Realização: IES parceiras:
TÍTULO: AÇÃO ANTIFÚNGICA DA PRATA COLOIDAL NANOPARTICULADA NO FUNGO CANDIDA ALBICANS
CATEGORIA: CONCLUÍDO
ÁREA: CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E SAÚDE SUBÁREA: Medicina Veterinária
INSTITUIÇÃO: UNIVERSIDADE SÃO JUDAS TADEU - USJT, CENTRO UNIVERSITÁRIO SÃO JUDAS TADEU - CSJT
AUTOR(ES): ISABELLE DE MELO ABREU PESTANA, VANESSA MOREIRA CUNHA VICTONI, YURI
TANIKAWA MARQUES, MARIANA DI GREGORIO GIUFFRIDA, VITÓRIA LUIZA PINTO FAVA GERES, BRUNO PELINSON FOGAÇA DUARTE
RESUMO
Candida albicans é um fungo oportunista, ocasionado a sua disseminação quando o sistema imunológico do animal estiver debilitado. Podemos encontrar a Candida albicans na mucosa vaginal, orelha externa e conduto auditivo, podendo causar otites, e também em garganta e língua. O tratamento atual para a infecção por Candida albicans é realizado por meio do uso de medicamentos antifúngicos como, Fluconazol e o Cetoconazol. Uma nova alternativa relatada na literatura como medicação antifúngica seria a prata coloidal nanoparticulada, pois se destaca devido às suas propriedades ricas e únicas, como boa condutividade, estabilidade química, catalise e atividade antimicrobiana. O efeito antimicrobiano da prata tem sido utilizado na medicina como, por exemplo na profilaxia da
oftalmia neonatal e cicatrização de feridas. Neste trabalho, pôde-se concluir que a prata coloidal nanoparticulada diluída em 20ppm (partículas por milhão), obteve sucesso na inibição do crescimento do fungo Candida Albicans.
Palavras-chave: Levedura; medicamento antifúngico; fungo oportunista. OBJETIVOS
O objetivo desse trabalho foi determinar a concentração mínima inibitória da prata em relação a Candida Albicans por meio de diluições seriadas.
INTRODUÇÃO
Candida albicans é um fungo polimórfico presente na microbiota humana e animal
(NISHIMOTO et al., 2020). Apresenta-se como uma levedura diploide com diferentes características, dentre elas a habilidade de se apresentar em várias formas como brotamento e filamentação. Podem exibir várias morfologias durante seu crescimento formando as pseudo-hifas (leveduras alongadas unidas entre si) (BARBEDO; SGARBI, 2010). É o mais importante fungo oportunista patógeno, geralmente reside como um comensal nos tratos gastrointestinal, geniturinário e nas vias oral e flora conjuntival. No entanto, causa infecção quando o hospedeiro fica debilitado ou imunocomprometido. As infecções podem ser superficiais e afetar a pele, mucosas ou podem invadir a corrente sanguínea e se disseminar aos órgãos internos. (SPAMPINATO; LEONARDI, 2013).
Manifestações por Candida spp. são pouco frequentes na Medicina Veterinária, no entanto, nos últimos anos, tem sido observado aumento considerável de relatos de enfermidades causadas por essas leveduras, acometendo diferentes animais. Várias espécies do gênero são implicadas em quadros infecciosos, sendo a
Candida albicans a principal delas. (SPAMPINATO; LEONARDI, 2013).
Na Medicina Veterinária, são fatores predisponentes a infecções por Candida
albicans: idade, presença de doenças autoimunes, diabetes mellitus, uso de
corticosteroide, antibioticoterapia, cateterismo venoso e urinário e administração de nutrição parenteral. (DADAR et al., 2018). Atualmente o tratamento da Candida
albicans dura meses e os antifúngicos são extremamente tóxicos e cada vez mais os
fungos estão se tornando resistentes aos antifúngicos disponíveis no mercado. Os principais farmacos utilizados no combate das infecções fúngicas são Fluconazol e o Cetoconazol (WHALEY et al., 2017).
A prata é um potente antibiótico natural bastante utilizado nos tempos da Grécia antiga. As famílias daquela época perceberam que conforme era utilizado
utensílios compostos pela prata, dificilmente os indivíduos ficavam doentes, pois esta acabava por misturar-se com a comida. Após algumas gerações, os
benefícios da prata passaram a ser mais observados e cada vez mais os
indivíduos se tornavam imunes a doenças infecciosas (ROCHA et al., 2011).Entre as várias nanopartículas de metais nobres as que se destacam são as
nanopartículas de prata, destacam-se devido às suas propriedades ricas e únicas, como boa condutividade, estabilidade química, catálise e atividade antimicrobiana (ANTUNES et al., 2013). A atividade antimicrobiana das nanopartículas de prata pode apresentar-se mais efetiva por serem partículas extremamente pequenas e com maior razão de área de superfície por volume (VASCONCELLOS, 2012). Características de nanopartículas de prata, tais como a forma e o tamanho, são importantes não só para aumentar a atividade antimicrobiana, mas também para reduzir o tecido e as toxicidades de células eucarióticas.
O uso da prata coloidal como antifúngico já foi testado em estudos utilizando concentrações de 5, 10 e 60nm, que se trata da unidade da prata ainda não diluída, demonstrando bons resultados na inibição do fungo Candida Albicans. (VASCONCELLOS, 2012).
METODOLOGIA
Os equipamentos utilizados para realizar a pesquisa cientifica foram necessarios 10 placas de ágar Sabouraud fornecidas da empresa central lab, fungo Candida
albicans fornecido da micoteca da Universidade São Judas – campus Unimonte, 2
meios liquidos BHI fornecidos da empresa central lab, 6 tubos de ensaio com tampa, água destilada, 6 alças bacteriológicas, gerador de prata coloidal
nanoparticulada da empresa acqua prata, vortex, estufa, 6 swabs, 6 lâminas de microscopio, 6 lamínulas, tinta nakin e microscópio para observar crescimento do fungo.
Para iniciarmos o processo foi necessario realizar a semeadura do fungo Candida
albicans que estava em formado de disco difusão, tivemos que introduzir o disco
difusão no meio de liquido BHI para observar o crescimento do fungo Candida
albicans após 24 horas dentro da estufa, logo que observamos o crescimento do
fungo no meio liquido com o auxilio de um swab coletamos o conteudo do meio liquido BHI e passamos para o meio solido agar sabouraud para observar o
crescimento das colonias e foi necessario colocar as placas de agar sabouraud na estufa a 37,5 (Fig. 1 e 2).
Segunda parte do experimento tivemos que produzir o antifungico prata coloidal nanoparticulada com o gerador acquaprata (Fig. 3 e 4) foi necessario utilizar
determinados utensilios sendo um bequer 500 ml com agua destilada autoclavada, bico de bulsen, gerador acquaprata que possui dois eletrodos. Foi introduzido os dois eletrodos do gerador acquaprata no bequer de 500 ml com 300 ml de agua destilada autoclavada durante um periodo de 2 horas para conseguir obter a
concentração de 20 particular por milhão (ppm) em 300 ml de agua destilada, após o periodo de 2 horas foi necessario deixar a solução descansar durante 24 horas em meio ambiente sem luminosidade.
Terceira etapa após observar crescimento das colonias do fungo Candida albicans no meio solido agar sabouraud e após produzir o antifungico prata coloidal
nanoparticulada e deixar em descanso no periodo de 24 horas demos continuação com nossa metodologia realizando o procedimento da diluição minima inibitoria. Foi necessario 6 tubos de ensaio com tampa autoclavado e cada tubo possuia 5 ml de agua destilada autoclavada, utilizamos 6 alças bacteriologicas para coletar uma alçada do fungo Candida albicans no meio solido agar sabouraud e depositar em cada tubo de ensaio junto com os 5 ml de agua destilada autoclavada, cada tubo recebeu uma diluição de prata coloidal nanoparticulada com auxilio de 6 pipetas graduadas 1 ml e apenas o tubo numero 6 não recebeu o anti fungico pois serviu como controle para observar se haveria crescimento do fungo Candida albicans sem o antifungico (Tab.1). Após realizar todas as diluições utilizamos o vortex para homogenizar todos os tubos de ensaio com tapa autoclavado e com o auxilio de 6 swabs coletamos cada amostra de cada tubo e semeamos com o auxilio do swab
em 6 placas de petri com o meio de cultura agar sabouraud e levamos na estufa a 37,5 graus celsius durante um periodo de 42 horas para observar qual seria a placa que não haveria crescimento algum do fungo.
Obtivemos um resultado positivo pois o tubo de numero 6 que havia apenas água destilada autoclavada 5 ml e uma alçada do fungo Candida albicans observamos um crescimento de mais de 500 colonias sendo que esse tubo era definido como nosso controle (Figura 5), tubo de numero 5 havia água destilada autoclavada 5 ml, uma alçada do fungo Candida albicans e com concentração de 0,002 ppm houve um crescimento de mais de 400 colonias, tubo numero 4 havia água destilada autoclavada 5 ml e uma alçada do fungo Candida albicans e com uma diluição de 0,02 ppm houve um crescimento de mais de 400 colonias (Quadro 1), tubo numero 3 havia água destilada autoclavada 5 ml, uma alçada do fungo Candida albicans com uma diluição de 0,2 ppm que observamos um crescimento de mais de 300 colonias, tubo numero 2 havia água destilada autoclavada 5 ml, uma alçada do fungo Candida albicans com uma diluição de 2 ppm sendo obserado mais de 200 colonias e o tubo de numero 1 havia agua destilada autoclavada 5 ml, uma alçada do fungo Candida albicans com uma diluição de 20 ppm que não observamos nenhum crescimento do fungo Candida albicans, sendo definida como nossa concentração minima inibitoria. Para comprovar o crescimento do fungo Candida
albicans nas colonias observadas em cada placa foram realizadas laminas de
microscopio e observado na objetiva de 400x as colonias do fungo Candida
Figura 1: Fungo Candida albicans semeado Figura 2: Semeação do fungo nas placas de no meio de cultura ágar Sabouraud. Petri.
Fonte: Acervo pessoal, 2020. Fonte: Acervo pessoal, 2020.
Figura 3: Gerador de prata coloidal. Figura 4: Eletrodos de prata coloidal.
Fonte: Acervo pessoal, 2020. Fonte: Acervo pessoal, 2020.
Tabela 1: Análise realizada a partir das diluições com a prata coloidal e suas porcentagens com seus respectivos tubos de ensaio.
Fonte: Acervo pessoal, 2020. RESULTADOS
Quadro 1: Contagem das unidades de formação de colônias crescidas durante o processo de incubação de microrganismos, como fungos e bactérias.
Ppm (partes por milhão %) UFC (Unidade de Formação de Colônias)
20 0 2 * >20 0,2 >30 0,02 >30 0,002 >30 0 >40
Fonte: Acervo pessoal, 2020.
Figura 5: Resultados das diluições seriadas do anti fungico prata coloidal
nanoparticulada (tabela 1) para obter a concentração minima inibitoria do fungo
Candida albicans. 1) Placa de petri semada com diluição do tubo 1. 2) Placa de
petri semeada com diluição do tubo 2. 3) Placa de petri semeada com a diluição do tubo
3. 4) Placa de petri semeada com diluição do tubo 4. 5) Placa de petri semeada com diluição do tubo 5. 6) Placa de petri semeada com diluição de agua destilada autoclavada e com uma alçada do fungo Candida albicans considerada como nosso controle.
Fonte: Acervo pessoal, 2020.
Figura 6: Comprovação da presença do fungo Candida albicans pela microscopia, observado na objetiva de 1000x. Coloração gram.
Fonte: Acervo pessoal, 2020. DESENVOLVIMENTO
Baseado nos trabalhos de BRITO et al. (2009), manifestações por Cândida albicans são pouco frequentes na clínica de pequenos animais, no entanto nos últimos anos tem sido observado aumento considerável de relatos, porém quando comparado com a rotina do laboratorio acaba ocorrendo com frequencia o
aparecimento do fungo Candida albicans por ser um fungo da microbiota normal do animal.
Segundo os artigos de BARBEDO e SGARBI (2010), sabe-se que esse fungo possui a habilidade de apresentar em várias formas, tais como, brotamento, filamentos e pseudo-hifas e durante a pesquisa foi observado nas analises do projeto o crescimento de levedura.
A prata coloidal nanoparticulada durante a nossa pesquisa mostra que é um potente antifungico capaz de inibir completamente o crescimento do fungo
Candida albicans e quando comparado com o experimento de VASCONCELLOS (2012) que utlizou a prata coloidal nanoparticulada para testar a concentração minima inibitoria em duas tecnicas de pour plate e tecnica de disco de papel absorvente, obteve tambem resultados beneficos encontrando a concentração minima inibitoria.
Ação antimicrobiana da prata coloidal nanoparticulada de acordo com trabalho de CARREIRA et. al. (2009) demonstra satisfatorio o resultado pois ocorreu uma eliminação total do fungo Candida albicans e esse acontecimento ocorreu tambem em nosso trabalho onde a concentração de 20 ppm acabou gerando eliminação total do fungo Candida albicans.
O mecanismo de ação antimicrobiana da prata coloidal, especificamente na forma de nanopartículas, ainda não é bem claro na literatura, porem de acordo com a pesquisa de SANTANA (2012) aponto que a prata é um potente antibiótico e por ser natural possui baixo efeitos colaterais quando comparado com os
medicamentos utilizados atualmente para os tratamentos antifungicos.
De acordo com VIEIRA et al. (2017) o tratamento antifungico de eleição utilizado para Candida albicans é a anfotericina B e fluconazol porem esses medicamentos podem acabar gerando diversos efeitos colaterais durante o tratamento, uma alternativa benefica que acaba não sendo malefica para organismo do animal é a utilização do anti fungico prata coloidal nano particulada.
Apesar dos estudos de VASCONCELLOS (2012) serem eficazes em inibir a prata coloidal, sem diluição, nas concentrações de 5, 10 e 60nm nosso trabalho
encontra os mesmos resultados em um valor de 20ppm, mostrando, mesmo sob diluição, uma nova concentração viável onde a prata coloidal atua como um antifúngico eficiente.
CONCLUSÃO
Após análises microbiológicas e microscopicas foi averiguado a capacidade inibitória da prata coloidal nanoparticulada de 20 particulas por milhão sobre o fungo Candida albicans.
FONTES CONSULTADAS
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BARBEDO, L.S.; SGARBI, D.B.G. Candidíase. Jornal Brasileiro de Doenças Sexualmente Transmissíveis. Rio de Janeiro, p.22-38, 2010.
BRITO, E. H. S.; OLIVEIRA, S.F.R.; NOGUEIRA, B.R.S.; AGUIAR, C.R.D.; COSTA, S.J.J.; GADELHA, R.M.F. Candidíase na medicina veterinária: um enfoque micológico, clínico e terapêutico. Ciência Rural. Santa Maria, v.39, n.9, p.2655-2664, 2009.
CARREIRA, C. M,; PEREIRA, C.A.; BOMBANA, A. C.; JORGE, A. O. C. Eficácia antimicrobiana das nanopartículas de prata sobre esporos, leveduras e
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NISHIMOTO, A. T.; SHARMA, C.; ROGERS, P. D. Molecular and genetic basis of azole antifungal resistance in the opportunistic pathogenic fungus
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ROCHA, D. P.; PINTO, G. F.; RUGGIERO, R.; OLIVEIRA, C. A. D.; GUERRA, W.; FONTES, A. P. S.; PEREIRA, E. C. Coordenação de metais a antibióticos como uma estratégia de combate à resistência bacteriana. Química Nova, v. 34, n. 1, p. 111-118, 2011.
SANTANA, S. V. Nanopartículas de prata e Ag/Zno nanoestruturado como agentes antimicrobianos obtidos por processo hidrotermal de micro-ondas. Programa de pós-gradução em quimica, 2012.
SPAMPINATO, C.; LEONARDI, D. Candida Infections, Causes, Targets, and Resistance Mechanisms: Traditional and Alternative Antifungal Agents. BioMed Research International journal, 2013.
VASCONCELLOS, L.K. Ação de nanopartículas de prata sobre Candida
glabrata: análise da mínima concentração inibitória. Trabalho de conclusão de curso. Araçatuba, p. 5-6, fev. 2012.
VIEIRA, A. J. H., SANTOS, J. I. Mecanismos de resistência de Candida
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WHALEY, S. G.; BERKOW, E. L.; RYBAK, J. M.; NISHIMOTO, A. T.; BARKER, K. S.; ROGERS, P. D. Azole antifungal resistance in Candida albicans and
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