Diagnóstico de laboratorio del cólera

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Reseñas

DIAGNOSTICO DE LABORATORIO DEL COLERA *

Texto de la publicación Prontuario de diagnóstico de laboratorio del cólera,l preparado por el Servicio de Enfermedades Bacterianas de la OMS.

Organización de servicios de laboratorio para el diagnóstico del cólera

La detección temprana de la infección colérica y la determinación de las caracterís- ticas epidemiológicas de los brotes facilitan considerablemente la lucha contra el cólera. Estos objetivos pueden alcanzarse por medio de un servicio nacional debidamente orga- nizado e integrado por un laboratorio central y por una red de laboratorios regionales y locales que sirvan de puntos de apoyo a las actividades de vigilancia continua. La orga- nización del servicio nacional de laboratorio dependerá de las dimensiones del país, de la distribución de su población, de su sistema de comunicaciones y de la fase de desarrollo a que hayan llegado los servicios nacionales de salud.

Laboratorio central para el diagnóstico del cólera

El laboratorio nacional de referencia puede establecerse en un departamento de microbiología y de preferencia en la sección de enterobacteriología de ~11 laboratorio nacional o federal de salud pública. Sus funciones serán las siguientes :

1) establecer los métodos aplicables en los laboratorios locales y fijar las atribu- ciones de estos;

2) velar por la observancia de normas técnicas adecuadas en los laboratorios peri- féricos, organizando cursos de capacitación y de actualización de conocimientos, visitas frecuentes de inspección a los laboratorios

1 Organización Mundial de la Salud, Ginebra, Suiza, 1974.

locales y verificaciones periódicas del buen funcionamiento de los laboratorios periféri- cos, por medio del envío de muestras previamente examinadas con o sin Vibrio cholerae;

3) organizar el suministro continuo de sueros anticoléricos de diagnóstico, especí- ficos de grupo y de tipo, sea fabricándolos él mismo, sea comprándolos a fabricantes de confianza, directamente o con ayuda de la OMS;

4) facilitar personal preparado, material y productos químicos a todos los laboratorios de la red;

5) centralizar la coordinación y el inter- cambio de información entre los epidemió- logos encargados del programa de lucha contra el cólera en el Ministerio de Salud y los hospitales y laboratorios periféricos, y velar por que las autoridades de salud pública hagan buen uso de los resultados de los análisis en la ejecución del citado programa;

6) confirmar las identificaciones y determinar todas las características de las cepas

de Vibrio aisladas en los laboratorios

periféricos;

7) practicar pruebas de sensibilidad a los medicamentos con cepas representativas locales;

8) efectuar o disponer que se efectúen pruebas de fagotipia de las cepas de Vibrio; 2

9) constituir una reserva suficiente de muestras de cepas locales liofilizadas o conservadas en agar semisólido (véase el Anexo, pág. 168), y 1Ievar registros completos.

2 Las muestras

Inte~acjonal de ii ara fagotipia eferencia de Vibriones, deben enviarse al Centro Centro de In- v$gc~~ones sobre el Cólera, 3, Dr. Isaque Road, Calcuta

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162 BOLETIN DE LA OFICINA SANITARIA PANAMERICANA * Febrero 1975

En los países de gran extensión el laboratorio central podrá compartir el ejercicio de esas funciones con laboratorios regionales convenientemente ubicados.

Laboratorios locales

Los servicios locales de

cólera pueden establecerse en laboratorios diagnóstico del regionales o de distrito que dispongan de los medios necesarios para aislar e identificar microorganismos entéricos y vibriones en las muestras que envíen los centros de salud, los hospitales o los grupos móviles. En la mayoría de los países, los pequeños laboratorios dependientes de los centros de salud o de los hospitales urbanos y rurales poco importantes no disponen de personal ni de medios materiales para practicar investiga- ciones bacteriológicas y han de limitarse a efectuar exámenes microscópicos de las muestras que reciben. No obstante, esos laboratorios pueden usarse para la obtención de muestras de análisis en los casos de cólera y de otras enfermedades diarreicas. Tam- bién pueden efectuar ese trabajo los inspec- tores sanitarios, los médicos privados y las parteras rurales, siempre que hayan recibido una instrucción adecuada, y que dispongan de escobillones rectales, de cantidades sufi- cientes de un medio adecuado para la con- servación de los microorganismos y del resto del material necesario para el transporte de las muestras.

En caso de epidemia o de peligro de epidemia, pueden instalarse laboratorios mó- viles para los análisis bacteriológicos en una serie de centros rurales de salud o de hospitales pequeños estratégicamente situados, que dispongan de agua, de electricidad y de personal capacitado. El uso de laboratorios montados en vehículos de motor o en lanchas de vapor permitirá adentrarse en las zonas rurales todo lo que permitan la red de ca- rreteras 0 el sistema fluvial, para tomar y analizar muestras. Los laboratorios móviles son especialmente útiles en los países con servicios de laboratorio deficientes. Hay que tener en cuenta, sin embargo, que la eficacia

de un servicio de laboratorio está inequívoca- mente supeditada a la competencia del personal y a la calidad del material y de los productos químicos disponibles.

Métodos aplicables en los laboratorios locales 0 periféricos

El diagnóstico de laboratorio del cólera no requiere un material ultramoderno ni medios de cultivo muy complicados; no obstante, los laboratorios periféricos depen- derán forzosamente del laboratorio central en lo que respecta al suministro de medios de cultivo, de ingredientes para su prepara- ción y de sueros de diagnóstico y en lo que se refiere a la formación de personal.

Toma de muestras

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* RESEÑAS 163

obtener alrededor de 0.1 ml de heces, aun en el caso de que !a operación se haga como es debido. No obstante, como en un ml de heces coléricas típicas hay entre IO6 y 1O9 vibriones, una escobilladura rectal debidamente practicada es suficiente si todavía no se han administrado al enfermo sustancias antimicrobianas. Para transportar la muestra se debe usar el medio de Cary-Blair, o una solución acuosa alcalina de peptona, o el medio de taurocolato, telurito y peptona si se trata de escobilladuras rectales (véase el Anexo, pág. 168); para las muestras más voluminosas puede usarse el líquido de Venkatraman-Ramakrishnan (VR). Para transportar los escobillones rectales, se romperán las varillas por su parte superior de manera que pueda taponarse el recipiente con el medio de transporte. De ser posible, se hará en el domicilio del enfermo la siembra en placa en un medio adecuado y, en ese caso, la muestra se enviará al laboratorio en unión del medio de transporte, cualquiera que haya sido el método utilizado para obtenerla.

Método de uso común en los laboratorios

periféricos (véase fig. 1)

A su llegada al laboratorio, los tubos con las muestras en solución acuosa alcalina de peptona o en medio de taurocolato, telurito

y peptona se incubarán por espacio de seis a ocho horas (contando el tiempo de tránsito), al cabo de las cuales se procederá a Ia operación de enriquecimiento. Si la muestra llega en un medio de conservación, como el líquido VR o el medio de Cary- Blair, se transvasarán a un recipiente con unos 10 ml de solución acuosa alcalina de peptona (pH 8.5) alrededor de 1.0 ml del líquido o de la escobilladura, y después de efectuada la incubación por espacio de seis a ocho horas se hará la siembra en un medio selectivo y en un medio no selectivo. Cuando la muestra llegue en un medio de cultivo en placa,3 la siembra se efectuará en el acto, 3Si no se ha’ hecho la siembra en placa antes de enviar la muestra al laboratorio y si no es posible hacerla el mismo día, después de la operación de enriquecimiento, se

para proceder seguidamente a la incubación. En determinados casos, puede ser conveniente practicar un segundo enriquecimiento con peptona, como el recomendado para el caso de los portadores (véase pág.

167).

La elección de medio depende de la experiencia del personal y de la disponibilidad de medios preparados o de ingredientes de calidad normalizada para su preparación. Se empleará para cada muestra un medio ligeramente selectivo 0 no selectivo (agar con sal biliar (ASB), agar con autriente o con extracto de carne (AEC), o agar gelatina (AG); véase el Anexo, pág. 168), y un medio selectivo-placa con TCSB o agar gelatina con tripticasa, taurocolato y telurito (AGTT)-empleando la mitad de la muestra para siembra directa y la otra mitad para inoculación después del enriquecimiento. Las placas deben ser de preparación reciente (no más de tres a cinco días) y su superficie deberá estar seca en el momento de la incubación. La práctica de economizar placas atilizando la mitad de cada una de estas para la siembra directa y la otra mitad para la siembra siguiente al enriquecimiento solo es admisible si el personal de laboratorio tiene mucha experiencia en este método de cultivo y bajo ningún pretexto debe seguirse en los primeros casos presuntos de cólera observados en una zona. Todos los técnicos del laboratorio deben dominar a la perfección el método de la siembra en medio sólido, antes o después del enriquecimiento. La proliferación de las colonias suele ser patente al cabo de ocho a 10 horas de incubación, pero vale más no examinar las placas hasta que haya transcurrido una noche entera de incuba- ción.”

Las colonias sospechosas (véase págs. 170 y 171) deben ensayarse en un portaob-

hará directamente anfes de esta, a partir del medio de transporte utilizado, sea el que sea, y se procurará obtener los resultados a la mañana siguiente.

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jetos con suero polivalente de diagnóstico; esta prueba permite hacer un diagnóstico provisional a la mañana siguiente. Como en una misma muestra puede haber vibriones aglutinables y no aglutinables y como estos últimos pueden crecer más aprisa que los primeros en el medio de enriquecimiento, si una colonia sospechosa no da reacción con los sueros de grupo, el ensayo deberá repetirse con otras cinco colonias por lo menos, antes de considerar negativo el re- sultado de la investigación de V. cholerae

aglutinable. Esa precaución es particular- mente importante en los primeros casos presuntos que se observan en una zona. No es necesario, en cambio, para el diagnóstico sistemático en laboratorio el examen micros- cópico de las heces ú o de las colonias después de la ,tinción durante un minuto con carbol-fucsina fría diluida (1: 10). Si no se dispone de suero de diagnóstico, puede hacerse la “prueba de la hebra” para obtener un diagnóstico presuntivo (véase el Anexo, pág. 168) que tendrá que confirmarse luego en el laboratorio central. La prueba de aglutinación en portaobjeto se hará por el método habitual, aunque acaso sea preferible usar un alambre reoto en vez de un asa de platino para tomar una parte de la colonia grande. La reacción de aglutinación es más rápida y más precisa si se usan colonias conservadas en medios ASB, AEC o AG; las colonias desarrolladas en un medio muy selectivo como el TOSB se aglutinan a veces poco 10 despacio y deben ser objeto de un nuevo examen después de un subcultivo en tubo inclinado con agar nutriente o con agar-hierro de Kligler (medio AHK) .

una coloración en la parte inclinada roja y amarilla en el fondo del tubo, al cabo de 18 horas sin formación de ácido sulfhídrico, ni de gases). El tubo, con un resumen de las condiciones de obtención de la muestra, se enviará al laboratorio central para estudios ulteriores y se comunicarán aI mismo tiempo los resultados de la observación a las autoridades de salud pública de la zona y a los encargados de la asistencia clínica.

Las colonias de vibriones que no se aglutinen con suero anticolérico deben enviarse conservadas en medio AHK al laboratorio central, con un breve resumen de los antecedentes, para que se proceda a una investigación completa.

Determinación de los caracteres de las cepas en el laboratorio central (véase fig. 1)

A las 18 horas de incubación en medio AHK,O V. cholerue da lugar a la aparición de una coloración roja en la superficie inclinada del cultivo y amarilla en el extremo opuesto, sin desprendimiento de ningún gas. Una reacción irregular en medio AHK puede deberse a la contaminación del cultivo; en este caso, el cultivo se pasará por agua con peptona y se volverá a sem- brar en placas para obtener un cultivo puro. El uso de agarhierro azúcar triple (HAT) no es aconsejable porque las cepas del biotipo El Tor, como otras bacterias entéri- cas anaerogénicas, suelen dar una coloración amarilla a la superficie y al fondo del cultivo, al cabo de 18 horas.

El resto de las colonias aglutinables se colocará en un tubo inclinado con medio AHK (o con agar nutriente, si no se dispone de medio AHK) para observar sus características en ese medio (aparición de

Las cepas recibidas de los laboratorios periféricos deben pasarse a pIacas recientes para los análisis de confirmación (pruebas suplementarias de aglutinación en porta- objetos) y para la determinación del sero- tipo, por medio de sueros específicos debidamente absorbidos. Si la reacción de aglutinación es dudosa o atípica, se deter- minará la morfología del micoorganismo y

cE1 examen de heces coléricas líquidas, con o sin enriquecimiento previo, en un microscopio de campo pscuro puede ser útil para formular un diagnóstico presuntivo de c6lera en pocos minutos (Benenson, M. S. y cok. Bu22 WHO 30:827, 1964). Para esta prueba deben usarse sueros

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- RESEÑAS 165

FIGURA l-Métodos de laboratorio para el diagnóstico del cólera. LABORATORIO LOCAL

Muestra de heces

de microorganismos Agar-haerro de Klleger

--- LABORATORIO CENTRAL 2. suern Oaawa

-

3. Suem Iniba

4. Suspensión salma de m,croorga- Aglutlnaclón confirmatorna en portaobjeto “MTFJS sospechosos [testigo)

se practicará a continuación, si es necesario, una prueba con suero anti-V. cholerae

“rugoso”, pues en otro caso, Ias variantes rugosas de V. cholerae pueden confundirse con los llamados “vibriones no aglutinantes” o “no coléricos” (VNAG o VNC). Los sueros de diagnóstico deben ensayarse de cuando en cuando con cepas conocidas de V. cholerae para confirmar que siguen teniendo calidad satisfactoria. La prontitud y la claridad de las reacciones dependen mucho de la homogeneidad y la densidad de la suspensión y de la calidad y la cantidad del suero.

Seguidamente, se practicarán con la cepa Ias pruebas siguientes:

1) Prueba de hemaglutinación directa.

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166 BOLETIN DE LA OFICINA SANITARIA PANAMERICANA . Febrero 1975

una porción del cultivo de los tubos de agar inclinados y se mezcla bien. En los casos posistivos la aglutinación de los hematíes se produce a los pocos segundos. Para cada nueva suspensión de hematíes se usarán como testigos cepas conocidas hemaglutinantes (El Tor) y no hemaglutinantes (clásicas). Las cepas de V. cholerue clásico que han envejecido en el laboratorio, o han sufrido pases repetidos en caldo pueden producir también hemaglutinación directa.

2) Sensibilidad a la polimixina B. Se

coloca un disco de 50 unidades de polimixina B 7 sobre un cultivo obtenido en placa de agar-extracto de carne o agar de Mueller Hinton (pH 7.6) (no en TCSB ni en AGTT) a partir de un cultivo de dos a cuatro horas en caldo nutritivo. En cada placa pueden ensayarse varias cepas haciendo cultivos diferentes en zonas marcadas en el reverso de la placa. Deben usarse siempre como testigos cepas conocidas de vibriones de los biotipos clásico y El Tor. Se colocan los discos haciendo una presión suave sobre el medio y se mantienen las placas a 4” C durante una hora aproximadamente, antes de incubarlas por espacio de 18 horas. El vibrión El Tor resiste a la concentración uti- lizada, pero l’. cholerae clásico es sensible.

3) Sensibilidad al colerófago del grupo

IV. Si el laboratorio central dispone de medios para practicar esta prueba, será preferible enviar Ia cepa aI Centro Interna- cional de Referencia de Vibriones de la OMS.S Las oficinas regionales de la Or- ganización Mundial de la Salud están a disposición de los interesados para facilitar el envío de las cepas al Centro Internacional. La prueba se practica aplicando con un asa de platino el colerófago del grupo IV en la dilución de prueba ordinaria (DPO) a un cultivo en placas de agar-nutriente obtenido a partir de un cultivo de dos horas ?Los discos pueden obtenerse de la empresa Difco La- boratories IN., Detroit, Mich. 48232, Estados Unidos de Amkrica.

R Véase la nota 2.

de la cepa de ensayo en caldo. En todos los casos se usarán como testigos cepas conocidas sensibles (clásicas) y resistentes (El Tor). La lectura de los resultados se hará después de una noche entera de incuba- ción.

4) Reacción de Voges-Proskauer. Se

recomienda el método de Barritt: a un ml de cultivo de un día en caldo de fosfato de glucosa, añádanse, por este orden, 0.6 ml de una solución al 5% de a-naftol en etanol y 0.2 ml de hidróxido potásico al 40%. Agítese bien, quítese la tapa y obsérvese por espacio de una hora. Si hay microorganismos del biotipo El Tor, la reacción positiva se manifestará por la coloración en rosa o en púrpura de toda la mezcla, empezando por la parte superior.

5) Prueba de la hemólisis. Se mezclan 0.5 ml de un cultivo de 24 horas en caldo de infusión de corazón (CIC, medio deshidratado comercial) (mantenido a 37°C en un tubo de ensayo de 16 por 150 mm con 10 ml de medio) y 0.5 ml de hematíes de carnero al 1% lavados (tres veces). La mezcla se incuba durante dos horas a 37°C y se conserva durante toda la noche a 4°C. Seguidamente, se examinan los tubos, sin agitarlos, para ver si ha habido hemólisis. Se usarán siempre como testigos cepas conocidas positivas (El Tor) y negativas (clásicas). Puede añadirse una muestra calentada (a 56°C durante 30 minutos) de la cepa de prueba para confirmar la pre- sencia de hemolisina termolábil.

Las cepas de El Tor, aisladas en la actualidad, no suelen tener acción hemolítica en esta prueba, pero muchas la tienen si antes del ensayo se las cultiva en caldo de infusión de corazón con el 1% de glicerol (CICG) como estabilizador.

Identificación de microorganismos parecidos

a V. cholerae

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* RESEÑAS 167

parentadas deben usarse las pruebas de la oxidasa y de la hebra, la prueba de utiliza- ción de aminoácidos (lisina, arginina y ornitina) y las pruebas de oxidación-fermen- tación (véanse el cuadro 1 y el Anexo, pág.

168). Sólo después de practicadas esas pruebas podrán identificarse los microorganismos como vibriones no aglutinables.

Métodos de laboratorio para la detección de portadores

Los portadores, sean convalecientes 0 simples contactos, eliminan menos vibriones (alrededor de lo? a lo5 por gramo de materia fecal). Por ese motivo conviene usar, en vez de escobilladuras rectales, muestras de heces recientes debidamente obtenidas. Cuando sea posible, se inoculará por lo menos un gramo de heces recientes en unos 50 ml de solución acuosa alcalina de peptona y se practicará una incubación por espacio de seis a ocho horas antes de sem- brar las placas.

Sin embargo, por razones de comodidad, suelen usarse, para la obtención de las muestras, escobihones rectales humedecidos con medio de transporte. Es indispensable practicar antes de la siembra un enriquecimiento a 37°C por espacio de seis a ocho horas. Si se ha rebasado el tiempo de incubación normal de la primera solución acuosa alcalina de peptona, o si después del

primer enriquecimiento las placas resultan ser negativas, se pasan alrededor de 0.1 ó 0.2 ml tomados de la parte superior de la primera solución acuosa de peptona a un segundo tubo de la misma solución para practicar una incubación adecuada y la siembra subsiguiente. Esta segunda opera- ción de enriquecimiento es muy importante para la detección de portadores, y resulta útil también para el diagnóstico en generaI. El enriquecimiento en medio de taurocolato, telurito y peptona puede prolongarse hasta 18 horas antes de la siembra en placas. La identificación de los microorganismos aislados y la determinación de sus caracteres se harán como si se tratara de enfermos con síntomas. Se podrán detectar más convalecientes portadores por medio del examen de la segunda o la tercera deposición líquida después de una purga con 15-30 g de sulfato magnésico o, mejor aún, con 30 g de manitol. El uso de medios selectivos y el enriquecimiento practicado en las debidas condiciones tienen gran importancia para la detección de portadores.

Diagnóstico serológico Enfermos con síntomas

En los casos declarados suelen aparecer altas concentraciones de anticuerpos aglutinantes y vibrionicidas al cabo de cinco a siete días de iniciada le enfermedad; no

CUADRO l-Diferenciación entre los vibriones y las especies estrechamente emparentadas.

Prueba de Prueba de oxidación- _{fermentación} Utilizacidn de Prueba

la oxidasa _{(Hugh y Leifson) a} aminoácidos _hebrade la

Oxidación FeClllen- _tación Lisina Arginina Omitina

Vibriones f+++ + -!- (no hay + - + +

WI

Aeromanas ++++ -l- + (no hay - + - f

gas f

Pseudomonas ++ -!- - b b b -

Plesiomonas ++ -- + + + -

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obstante, para el diagnóstico serológico es necesario comparar muestras de suero to- madas en los tres primeros días de la enfer-

medad con otras obtenidas entre los días séptimo y decimocuarto. El aumento de la concentración en proporción de 1:4 o más tiene valor diagnóstico. La concentración de antitoxina aumenta con lentitud y su

investigación es más difícil.

Portadores

En los portadores no vacunados, la con- centración de anticuerpos aglutinantes suele bajar mucho entre las seis y las 12 semanas

siguientes al restablecimiento de un ataque de cólera, pero se ha observado que persiste

en un nivel alto (1: 160 o más de título homólogo) en los portadores crónicos. En esas condiciones, la prueba de aglutinación del suero practicada entre seis y 12 semanas

después de la desaparición de la enfermedad

puede ser útil para detectar a los portadores crónicos, fuera de las regiones hiperendé-

micas. La detección de un portador tendrá

que confirmarse en estos casos por medio del examen de cultivos fecales, de prefe-

rencia después de la administración de un

purgante, y por examen de la bilis obtenida por intubación duodenal.

Anexo

MEDIOS Y PRUEBAS DE USO COMUN PARA EL AISLAMIENTO Y LA

IDENTIFICACION DE VIBRIONES

1. MEDIOS DE TRANSPORTE (DE CONSERVACIÓN)

1 .l Solución alcalina de sal marina (medio de Venkatraman-Ramakrishnan (VR) )

La solución madre se obtiene disolviendo

12.4 g de ácido bórico (H,BO,) y 14.9 g de cloruro potásico (KCI) en unos 800 ml de agua caliente destilada, después de dejarla enfriar.

Seguidamente se completa el volumen hasta obtener un litro.

Tómense 250 ml de la solución madre y 133.5 ml de hidróxido, sódico 0.2 M y com- plétese hasta un litro. Añádanse 20 g de sal marina seca, ajústese el pH a 9.2,” fíltrese por papel de filtro, viértanse porciones de 10 ml en frascos de boca ancha y tapón roscado, de unos 30 ml de capacidad, y esterilícese en autoclave. Este medio no estimula la proliferación de los vibriones u otros microorganismos y es, por tanto, un medio auténtico de conservación en sentido estricto. La inoculación se hará intro- duciendo de uno a tres ml de heces en los frascos.

Una variante simple de la técnica de prepara- ción es la siguiente: disuélvanse 20 g de sal marina sin refinar y cinco gramos de peptona D El ajuste del pH de los medios de cultivo puede ha-

cerse con soluciones al 5-10% (peso por volumen) de hi- dróxido sódico o carbonato sódico (Na&Os).

en agua destilada hasta obtener un volumen total de un litro, ajústese el pH a 8.6-8.8, y

distribúyase la solución en porciones de 10 a 15 ml en frascos de boca ancha con tapón roscado. Inocúlense en los frascos alrededor de uno a tres ml de heces.

1.2 Medio de CarpBlair

Este medio contiene los siguientes ingredientes

tioglicolato sódico 1.5 g

fosfato disódico 1.1 g

cloruro sódico 5.0 g

agua desmineralizada destilada 99 1 .O ml

agar 5.0 g

Caliéntese la solución hasta que quede trans- parente. Después de enfriar a 5O”C, añádanse nueve ml de solución de cloruro cálcico al 1%

recién preparada y ajústese el pH a 8.4. Viér-

tanse porciones‘de siete ml en ampollas estériles de nueve ml con tapón roscado; esterilícese al

vapor durante 15 minutos, enfríese y apriétense los tapones. Este medio de transporte sirve

para diagnosticar no sólo el cólera, sino las salmonelosis y las shigelosis y puede adquirirse en el comercio.1°

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* RESEÑAS 169

1.3 Solución acuosa alcalina de peptona

Los ingredientes de este medio son:

peptona 10.0 g

agua destilada 1.0 litro

Ajústese el pH a 8.6, viértanse porciones de 10 ml en frascos de tapón roscado, y esterilícese en autoclave a una presión l2 de 1 kN/cm2 durante 15 minutos.

Por la sencillez de su composición, por su bajo costo y por su gran eficacia práctica, este medio resulta muy útil para el transporte y el enriquecimiento de V. cholerae.

1.4 Medio de taurocolato, telurito y peptona

(Monsur)

Este medio puede usarse también para las operaciones de enriquecimiento. Sus ingredientes son los siguientes:

tripticasa 10.0 g

taurocolato sódico 5.0 g

carbonato sódico 1.0 g

Ajústese el pH a 9.2, viértanse porciones de 25 ml en frascos de boca ancha con tapón

roscado, y esterilícese en autoclave a una pre- sión de 1 kN/cm? durante 15 minutos.

Inmediatamente antes de la inoculación, añádase telurito potásico hasta obtener una concentración final de 1 X lo5 (véase la sec- ción 3). Para las campañas podrán emplearse torundas de algodón empapadas en una solu-

ción adecuada de telurito potásico y previamente secadas. En este caso, es conveniente determinar de antemano la cantidad de solu- ción de telurito (de ordinario el 0.1% o menos) absorbida por la torunda.

2. MEDIOS PARA ENRIQUECIMIENTO

La gran cantidad de vibriones presentes en las heces acuosas de los enfermos de cólera (de lo6 a 109/ml, aproximadamente), permite usar cualquier medio disponible de cultivo en placa (véase lo que sigue) para la detección del microorganismo por siembra directa. En los climas calurosos los vibriones inoculados en un medio de cultivo en placa pueden proliferar a la temperatura ambiente, pero convendrá prac-

“De conformidad con lo recomendado por la OIN, las presiones se expresan en kilonewtonios: 1 kN eqmvale aproximadamente a un kilogramo-fuerza (1 kgf).

ticar en todos los casos un enriquecimiento en solución acuosa alcalina de peptona (véase la sección 1.3) o en un medio de taurocolato, telurito y peptona (véase la sección 1.4).

Cuando se use uno de estos dos medios para la inoculación, la incubación se hará a 37°C por espacio de seis a ocho horas, antes de la siembra en placa. No es frecuente que en ese período de incubación, la proliferación de los vibriones resulte superada por la de otros microorganismos. Si el tiempo de cultivo pasa de ocho horas, será necesario proceder a un segundo enriquecimiento por inoculación de un tubo del medio recién preparado con el medio usado en el primer tubo para practicar seguidamente una incubación adecuada por espacio de seis a ocho horas.

3. MEDIOS DE CULTIVO EN PLACAS

El cultivo en placa puede hacerse en la actualidad con medios selectivos y diferenciadores que facilitan la proliferación y Ia identi- ficación de Ias coIonias de vibriones. La inocu- lación de las placas debe ser bastante intensa.

3.1 Medios selectivos y diferenciadores

Medio de agar-gelatina con taurocolato, tripticasa y telurito (AGTT) (Monsur) .

El medio de base consta de los siguientes ingredientes:

tripticasa 10.0 g

gelatina 30.0 g

carbonato sódico 1.0 g

agar 15.0 g

agua destilada 1 .O litro

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170 BOLETIN DE LA OFICINA SANITARIA PANAMERICANA . Febrero 1975

locales, en unión de una solución de telurito potásico al 1% .lZ

Las características de las colonias de vibriones en este medio son:

1) a las 24 horas: colonias pequeñas, entre translúcidas y transparentes, con un centro negro grisáceo l3 y un halo turbio;

2) a las 48 horas: colonias más grandes de tres a cuatro mm de diámetro, con un centro negro y un halo bien definido.

Es frecuente la proliferación de Proteus en las placas. Las colonias de este microorganismo tienen un centro grisáceo, pero generalmente sin halo.

Medio TCSB (disponible en el comercio). Disuélvase el medio deshidratado por calenta- miento al baño María de agua hirviendo o en un esterilizador con flujo de vapor, y viértase en placas limpias (20 ml por placa) sin esterili- zación. Al cabo de 10 a 18 horas, los vibriones forman colonias grandes, amarillas y ligeramente convexas que, después de una incubación prolongada, toman un color verde, sobre todo cuando el microorganismo es un vibrión del biotipo El Tor.

Los microorganismos del género Pseudo- monas y la mayoría de las Aeromonas no crecen en este medio, en el que, sin embargo, pueden proliferar algunos Proteus (formando colonias con centros negros o sin ellos), bacilos esporulados y cocos, en colonias de color amarillo oscuro y de diversos tamaños. Las propiedades selectivas del medio TCSB pueden variar según el fabricante y el lote. Algunas cepas de V. cholerae crecen en agar SS y en agar de MacConkey, pero muchas no lo hacen.

3.2 Medios no selectivos

Agar nutritivo o agur-extracto de carne (AEC). Este medio consta de los siguientes ingredientes:

l?Hay que determinar, de preferencia en el laboratorio central, la concentración de telurito potásico de cada lote de preparación. La experiencia indica que el efecto inhibidor de los diferentes lotes no es constante. El efecto inhibidor de un lote de telurito potásico sob:e los vibriones de los biotipos clásico y El Tor recién aislados puede de- terminarse variando la concentración del agente en un medio de base. Los indicadores del efecto de inhibición serán el número total y el tamaño de las colonias de vibriones. La concentración habitual en estos ensayos puede ser la equivalente a la mitad de la n.áxima concentración no inhibidora. La solución de telurito potásico (1%) puede enviarse a cada laboratorio, acompañada de instrnc- ciones sobre la cantidad de la solución que debe añadirse a una cantidad determinada del medio de base para obtener la concentración deseada.

1s Véase también la nota 4.

peptona 10.0 g

extracto de carne 3.0 g

agar 20.0 g

El pH se ajusta a 7.6. El medio debe usarse en los tres o, a lo sumo, los cinco días siguientes a su preparación.

En el medio AEC las colonias son más translúcidas y pueden diferenciarse de las colonias de microorganismos coliformes.l’

Agar-sal biliar (ASB). Los ingredientes de este medio son:

peptona 10.0 g

extracto de carne 5.0 g

agar 20.0 g

El pH se ajusta a 8.2. El medio debe usarse en los tres o, a lo sumo, los cinco días siguientes a su preparación.

Las colonias se parecen a las obtenidas en el medio AEC, pero son más transparentes y de contornos más precisos, si el medio está bien preparado. La calidad de la sal biliar puede variar de un lote a otro.

4. MEDIO PARA EL CULTIVO MADRE

El agar semisólido para cultivos madre los siguientes ingredientes:

peptona l6 cloruro sódico agar

agua destilada

10.0 5.0 4.0 1.0

tiene

g g g litro Ajústese el pH a 7.4 y viértanse cantidades de cuatro a cinco ml aproximadamente en tubos de ensayo de 13 X 100 mm; pónganse los tubos en la autoclave a una presión de 1 kN/cm2 durante 15 minutos.

Para evitar la desecación, el medio se con- servará en bolsas de plástico en el refrigerador hasta el momento de emplearlo. Después de la inoculación, los tubos se cerrarán con un tapón de corcho parafinado o un obturador de caucho y se mantendrán a la temperatura ambiente (sin incubación). V. cholerae no sobrevive mucho tiempo a la liofilización, si no se toman pre- cauciones especiales.

I4 Véase la nota 4.

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. RESEÑAS 171

5. OTROSMEDIOS

1) Agar-hierro de Kligler (AHK, medio deshidratado comercial). Después de la inocu- lación, los tapones roscados de los frascos no deben apretarse durante la incubación y el cultivo.

2) Caldo de infusión de corazón (CIC, medio deshidratado comercial). Es preferible un pH de 7.4.

6. ALGUNAS PRUEBASUTILES 6.1 Prueba de Za oxidasa

A un cultivo de 18 horas del microorganismo en una placa de agar o un tubo inclinado de agar, añádanse unas gotas de una solución acuosa al 1.0% de clorhidrato u oxalato de P-aminodimetilanilina o de clorhidrato de N- N-dimetil-P-fenilenediamina y hágase pasar la solución por encima del cultivo; repítase la operación con la misma cantidad de una solu- ción alcohólica al 1% de a-naftol. Los cultivos positivos para la oxidasa presentarán un color púrpura azulado intenso al cabo de 0.5 a dos minutos.

Las colonias de vibriones toman un color púrpura en 20 segundos cuando se ponen en la placa unas gotas de una solución acuosa al 1% de clorhidrato (no oxalato) de tetrametil-p- fenilenediamina, es decir del reactivo de KovaC.

6.2 Prueba de la hebra

Con un asa de platino añádase una pequeña porción de cultivo de vibriones en medio sólido a una gota grande de una solución al 0.5% de deoxicolato sódico en suero salino (de preferencia amortiguado) puesta en un portaobjeto.

Mézclese. Si la reacción es positiva, la suspen- sión pierde turbiedad, se hace mucoide y forma una “hebra” que cuelga del asa de platino cuando esta se retira lentamente de la suspen- sión al cabo de 60 segundos.

6.3 Prueba de oxidación-fermentación (prueba O-F)

El medio contiene las siguientes cantidades de ingredientes por litro:

peptona cloruro sódico fosfato dipotásico

OWIPO,) agar

azul de bromotimol

2.0 g 5.0 g

0.3 g 3.0 g

(solución acuosa al 1% ) 3.0 ml Viértase el medio en tubos de 13 X 100 mm en porciones de tres a cuatro ml y esterilícese a 121°C durante 15 minutos. Después de la esterilización, añádase una solución de glucosa al lO.O%, previamente esterilizada por filtra- ción, hasta obtener una concentración final del

1.0%.