4 Método Amostragem

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4 Método

4.1. Amostragem

Foram coletados indivíduos da espécie Perna perna da praia do Diabo (N=

40), praia Vermelha (N= 40), praia da Urca (N= 40) e Baía de Ilha Grande (N=

40). Os indivíduos foram medidos (comprimento, largura e altura da concha) com o auxílio de um paquímetro de precisão (0,01 mm) e agrupados por faixa de tamanho, totalizando 4 amostras compostas, ou pools, contendo 10 indivíduos cada. Em seguida os músculos e as glândulas dos indivíduos de cada classe de tamanho foram retirados e juntados (Figura 10). Assim, obteve-se e 4 amostras compostas de músculos e 4 amostras compostas de glândulas para cada área de estudo, cada uma contendo os órgãos de 10 indivíduos. Cabe ressaltar que uma parte das amostras foi congelada a -20 ^oC em tubos de polipropileno estéreis para determinação da atividade e caracterização de enzimas e a outra parte das amostras foi liofilizada para a caracterização de proteínas e determinação de metais, metalóides e proteínas. Este procedimento foi realizado em duas estações do ano de 2014: verão (Fevereiro) e inverno (Agosto).

Figura 10. Exemplar de mexilhão de Perna perna e esquema ilustrativo dos órgãos dissecados no presente estudo (Modificado de Leung et al., 2014).

PUC-Rio - Certificação Digital Nº 1212277/CA

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4.2. Determinação de metais, metalóides, proteínas e enzimas e caracterização de proteínas e enzimas

4.2.1. Otimização do processo de extração de MT seguido de quantificação

As amostras foram homogeneizadas em microtubos de polipropileno estéreis na proporção de 1 para 20 volumes em uma solução tampão contendo Tris-HCl 20 mmol L^-1 pH 8,6, PMFS (fenil-metil-sulfonil-fluoreto) 0,5 mmol L^-1 e TCEP 1 % e para fins de comparação as mesmas amostras foram homogeneizadas em uma solução tampão contendo Tris-HCl 20 mmol L^-1 pH 8,6, PMFS (fenil-metil-sulfonil-fluoreto) 0,5 mmol L^-1 e β-mercaptoetanol 0,01 %.

As amostras foram então centrifugadas em uma centrífuga para microtubos refrigerada modelo Mikro 220R (Hettich, Alemanha) a 20.000 x g por 60 min a 4

oC e os sobrenadantes foram cuidadosamente removidos e transferidos para outros microtubos. Foi realizado um aquecimento a 70 ôC por 10 minutos em banho-maria termostatizado (Kacil, São Paulo, Brasil) e então uma nova centrifugação a 20.000 x g por 30 minutos a 4 ôC foi realizada. Após esta última centrifugação os sobrenadantes contendo as MTs foram novamente separados e as amostras foram então congeladas a -20 ôC.

As MTs foram extraídas de acordo com o procedimento de extração térmica comparando a eficiência de extração de dois agentes redutores diferentes, β-mercaptoetanol 0,01 % (Mpbiomedicals, Ohio, EUA) e TCEP 1 % (Tris-2-carboxietil-fosfina) (Sigma-Aldrich, São Paulo, Brasil). Para a maioria das aplicações em proteômica, a faixa de concentração de TCEP 5-50 mmol L^-1 oferece excesso molar suficiente para reduzir de forma eficaz ligações dissulfeto de peptídeos ou proteínas. Por essa razão, a concentração de TCEP utilizada para o procedimento de extração (1 %) foi diferente daquela recomendada para o β-mercaptoetanol (0,01 %) (Getz et al., 1999; Erk et al., 2002; Tenório-Daussat et al., 2014).

A quantificação de MT foi realizada através do método espectrofotométrico utilizando a reação de Ellman: 50 µL das amostras contendo as metalotioneínas provenientes da extração térmica foram tratadas com 50 µL de solução de HCl 1 mol L^-1 contendo EDTA 4 mmol L^-1. Logo em seguida, adicionou-se 1400 µL da solução de NaCl 2 mol L^-1 contendo 0,43 mmol L^-1 de DTNB (ácido 5,5-ditiobis (2-nitrobenzóico) tamponado com 200 mmol L^-1 de fosfato de sódio, pH 8,0. As amostras foram incubadas no escuro por 30 minutos e as absorvâncias das

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amostras foram medidas em microcubetas de quartzo a 412 nm em um espectrofotômetro UV-VIS (Lambda 35, Perkin Elmer) (Ellman, 1959).

A concentração de MT foi estimada utilizando uma curva analítica construída com GSH como padrão externo, pois embora este método mensure todos os tióis ácidos solúveis, a glutationa representa mais de 90 % dos grupos tióis reativos, sendo considerado um padrão adequado. Os níveis de MT foram estimados assumindo a relação de 1 mol MT = 20 mol GSH como descrito por Kagi para peixes (Kagi, 1991).

4.2.2. Extração e quantificação de GSH

A extração de GSH foi realizada seguindo o protocolo de Beutler (1975), com modificações por Wilhelm-Filho, Torres et al. (2005), no qual aproximadamente 25 mg de cada tecido foi homogeneizado em 350 µL de tampão fosfato de sódio 100 mmol L^-1 pH 7,0 contendo sacarose 250 mmol L^-1 em ambiente inerte (nitrogênio 99,9 %). Em seguida, as amostras foram centrifugadas a 11.000 x g em uma centrífuga para microtubos refrigerada modelo Mikro 220R (Hettich, Alemanha) durante 30 min a 4 ^oC. Os sobrenadantes foram removidos e transferidos para microtubos estéreis e foram tratados com DTNB 0,1 mol L^-1 em tampão fosfato de sódio pH 8,0 a uma razão de 1:1. As amostras foram incubadas durante 15 min no escuro as absorvâncias das amostras foram medidas em cubetas de quartzo a 412 nm em um espectrofotômetro UV-VIS (Lambda 35, Perkin Elmer). As concentrações de GSH foram estimadas usando uma curva analítica construída com GSH como padrão externo (Monteiro, 2006).

4.2.3. Determinação de metais e metalóides na fração total e na fração termoestável

As amostras liofilizadas (fração total) e as amostras que foram extraídas para a quantificação de MT (fração termoestável) foram submetidas a digestão em meio ácido utilizando a proporção de 50 mg de amostra para 0,5 mL de ácido nítrico bidestilado (Vetec, Rio de Janeiro), sob aquecimento a 100 °C durante 4 horas. Após o resfriamento, o volume foi ajustado para 5 mL com água ultrapura (resistividade> 18 MΩ cm) para posterior análises por ICP- MS.

Os metais e metalóides foram determinados em um ICP- MS, modelo ELAN DRC II (Perkin Elmer-Sciex, Norwalk, CT, USA). O sistema para

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introdução de amostra no plasma foi o sistema padrão fornecido pelo fabricante do ICP-MS e composto de nebulizador tipo Meinhard com câmara ciclônica e twister.

Para o controle de qualidade da análise, foram realizados brancos das amostras com a finalidade de detectar qualquer contaminante proveniente do processo analítico capaz de alterar a detecção e a quantificação.

A exatidão do método foi avaliada através do uso de material de referência certificado DORM-4 (NRC, Canadá) (do inglês Dogfish Muscle Reference Material), um material de referência composto de músculo de peixe-cão impregnado com traços de diferentes metais e metalóides.

As soluções de calibração foram preparadas utilizando padrões Perkin Elmer 29 (Al, V, Cr, Mn, Fe, Ni, Cu, Zn, Ga, Se, Cd e Pb) e padrões individuais de As e Hg, todos com concentrações 100 μg L^-1 e 1000 μg L^-1. As concentrações da curva de calibração variaram de 1 a 80 µg g^-1.

Os isótopos dos elementos determinados (Ni, Cu, Zn, As, Se, Cd, Hg, Pb) foram: ⁶⁰Ni, ⁶⁵Cu, ⁶⁶Zn, ⁷⁵As,⁸²Se, ¹¹⁴Cd, ²⁰²Hg, ²⁰⁸Pb. As condições operacionais típicas para determinação dos elementos estão mostradas na Tabela 1 abaixo.

Tabela 1. Parâmetros Operacionais do ICP-MS ELAN DRC II

Potência de radiofrequência 1150 W

Amostrador e skimmer Pt

Modo de varredura Peak Hopping

Resolução 0,7 u

Varreduras por leitura 3

Leituras por replicatas 1

Replicatas 3

Dwell time 70 ms

Tempo morto 55 ns

Operação do detector Dual Mode

Vazão do gás auxiliar 1 L min^-1

Vazão do gás plasma 15 L min^-1

Vazão do gás carreador 1 L min^-1

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4.2.4. Dosagem de proteínas totais

A dosagem protéica foi realizada através do método de Lowry modificado por Peterson. Este método consiste em uma reação que se baseia na interação das proteínas com o reagente fenol e cobre em condições alcalinas. A reação colorimétrica envolve uma oxidação, catalisada por cobre e aminoácidos aromáticos por um reagente heteropolifosfato (fosfotungístico-fosfomolíbidico), desenvolvendo uma cor azul que é medida em um colorímetro e comparada com uma curva padrão (Peterson, 1977).

Foi preparada uma solução de sulfato de cobre 0,1 % (Vetec, RJ, Brasil), tartarato de sódio e potássio (Isofar, RJ, Brasil) 0,2 %, carbonato de sódio (Synth, SP, Brasil) 10 %, hidróxido de sódio (Proquímicos, RJ, Brasil) 800 mmol L^-1 e dodecil sulfato de sódio (SDS) (Sigma-Aldrich, São Paulo, Brasil) 10 %, que misturadas resultam no Reativo A. O Reativo B, por sua vez, é uma solução de Follin-Ciocalteau (Sigma-Aldrich, São Paulo, Brasil) diluída 5x com água ultrapura.

Preparou-se uma solução padrão de BSA (do inglês, Bovine Serum Albumin- BSA) 2 mg mL^-1 e então foram realizadas algumas diluições para se obter seis pontos com as seguintes concentrações para a curva: 0 µg mL^-1, 10 µg mL^-1, 20 µg mL^-1, 30 µg mL^-1, 40 µg mL^-1e 50 µg mL^-1. As amostras utilizadas para dosar proteína foram as soluções obtidas após o procedimento de extração de MT nas amostras de músculos e glândulas dos mexilhões. Foram pipetadas 10 µL e 20 µL para glândulas e músculos, respectivamente e, em seguida, foram adicionados 400 µL do "Reativo A" para cada amostra e ponto da curva. Os microtubos foram agitados manualmente e deixados em descanso por 10 min e então foi adicionado 200 µL do "reativo B", agitando novamente. As soluções foram deixadas em descanso por 30 min e, após este tempo, foi feita a medida das absorvâncias das amostras e dos padrões em microcubetas de quartzo a 750 nm em um espectrofotômetro UV-VIS (Lambda 35, Perkin Elmer). As concentrações de proteína total foram estimadas usando uma curva analítica com BSA (Sigma-Aldrich, São Paulo, Brasil).

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4.2.5. Determinação das atividades de GST

Esta etapa do trabalho foi realizada em parceria com o Departamento de Bioquímica da Universidade Estadual do Rio de Janeiro (UERJ). Os tecidos foram homogeneizados em homogeneizador tipo Potter-Elvehjem na proporção 1:4 em tampão fosfato de sódio 100 mmol L^-1 pH 7,7. O método para o ensaio de GST, consistiu em avaliar a conjugação de 5 mmol L^-1 de GSH (Sigma) com 1 mmol L^-1de 1-cloro-2,4 dinitrobenzeno (CDNB, Sigma), processo catalisado pela GST. O conjugado formado foi determinado pela medida da absorvância em microcubetas de quartzo a 340 nm por 3 min em um espectrofotômetro UV-VIS (Shimadzu UV-160). Foi utilizado o coeficiente de absortividade molar do CDNB de 9,6 mmol^-1 L^-1 cm^-1 (Habig et al., 1974). Uma unidade (U) de atividade enzimática foi definida como 1 umol de produto formado por min e as atividades foram expressas em U.mg-1 de proteínas.

4.2.6. Determinação das atividades de carboxilesterase

Esta etapa do trabalho foi realizada em parceria com o Departamento de Bioquímica da Universidade Estadual do Rio de Janeiro (UERJ). Os tecidos foram homogeneizados em homogeneizador tipo Potter-Elvehjem na proporção 1:4 em tampão fosfato de sódio 0,1 mol L^-1 pH 7,7. O substrato p- nitrofenilacetato (p-NPA) (Sigma-Aldrich, São Paulo, Brasil) em acetonitrila foi usado em concentração final de 5 mmol L^-1. O p-nitrofenol formado foi determinado pela medida da absorvância em microcubetas de quartzo a 410 nm por 3 min em um espectrofotômetro UV-VIS (Shimadzu UV-160). Foi utilizado o coeficiente de absortividade molar do p-nitrofenol de 1,3 x 10⁴ mol^-1 L^-1 cm^-1 (Morgan et al., 1994). Uma unidade (U) de atividade enzimática foi definida como 1 umol de produto formado por min e as atividades foram expressas em U.mg-1 de proteínas.

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4.2.7. Caracterização de proteínas e verificação do processo de purificação das amostras por eletroforese em gel de poliacrilamida em condições desnaturantes (SDS-PAGE)

Os protocolos experimentais para esta técnica analítica seguiram procedimentos descritos na literatura (Ge-Healthcare, 2004), no qual as proteínas foram separadas em sistema vertical Ruby SE600 (GE Healthcare®, São Paulo, Brasil). As amostras foram homogeneizadas na proporção 1:1 com o tampão de solubilização composto de 10 % SDS (p/v), β-mercaptoetanol 10 mmol L^-1, 10 % glicerol (v/v), 200 mol L^-1Tris-HCl (pH 6,8) e 0,05 % azul de bromofenol (p/v), fervidas por 5 minutos e aplicadas nos géis de policrilamida (gel de corrida 15 % e gel de empilhamento 4 %). Para estimar o peso molecular das proteínas separadas foram utilizados padrões de peso molecular Precision Plus ProteinTM Dual Color (Biorad). O programa de separação consistiu em uma primeira etapa de 10 mA/gel por 15 minutos, para uma migração lenta e, portanto, mais eficiente das proteínas do gel de empilhamento para o gel de separação; e então uma segunda etapa de 45 mA/gel por aproximadamente 3 h.

Após a separação, os géis foram revelados com nitrato de prata de acordo com o protocolo de Heukeshoven e Dernick (1985), no qual os géis foram fixados em uma solução contendo 10 % de ácido acético e 30 % de etanol, sensibilizados em uma solução contendo 200 mmol L^-1 de acetato de sódio, 4 % de tiossulfato de sódio (5 %) e 20 % de etanol, lavados em água ultra pura, incubados em uma solução contendo 10 % de nitrato de prata (2,5 %), lavados novamente com água ultra pura e então revelados em uma solução contendo 60 mmol L^-1 de carbonato de sódio e 0,08 % de formaldeído (37 %). A reação de revelação foi então interrompida com uma solução contendo 10 mmol L^-1 de EDTA e os géis foram então preservados em uma solução contendo 30 % de etanol e 4,6 % de glicerol (87 %). Os géis foram escaneados (ImageScanner II) utilizando-se o programa LabScan v.30 (GE Healtchare, Uppsala, Sweden) com o densitômetro operando a uma resolução de 300 dpi. O software Image-Master 2D Platinum 6.0 (GeneBio, Genebra, Suécia) foi utilizado para as análises de imagem dos géis.

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4.2.8. Caracterização de metaloproteínas termoestáveis por SEC-HPLC- ICP-MS

As amostras extraídas para determinação de MT foram injetadas em um HPLC (Shimadzu) acoplado a um ICP-MS (Modelo NexIon 300x, Perkin Elmer, USA) com bomba quaternária, desgaseificador e injetor manual com loop de 20 μL. As condições operacionais típicas desta análise estão descritas na Tabela 2.

Foram injetados a mesma quantidade (em massa, 40 µg) de proteínas das diferentes amostras, para permitir comparações de intensidades relativas dos sinais referentes ao metais e metalóides. Os sinais de UV-Vis foram monitorados on-line a 254 e 280 nm (comprimentos de onda associados a ligação peptídica e aminoácidos aromáticos, respectivamente), e apenas picos de UV associados a metais, ou seja, metaloproteínas, são relatados neste trabalho.

Tabela 2. Parâmetros operacionais do HPLC-ICP-MS

Condições SEC

Coluna Superdex ^TM-75 (10 x 300 x 13 mm) (GE Healthcare, Uppsala, Sweden) Faixa de resolução

efetiva 3-7 kDa

Limite de exclusão 100 kDa

Fase móvel Tris-HCl 20 mmol L^-1 (pH 7,4)

Vazão 0,7 mL min^-1

Volume da injeção 20 µL

Condições do ICP-MS Potência de

radiofrequência 1100 W

Vazão do gás plasma 17,0 L min^-1

Vazão do gás auxiliar 1,2 L min^-1

Vazão do gás

carreador 0,98 L min^-1

Amostrador e skimmer Pt

Dwell time 30 ms por isótopo

Isótopos monitorados ⁶⁰Ni, ⁶⁵Cu,⁶⁶ Zn, ⁷⁵As, ⁸²Se, ¹¹⁴Cd, ²⁰²Hg, ²⁰⁸Pb

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4.2.9. Caracterização de proteases (geral) e serino-proteases (específico) por zimografia

Primeiramente, as amostras foram homogeneizadas com tampão fosfato de sódio 100 mmol L^-1 pH 7,0 contendo sacarose 250 mmol L^-1, sonicadas por 5 minutos e centrifugadas a 16.000 x g por 15 minutos a 4º C em uma centrífuga para microtubos refrigerada modelo Mikro 220R (Hettich, Alemanha). Os sobrenadantes foram então transferidos para novos microtubos estéreis. A 250 µL do sobrenadante foram adicionados 62,5 µL de Cleanascite^TM (Ligo-Chem, Inc., Fairfield, NJ), um adsorvente não-iônico utilizado para precipitação de lipídios, gotículas de gordura e detritos celulares. Após esse procedimento as amostras foram submetidas a agitação mecânica por 1 hora a 4º C e foram centrifugadas a 16.000 x g por 1 minuto. Em seguida, os sobrenadantes foram transferidos para tubos concentradores Vivaspin^® (Sartorius, Reino Unido); que dessalinizam e concentram as amostras ao mesmo tempo, com um corte molecular de 5 kDa, foram centrifugadas a 16.000 x g por 30 minutos e os sobrenadantes foram transferidos para outros microtubos estéreis.

As amostras foram separadas em condições não-redutoras em géis SDS- PAGE em um tampão de solubilização de amostra composto de Tris-HCl, pH 6,8 500 mmol L^-1, SDS 10 % e azul de bromofenol 0,1 %.

Os géis de poliacrilamida de 12,5 % contendo 0,1 % de gelatina (Sigma- Aldrich) como substrato, foram preparados de acordo com o protocolo de Troeberg e Nagase (2003). Após a separação eletroforética os géis foram lavados 4 vezes por 15 minutos cada vez em Triton-X100 2,5 %, para remover o SDS e renaturar as proteínas. Os géis foram rapidamente rinsados em água ultra-pura e incubados “overnight” a 37 ºC em um tampão contendo Tris-HCl (pH 7,4) 50 mmol L^-1, CaCl₂.2H₂O e ZnCl₂ 0,001 mmol L^-1. Após a incubação, os géis foram corados com Coomassie Blue G-250 e descorados em solução 30 % metanol e 10 % ácido acético. As áreas de atividade enzimática foram visualizadas como áreas claras sobre um fundo azul escuro. Diferentes tempos de incubação (16 e 18 h) e diferentes massas de proteínas (40 e 60 µg) das amostras de músculos e glândulas dos mexilhões foram testado, em triplicata, e também o efeito do inibidor enzimático PMSF 10 mmol L^-1 (Troeberg e Nagase, 2003).

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4.3. Limites de detecção e quantificação

O limite de detecção (LD) é definido como a menor concentração do analito que pode ser detectada com certo grau de certeza estatística e o limite de quantificação (LQ) é definido como a menor concentração do analito, que pode ser quantificada na amostra, com exatidão e precisão aceitáveis. Foram calculados os LD e LQ para as técnicas de espectrometria de massa com plasma indutivamente acoplado e espectrofotometria.

O LD foi determinado pela razão entre o desvio padrão somado a concentração média do branco e a inclinação da curva analítica multiplicado por um fator (3) e o LQ foi determinado pela razão entre o desvio padrão somado a concentração média do branco e a inclinação da curva analítica multiplicado por um fator (10) (Miller e Miller, 1994; Welz e Sperling, 1999; Brito et al., 2003).

4.4. Análises estatísticas

Para as análises estatísticas referentes aos resultados de metais, metalóides, MT, GSH, carboxilesterase e GST em músculos e glândulas de mexilhões Perna perna, a normalidade dos dados foi testada utilizando o teste W de Shapiro-Wilkes. Após a verificação da distribuição não-normal, os resultados foram normalizados com o comprimento médio dos mexilhões para que as diferenças individuais, como o tamanho e a massa, fossem excluídos (Seixas et al., 2007). Assim, todos os testes estatísticos a partir desta etapa foram testes aplicados em dados paramétricos. O teste ANOVA foi aplicado para verificar diferenças significativas nas concentrações dos metais e metalóides, MT e GSH nos diferentes tecidos dos mexilhões entre os diferentes locais de coleta. A correlação de Pearson foi utilizada para verificar a existência de correlações significativas entre a concentração dos metais e metalóides analisados com as respectivas respostas dos biomarcadores protéicos e enzimáticos utilizados neste trabalho. As diferenças e correlações foram consideradas significativas quando p<0.05. As análises estatísticas foram realizadas utilizando o software Statistica 10 (StatSoft) para Windows e os gráficos foram plotados usando os pacotes de software Prism® e Excel®.