituídas de 96 poços de fundo chato sem tampa, onde as linhas foram representadas por letras e as colunas por números.

- Linhas A e H: água ultrapura (água destilada em osmose reversa).

PROCEDIMENTO

-Linhas D a G: Em cada poço foi posto um volume de 25 μL dos constituintes. Nessas linhas foram abrigadas as amostras, foram feitas 3 diluições em 6 replicatas.

-Se não sabe qual a diluição correta, deve ser feito um teste com 3 trincas de diluições (Tabela).

Partida Diluição

10X 160X 320X 640X

50X 1000X 2000X 4000X

50X 8000X 16000X 32000X

Tabela 2: Diluições de partida para ORAC do óleo de buriti bruto.

Microplaca → Fluorímetro acoplado de duas seringas (Figura). onde a primeira estava constituída da solução de fluoresceína e a outra da solução do AAPH (0,414 g de AAPH sólido diluído em 10mL de solução tampão) regidos pelo programa computacional Gen 5 .

•Ambientação das seringas/15 minutos, onde a primeira seringa foi ambientada com 1500 μL da solução de fluoresceína numa taxa de 275 μL/segundos e a segunda seringa foi ambientada com 1500 μL da solução de AAPH numa taxa de 175 μL/segundo;

•Temperatura de trabalho 37^oC (temperatura do corpo humano);

• Pela primeira seringa, o programa injeta 150 μL de fluoresceína em cada um dos poços da placa, enquanto que pela segunda seringa, o programa injeta 25 μL do AAPH completando o volume total de 200 μL em cada poço.

•O programa executa a leitura num intervalo de 50 minutos.

PROCEDIMENTO

CÁLCULO

- Valor médio das leituras obtidas na diluição;

- Volume de acetona, cerca de 4 mL;

– Massa de óleo pesada, cerca de 1g.

Onde:

ORAC óleo de buriti bruto = 542 µmolET/g

HALOGENAÇÃO

•Adição de halogênio [Cl, Br, I₂] a ácidos graxos insaturados.

•Usado na determinação do índice de iodo: peso em g de I₂ que reage com 100g de gordura, determina o grau de insaturação dos ácidos graxos.

H₂C-[CH₂]₆CH=CH-[CH₂]₇COOH + Br₂H₃C-[CH₂]₆-CH-CH-[CH₂]₇ – COOH Br Br

ÍNDICE DE IODO

(MÉTODO AOCS CD 1-25)

•DEFINIÇÃO^:

Medida do grau de insaturação dos ácidos graxos presentes na gordura → quanto maior a insaturação maior será a capacidade de absorção de iodo

e, conseqüentemente, maior será o índice de iodo.

Expresso em termos do número dos centigramas do iodo absorvidos por grama da amostra.

•MATERIAL E REAGENTE: Óleo, Erlenmeyer de 500mL com boca esmerilhada; Pipeta de 25mL; Solução de Wijs; Iodeto de potássio;

Tetracloreto de Carbono; Solução de amido; Dicromato de potássio ( K₂Cr₂O₇); Tiosulfato de sódio (Na₂S₂O₃);

•IMPORTÂNCIA: Determinar o teor de ácidos graxos insaturados, medir a susceptibilidade à rancidez oxidativa, controlar o processo de hidrogenação e verificar adulterações em óleos e gorduras.

PROCEDIMENTO

• Pesar 10g da amostra no erlenmeyer de 500mL;

• Adicionar 15mL de tetracloreto de carbono e agitar até total diluição;

• Adicionar 25mL da solução de Wijs (iodo e cloro) e estocar o frasco ao abrigo da luz durante 30 min. Após os trinta minutos adicionar 20mL da solução de KI e 100 mL de água destilada.

• Titular o conteúdo do erlemeyer com solução de tiossulfato de sódio 0,1N.

• Durante a titulação verifica-se o aparecimento de uma coloração levemente amarela - neste momento adicionar de 1 a 2 mL de solução de amido mudando a coloração para azul intenso;

• Continuar a titulação até que a coloração azul desapareça.

CÁLCULO

Onde:

•B - Volume utilizado na titulação do branco (mL);

•S - Volume usado na titulação da amostra (mL);

•N_Na2S2O3 - normalidade do Na₂S₂O3;

•PM_KI – Peso molecular do iodeto de potássio;

•m_AMOSTRA – Massa da amostra, em gramas;

•f_Na2S2O3 – Fator de correção do tiossulfato de sódio.

AMOSTRA

O S Na KI

O S Na

2 m

f . .PM S).N

/100g) (B I

Iodo(g de

Índice  ^{2 2 3 2 2 3}



FAT OR OIL IODIN NUMBER

Linseed oil 173 - 201

Tung Oil 170.6

Menhaden oil 139 - 173

Whale oil 121 - 146.6

Soy bean oil 137 - 143

Sunflower oil 119 - 135

Corn oil 111 - 130

Cottonseed oil 108 - 110

Sesame oil 103 - 108

Rapeseed oil 94 - 102

Peanut oil (arachis) 83 - 100

Olive oil 79 - 88

Horse oil 71 - 86

Lard 46 - 70

Palm oil 51.5 - 57

Milk fat 26 - 50

Beef tallow 38 - 46

Mutton tallow 35 - 46

Cacao butter 32 - 41

Palm kernel oil 13 - 17

Coconut oil 8 - 10

Tabela 3: Índice de iodo de alguns óleos.

Fonte : ALSBERG; TAYLOR, 1928 apud LEWKOWITSCH, SD.

SAPONIFICAÇÃO – HIDRÓLISE BÁSICA

• Mecanismo:

Éster + Base ^ Álcool + Sal Alcalino de um Ácido Carboxílico

Lipídios podem ser saponificáveis ou não saponificáveis

SAPONIFICAÇÃO – HIDRÓLISE BÁSICA

LIPÍDIOS SAPONIFICÁVEIS

–Todos derivados de triacilgliceróis (todas as gorduras e óleos).

LIPÍDIOS NÃO SAPONIFICÁVEIS

–Esteróides e derivados;

–Terpenos;

–Alcanos de cadeia longa (óleo mineral);

–Prostaglandinas;

–Poliacetilenos.

ÍNDICE DE SAPONIFICAÇÃO

DEFINIÇÃO:

Número dos miligramas de hidróxido de potássio (KOH) necessário É para neutralizar os ácidos graxos resultantes da hidrolise de 1 grama da

amostra.

MATERIAL:

•Erlenmeyer de 250 ou 300 mL resistente a base;

•Condensadores com t 24/4 para ajustar os erlenmeyers;

•Banho ou chapa quente com controle de temperatura; Frasco para destilação 2 ml com t 24/40, ajustado a condensador resfriado com água, para refluxo e álcool 95% para destilação.

REAGENTES:

• Ácido hidroalcoólico 0,5 N padronizado;

•KOH alcoólico; Solução indicadora de fenolftaleína 1% em álcool etílico 95%.

PROCEDIMENTO

5 - Titular as amostras e o branco com HCl 0,5N.

1 - Preparação da Solução alcoólica de KOH.

2 - No erlenmeyer, pesar a amostra (1,2-2,2g) e adicionar 25mL de solução alcoólica junto a amostra.

3 - Preparação do branco: em um erlenmeyer adicionar 25mL da solução alcoólica de KOH.

4 - Colocar em condensador de refluxo por 1hora as amostras e o branco.

Onde:

B – volume de ácido clorídrico gasto na titulação do branco, mL;

A – volume de ácido clorídrico gasto na titulação da amostra, mL;

N_HCl– normalidade da solução do ácido clorídrico;

m_AMOSTRA – massa da amostra, em g;

PM_KOH – Peso molecular do KOH;

f_HCl – Fator de correção do HCl.

AMOSTRA

HCl KOH

HCl

m

f . .PM

A).N (mgKOH/g) (B

ção Saponifica

de

Índice  

CÁLCULO

CROMATOGRAFIA GASOSA

•FINALIDADE: Separar componentes de uma mistura, inclusive compostos voláteis, para uso ou quantificação subsequente;

•COMPONENTES: Porta de injeção através do qual as amostras

são carregadas, a "coluna" na qual os componentes são separados, um fluxo regulamentado de um gás portador (muitas vezes hélio) que transporta a amostra através do instrumento, um detector, e um processador de dados.

Fotografia 1: Vista da frente de um cromatógrafo a gás.

Fonte: GAS CHROMATOGRAPHY, 2011

Fotografia 2: Vista traseira de um cromatógrafo a gás.

Fonte: GAS CHROMATOGRAPHY, 2011

PORTA DE INJEÇÃO

•Volatilizar a amostra (apenas na fase gasosa a amostra é conduzida à coluna pelo gás de arraste – He – ou fase móvel);

• Amostras de 1 microlitro são injetadas na coluna;

COLUNA

•Onde os componentes da amostra são separados;

•Contém a fase estacionária;

•2 tipos: capilar e encamisada;

•Os componentes da amostra são separados na coluna em função dos

≠s tempos que passam na coluna dependendo em como da força de interação com a fase estacionária→ o processo repete várias vezes à medida que os compostos migram para a coluna

CROMATOGRAFIA GASOSA

•DETECTOR: Se as condições da coluna foram escolhidas corretamente os componentes da amostra vão sair da coluna vão sair da coluna e passarão pelo detector apenas uma vez.

•A escolha do detector é feita em função das classes de compostos analisadas e da sensitividade;

•GRAVADOR DE INTEGRAÇÃO: A saída do detector

(convertida da corrente para voltagem) é enviada para um gravador de integração que plota, armazena e analisa os dados.

CROMATOGRAFIA GASOSA

Figura 1: Cromatograma de óleo de buriti bruto (cromatografia gasosa)

Tabela 2: Continuação do Cromatograma de óleo de buriti bruto

• DETERMINAÇÃO: Espectrofotometria;

• A partir da leitura da absorbância da amostra na região do UV a um comprimento de onda de máxima absorção, em éter de petróleo, de 450 nm;

CAROTENÓIDES TOTAIS

104

. 2592

).

(ppm) ( Carotenos

x

m A mL V

o



•O valor registrado da absorbância → cálculo da concentração de carotenos, usando a equação:

Onde:

•V – Volume da amostra, em mL;

•A – Absorbância;

•2592 – cte Lambert-Beer para o éter de petróleo;

•m – Massa da amostra, em g;

• Obtenção da curva de calibração do padrão comercial de β–caroteno → Pesar cerca de 5,2 mg desta substância e diluir em 100 mL de éter de petróleo.

• Solução → varredura no espectrofotômetro para se conhecer o comprimento de onda de máxima absorção do β–caroteno nas condições propostas e desta forma, utilizá-lo como parâmetro na leitura dos extratos das amostras.

• Posteriormente, a partir da solução concentrada preparar sete amostras diluídas, cada uma, em 25 mL de éter de petróleo (P.A.), com concentrações variando de 0.4 a 2.8 µg/mL.

PROCEDIMENTO

Refratômetro de bancada Refratômetro portátil

ÍNDICE DE REFRAÇÃO

DETERMINAÇÃO: Refratometria.

PROCEDIMENTO:

•Calibrar o refratômetro com água destilada (IR 20 ^oC = 1,333);

•Inserir a amostra e executar a leitura.

•Obtido pela relação entre a velocidade da luz no ar (v) e no material analisado → óleo/gordura (v´).

VISCOSIDADE

DEFINIÇÃO: resistência de um fluido ao escoamento quando submetido a uma tensão cisalhante e está diretamente ligadas com as interações intermoleculares presentes.

•Tipos: Dinâmica (μ), em Pa.s (N/m².s) e Cinemática (ν), em cSt (mm²/s);

•Medição: viscosímetro.

Fotografia 3: Viscosímetro rotacional VT 550, Haake.

Fotografia 4: Viscosímetro Cannon-Fenske AVS250, Schott.

PROCEDIMENTO

VISCOSIDADE CINEMÁTICA

Viscosímetro Cannon-Fenske (SCHOTT GERATE, Tipo n 513 10 );

•Tubo capilar n 300 ( = 1,26 mm);

•Banho termostático a 40^oC

•Normas: ASTM 446, ASTM D 2515 e Norma ISO 3105

) (t

.

k e

v  

Onde:

v – viscosidade cinemática cSt (mm²/s);

k – constante característica do viscosímetro; k=0,25 para o capilar de 300;

t – tempo de escoamento da amostra, em s;

e – correção da energia cinética para o valor de T (Tabela do manual).

•Cálculo:

DENSIDADE (ρ)

•PRINCÍPIO: determinar relação sólido/líquido das gorduras comerciais;

•Determinação: por densímetro; picnômetro; dilatômetro.

Fotografia 5: Densímetro digital Kem Kyoto Electronics.

Fotografia 6: Picnômetro de 20mL com óleo de buriti.

PROCEDIMENTO

MÉTODO PICNOMÉTRICO

•Pesar o picnômetro vazio;

•Pesar o picnômetro com a amostra;

•Subtrair a massa do picnômetro com a amostra da massa do picnômetro vazio (massa da amostra);

•Dividir essa massa pelo volume do picnômetro, conforme a Equação.

Onde:

ρ – densidade (g/mL);

m – massa da amostra (g);

V – volume ocupado pela amostra (mL)

CONCLUSÃO

• De um modo geral, foram abordadas algumas análises físico-químicas feitas para óleos

vegetais a fim de se conhecer as suas

propriedades e o seu estado de conservação, bem como algumas reações químicas que corriqueiramente ocorrem com essas matérias

primas.

•ALSBERG, C.L.; TAYLOR, A.E. The Fats and Oils: a General View. California:

Research Institute, Stanford University, 1928.

•AMERICAN OIL CHEMISTS SOCIETY – AOCS. Official and Tentative Methods of the American Oils Chemists Society:

•ASSOCIATION OFFICIAL ANLYTICAL CHEMISTS – AOAC, 15 ed. Champaign:

v.1, p.69-70, AOAC, 1990.

•GAS CHROMATOGRAPHY. Disponível em:

<pages.pomona.edu/~wes04747/lab/gaschrom.doc> – Acesso em 28.10.2011.

REFERÊNCIAS

•MENDONÇA, M.A.; BORGO, L.A.; ARAÚJO, W.M.C.; NOVAIES, M.R.C.G. Alterações físico-químicas em óleos de soja submetidos ao processo de fritura em unidades de produção de refeição no Distrito Federal. Com. Ciências Saúde. v.19; n.2; p.115- 122. 2008.

•PORIM. Test Methods Carotene Content. Malaysia, 1995.

•PRIOR, R.L.; HOANG, H.; GU, L.; WU, X.; BACCHIOCCA,M.; HOWARD, L.; HAMPSCH- WOODILL, M.; HUANG, D.; OU,B.; JACOB,R. Assays for Hydrophilic Antioxidant Capacity (OXYGEN RADICAL ABSORBANCE CAPACITY - ORAC) of Plasma and Other Biological and Food Samples. Journal of Agricultural and Food Chemistry. V.51. p.

3273-3279, 2003.

•THE OLIVE OIL SOURCE. Disponível em: <http://www.oliveoilsource.com> - Acesso em 28.10.2011.

REFERÊNCIAS

Obrigada!!!!