FACULDADE DE MEDICINA DE BARBACENA
FUNDAÇÃO JOSÉ BONIFÁCIO LAFAYETTE DE ANDRADA
NÚCLEO DE PESQUISA E EXTENSÃO
ATIVIDADE LEISHMANICIDA in vitro
DE ÓLEOS ESSENCIAIS DE Schinus molle CONTRA
Leishmania
spp.
Pré-projeto de Pesquisa apresentado ao Núcleo de Pesquisa e Extensão (NUPE) da Faculdade de Medicina de Barbacena (FAME/FUNJOB) como pré-requisito para seleção de Bolsista(s) do Programa de Iniciação Científica (PIC) da FAME/FUNJOB
Orientadora:
Profª. Drª. Dulcilene Mayrink de Oliveira (FAME) Coorientadores:
Profª. Drª. Cristiane de Melo Cazal (IF Sudeste MG) Prof. Dr. Jonatan Marques Campos (FAME)
Profª. Drª. Maria Norma Melo (UFMG)
Barbacena 2018
EQUIPE DE PESQUISADORES Orientadora:
Profª. Drª. Dulcilene Mayrink de Oliveira(1,2)
Coorientadores:
Profª. Drª. Cristiane de Melo Cazal(3)
Prof. Dr. Jonatan Marques Campos(1)
Profª. Drª. Maria Norma Melo(2)
Colaboradores:
Profª. Msc. Cristina Maria Miranda Bello(1)
Prof. Dr. José Emílio Zanzirolani de Oliveira(3)
Drª. Soraia de Oliveira Silva(2)
(1) Núcleo de Pesquisa e Extensão (NUPE), Faculdade de Medicina de Barbacena (FAME/FUNJOB) (2) Departamento de Parasitologia, Instituto de Ciências Biológicas (ICB), Universidade Federal de Minas
Gerais (UFMG)
RESUMO
As leishmanioses são enfermidades causadas por protozoários do gênero Leishmania, transmitidas por fêmeas infectadas de flebotomíneos (Diptera, Phlebotominae). De modo geral, essas enfermidades dividem se em leishmaniose tegumentar, que acomete a pele e as mucosas e a leishmaniose visceral, que acomete órgãos internos. Leishmania
braziliensis, Leishmania.amazonensis e Leishmania infantum são as espécies causadoras
das leishmanioses prevalentes no Brasil e responsáveis pelas formas tegumentar (cutânea e mucocutânea) e visceral, respectivamente. O objetivo deste trabalho é o de avaliar a atividade leishmanicida contra L. braziliensis, L. amazonensis e L. infantum de óleos essenciais (EOs) da espécie Schinus molle, planta de uso popular utilizada na medicina indígena, desde mil anos antes da era cristã. A sensibilidade das cepas dos parasitos frente aos EOs de S. molle será avaliada através da concentração inibitória em 50% (IC50) de
amastigotas intracelulares e promastigotas, tratadas in vitro; pela concentração citotóxica em 50% (CC50) de macrófagos caninos imortalizados, tratados in vitro; e pelo índice de
seletividade dos EOs. Em muitas regiões do mundo, ainda hoje, plantas de uso medicinal são a primeira e, muitas vezes, a única opção de tratamento das leishmanioses. A espécie
Schinus molle, popularmente conhecida por pimenteira-bastarda ou aroeira salsa, foi a
planta medicinal de escolha neste projeto de pesquisa por ter apresentado alta seletividade e atividade leishmanicida contra L. amazonensis, em estudo já descrito na literatura. Palavras-chave: Schinus molle; óleos essenciais; atividade leishmanicida; Leishmania
SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO ... 05 2. JUSTIFICATIVA ... 08 3. OBJETIVOS ... 09 3.1. Objetivo geral ... 09 3.2. Objetivos específicos ... 09 4. MATERIAL E MÉTODOS ... 10
4.1. Óleos essenciais de Schinus molle ... 10
4.2. Cepas de Leishmania spp. ... 10
4.3. Macrófagos caninos imortalizados DH82 ... 10
4.4. Delineamento experimental ... 11
4.5. Concentração inibitória para 50% das células (IC50) ... 14
4.5.1. IC50 em promastigotas in vitro ... 14
4.5.2. IC50 em amastigotas intracelulares in vitro ... 14
4.6. Concentração citotóxica em 50% (CC50) de macrófagos caninos DH82 in vitro ... 15
4.7. Índice de seletividade dos óleos essenciais (IS) ... 16
4.8. Análise estatística ... 16
5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 17
6. CRONOGRAMA DAS ATIVIDADES ... 20
7. ORÇAMENTO E FONTE FINANCIADORA ... 21
7.1. Orçamento ... 21
1. INTRODUÇÃO
Segundo a Organização Mundial de Saúde (OMS), as leishmanioses são doenças infecto-parasitárias negligenciadas1, que estão amplamente distribuídas no Velho e no
Novo Mundo. São endêmicas em cinco continentes, sendo registradas em 98 países e três territórios, abrangendo países subdesenvolvidos, em desenvolvimento ou mesmo desenvolvidos, com prevalência nas áreas de clima temperado a tropical. Estima-se que cerca de 14 milhões de pessoas estejam infectadas e que 350 milhões estejam em situações de risco de infecção. O Brasil está entre os países com maior número de casos registrados no Mundo2,3.
As leishmanioses apresentam uma grande diversidade epidemiológica, sendo causadas por várias espécies de protozoários do gênero Leishmania4,5, mantendo seu ciclo
de infecção entre flebotomíneos e hospedeiros mamíferos. Os agentes etiológicos das leishmanioses são protozoários da ordem Kinetoplastida, da família Trypanosomatidae e do gênero Leishmania, cujos vetores são Diptera, Psychodidae, Phlebotominae, dos gêneros Lutzomyia no Novo Mundo e Phlebotomus no Velho Mundo6,7. O ciclo biológico
do parasito alterna entre as formas amastigota (intracelular obrigatória), no hospedeiro mamífero; e promastigotas (extracelular), no trato digestório do vetor.
De acordo com as espécies que infectam o ser humano, as leishmanioses podem ser classificadas em dois grandes grupos: (1) Leishmaniose Visceral (LV), conhecida como calazar, que pode assumir um carácter espectral com diversas formas clínicas, variando de assintomática, às formas subclínicas ou oligossintomáticas, agudas e o calazar clássico, e (2) Leishmaniose Tegumentar (LT) com as formas cutânea (LC), mucocutânea (LMC), cutâneo-difusa (LCD) e cutânea disseminada (LCDB)8,9.
Leishmania braziliensis, Leishmania.amazonensis e Leishmania infantum são as espécies
causadoras das leishmanioses prevalentes no Brasil e responsáveis pelas formas tegumentar (cutânea e mucocutânea) e visceral, respectivamente.
As leishmanioses ocorrem de forma endêmico-epidêmica, apresentando diferentes padrões de transmissão relacionados não somente à penetração do ser humano em focos silvestres, mas frequentemente em áreas de expansão agrícola. A doença está presente em áreas de colonização antigas, mostrando uma possível adaptação de vetores e reservatórios em ambientes modificados pelo ser humano com urbanização em muitas áreas do Brasil.
O tratamento humano das leishmanioses é baseado principalmente no uso de antimoniais pentavalentes (SbV), entre eles o antimoniato de N-metilglucamina
(Glucantime®) e o estibogluconato de sódio (Pentostan®). No Brasil, o Glucantime® tem sido utilizado como fármaco de primeira escolha, enquanto fármacos de segunda linha, como a anfotericina B e sua forma lipossomal (Ambisome®), têm sido recomendados nos casos de intolerância e/ou resistência ao tratamento convencional10.
A emergência de cepas de Leishmania spp. resistentes ao antimônio tornou-se uma séria ameaça à saúde pública em diversos países endêmicos11–14, diminuindo
acentuadamente a eficácia do tratamento humano; elevando o risco de mortes em decorrência da infecção15 e tornando essencial a identificação de novos fármacos16.
Tradicionalmente, as plantas medicinais têm sido utilizadas para aliviar sintomas e melhorar a saúde humana. Mesmo hoje, em muitas regiões do mundo, plantas de uso popular são a primeira e, muitas vezes, a única opção de tratamento das leishmanioses17.
Nos Estados Unidos (EUA) e Reino Unido, cerca de 25% dos medicamentos atualmente prescritos possuem como princípio ativo compostos isolados de plantas. No entanto, menos que 10% de 250 mil plantas de uso medicinal no mundo possuem suas propriedades farmacológicas estudadas cientificamente, constituindo um vasto reservatório inexplorado de potenciais novos fármacos18.
Algumas espécies de plantas contêm grande quantidade de óleos essenciais (EOs), presentes como uma mistura complexa de compostos lipofílicos voláteis e semi-voláteis. EOs são metabólitos secundários classificados como Generally Regarded As Safe (GRAS), ou seja, seguros para a saúde, sendo muito utilizados pela indústria farmacêutica devido às suas propriedades antimicrobianas e antiparasitárias. Esses compostos podem ser sintetizados por todos os órgãos da planta e são armazenados em células secretoras, cavidades, canais, células epidérmicas ou tricomas glandulares19,20. O mecanismo de ação
antiparasitária dos EOs pode estar relacionado ao rompimento da membrana plasmática devido às suas propriedades lipofílicas, que levam à lise celular. Além disso, os óleos essenciais podem interagir com as membranas mitocondriais para gerar radicais livres, os quais oxidam macromoléculas do parasito, levando à sua morte por necrose ou apoptose21,22.
A espécie Schinus molle, popularmente conhecida por pimenteira-bastarda ou aroeira salsa, é uma planta da família Anacardiaceae, amplamente distribuída pela Região Sul do Brasil. Os óleos essenciais de S. molle são compostos, principalmente, por flavonoides, alcaloides e taninos23; e têm sido utilizados na medicina popular devido às
suas propriedades antimicrobiana, antimicótica e antiparasitária24. Em um estudo
conduzido in vitro por Delgado-Altamirano et al. (2017), o extrato orgânico de S. molle demonstrou altas seletividade e atividade leishmanicida contra promastigotas de
Leishmania amazonensis, além de uma concentração inibitória (IC50) abaixo de 50 µg/mL
em amastigotas do parasito, sugerindo que possíveis fármacos derivados de extratos orgânicos da planta podem ser uma alternativa ao tratamento das leishmanioses ou, até mesmo, funcionar como adjuvante aos fármacos comercialmente disponíveis17.
2. JUSTIFICATIVA
O tratamento das leishmanioses é baseado no uso de antimoniais pentavalentes (SbV), entre eles o Glucantime®, fármaco utilizado como primeira escolha no Brasil. No
entanto, a emergência de cepas de Leishmania spp. resistentes ao antimônio tornou-se uma séria ameaça à saúde pública em diversos países endêmicos, diminuindo acentuadamente a eficácia do tratamento humano; elevando o risco de mortes em decorrência da infecção e tornando essencial a identificação de novos fármacos
Em muitas regiões do mundo, ainda hoje, plantas de uso popular são a primeira e, muitas vezes, a única opção de tratamento das leishmanioses. Algumas espécies de plantas de uso medicinal contêm grande quantidade de óleos essenciais (EOs), que são metabólitos secundários classificados como Generally Regarded As Safe (GRAS), ou seja, seguros para a saúde, sendo muito utilizados pela indústria farmacêutica devido às suas propriedades antimicrobianas e antiparasitárias.
Este projeto propõe estudar a atividade leishmanicida de EOs extraídos de frutos e folhas da espécie Schinus molle, devido à sua alta seletividade e atividade leishmanicida já descritas na literatura. Possíveis fármacos derivados da planta, principalmente de seus óleos essenciais, podem ser uma alternativa ao tratamento das leishmanioses ou, até mesmo, funcionar como adjuvante aos fármacos comercialmente disponíveis.
3. OBJETIVOS 3.1. Objetivo geral
Avaliar a atividade leishmanicida de óleos essenciais de Schinus molle, extraídos de frutos e folhas da planta, contra cepas das espécies Leishmania braziliensis,
Leishmania amazonensis e Leishmania infantum.
3.2. Objetivos específicos
Avaliar a sensibilidade in vitro das cepas de Leishmania frente aos óleos essenciais de S. molle, através da concentração inibitória para 50% (IC50) de amastigotas
intracelulares e promastigotas;
Avaliar a citotoxicidade dos óleos essenciais de S. molle em macrófagos caninos imortalizados tratados in vitro, através da concentração citotóxica em 50% das células (CC50);
4. MATERIAL E MÉTODOS
4.1. Óleos essenciais de Schinus molle
Os óleos essenciais (EOs) de Schinus molle (SmEO) foram previamente extraídos de frutos (SmEO-fr) e folhas (SmEO-fo) da espécie e já se encontram quimicamente caracterizados. Amostras de SmEO-fr e SmEO-fo serão gentilmente cedidas pela Profª. Drª. Cristiane de Melo Cazal, Diretora de Pesquisa, Inovação e Pós-graduação do IF Sudeste MG, campus Barbacena; e coorientadora deste projeto de pesquisa. Os óleos essenciais serão mantidos a - 20°C até o momento do uso.
4.2. Cepas de Leishmania spp.
Serão utilizadas as cepas MHOM/BR/1975/M2903 de Leishmania (Viannia)
braziliensis, MHOM/BR/1967/PH8 de Leishmania (Leishmania) amazonensis e
MCAN/BR/2002/BH400 de Leishmania (Leishmania) infantum.
Essas cepas encontram-se no criobanco de cepas de Leishmania spp., sob os cuidados da Profª. Drª. Maria Norma Melo, coordenadora do Laboratório de Biologia de Leishmania, Departamento de Parasitologia, ICB, UFMG; e coorientadora deste projeto de pesquisa.
Os parasitos serão retirados da criopreservação e cultivados em meio α-MEM (Minimum Essential Medium) suplementado com 10% de soro fetal bovino (SFB) inativado e Penicilina/Estreptomicina (P/E) nas concentrações de 50 μg/mL e 50 U/mL, respectivamente (meio α-MEM completo). Os parasitos serão mantidos em estufa BOD à temperatura de 24ºC e repicados periodicamente na fase logarítmica de crescimento, para a manutenção de 107-108 promastigotas/mL.
4.3. Macrófagos caninos imortalizados DH82
Os macrófagos caninos imortalizados DH82 (ATCC® CRL-10389™) serão cultivados em meio RPMI (Roswell Park Memorial Institute) 1640 suplementado com 10% de soro fetal bovino (SFB) inativado e com Penicilina/Estreptomicina (P/E) nas concentrações de 50 μg/mL e 50 U/mL, respectivamente (meio RPMI completo). O cultivo será mantido e repicado em temperatura de 37ºC e à 5% de CO2.
4.4. Delineamento experimental
O delineamento experimental do estudo, bem como as técnicas que serão utilizadas na obtenção dos dados, estão esquematizados na Figura 1. Todos os experimentos propostos no fluxograma, exceto a obtenção dos óleos essenciais (Figura 1.1, etapa concluída), serão realizados no Laboratório de Biologia de Leishmania, Departamento de Parasitologia, ICB, UFMG; e supervisionados pela Profª. Drª. Maria Norma Melo, coorientadora deste projeto.
Figura 1. Delineamento experimental proposto. (1) Obtenção dos óleos essenciais de Schinus molle (etapa concluída); (2) Tratamento de cepas de Leishmania.spp. com óleos essenciais de S. molle; (3) Análise in vitro da atividade leishmanicida dos óleos essenciais frente ao parasito. Abreviações: SmEO, óleos essenciais de Schinus molle; SmEO-fr, óleo essencial de frutos de S. molle; SmEO-fo, óleo essencial de folhas de S. molle.
As cepas de Leishmania spp. serão tratadas com os óleos essenciais derivados de folhas ou frutos da planta (Figura 2). Além disso, cada cepa será tradada com o diluente dos óleos essenciais (controles negativos do experimento) e com antimonial trivalente SbIII [Tartarato de antimônio e potássio (C
8H4K2O12Sb2•3H2O), Sigma-Aldrich®] nas
mesmas concentrações utilizadas com os óleos essenciais. Esses grupos serão utilizados para a análise da atividade leishmanicida in vitro dos óleos essenciais de S. molle contra as cepas do parasito, através dos seguintes testes de sensibilidade aos fármacos:
Concentração inibitória para 50% das células (IC50)
IC50 em promastigotas in vitro
IC50 em amastigotas intracelulares in vitro
Concentração citotóxica em 50% (CC50) de macrófagos caninos DH82 in
vitro
Índice de seletividade dos óleos essenciais (IS)
Figura 2. Grupos experimentais propostos. As cepas de Leishmania spp (L. braziliensis, L. amazonensis e L. infantum) serão divididas em grupos e tratadas com os óleos essenciais de S. molle, com o diluente dos óleos, com antimonial trivalente (SbIII) ou não tratadas. Abreviações: EO, óleo essencial; SbIII, antimonial trivalente; SmEO-fr, óleo essencial de frutos de S. molle; SmEO-fo, óleo essencial de folhas de S. molle; Ctrl, controle(s).
4.5. Concentração inibitória para 50% das células (IC50)
4.5.1. IC50 em promastigotas in vitro
A concentração inibitória de 50% do crescimento de promastigotas de Leishmania spp., em relação aos óleos essenciais de Schinus molle (SmEO) avaliados, será mensurada através do ensaio de redução do MTT25.
Formas promastigotas das cepas de Leishmania spp., na concentração de 1×106
células/mL, em fase logarítmica de crescimento, serão inoculadas em 1 mL de meio α-MEM completo, em placas de 24 poços, na presença de diferentes concentrações dos
SmEO (200; 100; 50; 25; 12,5 e 6,25 µg/mL) e incubadas sob agitação a 24°C. Após o
período de 72h de incubação, 300 µL do cultivo serão transferidos para placas flexíveis de 96 poços de fundo côncavo. Em cada poço, serão adicionados 10 µL de uma solução de MTT (5 mg/mL). A placa será incubada por 4h em estufa à 37ºC. Após esse período as placas serão centrifugadas a 800×g por 15 min, o sobrenadante será descartado e serão adicionados 100 µL de DMSO em cada poço. As placas serão submetidas à agitação de 500 rpm por 1h à temperatura ambiente, a fim de solubilizar os cristais de formazan.
A absorbância correspondente a cada amostra será mensurada através da leitura a 570 nm em espectrofotômetro. A absorbância obtida dos parasitos não expostos aos
SmEO será considerada como controle de 100% de viabilidade celular. A inibição de
crescimento será determinada pelo percentual de redução do crescimento dos parasitos expostos às diferentes concentrações dos SmEO em comparação aos parasitos não expostos (crescimento relativo).
4.5.2. IC50 em amastigotas intracelulares in vitro
Após cultivo, macrófagos caninos imortalizados (DH82) serão quantificados em câmara de Neubauer com o auxílio do corante vital azul de Trypan 0,4%. A concentração dos macrófagos será ajustada com meio RPMI completo, para conter 5×105 células/mL e
a suspensão será distribuída em placas de 24 poços no volume de 1 mL/poço, com cada poço contendo uma lamínula estéril de 13 mm de diâmetro. As placas serão incubadas a 37ºC em estufa com atmosfera de 5% de CO2 por 2h, para aderência dos macrófagos às
Após o período de incubação, os cultivos serão visualizados em microscópio invertido e os poços serão lavados três vezes com meio RPMI completo, previamente aquecido a 37ºC, para remover possíveis células não aderentes. Em seguida, será adicionado aos poços 1 mL de meio RPMI completo contendo 5×106 promastigotas (10
promastigotas/macrófago) das cepas de Leishmania estudadas, obtidas na fase logarítmica de crescimento. As placas serão incubadas em estufa de 5% de CO2 a 37°C
por 8h, período de infecção dos macrófagos.
Após o período de infecção, os poços serão lavados por três vezes com meio RPMI completo e incubados em estufa de 5% de CO2 a 37°C por 72h, na presença das diferentes
concentrações dos SmEO (200; 100; 50; 25; 12,5 e 6,25 µg/mL). Poços na ausência dos
SmEO serão estabelecidos como controle.
Após 72h, as lamínulas serão retiradas dos poços, secadas à temperatura ambiente, coradas com o Kit Panótico Rápido® (Laborclin) e montadas em lâminas com Entelan (Merck). As lamínulas serão observadas em microscópio óptico. A taxa de infecção será estimada pela contagem do número de macrófagos infectados e não infectados, em relação às concentrações dos fármacos.
4.6. Concentração citotóxica em 50% (CC50) de macrófagos caninos DH82 in vitro
O ensaio de citotoxicidade em macrófagos caninos imortalizados (DH82) será realizado pelo método colorimétrico da sulforodamina B.
Cem microlitros de uma suspensão de macrófagos caninos DH82 (5x105 céls/mL
em meio RPMI 1640) serão semeados em placas de 96 poços e incubados a 37°C com tensão de 5% de CO2. Após 24h de incubação, serão adicionadas 100 μL das várias
concentrações dos SmEO (200; 100; 50; 25; 12,5 e 6,25 µg/mL) e as placas serão incubadas por mais 72h. O crescimento celular será avaliado através do método colorimétrico de sulforodamina B, como descrito por Skehan et al. (1990)26, com poucas
modificações. As células serão fixadas com 50 μL de ácido tricloroacético a 10% em temperatura de 4ºC por 1h, lavadas 5 vezes com água corrente e secas. Em seguida serão adicionados 50 μL de solução de sulforodamina B (0,4% p/v em ácido acético aquoso 1%) em cada poço e a placa será incubada por 30 min a 4ºC ao abrigo da luz. O corante será removido lavando-se os poços 4 vezes com ácido acético 1%. Para avaliação do crescimento celular serão adicionados 150 μL de Tris base a 10 mM em cada poço. A
placa será agitada por 15 min e a leitura realizada em espectrofotômetro a uma densidade óptica (DO) de 550 nm.
4.7. Índice de seletividade dos óleos essenciais (IS)
O índice de seletividade (IS) mede o quanto um composto é ativo contra o parasito, sem causar danos à viabilidade das células de mamíferos. O IS será calculado pela razão entre o CC50 de macrófagos caninos imortalizados (DH82) pelo IC50 de amastigotas
intracelulares27. Quanto menor essa razão, mais seletivo é o composto e,
consequentemente, menor efeito ele tem sobre a célula hospedeira de mamífero. 4.8. Análise estatística
Os resultados serão submetidos ao teste t de Student ou à Análise de Variância (ANOVA), seguida pelo teste de Bonferroni. Diferenças serão consideradas significativas quando p ˂ 0,05.
5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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7. ORÇAMENTO E FONTE FINANCIADORA 7.1. Orçamento
7.2. Fonte financiadora
Este projeto será financiado pelo CNPq, através da Bolsa de Produtividade em Pesquisa 1A e da taxa de bancada (CNPq nº 306952/2017-3) da Profª. Drª. Maria Norma Melo, coordenadora do Laboratório de Biologia de Leishmania, Professora Titular Emérita do Departamento de Parasitologia, ICB, UFMG e coorientadora deste projeto.
