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Efeito da dieta hiperlipídica e melatonina sobre a lesão periapical na sensibilidade a insulina, inflamação, perfil lipídico e estresse oxidativo em musculo esquelético de ratos

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Academic year: 2023

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RODRIGO MARTINS DOS SANTOS

EFEITO DA DIETA HIPERLIPÍDICA E MELATONINA SOBRE A LESÃO PERIAPICAL NA SENSIBILIDADE A INSULINA, INFLAMAÇÃO, PERFIL LIPÍDICO E ESTRESSE OXIDATIVO EM MUSCULO ESQUELÉTICO DE RATOS

Araçatuba 2022

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RODRIGO MARTINS DOS SANTOS

Efeito da dieta hiperlipídica e melatonina sobre a lesão periapical na sensibilidade a insulina, inflamação, perfil lipídico e estresse oxidativo em musculo esquelético de ratos

.

Araçatuba 2022

Tese apresentada à Faculdade de Odontologia do Campus de Araçatuba - Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” - UNESP, para obtenção do título de “Doutor em Ciências Fisiológicas”.

Orientadora: Profa. Titular Dóris Hissako Matsushita

Coorientador(a): Sandra Helena Penha de Oliveira

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Catalogação na Publicação (CIP)

Diretoria Técnica de Biblioteca e Documentação – FOA / UNESP Santos, Rodrigo Martins dos.

S237e Efeito da dieta hiperlipídica e melatonina sobre a lesão periapical na sensibilidade a insulina, inflamação, perfil lipídico e estresse oxidativo em musculo esquelético de ratos / Rodrigo Martins dos Santos. – Araçatuba, 2022 103 f. : il. ; tab.

Tese (Doutorado) – Universidade Estadual Paulista, Faculdade de Odontologia de Araçatuba

Orientadora: Profa. Dóris Hissako Matsushita

Coorientadora: Profa.Sandra Helena Penha de Oliveira 1. Melatonina 2. Resistência à insulina 3. Estresse oxidativo 4. Doenças periodontais 5. Receptor 4 toll-like 6. Inflamação I. T.

CDD 612

Claudio Hideo Matsumoto CRB-8/5550

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Dados curriculares

Nascimento: 13.05.1991- Ilha Solteira –SP

Filiação: Vilma Gonçalves Martins Santos José dos Santos

2011/2015: Curso de Graduação em Licenciatura em Ciências Biológicas pela Universidade Federal do Mato Grosso do Sul – UFMS

2016/2018: Curso de Pós-Graduação em Ciências Fisiológicas, nível de Mestrado, na Faculdade de Odontologia do Campus de Araçatuba - Universidade Estadual Paulista

“Júlio de Mesquita Filho” – UNESP.

2018/2022: Curso de Pós-Graduação em Ciências Fisiológicas, nível de Doutorado, na Faculdade de Odontologia do Campus de Araçatuba - Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” – UNESP.

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Dedicatória

A Deus e minha família por sempre acreditarem na minha vitória

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AGRADECIMENTOS

Primeiramente a Deus por me oferecer o dom da vida e do aprendizado e oportunidade de prosseguir em meus estudos.

À UNESP – Universidade Estadual Paulista, pela possibilidade de realizar este curso.

À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), pela concessão da bolsa de estudos e apoio financeiro (Processo nº 2019/08520-0), o qual foi imprescindível para a execução do projeto de doutorado.

À Diretoria da Faculdade de Odontologia de Araçatuba – UNESP: Prof. Tit. Glauco Issamu Miyahara e ao Vice-Diretor Prof. Tit. Alberto Carlos Botazzo Delbem.

Agradecimento especial a minha família: minha Mãe Vilma, meu pai José, minhas irmãs Jaqueline e Vanessa e meu irmão Wagner, e ao meu avô Waldemar, agradeço a todos pelo apoio, incentivo e toda fé depositada em mim. Sem vocês essa jornada não seria possível. Amo vocês!

À minha orientadora, Profª Drª Doris Hissako Matsushita pelos ensinamentos transmitidos ao longo destes quatro anos de doutorado

Ao professor Drº Antônio Hernandes Chaves Neto pelos pareceres semestrais do projeto, além dos diversos ensinamentos e amizade ao longo deste período.

Aos amigos do laboratório Bianca Elvira Belardi, Maria Sara de Lima Coutinho Mattera, Thais Verônica Tsosoura, Fernando Yamamoto Chiba, Núbia Ramos Carvalho e Lara Teschi Bravo agradeço por todo ensinamento e amizade em todos esses anos. Agradeço aos alunos de iniciação científica Heloiza Macedo Sampaio, Letícia Trabalon, Nicole Carvalho Barbosa por prestarem auxílio durante minha pesquisa.

A todos os professores do departamento de Ciências Básicas: Sandra Helena Penha de Oliveira, Ana Cláudia Nakamune, Cristina Antoniali Silva, Wilson Galhego Garcia, Rita Cássica Menegati Dornelles, João Carlos Callera, Antônio Hernandes Chaves Neto, Edilson Ervolin, por somarem seus conhecimentos durante meu aprendizado.

A todos os funcionários da UNESP, que de acordo com suas funções, prestaram seu importante parcela de contribuição nos diferentes estágios de realização desta pesquisa.

Aos funcionários da Biblioteca, Cláudio Hideo Matsumoto, Ana Cláudia Martins Grieger Manzatti, Ana Paula Rimoli de Oliveira, Denise Haruyo Nakamura, Ivone Rosa de Lima Munhoz, Luís Claudio Sedlacek, Luzia Anderlini e Maria Cláudia de Castro Benez, sempre prontos para nos ajudar.

Aos funcionários da Seção Técnica de Apoio ao Ensino, Pesquisa e Extensão (STAEPE), Samuel Aparecido Patim, Maurício Hiromi Tutumi e Patrick Santos Nogueira da Silva.

Aos funcionários da Seção de Pós-Graduação da FOA/UNESP, Valéria Queiroz Marcondes Zagatto, Cristiane Regina Lui Mattos, Lilian Sayuri Mada, pela atenção dispensada e grande disposição em atender.

Aos funcionários do Setor de Biotério, João Batista Alves Correa e Arnaldo César dos Santos

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À funcionária Eliseide Maria Ferreira Silva Navega, pela presteza e carinho dedicado aos alunos.

A todos, que me ajudaram direta ou indiretamente para conclusão do mestrado, meu muito obrigado pela indispensável ajuda na execução de cada uma das etapas deste trabalho.

Gratidão a Deus sempre!

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“E o futuro é uma astronave Que tentamos pilotar Não tem tempo, nem piedade Nem tem hora de chegar Sem pedir licença, muda a nossa vida E depois convida a rir ou chorar Nessa estrada não nos cabe Conhecer ou ver o que virá O fim dela ninguém sabe Bem ao certo onde vai dar Vamos todos numa linda passarela De uma aquarela Que um dia enfim descolorirá”

Aquarela Canção de Toquinho

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SANTOS, R.M. EFEITO DA DIETA HIPERLIPÍDICA E MELATONINA SOBRE A LESÃO PERIAPICAL NA SENSIBILIDADE A INSULINA, INFLAMAÇÃO, PERFIL LIPÍDICO E ESTRESSE OXIDATIVO EM MUSCULO ESQUELÉTICO DE RATOS.

2022. F 103 Tese (Doutorado) – Faculdade de Odontologia, Universidade Estadual Paulista, Araçatuba, 2022

RESUMO

Atualmente, na literatura, existem diversos tipos de dietas alimentares administradas em animais que visam verificar os efeitos em seu metabolismo e em sua saúde sistêmica, com intuito de compreender como essas dietas podem afetar a saúde humana. Sendo assim, é fundamental verificar a relação entre o consumo de dietas ricas em gordura juntamente com infecções endodônticas associadas, tais como: a periodontite apical (PA), pois ambas compartilham efeitos sistêmicos como a resistência insulínica, e o aumento de mediadores inflamatórios. A melatonina (MEL) vem sendo utilizada em cenários clínicos para várias doenças crônicas (diabetes, dislipidemias, doenças cardiovasculares), além de patologias orais; isso se deve as suas propriedades antioxidantes e anti-inflamatórias. Portanto, o objetivo deste estudo foi investigar os efeitos do tratamento com ME em ratos com periodontite apical (PA) alimentados com dieta hiperlipídica (DHL) sob à sensibilidade a insulina, citocinas plasmáticas, expressão proteica e gênica de Toll-like receptor tipo 4 (TLR-4) e sua via de sinalização e estresse oxidativo no músculo gastrocnêmico (MG). Para tanto, 80 ratos Wistar com 60 dias foram distribuídos em 8 grupos (n=10): 1) controle (CN); 2) PA; 3) DHL; 4) DHL+PA; 5) CN+MEL); 6) PA+MEL; 7) DHL+MEL; 8) DHL+PA+MEL.

Os grupos com DHL foram alimentados com uma dieta composta por 45,5% de ração padrão + 22,7% de banha animal e gordura vegetal + 9% de açúcar; os demais grupos receberam dieta padrão. No 7º dia os grupos com PA foram submetidos a indução cirúrgica da PA e, após 70 dias da indução da PA, os animais do grupo com melatonina receberam MEL (5 mg/Kg) diluída na água de beber, por 30 dias. Ao término do tratamento foram avaliados os seguintes parâmetros: 1) ingestão hídrica, alimentar e evolução da massa corpórea; 2) Histologia dos maxilares; 3) glicemia, insulinemia e HOMA-IR; 4) concentrações plasmáticas de TNF-α, IL-1β, IL-6 e LPS;

5) perfil lipídico; 6) expressão gênica e proteica do TLR4 e sua via de sinalização intracelular: MyD88, TRIF, IRF-3 e NFκB no MG; 7) estresse oxidativo: proteína carbonilada (PC) e substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARs), capacidade antioxidante total não-enzimática (FRAP) e das concentrações de glutationa reduzida (GSH), superóxido disumutase (SOD), Catalase (CAT) e Glutationa peroxidase (GPx).

A análise estatística foi feita por análise de variância ANOVA seguida pelo teste de Tukey, o nível de significância será de 5%. Os resultados do presente estudo demonstraram que: 1) Os grupos alimentados com DHL apresentaram diminuição da massa corpórea, menor ingestão hídrica, alimentar e maior ingestão energética quando comparados aos grupos alimentados com dieta padrão; 2) Os grupos DHL e DHLPA apresentaram aumento do peso absoluto do tecido adiposo periepididimal (TAB); os grupos alimentados com DHL apresentaram diminuição do peso MG; o tratamento com ME promoveu diminuição do peso do TAB; 3) Os grupos DHL e DHLPA apresentaram aumento da glicemia; o grupo DHLPA aumento da insulinemia;

PA, DHL e DHLPA demonstraram resistência insulínica e o tratamento com MEL reverteu as alterações na glicemia, insulinemia e resistência insulínica 4) Perfil lipídico:

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os grupos DHL e DHLPA apresentaram aumento de LDL e diminuição de HDL, o tratamento com ME reverteu esta alteração; 5) Citocinas: os grupos PA, DHL e DHLPA mostraram aumento do TNF-α, e a ME reverteu; o tratamento com MEL diminuiu os níveis de IL-1β plasmáticos nos grupos PAME e DHLMEL; não houve alterações nos níveis de IL-6 plasmáticos; houve redução na concentração plasmática de LPS apenas no grupo DHLME; 6) Expressão gênica e proteica: houve aumento da expressão proteica de IRF-3 nos grupos PA, DHL e DHLPA no MG e o tratamento com MEL diminuiu a expressão da proteína apenas nos grupos PAMEL e DHLMEL;

7) Não houve alterações na expressão gênica do TLR4 e sua via de sinalização celular; 8) Estresse oxidativo: TBARS aumentou nos grupos PA e DHLPA, e MEL reverteu apenas no grupo DHLPAMEL; PC aumentou em todos os grupos DHL e melhorou nos grupos MEL; a atividade da GSH diminuiu em todos os grupos experimentais, e a MEL aumentou esse parâmetro apenas nos grupos CNME e PAME; FRAP não se alterou entre os grupos, mas o tratamento com ME aumentou sua atividade nos grupos PAMEL e DHLMEL; a MEL aumentou a SOD nos grupos CN e AP. Conclui-se que a associação da DHL e da PA intensificou as alterações observadas neste estudo. O tratamento com ME demonstrou ser um importante recurso para reversão destas alterações devido aos seus efeitos antioxidantes, anti- inflamatório e hipocolesterolêmicos. Sendo assim estudos clínicos devem ser realizados para verificar os efeitos sistêmicos e inflamatórios do PA e DHL.

Palavras-chave: Melatonina. Resistência à insulina. Estresse Oxidativo. Doenças periodontais. Receptor 4 toll-like. Inflamação

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SANTOS, R.M.Effect of high fat diet and melatonin on periapical lesion on insulin sensitivity, inflammation, lipid profile and oxidative stress in skeletal muscle of rats.

F.103 Thesis (Ph.D.) - School of Dentistry of Araçatuba, São Paulo State University, 2022.

ABSTRACT

Currently in the literature there are several types of diets administered to animals that aim to verify their effects on metabolism and systemic health of animals, in order to understand how these diets can affect human health. Therefore, it is essential to verify the relationship between the consumption of high-fat diets together with associated endodontic infections such as apical periodontitis (AP), since both share systemic effects such as insulin resistance and increased inflammatory mediators. Currently, melatonin (MEL) has been used in clinical scenarios for several chronic diseases (diabetes, dyslipidemia, cardiovascular diseases) in addition to oral pathologies; all this thanks to its antioxidant and anti-inflammatory properties. Therefore, the aim of this study was to investigate the effects of ME treatment in rats with apical periodontitis (AP) fed a high-fat diet (HFD) on insulin sensitivity, plasma cytokines, protein and gene expression of Toll-like receptor type 4 (TLR-4) and it signaling pathway and oxidative stress in the gastrocnemius muscle (GM). For this purpose, 80 Wistar rats aged 60 days were divided into 8 groups (n=10): 1) control (CN); 2) AP; 3) HFD; 4) HFD+AP;

5) CN+MEL); 6) AP+MEL; 7) HFD+MEL; 8) HFD+AP+MEL. HFD groups were fed a diet consisting of 45.5% standard chow + 22.7% animal fat and vegetable fat + 9%

sugar; the other groups received a standard diet. On the 7th day, the groups with BP underwent surgical induction of BP and, 70 days after AP induction, the animals in the melatonin group received MEL (5 mg/Kg) diluted in drinking water for 30 days. At the end of treatment, the following parameters were evaluated: 1) water and food intake and evolution of body mass; 2) Histology of the jaws; 3) glycemia, insulinemia and HOMA-IR; 4) plasma concentrations of TNF-α, IL-1β, IL-6 and LPS; 5) lipid profile; 6) gene and protein expression of TLR4 and its intracellular signaling pathway: MyD88, TRIF, IRF-3 and NFκB in MG; 7) oxidative stress: protein carbonyl (PC) and thiobarbituric acid reactive substances (TBARs), total non-enzymatic antioxidant capacity (FRAP) and concentrations of reduced glutathione (GSH), superoxide disumutase (SOD), Catalase (CAT) and Glutathione peroxidase (GPx). Statistical analysis was performed by analysis of variance ANOVA followed by Tukey's test, the significance level will be 5%. The results of the present study demonstrated that: 1) The groups fed HFD showed a decrease in body mass, lower water and food intake and higher energy intake when compared to the groups fed a standard diet; 2) The HFD and HFDAP groups showed an increase in the absolute weight of the periepididymal adipose tissue (WAT); groups fed with DHL showed a decrease in MG weight; treatment with ME promoted a decrease in WAT weight; 3) The HFD and DHLPA groups showed increased glycemia; the HFDAP group increased insulinemia;

AP, HFD and HFDAP showed insulin resistance and treatment with MEL reversed changes in glycemia, insulinemia and insulin resistance 4) Lipid profile: HFD and HFDAP groups showed an increase in LDL and a decrease in HDL, treatment with ME reversed this change; 5) Cytokines: the AP, HFD and HFDAP groups showed an increase in TNF-α, and ME was reversed; treatment with MEL decreased plasma IL- 1β levels in the APMEL and HFDMEL groups; there were no changes in plasma IL-6 levels; there was a reduction in the plasma concentration of LPS only in the HFDMEL group; 6) Gene and protein expression: there was an increase in the protein expression of IRF-3 in the AP, HFD and HFDAP groups in MG and the treatment with MEL

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decreased the protein expression only in the APMEL and HFDMEL groups; 7) There were no changes in TLR4 gene expression and its cell signaling pathway; 8) Oxidative stress: TBARS increased in the AP and HFDPA groups, and MEL reversed only in the HFDAPMEL group; CP increased in all DHL groups and improved in MEL groups; GSH activity decreased in all experimental groups, and MEL increased this parameter only in CNMEL and APME groups; FRAP did not change between groups, but ME treatment increased its activity in APMEL and HFDMEL groups; MEL increased SOD in the CN and AP groups. It is concluded that the association of HFD and AP intensified the alterations observed in this study. ME treatment proved to be an important resource for reversing these changes due to its antioxidant, anti-inflammatory and hypocholesterolemic effects. Therefore, clinical studies must be carried out to verify the systemic and inflammatory effects of AP and HFD.

Keywords: Insulin resistance. Oxidative stress. Periodontal diseases. 4 toll-like receiver. Inflammation.

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LISTA DE FIGURAS

Figura 1- Fluxograma do delineamento do período experimental ... 32

Figura 2 - Ração Hiperlipídica fornecida em forma de “pelletes” ... 33

Figura 3 - Indução da periodontite apical na Hemi-maxila esquerda em rato Wistar 35 Figura 4- Evolução da massa corpórea dos animais durante 15 semanas ... 46

Figura 5- Ingestão alimentar em (g) dos animais durante 15 semanas ... 47

Figura 6- Ingestão hídrica dos animais durante 15 semanas... 47

Figura 7 - Calorias consumidas por grama de alimento ... 48

Figura 8 - Peso absoluto do tecido adiposo periepididimal (TAB) ... 49

Figura 9 - Peso absoluto (g) do tecido muscular gastrocnêmico (MG) ... 49

Figura 10 - Concentrações plasmáticas de TNF-α ... 53

Figura 11 - Concentrações plasmáticas de IL-6 ... 53

Figura 12 - Concentrações plasmáticas de LPS ... 54

Figura 13 Concentrações plasmáticas IL-1β ... 55

Figura 14 Avaliação da expressão proteica do receptor TLR-4 e das proteínas das vias de sinalização inflamatória no músculo gastrocnêmico ... 56

Figura 15 - Avaliação da expressão gênica do receptor TLR-4 e vi e proteínas da via de sinalização intracelular ... 57

Figura 16 Concentração de Glutationa (GSH) no músculo gastrocnêmico ... 58

Figura 17 - Teste capacidade antioxidante total no músculo gastrocnêmico ... 58

Figura 18 - Atividade da Superóxido dismutase (SOD) no músculo gastrocnêmico 59 Figura 19 - Atividade da Catalase (CAT) no músculo gastrocnêmico ... 60

Figura 20- Atividade da Glutationa peroxidase (Gpx) no músculo gastrocnêmico ... 60

Figura 21 Concentração de Proteína Carbonilada músculo gastrocnêmico ... 61

Figura 22 Concentração de TBARS no músculo gastrocnêmico ... 62

Figura 23 - Fotomicrografias em campo claro evidenciando a região periapical dos primeiros molares inferiores nos respectivos aumentos 50x e 100X (‘) ... 64

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LISTA DE TABELA

Tabela 1- Ingredientes e composição dos nutrientes da dieta hiperlipídica e padrão administrada aos animais por 15 semanas (g / 100g) ... 34 Tabela 2- Valores de Glicemia (mmol/L), insulinemia (μIU/mL) e índice HOMA-IR .. 51 Tabela 3 - Concentrações plasmáticas em mg/dl de Triglicérides, Colesterol Total e suas frações (HDL, LDL e VLDL) ... 52

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LISTA DE ABREVIATURA

(O 2) ânion superóxido

ANOVA: Análise de Variância é um procedimento utilizado para comparar três ou mais tratamentos.

CAT: Catalase CT: colesterol Total DTT: ditiotreitol

EDTA: ácido etilenodiamino tetra-acético ELISA: ensaio de imunoabsorção enzimática ERN: espécies reativas de Nitrogênio

EROS: espécies reativas de oxigênio;

GPX: glutationa peroxidase

GSH/GSSG (glutationa reduzida e oxidada) H2O2: Peróxido de hidrogênio

HDL: lipoproteína de alta densidade

HOMA-IR: modelo de Avaliação da Homeostase - Resistência à Insulina IL-1β: interleucina 1 Beta

IL-6: interleucina 6

Inflamassoma NLRP3: domínio pirina da família NLR contendo 3 iNOS: óxido nítrico sintase

IRF-3 fator regulador de interferon 3 LDL: lipoproteína de baixa densidade LPL: lipase lipoproteica;

LPS: lipopolissacarídeo

LPS: lipopolissacarídeo bacteriano

MCP-1: proteína quimiotática de monócitos 1 MDA: malondialdeído

ME: melatonina

MG: músculo gastrocnêmio MT3: quinona redutase 2 (MT3)

MyD88: A resposta primária de diferenciação mieloide 88 NADPH: fosfato de dinucleotídeo de adenina e nicotinamida NFκB: fator nuclear kappa de células B ativadas

PA: periodontite apical

PC: carbonilação de proteínas;

RZR/RORa: receptor de hormônio nuclear órfão relacionado ao retinóide nuclear SB: solução basal

SDS: dodecil sulfato de sódio

SDS-PAGE: eletroforese em gel de poliacrilamida em dodecil sulfato de sódio SOD: superóxido dismutase

TAB: tecido Adiposo branco periepididimal TEMED: tetrametil etilenodiamina

TG: triglicérides

TLR4: receptor Toll-like tipo 4

TNF-α: fator de necrose tumoral alfa

TRIF: interferon indutor de adaptador contendo um domínio Tris: hidroximetil aminometano

VLDL: lipoproteína de densidade muito baixa

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SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ... 17

2 OBJETIVOS GERAIS ... 30

2.1 Objetivos específicos ... 30

3 MATERIAIS E MÉTODOS ... 31

3.1 Animais ... 31

3.2 Delineamento experimental ... 31

3.3 Dieta Hiperlipídica ... 33

3.4 Indução da periodontite apical ... 34

3.5 Administração de melatonina ... 35

3.6 Avaliação do consumo de ração, ingestão hídrica, enegética e evolução da massa corporal dos animais ... 36

3.7 Determinação da concentração plasmática de colesterol total ... 36

3.9 Determinação da concentração plasmática do Colesterol HDL ... 37

3.10 Determinação da concentração plasmática do LDL e VLDL ... 37

3.11 Concentrações plasmáticas de TNF-α, IL-1β, IL-6 e LPS ... 37

3.12 Avaliação da glicemia (método de glicose-oxidase) ... 38

3.13 Determinação de insulinemia e Análise do índice HOMA-IR ... 38

3.14 Avaliação da expressão proteica de TLR4 e via de sinalização intracelular 38 3.15 Avaliação da expressão gênica do TLR-4 e sua via de sinalização celular por meio da técnica de “PCR em tempo real (polímera chain reaction)... 41

3.16 Avaliação do estresse oxidativo ... 43

3.17 Analise histológica para comprovação da Periodontite apical ... 45

3.18 Análise Estatística ... 45

4 RESULTADOS ... 46

4.1 Avaliação da evolução da massa corpórea, ingestão hídrica, alimentar e calórica ... 46

4.2 Peso absoluto do tecido adiposo periepididimal (TAB) e do tecido muscular gastrocnêmico (MG) ... 48

4.3 Glicemia, insulinemia e modelo de avaliação da homeostase da resistência à insulina (HOMA-IR) ... 50

4.4 Avaliação do Perfil Lipídico ... 51

4.5 Concentrações plasmáticas de citocinas inflamatórias: TNF-α, IL-6, IL-1β e níveis plasmáticos de LPS ... 52

4.6 Avaliação da expressão proteica de TLR-4 e via de sinalização intracelular ... 55

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4.7 Avaliação da expressão gênica de TLR-4 e via de sinalização intracelular ... 56

4.8 Avaliação do estresse oxidativo ... 57

4.9 Avaliação histológica da indução da periodontite apical ... 62

5 DISCUSSÃO ... 65

6 CONCLUSÃO ... 83

REFERÊNCIAS ... 84

ANEXOS ... 102

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1 INTRODUÇÃO

O estudo dos mecanismos pelos quais a obesidade induz disfunções fisiológicas pode ser facilitado utilizando-se modelos com animais (ROSINI et al., 2012). Os modelos que simulam a obesidade relacionada à dieta são amplamente utilizados em estudos com animais no intuito de compreender as alterações dessa doença em humanos. Seu estabelecimento depende da ingestão excessiva de dieta hiperlipídica ao longo do tempo, geralmente por cerca de 15 semanas. Entretanto, parte das desregulações imunometabólicas tem ocorrido precocemente (ou seja, 4 a 8 semanas com dieta) antes de ocorrer um quadro completo da síndrome metabólica incluindo a própria obesidade (YU et al., 2019).

A obesidade é tipicamente definida como um acúmulo excessivo de tecido adiposo no organismo. A distribuição desse tecido tem fundamental importância, uma vez que a obesidade abdominal (ou central) tem papel primordial no desenvolvimento da síndrome metabólica, tendo a resistência à ação da insulina como um ponto-chave, ligando a gordura abdominal ao desenvolvimento de diversas doenças crônicas (WHITE et al., 2013). Atualmente a obesidade é reconhecida como uma doença inflamatória crônica de baixo grau que está ligada a distúrbios metabólicos, incluindo diabetes tipo 2 e resistência à insulina. (STOLARCZYK, 2017). Essas patologias estão intimamente associadas à inflamação crônica, caracterizada pela produção anormal de citocinas inflamatórias, e outros mediadores de fase aguda, além da ativação de vias de sinalização inflamatória (HOTAMISLIGIL, 2006).

O tecido adiposo é composto por adipócitos maduros (≅50%) e outras células (≅50%) da fração vascular estromal que contém pré-adipócitos, fibroblastos, células endoteliais e imunocompetentes (macrófagos, linfócitos, mastócitos, células dendríticas e eosinófilos). No entanto, a supernutrição na obesidade desencadeia o remodelamento do tecido adiposo tornando-o um local de inflamação. Além da hipertrofia dos adipócitos, ocorre acúmulo acentuado de macrófagos junto com outras células imunes. Paralelamente, a obesidade induz a troca fenotípica dos macrófagos M2 (produzindo citocinas anti-inflamatórias) para os macrófagos M1 (produzindo citocinas pró-inflamatórias) além de liberar fatores derivados de macrófagos influenciando a biologia do tecido adiposo, como inibição da adipogênese, modulação da produção de adipocinas e aumento das respostas inflamatórias (BING, 2015).

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Outro órgão também afetado pela obesidade é o músculo esquelético. A obesidade, de fato, está associada à remodelação do músculo esquelético, resultando em disfunção do muscular, incluindo turnover anormal de proteínas, redução da captação de glicose, diminuição do metabolismo lipídico, prejuízo da função mitocondrial além da modificação fenotípica das fibras musculares (HEO et al., 2018; TALLIS et al., 2018).

Além disso, os mecanismos subjacentes ao desenvolvimento da obesidade podem incluir alterações na regulação enzimática e/ou receptora do músculo esquelético e do tecido adiposo (lipoproteína lipase, lipase hormônio-sensível, receptor de lipoproteína de densidade muito baixa (VLDL-R)) e/ou regulação hormonal (ou seja, insulina, hormônio do crescimento, catecolaminas), resultante da inatividade física e/ou ingestão inadequada de macronutrientes (ou seja, alto teor de gordura saturada e/ou carboidratos refinados) (ROBERTS et al., 2002)

O tecido adiposo não é apenas um local para armazenamento de energia, mas também é considerado um órgão endócrino ativo que secreta inúmeras citocinas e mediadores bioativos chamados adipocinas, as quais estão envolvidas no metabolismo lipídico, sensibilidade à insulina, imunidade, angiogênese e inflamação (SINDHU et al., 2015). A secreção excessiva de adipocinas pró-inflamatórias por adipócitos e macrófagos neste tecido leva a um estado inflamatório sistêmico de baixo grau em algumas pessoas com obesidade (HEYMSFIELD;WADDEN, 2017). Mais de 50 adipocinas foram identificadas possuindo diversas funções. As principais, que atuam no metabolismo dos adipócitos e na sensibilidade a insulina, são: leptina, adiponectina, interleucina-6 (IL-6) e fator de necrose tumoral alfa (TNF-α), participando na gênese da obesidade bem como nos distúrbios metabólicos associados (STOLARCZYK, 2017).

A interleucina (IL-6) é uma importante citocina secretada por macrófagos, adipócitos e outras fontes, incluindo músculo esquelético, fibroblastos e células endoteliais, sendo um importante regulador sistêmico do peso corporal e do metabolismo lipídico. Além desses efeitos, a IL-6 tem demonstrado aumentar a resistência à insulina pela inibição da lipase lipoproteica (LPL). A IL-6 está associada a estados inflamatórios crônicos, incluindo inflamação de baixo grau associada à obesidade e diabetes mellitus tipo 2. Na obesidade, as células imunes do tecido adiposo surgiram como a principal fonte de níveis elevados de IL-6 na circulação.

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Nessa linha, o aumento dos níveis sistêmicos de IL-6 está ligado ao aumento de massa gorda, não apenas em modelos de roedores, mas também em humanos obesos. Como resultado desses achados, a IL-6 tem sido reconhecida como um iniciador da resistência à insulina, pois a infusão aguda de IL-6 periférica em camundongos prejudica a ação da insulina enquanto sua neutralização resulta na melhora. Apesar de seu papel prejudicial na homeostase glicêmica, diversos estudos identificam a IL-6 como um regulador homeostático do metabolismo de energético e de carboidratos (TIMPER et al., 2017), tal como ocorre no músculo esquelético, o qual produz e libera concentrações significativas de IL‐6 após exercício prolongado, além disso, a IL-6 atua neste tecido regulando o metabolismo energético e estimulando a produção de glicose (MUÑOZ‐CÁNOVES et al., 2013).

Outra importante citocina envolvida no metabolismo dos adipócitos é o TNF-α. Nos seres humanos o TNF-α é sintetizado e secretado pelas células do estroma vascular e frações da matriz, incluindo os macrófagos. O tecido adiposo também expressa essa citocina, e sob condições fisiológicas este tecido produz uma quantidade relativamente grande de TNF-α, fato este que o inclui como uma adipocina (PRADO et al., 2009). O TNF-α pode ativar diversas cascatas de transdução de sinal, incluindo vias inibitórias críticas da ação da insulina. Em modelos de ratos obesos, a falta de função do TNF-α resulta em melhora na sensibilidade à insulina e na homeostase da glicêmica, confirmando que essa resposta inflamatória tem um papel crucial na ação da insulina na obesidade (HOTAMISLIGIL, 2006). Essa citocina encontra-se elevada nos tecidos adiposo e muscular de humanos obesos e, quando administrado exogenamente, pode levar à resistência à insulina por inibir a LPL, impedindo assim a conversão de pré-adipócitos em adipócitos maduros durante a expansão da massa do tecido adiposo (HOTAMISLIGIL, 2006; STOLARCZYK, 2017).

Apenas uma parte do TNF-α derivado do tecido adiposo se origina do próprio adipócito; uma considerável parte pode ser secretada por macrófagos infiltrados no tecido, fato este particularmente importante na obesidade. A partir dessas premissas, o TNF-α é considerado um potente regulador interno do tecido adiposo, que pode atuar de forma autócrina/parácrina, influenciando, assim, diversos processos intracelulares, como a apoptose. Já na produção de várias outras citocinas e adipocinas, por exemplo, é o regulador-chave da síntese de IL-6 e de proteínas de fase aguda (PRADO et al., 2009).

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Outra citocina que está criticamente envolvida na tradução da inflamação associada à obesidade em resistência à insulina em modelos de roedores é a IL-1β.

Essa citocina é produzida principalmente por macrófagos, sendo que sua forma biologicamente ativa é formada por meio da clivagem da pró-IL-1β pela caspase-1 ativada pela mediação do domínio pirina da família NLR, contendo 3 (inflamassoma NLRP3) o qual tem um papel central na inflamação induzida pela obesidade, resistência insulina e diabetes tipo 2. (GAO et al., 2014; RHEINHEIMER et al., 2017).

Outro fato importante é que a ativação do inflamassoma NLRP3/caspase-1 parece ser um regulador chave na diferenciação dos adipócitos, direcionando esses para um fenótipo mais resistente à insulina (RHEINHEIMER et al., 2017). A elevação dos níveis circulantes de IL-1β juntamente com a IL-6 contribuem para aumento do risco de diabetes tipo 2. A inibição da IL-1β reduz a hiperglicemia e a inflamação tecidual em ratos obesos e diabéticos. Além disso, a IL-1β pode constituir um mediador de célula- célula em metainflamação, uma vez que essa citocina produzida por adipócitos de camundongo, estimulados pelo TNF-α demonstrou induzir resistência à insulina nas células do fígado. Essas descobertas sugerem que a IL-1β pode ter um papel central na interação entre macrófagos e adipócitos, bloqueando a ação da insulina no tecido adiposo humano (GAO et al., 2014; BING, 2015).

A obesidade é uma condição multifatorial e um dos principais contribuintes para o desenvolvimento de hipertensão, diabetes mellitus, doenças cardiovasculares, cerebrovasculares e síndrome metabólica (STOLARCZYK, 2017). Revisões sistemáticas da literatura e meta-análises de ensaios clínicos têm apoiado a ideia de que a obesidade pode ser considerada um fator de risco para as periodontites (CHAFFEE;WESTON, 2010; SUVAN et al., 2011), sendo, portanto, uma doença que afeta as estruturas de suporte dos dentes, resultante da interação entre bactérias patogênicas e a resposta imune do hospedeiro (DAHIYA et al., 2012). Um dos primeiros relatos sobre a relação entre obesidade e doença periodontal surgiu em 1977, quando Perlstein e Bissada (1977) observaram alterações histopatológicas no periodonto de ratos Zucker, obesos hereditários com periodontite induzida por meio ligadura, uma maior reabsorção óssea alveolar em comparação com ratos não obesos. Achados a partir de modelos animais vem demonstrando que a obesidade/excesso de peso pode influenciar a patogênese da doença periodontal levando a uma maior perda óssea alveolar (VERZELETTI et al., 2012; CAVAGNI et

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al., 2013; ZUZA et al., 2018; YU et al., 2019). Os mecanismos pelos quais a obesidade possa afetar o periodonto não estão totalmente elucidadas, mas o que se sabe é que a obesidade desencadeia diversos efeitos biológicos como por exemplo, o aumento citocinas pró-inflamatórias como IL-1β, IL-6 e TNF-α, adipocinas (leptina, adiponectina, resistinas) e espécies reativas de oxigênio que podem afetar diretamente os tecidos periodontais (DAHIYA et al., 2012; MOURA-GREC et al., 2014).

Quando a produção de radicais livres e/ou espécies reativas supera a capacidade de ação dos antioxidantes, se favorece a oxidação de biomoléculas, gerando metabólitos específicos, os marcadores do estresse oxidativo, que podem ser identificados e quantificados. Tais marcadores são derivados, sobretudo, da oxidação de lipídeos, proteínas e ácidos nucleico, sendo os primeiros os de maior expressão. Outra forma de abordar a avaliação do estresse oxidativo é a que emprega métodos indiretos, baseados na capacidade antioxidante (BARBOSA et al., 2010).

A carbonilação de proteínas (CP) é um biomarcador mais comum de dano oxidativo às proteínas e pode ser induzido pelo ataque de espécies reativas de oxigênio (EROS) (BARREIRO;HUSSAIN, 2010; MÉNDEZ et al., 2014). A CP é uma modificação oxidativa pós-traducional irreversível, que ocorre quando as proteínas reagem diretamente com as EROS, levando à formação de derivados proteicos ou fragmentos de peptídeos contendo grupos carbonil altamente reativos, como aldeídos e cetonas. Além disso, as reações secundárias de grupos amino primários de resíduos de lisina com açúcares redutores ou seus produtos de oxidação, conhecidas como reações de glicação ou glicoxidação ou ambas, também geram carbonilas reativas em proteínas. A CP também pode ser o resultado de reações de adição de Michael de resíduos de lisina, cisteína ou histidina com aldeídos reativos a,b-insaturados gerados durante a peroxidação de ácidos graxos poli-insaturados (BARREIRO;HUSSAIN, 2010; MÉNDEZ et al., 2014).

Além da Carbonilação das proteínas, outro processo que ocorre é a peroxidação lipídica, processo no qual radicais livres EROS, ERN atacam as ligações duplas carbono-carbono nos lipídeos, um processo que envolve a abstração de um hidrogênio de um carbono e a inserção de uma molécula de oxigênio. Esse processo leva a uma mistura de produtos complexos, incluindo radicais peroxil lipídico e hidroperóxidos como produtos primários, bem como malondialdeído (MDA) e 4-

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hidroxinonenal como produtos secundários predominantes (DE-LEON;BORGES, 2020).

A associação entre estado periodontal e os níveis de carbonilação de proteínas foram investigadas na saliva (SCULLEY;LANGLEY-EVANS, 2003) líquido gengival crevicular e soro (BALTACIOĞLU et al., 2008), demonstrando que níveis mais elevados de CP foram associados a pior estado periodontal. Além disso, outros estudos demonstraram que pacientes com periodontite crônica apresentaram níveis de peroxidação lipídica elevadas (BALTACIOĞLU et al., 2008; AMBATI et al., 2017).

Foi confirmado que a periodontite está associada a uma hiperatividade dos neutrófilos do sangue periférico, que deveriam ser a fonte predominante de EROS. Relatórios recentes sugerem que a hiperatividade dos neutrófilos é provavelmente uma reação imune do hospedeiro à inflamação da periodontite (WANG et al., 2017).

Dada a relação entre as EROS e os principais marcadores de dano oxidativo, os organismos possuem um sistema de defesa antioxidante que tem função de inibir e/ou reduzir os danos causados pela ação deletéria dos radicais livres ou das espécies reativas não-radicais. Tais ações podem ser alcançadas por meio de diferentes mecanismos de ação: impedindo a formação dos radicais livres ou espécies não-radicais (sistemas de prevenção), impedindo a ação desses (sistemas varredores) ou, ainda, favorecendo o reparo e a reconstituição das estruturas biológicas lesadas (sistemas de reparo) (SCHREIBELT et al., 2007; BARBOSA et al., 2010).

Comumente o sistema de defesa Antioxidante é dividido em enzimático e não-enzimático. Os antioxidantes são definidos como qualquer substância que, presente em menores concentrações que as do substrato oxidável, seja capaz de atrasar ou inibir a oxidação deste de maneira eficaz. Tais substâncias podem agir diretamente, neutralizando a ação dos radicais livres e espécies não-radicais, ou indiretamente, participando dos sistemas enzimáticos com tal capacidade (BARBOSA et al., 2010).

Em condições de normalidade, as EROs são mantidas em concentrações fisiológicas pelo sistema de defesa antioxidante. Este sistema é composto principalmente pelas enzimas superóxido dismutase (SOD), catalase (CAT), glutationa peroxidase (GPx). Esses são uma coleção de antioxidantes que atuam para

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suprimir ou prevenir a formação de radicais livres ou espécies reativas nas células.

Eles são muito rápidos em neutralizar qualquer molécula com potencial de se transformar em um radical livre ou qualquer radical livre com capacidade de induzir a produção de outros radicais. A CAT, GPx e SOD estão funcionalmente interconectadas, porque o produto da reação catalisada pela SOD, o peróxido de hidrogênio (H 2O2), é o substrato tanto da CAT quanto da GPx (IRATO;SANTOVITO, 2021).

A SOD é a primeira enzima de desintoxicação e o antioxidante mais poderoso da célula. É uma importante enzima antioxidante endógena que atua como componente do sistema de defesa de primeira linha contra ERO's, além disso catalisa a dismutação de duas moléculas de ânion superóxido (O 2) em peróxido de hidrogênio (H2O2 ), e oxigênio molecular (O 2 ), consequentemente, tornando o ânion superóxido potencialmente nocivo menos perigoso (IGHODARO;AKINLOYE, 2019).

A CAT é uma enzima antioxidante comum presente em quase todos os tecidos vivos que utilizam o oxigênio. Essa enzima utiliza ferro ou manganês como cofator e catalisa a degradação ou redução do peróxido de hidrogênio em água e oxigênio molecular, completando, consequentemente, o processo de desintoxicação imitado pela SOD. É abundante nas células, onde continuamente procura moléculas de peróxido de hidrogênio. A CAT é altamente eficiente; ele pode quebrar milhões de moléculas de peróxido de hidrogênio em um segundo. A enzima está localizada principalmente nos peroxissomos, mas ausente nas mitocôndrias de células de mamíferos (IGHODARO;AKINLOYE, 2019).

A GPx é uma importante enzima intracelular que quebra os peróxidos de hidrogênio em água; e peróxidos lipídicos aos seus álcoois correspondentes principalmente nas mitocôndrias e às vezes no citosol. Na maioria das vezes, sua atividade depende de um cofator de micronutrientes conhecido como selênio. Por essa razão, a GP X é, muitas vezes, referida como uma selenocisteína peroxidase. A enzima desempenha um papel mais importante na inibição do processo de peroxidação lipídica e, portanto, protege as células do estresse oxidativo (IGHODARO;AKINLOYE, 2019).

O sistema antioxidante não enzimático é constituído por substâncias de baixo peso molecular, endógenas como GSH e ácido úrico, bem como por

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antioxidantes que podem ser adquiridos através da dieta, como as vitaminas E e C, e compostos fenólicos presentes em elevadas quantidades em alguns vegetais (RATNAM et al., 2006).

A GSH é altamente abundante em todos os compartimentos celulares, sendo o principal antioxidante solúvel. A relação GSH/GSSG (glutationa reduzida e oxidada) é uma das principais determinantes do estresse oxidativo. A GSH mostra seus efeitos antioxidantes de várias maneiras: desintoxica o peróxido de hidrogênio e peróxidos lipídicos pela ação da glutationa peroxidase GSH-Px. A GSH doa seu elétron para H2O 2 para reduzi-lo em H2O e O2. A GSSG é novamente reduzida em GSH pela GSH redutase, que usa NADPH como doador de elétrons. A GSH-Pxs também são importantes para a proteção da membrana celular da peroxidação lipídica. A glutationa reduzida doa prótons aos lipídios da membrana e os protege dos ataques oxidantes. A GSH é um cofator para várias enzimas desintoxicantes, como glutationa peroxidase e transferase; além disso possui papel na conversão da vitamina C e E de volta às suas formas ativas. A GSH protege as células contra a apoptose, interagindo com vias de sinalização pró-apoptóticas e antiapoptóticas e também regula e ativa diversos fatores de transcrição, como proteína ativadora 1 (AP-1), NF- κB e especificidade proteína (Sp-1) (BIRBEN et al., 2012).

De uma maneira geral, as infecções dentárias também são patologias de origem inflamatória. Dentre elas, está a infecção endodôntica, que resulta no desenvolvimento da periodontite apical (PA) (COLIC et al., 2010). A PA é uma inflamação que resulta na destruição dos tecidos perirradiculares, que acometem diversos danos à polpa dentária. Com o avanço do processo inflamatório, o organismo monta uma série de respostas imune, recrutando várias classes de células imunocompetentes, mensageiros intercelulares e moléculas efetoras. Os fatores microbianos e as forças de defesa do hospedeiro encontram e destroem grande parte do tecido periapical, resultando na formação de vários tipos de lesões apicais, que comumente assumem a forma de granulomas reativos e cistos, com a reabsorção concomitante do osso ao redor das raízes dos dentes afetados (GRAUNAITE et al., 2011).

A resposta imune periapical localiza a infecção dentro dos limites do sistema de canais radiculares e impede sua disseminação sistêmica. No sistema imunológico do hospedeiro, o neutrófilo é a primeira linha de defesa quando os

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patógenos invadem. Além disso, a resposta pulpar inicial à infecção bacteriana e / ou à difusão de antígenos bacterianos compreende a infiltração de neutrófilos polimorfonucleares e monócitos. O infiltrado de células imunes constitui uma resposta imune complexa na lesão, sendo que diversas das citocinas, tais como: IL-1α, IL-1β, TNF-α e IL-6, derivadas das células imunes estão envolvidas na regulação da inflamação periapical e perda óssea (SASAKI et al., 2016). Estudos com ratos, comprovaram que a PA pode promover aumento de TNF-α, alterações na etapa inicial do sinal insulínico, resistência à insulina, aumento na infiltração de macrófagos e ativação de vias inflamatórias no tecido muscular esquelético (ASTOLPHI et al., 2015;

PEREIRA et al., 2017) evidenciando que uma inflamação local pode induzir efeitos sistêmicos.

A exposição crônica do canal pulpar apresenta, em sua maioria, colonização composta por diferentes tipos de bactérias gram-negativa. Entre os fatores de virulência das bactérias gram-negativas, o lipopolissacarídeo (LPS) é um dos principais constituintes da parede celular desses microrganismos, secretado em vesículas por organismos em crescimento ou liberado durante a desintegração de bactérias após sua morte (GOMES;HERRERA, 2018). O LPS é principalmente reconhecido pelo receptor Toll-like tipo 4 (TLR4), um receptor de superfície celular que atua na ativação da imunidade inata e indução de respostas inflamatórias (LI et al., 2014). O TLR4 é expresso por diferentes células, tecidos e órgãos (monócitos, macrófagos, tecido adiposo e muscular, baço, cólon, ovários, intestino delgado e placenta (VAURE;LIU, 2014), desempenhando uma função importante no desenvolvimento de alterações crônicas relacionadas à obesidade, como a resistência à insulina (PAL et al., 2012; REYNOLDS et al., 2012). O TLR4 reconhece especificamente o LPS, e essa interação induz a síntese de citocinas pró- inflamatórias, como TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-8 e IL-12, que por sua vez atuam como mediadores inflamatórios endógenos por meio da interação com receptores encontrados em diferentes células-alvo (ROGERO;CALDER, 2018).

Estruturalmente, o TLR4 forma um complexo na superfície celular com várias outras proteínas necessárias para o reconhecimento do ligante (por exemplo o LPS). A via dependente de (resposta primária de diferenciação mielóide 88) MyD88 resulta em rápida ativação de NF-κB e liberação de citocinas pró-inflamatórias, como TNF-α, IL-1β, IL-6, proteína quimiotática de monócitos 1 (MCP-1) e IL-8. Já a ativação

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da via independente de MyD88 via interferon indutor de adaptador contendo um domínio (TRIF fator regulador de interferon 3) resulta na rápida ativação do (IRF3), induzindo a liberação de interferão beta (IFN-β) e TNF-α e também levando a ativação NF-κB porém de uma forma mais lenta (ZUGHAIER et al., 2005; VAURE;LIU, 2014).

Nesse contexto, a via de sinalização do TLR4 tem sido reconhecida como um dos principais desencadeadores no aumento da resposta inflamatória induzida pela obesidade. A compreensão de que o sistema imunológico e as diferentes vias metabólicas estão estreitamente relacionados entre si é essencial para estudos focados na obesidade e em suas possíveis repercussões metabólicas, como por exemplo, na progressão de patologias orais, tais como as periodontites (GOMES;HERRERA, 2018; ROGERO;CALDER, 2018).

Durante a infecção endodôntica, a ligação de receptores TLRs, na superfície dos fagócitos, por motivos bacterianos ou células mortas, desencadeia ativação, fagocitose, síntese de ROS, ativação de respostas humorais e celulares, e produção de mediadores inflamatórios, como citocinas e metaloproteinases. Assim, a combinação de fagocitose bacteriana e secreção de enzimas proteolíticas e compostos imunomoduladores, que auxiliam na morte e digestão de bactérias, é acompanhada pela “explosão respiratória”. O aumento súbito do metabolismo oxidativo não mitocondrial, resulta na geração de radicais superóxido e uma bateria de outras EROs, via complexo NADPH-oxidase. Entretanto, os oxidantes também podem causar lesão tecidual através de danos no DNA e proteínas, envolvendo enzimas e constituintes da matriz, peroxidação lipídica, indução de citocinas pró- inflamatórias e enzimas hidrolíticas, além da inativação de inibidores de proteases.

Além disso, o peróxido de hidrogênio superproduzido extracelularmente pode, até mesmo passar livremente através de membranas biológicas e atuar como segundos mensageiros intracelulares, ativando uma variedade de vias de transdução de sinal (HERNÁNDEZ-RÍOS et al., 2017)

A redução da prevalência da obesidade bem como suas complicações associadas, e o desenvolvimento de novas estratégias são prioridades de saúde pública. Para combater esta pandemia global os mecanismos subjacentes à patogênese da obesidade e as doenças crônicas relacionadas estão sob intensa investigação. Um candidato ideal para diminuir as consequências deletérias da adiposidade excessiva seria um agente que exibisse simultaneamente propriedades

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anti-inflamatórias e antioxidantes, além de ter um impacto na secreção de adipocinas.

Uma molécula que satisfaz estas condições é a melatonina (MEL) (SZEWCZYK- GOLEC et al., 2017).

A MEL é um hormônio neuroendócrino sintetizado principalmente pela glândula pineal e também por diferentes tipos de células, tecidos e órgãos como a retina, medula óssea, trato gastrointestinal, linfócitos e leucócitos. A MEL desempenha um papel importante na regulação dos ritmos circadianos, nos vertebrados em geral (SANTOS et al., 2018). Além de sinalizar os ritmos circadianos, a ME participa na regulação de mecanismos neuroendócrinos, cardiovasculares, imunológicos, termorreguladores e na sensibilidade à insulina (GULCIN et al., 2002). Dentre as inúmeras funções da ME, destacam-se as propriedades anti-inflamatórias (FAVERO et al., 2017), antioxidantes (SZEWCZYK-GOLEC et al., 2017), neuroprotetoras (RAMIREZ-RODRIGUEZ et al., 2009) e efeitos antiproliferativos e citotóxicos em tumores humanos (CHOVANCOVA et al., 2017). Sem dúvida, a MEL destaca-se também por possuir grande capacidade de proteção contra ação dos radicais livres principalmente por aumentar as atividades de diversas enzimas antioxidantes, incluindo superóxido dismutase, glutationa peroxidase e glutationa redutase, diminuindo assim o estado oxidativo das células (XUE-DONG WAN, 2013). A partir disso, pode-se pressupor que a eficiência da MEL como antioxidante endógeno é parcialmente devida à sua propriedade anfifílica, ou seja, é capaz de adentrar barreiras fisiológicas, reduzindo assim o dano oxidativo em ambos os ambientes, lipídico e aquoso das células (MARTIN et al., 2000).

A MEL também é apontada como inibidora do fator nuclear kappa B (NF- κB) por impedir sua ligação ao DNA, evitando a sua translocação para o núcleo. Isso, por sua vez, reduz a produção de citocinas pró-inflamatórias e quimiocinas, além de inibir a expressão de moléculas de adesão e suprimir a síntese das enzimas que geram prostaglandinas e espécies reativas de oxigênio (SZCZEPANIK, 2007).Estudos in vitro demonstraram que a ME inibe a expressão de genes inflamatórios mediados pelo TLR4 em macrófagos, estimulados por LPS, por meio da via de sinalização dependente de MyD88 (HUNG et al., 2013).

Interessantemente, a MEL também participa na regulação do metabolismo e balanço energético no nosso organismo, podendo aumentar o gasto de energia pela ativação do tecido adiposo marrom (SZEWCZYK-GOLEC et al., 2017). Muitos

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processos metabólicos no tecido adiposo, incluindo a expressão e secreção de algumas adipocinas estão sob controle circadiano. Essa regulação pode ser mediada, pelo menos em parte, pela MEL, que pode ter ações sobre o tecido adiposo branco através de seus receptores de membrana ou através de uma ação sobre o sistema nervoso simpático ou pela expressão circadiana de inúmeros genes envolvidos no metabolismo lipídico (FARIAS et al., 2015; SZEWCZYK-GOLEC et al., 2017), ademais, a ME promove a melhora no perfil lipídico em diferentes modelos de animais com obesidade induzidos por dieta hiperlipídica (PRUNET-MARCASSUS et al., 2003;

HUSSAIN, 2007; AGIL et al., 2011; XUE-DONG WAN, 2013).

Os benéficos antioxidantes e anti-inflamatórios da ME foram, recentemente, mostrados em cenários clínicos para várias doenças crônicas, incluindo pacientes com RI (SUN et al., 2018), diabetes tipo 2 (HUSSAIN et al., 2006) e doenças cardiovasculares (HUNG et al., 2013). Da mesma forma, na cavidade oral, a MEL tem desempenhando um papel importante na remodelação óssea (TAKECHI et al., 2008; ARABACI et al., 2015; EL-GAMMAL et al., 2016), na diminuição do dano oxidativo (KARA et al., 2013) e na redução de citocinas inflamatórias em diferentes modelos experimentais

Estudos já demonstraram que a MEL possui ação direta na remodelação óssea, beneficiando o seu metabolismo por meio do anabolismo ósseo e efeitos antirreabsortivos, demonstrando múltiplos mecanismos para esses benefícios, como a diferenciação de células tronco mesenquimais humanas na linhagem de células osteoblásticas, reduzindo a reabsorção óssea, aumentando a síntese de (osteoprotegerina) OPG, um receptor que impede a ativação ativador de receptores do fator nuclear kappa-Β ligante (RANKL) em se ligar ao seu receptor, além de reduzir a síntese de RANKL prevenindo a reabsorção óssea adicional (AMSTRUP et al., 2013;

TRESGUERRES et al., 2014). SARıTEKIN et al. (2019) administraram melatonina em ratos com lesão apical e evidenciaram que a área de perda óssea periapical foi significativamente menor, além disso, na análise imuno-histoquímica, a expressão OPG foi significativamente maior no grupo melatonina. Sendo assim, é evidente os efeitos antirreabsortivos no osso associados a lesões periapicais induzidas experimentalmente em ratos por meio de sua atividade anti-inflamatória.

Atualmente, há um interesse crescente em investigar novas estratégias para prevenir a progressão da obesidade bem como as comorbidades associadas

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(XUE-DONG WAN, 2013). Com base nas evidências de que o tecido adiposo pode servir como um reservatório de citocinas inflamatórias, é possível sugerir que o aumento de gordura corporal pode resultar em uma resposta inflamatória maior e mais ativa do hospedeiro, nos casos de periodontites bem como o envolvimento de vias semelhantes na fisiopatologia da obesidade, doenças periodontais e outras doenças inflamatórias relacionadas (ZUZA et al., 2018). No entanto, deve-se reconhecer que cada uma dessas doenças crônicas também está independentemente associada a outros fatores, alguns dos quais são comuns a ambas as doenças, tais como dietas e sensibilidade à insulina e citocinas inflamatórias. Uma compreensão adicional do impacto que esses fatores podem ter sobre o sobrepeso/obesidade, a periodontite ou a interação desses fatores, juntamente com essas duas doenças crônicas ainda precisa ser averiguada (SUVAN et al., 2011).

A relação entre a função endócrina e as respostas imunitárias em um quadro de obesidade associado a uma patologia oral é de relevância para o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas (STOLARCZYK, 2017). Nesse contexto, o uso da MEL como um coadjuvante poderá ser amplamente explorada, devido a suas propriedades antioxidantes, anti-inflamatórias, metabolismo ósseo e sensibilidade a insulina. Outro fator importante é que a MEL pode ser administrada por várias vias, (oralmente, diretamente no local como em implantes dentários), além disso, está disponível como um suplemento ou como um medicamento sob prescrição médica, dependendo do país. Ademais, possui uma vida útil longa e poucos efeitos colaterais quando comparado com outras drogas, podendo ser utilizada com uma margem de segurança ampla. Em suma, essas características, juntamente com a gama de efeitos que a MEL exerce sobre os tecidos, torna essa substância um possível recurso terapêutico eficaz no tratamento das alterações decorrentes da obesidade e das patologias bucais (PERMUY et al., 2017).

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2 OBJETIVOS GERAIS

O objetivo deste estudo foi investigar os efeitos do tratamento com melatonina em ratos com periodontite apical alimentados com dieta hiperlipídica (DHL) sobre à sensibilidade a insulina e inflamação no plasma, expressão proteica e gênica de TLR-4 e sua via de sinalização e estresse oxidativo no músculo gastrocnêmico (MG).

2.1 Objetivos específicos

Os objetivos específicos foram avaliar:

1) ingestão hídrica, alimentar, energética e evolução da massa corpórea;

2) peso absoluto do tecido adiposo branco periepidimal e músculo gastrocnêmico;

3) glicemia, insulinemia e índice HOMA-IR;

4) colesterolemia e triacilglicerolemia;

5) Concentrações plasmáticas de citocinas inflamatórias: TNF-α, IL-1β, e IL-6 e níveis de LPS plasmático;

6) Expressão gênica e proteica do Toll like receptor tipo 4 (TLR4) e via de sinalização intracelular: MyD88, TRIF, IRF-3 e NFKB no musculo músculo gastrocnêmico;

7) Estresse oxidativo no músculo gastroecnêmio:

• dano oxidativo lipídico e proteico por meio da dosagem das concentrações de proteína carbonilada (PC) e substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARs);

• defesa antioxidante não enzimática por meio da dosagem da capacidade antioxidante total não-enzimática (FRAP) e das concentrações de glutationa reduzida (GSH);

• defesa antioxidante enzimática por meio da atividade das enzimas Superóxido disumutase (SOD), Catalase (CAT) e Glutationa peroxidase (GPx).

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3 MATERIAIS E MÉTODOS 3.1 Animais

Foram utilizados 80 animais (Rattus norvegicus albinus, linhagem Wistar) machos com 60 dias de idade com peso aproximado de 240g oriundos do Biotério Central da Faculdade de Odontologia de Araçatuba – FOA – Unesp. Os animais foram mantidos sob condições controladas de temperatura (23°C ± 2°C) e humidade com variação do ciclo claro-escuro de 12/12 horas (período claro iniciado às 7:00 h). Todos os experimentos foram aprovados pelo comitê de ética local de acordo com os Princípios Éticos de Experimentação Animal e sua implementação foi aprovada pelo CEUA - Protocolo FOA nº 00574-2019 (ANEXO-1).

3.2 Delineamento experimental

Os animais foram distribuídos aleatoriamente em 8 grupos (n=10): 1) controle (CN); 2) com periodontite apical (PA); 3) com dieta hiperlipídica (DHL); 4) dieta hiperlipídica + periodontite apical (DHLPA); 5) CN+MEL (CNMEL); 6) periodontite apical + ME (PAMEL); 7) dieta hiperlipídica + MEL (DHLMEL); 8) dieta hiperlipídica, periodontite apical + MEL (DHLPAMEL).

O experimento foi desenvolvido em um período de 107 dias. No 1º dia, os animais dos grupos DHL, DHLPA, DHLME e DHLPAMEL receberam dieta com alto teor lipídeos durante todo período experimental, os demais grupos CN, PA, CNMEL e PAMEL receberam dieta padrão. No 7 º dia de experimento os grupos com PA foram submetidos a indução da periodontite apical e após 70 dias da cirurgia, iniciu-se iniciado a administração de melatonina (5 mg/Kg) diluída na água de beber durante 30 dias. Na figura 1 pode ser observado o fluxograma com o delineamento temporal dos experimentos.

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Fonte: do autor

As coletas de amostras foram realizadas no período noturno com início às 19 horas, sob iluminação com vermelha. No termino do tratamento com melatonina, sob anestesia (Thiopentax® - Cristália Produtos Químicos Farmacêuticos Ltda, Itapira, Brasil, 3%, 5mg/ 100g peso corpóreo, foi realizada a laparotomia mediana, coletando- se sangue pela veia cava inferior. As amostras de sangue (n=10) foram transferidas para tubos de plástico heparinizados e mantidas a 4°C até a centrifugação a 800 g (4°C, 15 minutos). O plasma obtido foi armazenado a -70°C para avaliação: 1) das concentrações plasmáticas de citocinas inflamatórias (TNF-α, IL-1β e IL-6) e níveis de LPS; 2) colesterolemia e triacilgliceridemia 3) glicemia, insulinemia.

Amostras do músculo gastrocnêmico (MG) foram coletadas para avaliação da expressão gênica (n=5) e proteica (n=8) do Toll like receptor tipo-4 (TLR4) e sua via de sinalização intracelular (MyD88, TRIF, NFκB e IRF-3). Para avaliação do estresse oxidativo foram coletadas (n=10) do MG para análise de SOD, CAT, GPx, GSH, FRAP, TBARS e PC. Foram coletadas as mandíbulas superiores (n=10) para a confirmação da indução periodontite apical. Posteriormente, os animais foram

Figura 1- Fluxograma do delineamento do período experimental

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eutanasiados por dose anestésica excessiva utilizando tiopental sódico (Thiopentax, Cristália, Itapira, SP, Brasil; 3%, 5mg/100g peso corpóreo, via intraperitoneal).

3.3 Dieta Hiperlipídica

Os animais dos grupos DHL, DHLPA, DHLMEL e DHLPAMEL foram alimentados por 105 dias, com uma dieta hiperlipídica (DHL) composta por uma combinação de 45,5% de ração padrão (Labina® - Purina Agribras do Brasil Ltda., Paulínia, SP, Brasil) + 22,7% de banha animal (Sadia®,) + 22,7% de gordura vegetal hidrogenada (LIZA®, Cargil Agrícola S.A., Mairinque, SP, Brasil) e 9% de açúcar. O protocolo da DHL foi adaptado de acordo com o estudo de RAMALHO et al. (2017).

Primeiramente a banha animal e gordura vegetal foram derretidas e, logo em seguida a ração padrão juntamente com o açúcar foram adicionadas gradativamente até formar uma mistura homogênea. A DHL foi fornecida em forma de “pellets” semelhantes aos utilizados para oferecer dieta padrão Figura 1. A dieta hiperlipídica foi preparada a cada 3 dias e armazenada em geladeira sob temperatura de 7°C, ± 2; os demais grupos receberão dieta padrão que estão descritas na tabela 1. As composições das rações convencionais e com alto teor lipídico foram calculadas por meio do software de Avaliação e prescrição nutricional AVANUTRI® Revolution versão 4.0. A tabela com as informações das respectivas dietas estão descritas na Tabela 1

Fonte: do Autor

Figura 2 - Ração Hiperlipídica fornecida em forma de “pelletes”

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Tabela 1- Ingredientes e composição dos nutrientes da dieta hiperlipídica e padrão administrada aos animais por 15 semanas (g / 100g)

Ingredientes Dieta Padrão Dieta Hiperlipídica Energia em kcal 400 kcal

1672 kJ

627 kcal 2622 kJ

Carboidratos - 9,0 g

Proteínas 23,0 g 10,0 g

Gorduras Totais Gorduras Saturadas Gordura Trans

4,5 - -

45,0 g 14,0 g 6,1 g

Fibra alimentar 5,0 g 2,7 g

Minerais Sódio Cálcio Fósforo Zinco Ferro Cobre Flúor Selênio Manganês Iodo

280,0 mg 1200,0 mg 850,0 mg 11,0 mg 18,0 mg 3,0 mcg 3,0 mg 0,020 mcg 11,0 mg 0,10 mcg

127,52 mg 546,54 mg 387,13 mg 5,10 mg 8,19 mg 1,36 mcg 1,36 mcg 0,009 mcg 5,010 mg 0,046 mcg Vitaminas

Vit A Vit B1 Vit B2 Vit B3 Vit B5 Vit B9 Vit D3 Vit K

765,0 mcg 1100,0 mg 1200,0 mg 21900,0 mg 9,0 mg 1300,0 mcg 10,0 mcg 640,0 mcg

348,42 mcg 501,00 mg 546,54 mg 994,47 mg 4,09 mg 592,09 mcg 4,55 mcg 291,49 mcg

3.4 Indução da periodontite apical

Os animais do grupo PA, DHLPA, PAMEL e DHLPAMEL foram anestesiados com associação de cloridrato de Quetamina (10%, 80mg/kg de peso corpóreo, intraperitoneal) e Xilazina (2%, 10 mg/kg de peso corpóreo, intramuscular, e a periodontite apical (PA) foi induzida por meio de orifício realizado em 1º molar superior direito e inferior direito com auxílio de broca em aço carbono (Broca Long Neck - Maillefer, Dentsply, Terezópolis, RJ, Brasil) dotada de esfera na extremidade com 0,1mm de diâmetro, acoplada à caneta de baixa rotação Figura 2A (PEREIRA et al., 2017; TSOSURA et al., 2019). Ressaltamos que a exposição pulpar realizada por meio da abertura da cavidade pulpar com brocas, geralmente não induz à dor. A permanência da abertura é o método mais utilizado para o desenvolvimento da PA.

Figura 3B

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Fonte: do autor

Em A: periodontite apical induzida por meio de orifício realizado em 1º molar superior direito e inferior direito com auxílio de broca em aço carbono (Broca Long Neck) dotada de esfera na extremidade com 0,1mm de diâmetro, acoplada à caneta de baixa rotação. Em B: resultado da cirurgia com a exposição da polpa dentária no segundo molar superior

3.5 Administração de melatonina

Os animais dos grupos CNME, PAMEL, DHLMEL e DHLPAMEL receberam melatonina (Melatonin, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), por via oral solubilizada na água de beber no período escuro, iniciando as 19:00 h e encerrando as 7:00 h, na dosagem de 5 mg/Kg de peso corpóreo, ajustada diariamente conforme peso corporal baseado em estudos da literatura (TAVARES et al., 2021) durante 30 dias.

A MEL (0,5g) foi inicialmente diluída em 2 mL de etanol absoluto, adicionando 498 ml de água para um volume final de 1L. Após este procedimento, essa solução mãe de ME será diluída, seguindo a dosagem citada acima e quantificada de acordo com o peso dos animais e considerando um consumo de 30 mL de água durante o período escuro de acordo com a seguinte equação: Peso x quantidade de água 150 mL/ consumo de água (os reais valores serão mensurados Figura 3 - Indução da periodontite apical na Hemi-maxila esquerda em rato Wistar

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diariamente) x dose de melatonina (5 mg/kg), posteriormente, essa solução será colocada em bebedouros (cor âmbar). Diariamente os valores referentes a ingestão de água dos grupos foram medidos e reajustados na formula supracitada.Todos animais serão mantidos em caixas de polipropileno (5 animais por caixas) a disposição de 2 bebedouros cor âmbar de acordo com o volume necessário de ingesta, pois quando os animais são alojados em grupos, é importante observar se os indivíduos de menor grau de dominância social têm acesso à comida e à água (ANDRADE et al., 2002). Os demais grupos receberão uma solução veículo preparada com 2 mL de etanol absoluto dissolvido em 498 mL de água, adicionada nos bebedouros seguindo os mesmos critérios para os animais tratados.

3.6 Avaliação do consumo de ração, ingestão hídrica, enegética e evolução da massa corporal dos animais

Os animais foram pesados individualmente em balança digital (modelo 707;

Seca,Hamburgo, Alemanha) semanalmente após a avaliação do peso inicial dos ratos. O consumo de ração e ingestão hídrica foram avaliados semanalmente durante todo o experimento.

3.7 Determinação da concentração plasmática de colesterol total

Este é um método enzimático, específico para quantificação de colesterol total (Katal Biotecnológica Ind. Com. Ltda., Belo Horizonte, Brasil). Neste método os ésteres de colesterol foram hidrolisados pela colesterol esterase a colesterol livre e ácidos graxos. O colesterol livre é oxidado pela colesterol oxidase a colest-4-en-ona e pelo peróxido de hidrogênio. Na presença de peroxidase e peróxido de hidrogênio, o fenol e a 4-aminoantipirina são oxidados formando um composto róseo-avermelhado (antipirilquinonimina) que tem absorvidade máxima de 500 nm. A intensidade da cor vermelha formada na reação final é diretamente proporcional à concentração do colesterol na amostra. Para a dosagem de colesterol foram utilizados 10µL da amostra ou de padrão e 1,0 mL de reagente enzimático. Essa solução foi homogeneizada e colocada em banho-maria a 37°C durante 10 minutos. As absorbâncias do teste e do padrão foram determinadas em 500 nm acertando o zero com o branco.

Referências

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