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INFLUENCIA DA ADMINISTRAÇÃO DE ETINILESTRADIOL E LEVONORGESTREL NAS PROPRIEDADES MECÂNICAS DO LIGAMENTO CRUZADO POSTERIOR E TÍBIA.

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PROPRIEDADES MECÂNICAS DO LIGAMENTO CRUZADO POSTERIOR E TÍBIA.

Gabriela Rezende Yanagihara1, Aline Goulart de Paiva1, Rodrigo César Rosa2, Antônio Carlos Shimano2, Ricardo Cunha Bernardes1, Álvaro César de Oliveira Penoni1

1

Graduação em Fisioterapia, Universidade do Vale do Sapucaí, Pouso Alegre (MG), Brasil, 2

Departamento de Biomecânica, Medicina e Reabilitação do Aparelho Locomotor, Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto – Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto (SP), Brasil.

Resumo:

Introdução: Existem evidências de que há receptores de hormônios no tecido ligamentar, porém existem poucos trabalhos na área. O objetivo deste trabalho foi avaliar o comportamento biomecânico do ligamento cruzado posterior e de tíbia de ratas que foram submetidas ao uso de contraceptivo oral a base de simuladores de estrogênio e progesterona. Materiais e Métodos: Utilizou-se 32 ratas wistars divididas em grupos experimentais e controles que receberam doses de etinilestradiol e levonorgestrel dissolvidos em propilenoglicol e solução salina como placebo, respectivamente, durante 12 e 36 ciclos estrais. Após o período de administração de contraceptivo oral, foram realizados ensaios mecânicos de tração para os ligamentos cruzados posteriores e de flexão em três pontos para as tíbias. As duas propriedades mecânicas avaliadas foram a força máxima e a rigidez. Resultados e Discussão: Não houve diferença estatisticamente significante que afirme que o uso de contraceptivo oral durante 12 ou 36 ciclos estrais pode influenciar no comportamento biomecânico do ligamento cruzado posterior e da tíbia de ratas. Entretanto, a metodologia realizada se difere aos descritos na literatura, mostra que existe um campo aberto para novos estudos em relação ao comportamento biomecânico de tecidos moles submetidos ao uso prolongado de hormônios.

Palavras-Chave: Biomecânica, Ligamento Cruzado Posterior, Contraceptivo Oral, Estresse mecânico Abstract:

Introduction: Some evidence show that hormone receptors are present in the ligament tissue, however

there are few studies in this area. The present work aims to evaluate the biomechanical behavior of posterior cruciate ligament and tibia from rats which were submitted to oral contraceptive simulators of estrogen and progesterone. Materials and Methods: Were used 32 female rats wistars divided into experimental and control groups that received doses of levonorgestrel and ethinylestradiol dissolved in propylene glycol and placebo, respectively, during 12 and 36 estrous cycles. After the period of administration of oral contraceptives, were performed tensile test for posterior cruciate ligaments and 3-point bending to the tibia. The two mechanical properties were evaluated ultimate load and stiffness. Results and Discussion: There was no statistically significant stating that the use of oral contraceptives for 12 or 36 estrous cycles may influence the biomechanical behavior of the posterior cruciate ligament and the tibia of rats, however the methodology carried out differs from the literature, showing that there is an open field for further studies involving biomechanical behavior of soft tissues subjected to prolonged hormones use.

Key-Words: Biomechanics, Posterior Cruciate Ligament, Oral Contraceptive, Mechanical Stress

INTRODUÇÃO

Evidências científicas mostram que as alterações hormonais relacionadas ao ciclo menstrual da mulher podem influenciar no comportamento biomecânico de tecidos moles(2, 13-16,29), sendo que as mulheres atletas são até oito vezes mais propensas a lesões de ligamento cruzado anterior (LCA) se comparadas aos homens quando praticam uma mesma

atividade(4-5,11-13,29). Isso ocorre porque as mulheres sofrem uma produção maior de

hormônios, alterando a síntese de colágeno(11). Hormônios sexuais específicos aumentam a laxidez e alteram a composição e estrutura dos ligamentos(11,13), causando instabilidade articular que está associada ao risco de lesão do joelho. Os ligamentos cruzados anterior e posterior, localizados no centro da articulação do joelho, são fundamentais para a estabilidade ântero-posterior e rotacional dessa

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articulação(7,14). As lesões destes ligamentos cruzados podem acarretar distúrbios degenerativos na cartilagem articular e nos meniscos do joelho, podendo acelerar o desenvolvimento de artrose(21).

Um meio de analisar as propriedades biomecânicas de ligamentos é sujeitar estruturas a deformações de tensão usando uma taxa constante de alongamento. O tecido é alongado até se romper e uma curva resultante de carga versus deformação é formada, demonstrando o comportamento biomecânico do tecido(20).

Embora alguns estudos estejam sendo realizados com a finalidade de interligar as características hormonais com o risco de lesão do LCA, eles ainda são escassos, especialmente os direcionados a outros tecidos ligamentares do complexo do joelho, como por exemplo, o ligamento cruzado posterior (LCP). Estes estudos ainda relacionam as alterações hormonais intrínsecas da mulher em diversas fases do ciclo menstrual, porém, pouco se encontra na literatura trabalhos que relacionaram simuladores dos hormônios produzidos pelas mulheres com o risco de lesão do complexo do joelho. O objetivo desta pesquisa, portanto, foi investigar os efeitos da administração contínua de contraceptivo oral a base de levonorgestrel e etinilestradiol, simuladores de estrogênio e progesterona, nas propriedades mecânicas do LCP e da tíbia. MATERIAIS E MÉTODOS

Este trabalho seguiu as normas descritas pelo Colégio Brasileiro de Experimentação Animal (COBEA) de 1991, e do International Guiding Principles for Biomedical Research Involving Animals(6) e foi aprovado pelo Comitê de ética em pesquisa da Universidade do Vale do Sapucaí, sob o protocolo 122/10.

Animais:

Para este estudo foram utilizadas 32 ratas Wistar, fêmeas, que ficaram alojadas durante todo o experimento em gaiolas coletivas sob condições normais de ambiente (21 ± 2°C, 55 – 60% de umidade e ciclo 12 h claro/escuro) recebendo a mesma ração para ratos e água ad libidum.

Grupos Experimentais:

Os animais foram divididos aleatoriamente e igualmente (n=8) em quatro grupos, sendo dois grupos experimentais e dois controles:

Grupo Experimental 60 dias (GE1): Grupo que recebeu doses de etinilestradiol e levonorgestrel 12 ciclos estrais;

Grupo Experimental 180 dias (GE2): Grupo que recebeu doses de etinilestradiol e levonorgestrel durante 36 ciclos estrais;

Grupo Controle 60 dias (GC1): Grupo que recebeu placebo durante 12 ciclos estrais;

Grupo Controle 180 dias (GC2): Grupo que recebeu placebo durante 36 ciclos estrais; Procedimentos:

Durante os 60 dias, ou seja, 12 ciclos estrais, uma vez que o ciclo estral médio de ratas é de 5 dias(29), o grupo GE1 recebeu doses dos hormônios etinilestradiol (1,27 nanogramas) e levonorgestrel (4,5 nanogramas) dissolvidos em 0,25mL de propilenoglicol. O mesmo aconteceu com o GE2, que recebeu as mesmas doses de hormônios, porém durante 180 dias, ou seja, 36 ciclos estrais.

Ao mesmo tempo, durante 12 e 36 ciclos estrais, respectivamente, os grupos GC1 e GC2 receberam 0,25ml de Solução Salina (NaCl a 0,9%) como placebo(29).

A ingestão foi feita por meio de uma sonda de lavagem e, para simular a recomendação do medicamento para humanos, foi administrado durante 4 dias consecutivos, seguidos de pausa de 1 dia(29), uma vez que a ingestão humana é de 21 dias, seguidos de pausa de 7 dias.

Durante os 5 últimos dias consecutivos de ingestão, ou seja, o último ciclo estral antes da eutanásia das ratas de cada grupo, foram realizados esfregaços vaginais simples com intuito de se obter a fase do ciclo estral em que se encontravam:

1ª fase (maior concentração de estrogênio) ou

2ª fase (maior concentração de progesterona).

Esta identificação foi realizada partindo de uma análise histológica realizada por um avaliador cego.

Após o período de ingestão de cada grupo (60 dias e 180 dias) e dos esfregaços vaginais, os animais foram transportados para o Laboratório de Bioengenharia da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto/USP (FMRP/USP). Neste local, os animais foram eutanasiados através de doses excessivas de anestésico(17-18) e a estrutura Fêmur-LCP-Tíbia do membro direito de cada animal foi dissecada, a fim de realizar o ensaio mecânico de tração do LCP. Foi dissecada também a tíbia esquerda de cada animal, para que fosse realizado o ensaio mecânico de flexão em três pontos.

Utilizou-se para estes ensaios uma máquina universal de ensaios da marca EMIC®, modelo DL 10.000, e acessórios desenvolvidos especialmente para os ensaios de ligamentos e de flexão em três pontos para ossos de animais de pequeno porte, por exemplo, de ratos(8,22,24), como está demonstrado na Figuras 1 e 2. Para a realização do ensaio de tração da estrutura Fêmur-LCP-Tíbia, foi necessária a osteotomia do fêmur e tíbia, desprezando as diáfises, isso para melhor fixação e posicionamento no acessório.

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Figura 1. Acessórios de fixação da estrutura Fêmur-LCP-Tíbia para ensaio de tração)

(Figura 2. Acessórios de fixação da Tíbia para ensaio mecânico de flexão em três pontos)

A máquina de ensaios possui uma interface com o programa TESC (versão 3.13 - EMIC®), que permitiu a aquisição de dados referentes ao tempo e a força aplicada e deformação do material analisado. Os valores das propriedades mecânicas foram obtidos diretamente pelo programa TESC. Nos testes de tração dos LCPs e de flexão em três pontos das tíbias foram avaliadas a força máxima (Fmax) e a rigidez.

Para os ensaios mecânicos foi utilizada célula de carga com capacidade de 500N (certificada pela EMIC®). A velocidade de aplicação de força para os ensaios de tração dos LCPs foi de 10mm/min e de 1mm/min para os ensaios de flexão em três pontos das tíbias. O tempo de acomodação foi de 10 segundo para os dois tipos de ensaio.

A análise estatística dos valores de Fmax e rigidez foi realizada através do teste T- Student para comparação entre os grupos GC1 x GE1 e GC2 x GE2. Foi adotado o nível de significância de 5%.

RESULTADOS

Durante o transporte dos animais, houve perda de um animal da amostra do grupo C2.

O peso corporal dos animais não diferiu entre os grupos no início do estudo tanto na comparação GE1xGC1 (p=0,50), quanto na comparação GE2xGC2 (p=0,60). Os pesos finais dos animais bem como as medidas das estruturas analisadas se encontram na tabela 1. Quanto ao peso final dos animais, não houve diferença entre os grupos GE1xGC1 (p=0,30) e GE2xGC2 (p=0,28). Para as mesmas comparações de grupo, também não houve diferença no comprimento do LCP (p= 0,41 e p=0,30, respectivamente). O peso final das tíbias do grupo GE2 foi estatisticamente maior do que as do grupo GC2 (p<0,0001), enquanto na comparação GE1xGC1 não houve diferença.

Tabela 1. Médias de pesagem final dos animais, peso das tíbias e comprimento do LCP por cada grupo:

Peso animal (g) Massa Tíbia (g) Comprimento (mm) GE1 (n=8) 254,40±22,59 0,62±0,06 4,25±0,38 GE2 (n=8) 251,30±29,73 0,72±0,08 3,94±0,33 GC1 (n=8) 258,80±6,94 0,66±0,11 4,29±0,32 GC2 (n=7) 243,60±23,93 1,06 ±0,07 3,82±0,47

As médias dos resultados de força máxima dos LCPs de GE1 (12,10 ± 3,85 N), GC1 (19,08 ± 12,43 N), GE2 (18,33 ± 2,79 N), GC2 (16,28 ± 2,81 N) e de rigidez (26445,43 ± 6386,04 N/mm; 30957,23 ± 16120,80 N/mm; 33949,87 ± 10187,34 N/mm; 31501,33 ± 6348,95 N/mm, respectivamente) são mostradas nos gráficos 1 e 2.

Não houve diferença nos valores de Fmáx dos LCPs entre GE1xGC1 (p=0,08) e GE2xGC2 (p=0,09); também não houve diferença nos resultados de rigidez dos LCPs entre GE1xGC1 (p=0,20) e GE2xGC2 (p=0,29).

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Gráfico 1: Resultados de Força Máxima para GE1, GE2, GC1 E GC2 dos ligamentos cruzados posteriores

Gráfico 2: Resultados de Rigidez para GE1, GE2, GC1 E GC2 dos ligamentos cruzados posteriores

A médias dos resultados de força máxima das tíbia de GE1 (47,56 ± 3,01 N), GC1 (49,05 ± 6,65 N), GE2 (52,45 ± 7,43 N), GC2 (53,54 ± 8,24 N) e de rigidez (62,02 ± 6,20 N/mm; 66,50 ± 13,72 N/mm; 57,46 ± 11,52 N/mm; 63,68 ± 10,91 N/mm, respectivamente) são mostradas nos gráficos 3 e 4.

Não houve diferença nos valores de Fmáx das tíbias entre GE1xGC1 (p=0,28) e GE2xGC2 (p=0,39); também não houve diferença nos resultados de rigidez entre GE1xGC1 (p=0,20) e GE2xGC2 (p=0,15).

Gráfico 3: Resultados de Força Máxima para GE1, GE2, GC1 E GC2 das tíbias.

Gráfico 4: Resultados de Rigidez para GE1, GE2, GC1 E GC2 das tíbias.

A comparação dos valores qualitativos obtidos quanto à fase do ciclo estral mostrou que não houve homogeneidade dos ciclos estrais entre os grupos.

DISCUSSÃO

A literatura referente à influência hormonal sobre o comportamento biomecânico de tecidos moles é escassa, principalmente aos estudos destinados ao LCP. A maioria dos estudos utiliza o LCA e/ou o ligamento colateral medial, devido à grande incidência de lesões. Este fato motivou nosso estudo, procurando testar o comportamento biomecânico do LCP e aumentar a gama de informação sobre esse ligamento. Além disso, não foram encontrados estudos correlacionando o uso de hormônios extrínsecos com o tecido ósseo.

O LCP é descrito por vários autores como o ligamento mais importante do joelho e considerado duas vezes mais resistente do que o LCA. Porém, na prática clínica, tem sido mencionado pior prognóstico em joelhos com lesão isolada do LCA do que naqueles com lesão isolada do LCP, sugerindo a necessidade de confirmação desses conceitos sobre os ligamentos cruzados(15).

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Girgis et al. (1975), através de um estudo com cadáveres humanos frescos, realizaram um corte seletivo do LCP e demonstraram que ele é importante na flexão do joelho, por dosar a quantidade de rolamento e deslizamento, mantendo uma coaptação adequada durante esse movimento(9). A estabilidade rotacional do joelho manteve-se inalterada em extensão, mas alterou em flexão após o corte do LCP. Este ligamento é a maior contensão para desvio posterior da tíbia em todos os ângulos de flexão do joelho(2,15).

Kokron et al. (1993) afirmam que os ligamentos cruzados apresentam propriedades biomecânicas semelhantes e que os limites de resistência do LCA e do LCP diminuem com a idade na mesma proporção. Além disso, as propriedades biomecânicas dos ligamentos cruzados mantêm relação constante entre si(15).

Recentemente pesquisas mostraram a associação entre o ciclo menstrual e a frouxidão do LCA; no entanto, ainda não existe uma clara relação(4). Não foi encontrada na literatura a mesma relação com o LCP.

Um estudo de Wojtys et al. (1998) relacionou o ciclo menstrual com lesões do LCA em mulheres e revelou que há mais lesões do que o esperado na fase ovulatória do ciclo. Em contrapartida, um número significativamente menor de lesões ocorreu na fase folicular. Esses hormônios podem ser um fator para o dilema da lesão de ligamento de joelho em mulheres(28).

Embora os estudos de Kokron et al. tenham revelado que as propriedades biomecânicas do LCA são semelhantes ao do LCP, o tratamento ideal das rupturas do ligamento cruzado posterior permanece controverso, apesar de numerosos recentes avanços das ciências básicas sobre o tema(26).

César et al. (2008) afirmam que existe uma grande dificuldade na comparação dos estudos demonstrados na literatura uma vez que os protocolos utilizados não são semelhantes entre si(4). Outro fator que dificulta a comparação de estudos é o fato de poucos autores utilizarem hormônios extrínsecos, ou seja, os simuladores de hormônios, como o levonorgestrel e o etinilestradiol utilizados neste estudo.

Historicamente, a maioria dos estudos sobre LCA ou LCP e suas possíveis reconstruções tem como principal variável mensurada a força máxima (maior valor da curva força-deslocamento), sendo também traçada uma curva de força-deslocamento. A partir dessa curva pode-se determinar a rigidez, determinada como a inclinação da região linear da curva de força-deslocamento(7). Neste estudo, as estruturas, tanto ligamentares quanto ósseas, mostraram comportamento normal de resposta biomecânica, ou seja, à medida que a carga foi sendo aumentada de forma constante, a rigidez do tecido aumentou e progressivamente maior

força foi exigida para produzir quantidades equivalentes de deformação. Os tecidos foram levados à ruptura e a força máxima e a rigidez foram marcadas.

Liu et al. (1996) demonstraram a presença de receptores dos hormônios estrógeno e progesterona no LCA humano, o que pode alterar a proliferação de fibroblastos e a síntese de colágeno. Não foram encontrados estudo imuno-histoquímicos para o LCP(16).

A dose de hormônios ingesta nos animais foi estipulada de acordo com o trabalho realizado por Woodhouse et al. (2007), que obteve diferenças significativas nas propriedades mecânicas do LCA, porém seu procedimento de ensaio baseou-se em uma metodologia diferente da realizada neste estudo. Além disso, Woodhouse e colaboradores objetivaram analisar a influência do uso de contraceptivo oral no comportamento biomecânico do LCA, o que difere desta pesquisa cujo objetivo foi avaliar o comportamento biomecânico do LCP(29).

Em seu estudo, Woodhouse mostrou que, em ratos, parece que a administração de hormônios reprodutivos concebidos para simular a contracepção oral típica em seres humanos altera as propriedades mecânicas do LCA. Entretanto, os aparatos utilizados pelos autores, foram adaptados para que permitissem que os LCAs fossem submetidos a um mecanismo de lesão normal. Já neste estudo utilizou-se uma Máquina Universal de Ensaios e foram realizados ensaios estáticos tradicionais.

Em uma revisão de literatura, César et al., afirmaram que os ensaios estáticos são mais freqüentemente realizados que os dinâmicos, embora não reproduzam as situações de lesão do ligamento cruzado anterior. Entretanto, dos trabalhos analisados por César e et al., a maioria dos estudos que utilizaram o método de ensaio dinâmico, utilizaram amostras humanas, sem grupo controle, o que diminui a confiabilidade dos resultados(4). No presente estudo optou-se por realizar um estudo com comparação experimental versus controle, com ensaios estáticos, no intuito de revelar possíveis diferenças nas propriedades mecânicas. Embora ensaios estáticos não simulem o mecanismo de lesão, a análise do comportamento biomecânico de tecidos submetidos a fármacos é essencial no sentido de aumentar o conhecimento acerca das propriedades mecânicas em situações não usuais. Essa comparação foi realizada com ensaio estático com o objetivo de dar mais confiabilidade aos dados coletados.

O estudo de Ruedl et al. (2009) sugere que o uso de contraceptivo oral não mostra qualquer efeito protetor contra lesões do LCA nem auto-relatos de lesões LCAs mostraram associação com as taxas de acidentes no esqui recreativo. Uma análise de dados da história menstrual revelou que as esquiadoras recreativas na fase pré-ovulatória foram significativamente

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mais propensas a sustentar uma lesão do LCA do que eram na fase pós-ovulatória(23).

Shultz et al. (2005) procuraram mostrar as diferenças na lassidão da articulação do joelho durante o ciclo menstrual e descobriram unicamente que as diferenças sexuais são dependentes do ciclo, sendo maior quando as fêmeas estão em fase lútea inicial do seu ciclo estral(25).

Conforme exposto nos resultados das fases dos ciclos estrais, obtidos através dos esfregaços vaginais simples, podemos entender que embora a ingestão do medicamento tenha sido realizada em mesmo dia e horário, não houve homogeneidade de concentrações de estrogênio e progesterona entre os grupos, o que pode ter influenciado no resultado. Isso mostra que a dose estipulada para este estudo não foi suficiente para regular os ciclos estrais desses animais, ainda que tenha sido realizada de acordo com o estudo de Woodhouse em 2007 e as metodologias tenham sido semelhantes quanto à idade dos animais, veículo de diluição e dose do medicamento, tempo e modo de ingestão.

Não havendo diferenças estatisticamente significantes na comparação entre os grupos experimental versus controle, sugere-se, portanto, que outros estudos sejam realizados estipulando uma dose proporcional para os animais, acompanhando a regularidade de cada fêmea para garantir a sua atividade na regulagem do ciclo estral. Embora este estudo não tenha mostrado diferenças significativas para força máxima e rigidez nos ensaios em LCP e tíbia, houve um ponto positivo em contraposição ao estudo de Woodhouse (2007), mostrando que existe um campo aberto para novas explorações em relação ao comportamento biomecânico de tecidos moles submetidos ao uso prolongado de hormônios. Baseado nisso, sugere-se ainda, que os outros estudos sejam feitos com mais tempo de ingestão.

CONCLUSÃO

Concluiu-se com esse estudo que a ingestão de contraceptivo oral, baseado na solução de etinilestradiol e levonorgestrel, durante 12 e 36 ciclos estrais, em ratas, não influencia no comportamento biomecânico do LCP e da tíbia, quando avaliada a força máxima e a rigidez. REFERÊNCIAS

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Contato:

Gabriela Rezende Yanagihara

Graduação em Fisioterapia, Universidade do Vale do Sapucaí, Pouso Alegre (MG), Brasil.

Avenida Cel Alfredo Cstódio de Paula, 320 Medicina – CEP: 37550000,

Pouso Alegre, MG, Brasil. Telefone: 35 34492151

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