RIDASCREEN Spec. IgE. Art. No.: A0041 RIDASCREEN Spec. IgE Reagents Art. No.: A0040 RIDASCREEN Spec. IgE Reagents

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RIDASCREEN

®

Spec. IgE

Art. No.: A0041 RIDASCREEN® Spec. IgE Reagents Art. No.: A0040 RIDASCREEN® Spec. IgE Reagents

Also applies to:

Art. No.: A0049 RIDASCREEN® Allergen Disc

Art. No.: A0249 RIDASCREEN® _{Spec. IgE Allergen Disc}

R-Biopharm AG, An der neuen Bergstraße 17, D-64297 Darmstadt,

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1. Finalidade

Para diagnóstico in vitro. O teste RIDASCREEN® Spec. IgE é um enzima-imuno-ensaio (EIA) para a comprovação quantitativa de anticorpos IgE específicos no soro humano. O teste deve ser executado no caso de suspeita fundada de uma alergia para a confirmação, após o diagnóstico in-vivo e anamnéstico. Os anticorpos específicos IgE podem ser comprovados contra os possíveis alérgenos também para o esclarecimento dos resultados não relacionados anmnesticamente do diagnóstco in-vivo.

2. Resumo e explicação do teste

A tarefa do sistema imunitário é a defesa das bactérias patagênicas, vírus e outros microorganismos. A reação de defesa serve para proteger o organismo no primeiro contato com os agentes patogênicos, mas também para a imunização no caso de outros contatos. Um primeiro contato sem sintomas precede também todas as reações alérgicas, sendo que neste contato os anticorpos específicos da classe E (anticorpos IgE) já são formados. Com os contatos repetidos com os alérgenos causadores, estes anticorpos IgE reagem com os alérgenos e levam à distribuição de mediadores (quase sempre de mastócitos), como histamina, prostaglandina, etc. que por sua vez levam aos sintomas da alergia. Através da comprovação destes anticorpos específicos IgE no soro, os alérgenos causadores podem ser identificados demonstrando as reações alérgicas. Mas também as sensibilizações sem sintomas já podem ser registradas.

O teste é um teste sorvente de alergia e enzima (EAST) com base nos discos de celulose. Todos os reagentes presentes no ponto 4 (A0041 ou A0040) são validados com os discos de alérgeno da firma R-Biopharm (A0049). Ao utilizar estes reagentes em conjunto com os discos de outros fabricantes, o usuário tem o dever de fazer a validação do teste.

3. Princípio do teste

Os alérgenos são ligados em discos de celulose. Para a execução do teste, os discos de alérgenos são colocados nas cavidades de uma microplaca ou são disponibilizados por um médico de acordo com a necessidade.

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Os soros dos pacientes, soros padrão, controles positivos e negativos são pipetados nos respectivos discos de alérgenos e incubados a 37 °C. Com isso, os anticorpos IgE específicos do alérgeno se ligam ao alérgeno.

O material não ligado é removido com a água. Depois, é feita a adição de um anticorpo IgE anti-humano monoclonal conjugado de fosfatase alcalina. O conjugado não ligado é removido com a água. Então acontece a adição do substrato que, através da enzima conjugada, desfosforilhado em um produto de cor amarelo. A intensidade da cor amarela é proprocional à quantidade de anticorpos específicos do alérgeno no soro.

A medição acontece de forma fotométrica a 405 nm e comprimentos da onda de referência de 620 nm.

Alguns alérgenos são acoplados, através da HSA (albumina do soro humano), ao disco de celulose. Para isto, é necessária a utilização adicional de um disco de HSA por paciente para a realização da ligação não específica de alérgenos. Os respectivos alérgenos são marcados na lista de códigos da R-Biopharm AG através de “HSA”.

4. Conteúdo da embalagem

Tab.1: Conteúdo da RIDASCREEN® Spec. IgE Reagents 1-96 doses (art. n.º A0041)

Plate _{1-96 doses 1 Microplaca}

DiscS 10 _{Discos padrão}

DiscC 2 _{Discos de controle}

DiscA Discos de alérgeno, número de acordo com o desejo do

cliente (não faz parte do kit de reagente A 0041)

AllergyWB 60 ml Tampão de lavagem, concentração (16 x), 0,9% NaN3, Cor da tampa: transparente

Standard 1 500 µl Soro padrão 1, dil. soro humano; concentração (em IU IgE/ml): 0,35 ; na solução proteica estabilizada

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Control│+ 500 µl

Controle positivo IgE, dil. soro humano, pronto para o uso, concentração: veja o certificado;

na solução proteica estabilizada,

Cor da tampa: pequena tampa vermelha Control│- 500 µl

Controle negativo IgE, dil. soro humano, pronto para o uso, concentração: veja o certificado;

na solução proteica estabilizada, Cor da tampa: pequena tampa azul

Conjugate 6 ml

Conjugado IgE anti-humano, (monoclonal); pronto para o uso; anticorpo conj. De fosfatase alcalina em solução proteica, Cor da tampa: azul

AllergySub S 12 ml Substrato, solução pNPP, pronto para o uso, Cor da tampa: preta

AllergyStop R 12 ml Reagente bloqueadora, 7,4% EDTA, pronta para o uso, Cor da tampa: verde

Tab.2: Conteúdo da RIDASCREEN®_{Spec. IgE Reagents (art. n.º A0040)}

Plate 1-192

doses Placas microtítulo

DiscS 20 _{Discos padrão}

DiscC 4 _{Discos de controle}

DiscA Discos de alérgeno, número de acordo com o desejo do

cliente (não faz parte do kit de reagente A 0040)

AllergyWB 2 x 60 ml Tampão de lavagem, concentração (16x), 0,9% NaN3, Cor da tampa: transparente

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Control│+ 500 µl

Controle positivo IgE, dil. soro humano, pronto para o uso, concentração: veja o certificado;

na solução proteica estabilizada,

Cor da tampa: pequena tampa vermelha Control│- 500 µl

Controle negativo IgE, dil. soro humano, pronto para o uso, concentração: veja o certificado;

na solução proteica estabilizada, Cor da tampa: pequena tampa azul

Conjugate 12 ml

Conjugado IgE anti-humano, (monoclonal); pronto para o uso; anticorpo conj. de fosfatase alcalina em solução proteica, Cor da tampa: azul

AllergySub S 2 x 12 ml Substrato, solução pNPP, pronto para o uso, Cor da tampa: preta

AllergyStop R 12 ml Reagente bloqueadora, 7,4% EDTA, pronta para o uso, Cor da tampa: verde

5. Reagentes e a sua armazenação

O kit de teste deve ser armazenado a 2-8 °C e utilizado até a data de validade impressa na etiqueta. O tampão de lavagem diluído deve ser armazenado a 2-8 °C por, no máximo, 4 semanas. Deve-se evitar a contaminação microbial. Após a expiração da data de validade, nenhuma garantia de qualidade pode ser oferecida. Uma contaminação da solução de substrato com conjugado deve ser absolutamente evitada, pois isto faz com que o substrato mude de cor. Deve-se evitar a luz direta sobre o substrato para que ele não seja modificado ou mude de cor através de hidrólise. Com a mudança de cor o substrato não deve ser mais usado. Veja também o ponto 10. Controle de qualidade – Sinais da expiração do reagente

6. Reagentes adicionais necessários – equipamento necessário

6.1. Reagentes

– Água destilada ou deionizada 6.2. Equipamento

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– Fotômetro para as microplacas (com filtro 450 e 620 nm), área de medição 0 a 3,5 OD.

– Aparelho de lavagem para as microplacas ou aparelho para lavagem à mão (pente, bomba, contentor co reserva de tampão e de lixo)

– Incubador a 37 °C – Micropipeta 10 – 100 µl

– Pipetas de vários graus ou 8 canais – Cilindro de medição (1000 ml)

7. Medidas de precaução

Somente para o diagnóstico in vitro.

Este teste só deve ser executado por pessoal de laboratório instruído. As regras para o trabalho nos laboratórios médicos devem ser observadas. As intruções de uso para a execução do teste devem ser estritamente seguidas.

Não pipetar as amostras ou reagentes com a boca, evitar o contato com a pele ferida ou mucosas. Durante o manejo de amostras, deve-se usar luvas descartáveis e, após o término do teste, deve-se lavar as mãos. Nas áreas, nas quais se trabalha com as amostras ou com os reagentes do teste, não fumar, comer ou beber.

Os soros de controle presentes no kit (soros padrão, controles negativos e positivos) foram testados quanto à pesença de HIV e HCV-Ak, bem como HbsAg e CFR 21.640 sífilis e os resultados foram negativos. Porém, eles devem ser tratados como potencialmente infecciosos e manuseados de acordo com as regras de segurança nacionais, bem como as amostras dos pacientes e todos os materiais que entram em contato com elas.

Concentrado de tampão de lavagem contém ácido de sódio como meio de conservação. Um contato com a pele ou mucosa deve ser evitado. No contato com os tubos de cobre ou aço ou chumbo podem surgir ácidos metálicos explosivos. Todos os componentes do kit devem ser eliminados de forma especializada e sob responsabilidade própria.

Todos os materiais e reagentes, que entram em contato com amostras potencialmente infecciosas, devem ser manejados com desinfetantes adequados ou autoclavados pelo menos 1 hora a 121 °C.

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8. Coleta e armazenamento das amostras

O teste foi desenvolvido para o exame de soros humanos. Após a coleta de sangue, o soro deve ser separado o mais rápido possível do coágulo para evitar uma hemólise. As amostras devem ser armazenadas congeladas ou na geladeira até a utilização. Um congelamento e descongelamento repetido do soro deve ser absolutamente evitado, bem como a contaminação microbial. A utilização de amostras escurecidas, ictéricas, hemolíticas, lipêmicas e inativadas do calor pode produzir falsos resultados.

Tab. 2: Armazenagem das amostras soro não diluído

2-8°C –20°C

1 semana > 1 semana

9. Execução do teste

9.1. Generalidades

Antes da utilização, todos os reagentes, os soros do paciente e a microplaca devem ser colocados em temperatura ambiente (20-25 °C). Os reagentes devem ser misturados imediatamente antes da utilização. Após a utilização, o kit deve ser armazenado novamente a 2-8 °C.

Os discos de alérgeno, controle e padrão não devem ser usados várias vezes. Os reagentes e os discos não devem ser utilizados se a embalagem estiver danificada ou se o vaso não é impermeável. Os discos de alérgeno não podem estar secos. Exceção: antibióticos beta-lactam (C1, C2, C49, C50, C54, C55, C56, C64, C67) em barras quebráveis (A0049).

Uma mudança ou combinação de componentes do kit com kits de números de carga diferentes não é permitida.

Um desvio dos tempos e temperaturas de incubação leva a um desvio da curva padrão em comparação com o certificado. Um forte desvio dos valores da curva padrão leva a resultados de teste inválidos.

A luz do sol direta durante a execução do teste deve ser evitada. Recomenda-se cobrir a microplaca.

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9.2. Fabricação do tampão de lavagem

Cada garrafa do concentrado do tampão de lavagem AllergyWB é misturada com 1000 ml de água destilada Cristais eventualmente disponíveis no concentrado devem ser dissolvidos anteriomente com calor (banho-maria a 37 °C).

9.3. Disposição dos discos de alérgenos na microplaca

Com a entrega da microplaca Plate, todos os discos DiscS, DiscC e DiscA já estão colocados, conforme e protocolo do cliente. Para cada soro de paciente, que será examinado com relação a HSA-alpergeno, um disco HSA é colocado adicionalmente ao alérgeno.

Com a entrega de discos alérgenos em barras quebráveis (A0049), as cavidades com os discos alérgenos DiscA devem ser colocadas no quadro do kit de reagentes quebrando as barras de acordo com o protocolo de trabalho. No quadro do kit de reagentes, os discos padrão DiscS e os discos de controle DiscC já se encontram na posição certa.

Para cada paciente, que será examinado com relação a HSA-alérgeno, uma cavidade com um disco HSA é colocado adicionalmente ao alérgeno.

Nos testes de painéis (A0250-A0254) os painéis de 16 alérgenos já estão colocados no quadro. Podem ser trabalhados vários painéis diferentes no mesmo quadro. Para isso, é preciso retirar painéis da placa entregue e substituí-los pelos painéis pretendidos.

Tenha em consideração que só devem ser trabalhadas placas completas, pois a quantidade de reagentes foi preparada para isso.

9.4. Primeira incubação

Retirar a película da placa. Tomar cuidado para nenhum disco de alérgenos ficar agarrado à película e ser retirado com ela.

O tampão presente nas cavidades deve ser completamente removido com aspiração. Nas cavidades são pipetados respectivamente 50 µl dos soros Standard 1, Standard 2, Standard 3, Standard 4 e Standard 5, dos controles positivo Control│+ e negativo Control│- e os soros do paciente de acordo com o protocolo. Então a placa Plate é coberta por 60 min e incubada a 37 °C.

9.5. Lavagem

As cavidades devem ser 6 vezes lavadas, cada vez enchendo com buffe de lavagem diluído e aspirando-o. A última aspiração deve ocorrer, dentro do possível, quantitativamente, sendo que os discos permanecem nas cavidades.

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Com a utilização de um aparelho de lavagem automático (recomendado), faz-se a lavagem cada vez com 700 µl de tampão de lavagem, aspirando simultaneamente (ajuste overflow adquado). O ajuste correto do aparelho à medição do tipo de placa utilizada deve anteriormente ser assegurado.

Com a utilização de um aparelho de lavagem manual, trabalha-se em cada lavagem com uma capacidade de enchimento máxima. Não utilizar pipetas para a lavagem! Tanto com os aparelhos de lavagem automáticos bem como com os manuais, o jato do líquido deve ser desviado para a margem do disco, de modo que os discos durante a adição do tampão de lavagem giram ao redor do próprio eixo, com o qual é alcançado um melhor de lavagem.

O número de lavagens e o volume do tampão de lavagem não podem ser reduzidos. 9.6. Segunda incubação

Adição de 50 µl de conjugado Conjugate nas respectivas cavidades. Então a placa Plate é coberta por 60 min e incubada a 37 °C.

9.7. Lavagem

Lavagem de acordo com o ponto 9.5. 9.8. Terceira incubação e medição

Pipetar 100 µl da solução de substrato AllergySub S continuamente em todas as cavidades colocadas. Então a placa Plate é coberta por 15 min e incubada a 37 °C. Através da adição de 50 µl de reagente bloqueadora AllergyStop R, a reação é terminada em cada cavidade. A medição da absorbância ocorre a 405 nm contra o comprimento de onda de referência de 620 nm através dos discos de alérgenos. A placa deve ser medida novamente dentro de 24 horas, se ela tiver sido armazenada coberta e fria.

10. Controle de qualidade - Sinais de expiração do reagente

A cada execução de teste deve ser executado os controles padrão 1-5 (em dose dupla) bem como, para o controle de qualidade, um controle positivo e negativo. O teste foi feito corretamente se o valor OD405/620 para o padrão for de 5 > 1,0 e se as classes EAST alcançadas dos controles ficarem na faixa de valor prescrito no certificado anexo.

Um desvio dos valores prescritos, bem como um escurecimento do reagente ou a coloração amarela do substrato antes da adição nas cavidades podem ser um sinal de expiração do reagente.

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Se os valores prescritos não são alcançados, antes da repetição do teste deve-se controlar o seguinte:

– Validade dos reagentes utilizados

– Funcionalidade dos equipamentos utilizados (por ex. calibragem) – Execução correta do teste

– Controle visual dos componentes do kit para verificar se há contaminação ou vazamento; uma solução de substrato de cor amarelada não deve ser mais utilizada.

Se após a repetição do teste as condições não forem cumpridas, entre em contato com o seu distribuidor local.

Recomenda-se sempre introduzir alguns soros já encontrados como controles e documentar as respectivas classes de EAST alcançadas.

11. Avaliação e interpretação

11.1. Confirmação dos soros 11.1.1. Princípios de cálculo

Para a avaliação do teste, a detecção da curva de referência é necessária. Além disso, os padrões em dose dupla são feitos em cada placa. Para a detecção da curva de referência, os valores médios das extinções das doses duplas dos padrões são aplicados como função das concentrações respectivas (IU/ml) semi-logarítmicas (y-lin-/x-log) em uma apresentação de ponto a ponto. As concentrações dos anticorpos IgE específicos podem, de acordo com a curva padrão dos valores OD, medidos, ser estabelecidas e devem ser, então, calculadas em classes EAST (veja tab. 5). A avaliação pode também ser feita através do respectivo software.

A calibragem da curva padrão do RIDASCREEN® Spec. IgE é feita de acordo com a preparação de referência internacional "2nd WHO IRP 75/502 for human IgE"

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11.1.2. Concentração, classes EAST, avaliações

Tab. 5 Relação entre IU/ml, classes EAST e IgE título específicos de alérgeno estabelecidos do soro do paciente

IU / ml Classe EAST Quantidade de IgE específico de elérgeno 0,00 – 0,34 0 (0,0 – 0,9) não comprovável ou pouco presente

0,35 – 0,69 1 (1,0 – 1,9) baixa 0,70 – 3,49 2 (2,0 – 2,9) aumentada 3,50 – 17,49 3 (3,0 – 3,9) notavelmente aumentada 17,50 – 49,99 4 (4,0 – 4,9) alta 50,00 – 99,99 5 (5,0 – 5,9) muito alta ≥ 100,00 * 6 (≥ 6,0) * extremamente alta

* é definido através da extrapolação linear, visto que no teste só podem ser utilizados 5 padrões.

11.1.3. Interpretação dos resultados com alérgenos com discos HSA

Certos alérgenos, como produtos químicos e a maioria dos medicamentos, bem como alguns componentes adicionais de bens alimentícios não são diretamente acoplados no disco de celulose, mas através da albumina do soro humano (HSA). Para eliminar a ligação não específica ou para excluir uma alergia contra HSA o soro do paciente é testado respectivamente relacionado ao alérgeno HSA examinado e HSA.

Se o valor da densidade ótica OD do disco HSA puro for menor do que o valor da densidade ótica OD do Standard 1, o resultado do disco HSA é negativo e o alérgeno HSA pode ser avaliado quantitativamente mediante a curva padrão. O resultado é dado em classes RAST.

Se o valor da densidade ótica OD do disco HSA puro for maior ou igual ao valor da densidade ótica OD do Standard 1, possivelmente existem anticorpos IgE contra albumina humana no soro sanguíneo do paciente. Neste caso, não é possível avaliar alérgenos HSA para este paciente.

Se o valor da densidade ótica OD do disco de HSA puro for ligeiramente positivo (até a densidade máxima OD do Standard 2), recomendamos a repetição do teste para excluir que erros de pipetagem ou bolhas de ar debaixo do disco de alérgeno durante a medição tenham provocado erroneamente um resultado positivo.

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11.1.4. Interpretação dos resultados com discos de multi-alergia

Tab. 6: Relação entre IU/ml, classes EAST e avaliação estabelecidos do soro do paciente com discos de multi-alergia

IU / ml Classe EAST avaliação

0 – 0,34 0 negativo

≥ 0,35 ≥ 1 positivo

Com um resultado positivo, o respectivo soro deve ser testado em relação às reações específicas aos alérgenos individuais em questão.

12. Limites do método

As concentrações de IgE estabelecidas com este sistema de teste oferecem uma declaração sobre o grau bde sensibilização do paciente em relação aos alérgenos individuais testados ou às misturas de alérgenos.

Uma relação entre a altura de uma concentração IgE estabelecida e a incidência ou os sintomas altamente clínicos não pode ser ignorada daqui. Os resultados alcançados devem sempre ser interpretados em conjunto com o quadro clínico. Por causa da falta de padrões nacionais e internacionais e por causa das possíveis diferenças de soluções de teste Prick e dos extratos de alérgenos, que são utilizados para os testes in vitro, as discrepâncias nos resultados entre os testes in vivo e os diferesntes testes in vitro são possíveis.

Do mesmo modo, após o aparecimento de reações anafiláticas podem ser medidos IgE títulos negativos ou muito baixos. No caso de discrepâncias entre o diagnóstico in vivo e aquele in vitro, o teste deve ser repetido dentro de 3-4 semanas. As discrepâncias que permanecerem devem ser examinadas através de testes posteriores in vivo, em como testes de provocação por um alergista. Os testes de provocação podem causar um choque anafilático.

Os resultados positivos do teste podem ser influenciados pela atividade cruzada do alérgeno testado com outros alérgenos.

Não se pode excluir que na fabricação dos discos de alérgeno faltem epitopos de causadores de alergia, o que pode levar a resultados negativos.

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Em raros casos, algum componente do sérum do paciente liga-se, não especificamente, ao disco de celulose ou ao reagente bloqueante, que ativa a enzima AP ou liga-se não especificamente ao conjugado. Nesses casos, todos os testes são não especificamente positivos para todos os alérgenos, de modo que este sérum não é adequado para a detecção de anticorpos lgE específicos neste sistema.

13. Características de desempenho

Tab. 7: Variação inter ensaio, os princípios do cálculo foram as classes EAST com 1 decimal.

Inter-ensaio Classe EAST 1-2 Classe EAST 3-4 Classe EAST 5-6

alérgeno testado G6, T3, W6, D2, E1, M6,

G6, T3, W6, D2, E1, I3, M6, F37, F4, F17, F49, F85, SX1, K82 G6, T3, W6, D2, I3, F27, F4, F85, K82 ensaios / alérgenos 8 a 4 Repl./alérgenos 8 a 4 Repl./ alérgenos 8 a 4 Repl./ alérgenos Aritm. Meio dos

VKs 11,7 % 3,44 % 3,65 %

Tab. 8: Variação intra ensaio, os princípios do cálculo foram as classes EAST com 1 decimal.

Intra-ensaio Classe EAST 1-2 Classe EAST 3-4 Classe EAST 5-6

alérgeno testado G6, T3, W6, D2, E1, M6, F2, F37, F4, F17, K82 G6, T3, W6, D2, E1, I3, M6, F37, F4, F17, F49, F85, SX1, K82 G6, T3, W6, D2, I3, F27, F4, F85, K82 Repl./ alérgenos 32 32 32

Aritm. Meio dos

VKs 12,69 3,86 3,88%

13.1. Sensibilidade

A sensibilidade analítica do kit de teste relacionada à comprovação do material padrão calibrado do padrão WHO foi estabelecida com a ajuda de diluições sucessivas do soro padrão e fica abaixo de 0,24 IU/ml.

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Critério: o valor de medição médio (OD405-620) dos graus de diluição com uma quantidade de IgE de 0,229 IU/ml se diferencia do valor de medição do valor vazio a mais de 2 x do desvio padrão (intervalo de confiança 95%).

A sensibilidade diagnóstica está abaixo de 0,35 IU/ml. 13.2. Especificidade

Uma seleção de alérgenos representativos de 11 grupos de alérgenos foi testada com diferentes soros contra um outro fornecedor de sistemas de diagnóstico in vitro de alergia. Houve como resultado uma especificidade de 91,2 %

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Literatura

1. Kersten, W., von Wahl, P.G., Lange, C.E., Wenning, J.: Empfehlungen zur in-vitro Diagnostik allergischer Erkrankungen. Allergologie, Jg. 23, Nr. 6, 304 - 307 (2000)

2. Kjellman, N.I.M.: Prediction and prevention of atopic allergy, Allergy 37, 463 - 473 (1982)

3. Debelic, M.: Die klinische Bedeutung der Bestimmung von Serum-Gesamt IgE und spezifischem IgE für die Diagnostik und Verlaufsbeobachtung allergischer Krankheitsbilder. Therapiewoche 29, 2280 - 2295 (1979)

4. Urbanek, R,: Papier-Radio-Immuno-Sorbent-Test (PRIST) - IgE-Spiegel bei nicht allergischen und allergischen Kindern, Monatsschrift Kinderheilkunde 125, 583 - 585 (1977)

5. Kjellman, N.I.M., et al.: Serum IgE levels in healthy children quantified by a Sandwich technique (PRIST), Clin. Allergy 6, 51 - 59 (1976)

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