RIDASCREEN
®Chlamydophila pneumoniae
N° do art.: K2811 (IgA) K2821 (IgG) K2831 (IgM)
1. Finalidade
Para diagnóstico in vitro. Os testes RIDASCREEN® Chlamydophila pneumoniae são enzima-imuno-ensaios para a detecção de anticorpos IgA, IgG ou IgM contra Chlamydophila (C.) pneumoniae no soro humano.
O teste deve ser feito no caso de suspeita fundada de uma infecção com C. pneumoniae ou para o esclarecimento do estado imunitário.
2. Resumo e explicação do teste
No grupo das chlamydias, há três agentes patogênicos encontrados em humanos: Chlamydia trachomatis, Chlamydophila psittaci e Chlamydophila pneumoniae.
Até há poucos anos atrás, Chlamydia pneumoniae era considerada uma sub-espécie de Chlamydia psittaci. Em 1989 foi confirmada a existência desta terceira espécie de Chlamydia. Novas pesquisas levaram à descoberta do próprio gênero Chlamydophila. Dependendo de fatores específicos do hospedeiro, Chlamydophila pneumoniae pode causar doenças graves do aparelho respiratório superior, brônquios e pulmões. Resultados de pesquisa lançam a suspeita da participação de Chlamydophila pneumoniae na asma, doenças pulmonares e outras doenças crônicas. Chlamydophila psittaci é um agente patogênico muito comum em pássaros e mamíferos. Nos humanos, ele aparece raramente e normalmente causa doenças respiratórias. Para o diagnóstico de uma infecção com C. pneumoniae, deve-se dar preferência à detecção de anticorpos. Através da utilização de antígenos COMP (COMP = complexos de proteínas da membrana externa) específicos da espécie, são reconhecidos anticorpos altamente específicos contra Chlamydophila pneumoniae.
3. Princípio do teste
Antígenos COMP limpos são colocados em uma microplaca. Nas amostras dos pacientes, os anticorpos presentes se ligam aos antígenos e são, numa segunda etapa, comprovados com um anticorpo anti-humano marcado com enzima (conjugado). Através da enzima, um substrato sem cor (H2O2/TMB) é convertido em um produto final azul. A reação enzimática é finalizada
com a adição de ácido sulfúrico. Com isso, ocorre simultaneamente a mudança da cor de azul para amarelo. A posterior medição é feita com um fotômetro a 450 nm (comprimento de ondas de referência 620 nm).
4. Conteúdo da embalagem
Tab. 1 : Conteúdo da embalagem (Os reagentes de uma embalagem são suficientes para 96 doses) K2811 IgA K2821 IgG K2831 IgM
Plate 96 doses Microplaca;
12 tiras (divisíveis) no quadro de suporte;
revestidas com antígenos COMP de C. pneumoniae
X X X
Diluent 25 ml Tampão de amostra, pronto para o uso; tampão de
fosfato tingido de azul; contém estabilizadores de proteína, Neolone e Bronidox
X X X
Wash 50 ml Tampão de lavagem, (conc. 20X);
Tampão de fosfato, contém Tween 20 e Proclin
X X X
Control IgA │+ 500 µl Controle positivo IgA, soro humano, contém Neolone e Bronidox
X Control IgG │+ 500 µl Controle positivo IgG, soro humano,
contém Neolone e Bronidox
X Control IgM │+ 500 µl Controle positivo IgM, soro humano,
contém Neolone e Bronidox
X Control IgA │ 500 µl Controle negativo IgA, soro humano:
contém Neolone e Bronidox
X Control IgG │ 500 µl Controle negativo IgG, soro humano,
contém Proclin
X Control IgM │ 500 µl Controle negativo IgM, soro humano,
contém Neolone e Bronidox
X Cut Off IgA 500 µl Controle Cut Off IgA, soro humano;
contém Neolone e Bronidox
X Cut Off IgG 500 µl Controle Cut Off IgG, soro humano;
contém Neolone e Bronidox
X Cut Off IgM 500 µl Controle Cut Off IgM, soro humano;
contém Neolone e Bronidox
X Conjugado IgA 15 ml Conjugado IgA anti-humano, pronto para o uso;
anticorpos conjugados com peroxidase em solução de tampão tingida de laranja, contém Neolone e Bronidox
X
Conjugado IgG 15 ml Conjugado IgG anti-humano, pronto para o uso; anticorpos conjugados com peroxidase em solução de tampão tingida de laranja, contém Neolone e Bronidox
X
Conjugado IgM 15 ml Conjugado IgM anti-humano, pronto para o uso; anticorpos conjugados com peroxidase em solução de tampão tingida de laranja, contém Neolone e Bronidox
X
Substrate 15 ml Substrato,
H2O2/ tetrametilbenzidina; pronto para o uso
X X X
Stop 15 ml Reagente bloqueador,
1 N ácido sulfúrico; pronto para o uso
5. Reagentes e a sua armazenação
O kit deve ser armazenado de 2 - 8 °C e pode ser utilizado até a data de validade impressa no rótulo. Solução de lavagem diluída pode ser utilizada por no máximo 4 semanas quando armazenadas de 2 - 8 °C ou por 5 dias quando armazenados em temperatura ambiente (20 - 25 °C). A garantia do kit não é válida após o vencimento do kit.
O saco de alumínio, no qual a microplaca se encontra, deve ser aberto de um modo que o fecho zipper não seja arrancado. As tiras não necessárias devem imediatamente ser armazenadas em um saco de alumínio a 2 – 8 °C.
Após a abertura, as tiras podem ser armazenadas, sob as respectivas condições, por três meses.
Uma contaminação do reagente deve ser evitada bem como a luz direta sobre o substrato incolor.
6. Reagentes e equipamentos adicionais necessários
6.1. Reagentes
água destilada ou deionizada
RF-Absorbens (ver ponto 9.3.) 6.2. Equipamento
Incubador ou câmera úmida a 37 °C
Tubos de amostra
Mixer Vortex
Micropipetas para volumes de 10 – 100 µl e 100 – 1000 µl
Proveta (1000 ml)
Cronômetro
Aparelho de lavagem para as microplacas ou pipetas de vários canais
Fotômetro para as microplacas (450 nm, filtro de referência 620 nm)
Filtro de papel (lenços de laboratório)
Contentor para lixo com uma solução de hipocloreto de 0,5 %
7. Medidas de precaução
Para diagnóstico in vitro.
Este teste só deve ser efetuado pelo pessoal de laboratório instruído. As regras de trabalho nos laboratórios médicos devem ser observadas. As instruções de uso para a execução do teste devem ser estritamente observadas.
Não pipetar as amostras ou reagentes com a boca, evitar o contato com a pele ferida ou mucosas. Durante o manejo de amostras, deve usar luvas descartáveis e, após o término do teste, deve-se lavar as mãos. Nas áreas, nas quais se trabalha com as amostras ou com os reagentes do teste, não fumar, comer ou beber.
Os soros de controle contidos no kit (controle positivo, controle negativo, controle Cutt off) foram testados para HIV e HCV-Ak, bem como HbsAg, e considerados negativos. Porém, eles devem, bem como as amostras de pacientes e todos os materiais que entrem em contato com eles, ser considerados como potencialmente infecciosos e manejados de acordo com as respectivas regras de segurança nacionais.
Peróxido de hidrogênio (substrato) pode levar à corrosão.Manusear com cuidado! No caso de contato com a pele, enxaguar com água.
O reagente bloqueador contém 1 N ácido sulfúrico. Evitar o contato com a pele e com as roupas! No caso de contato com a pele, enxaguar com água.
Todos os materiais e reagentes, que vêm junto com as amostras potencialmente infecciosas, devem ser manejados com desinfetantes adequados ou autoclavadas pelo menos 1 hora a 121 °C. CUIDADO: para evitar a formação de gases venenosos, o dejto líquido, que contém reagente bloqueador, deve ser neutralizado, antes que seja colocado em uma solução de hipocloreto.
8. Coleta e armazenagem das amostras
O teste é desenvolvido para a análise de amostras de soro humano. Após a coleta de sangue, o soro deve ser rapidamente tirado do coágulo para evitar uma hemólise do soro. As amostras devem ser amazenadas frias ou congeladas até serem usadas para o teste. Deve-se absolutamente evitar um novo congelamente e descongelamento, bem como a contaminação microbial. A utilização de amostras escurecidas, ictéricas, hemolíticas, lipêmicas inativadas do calor pode produzir falsos resultados.
Tab. 2: Armazenagem das amostras
soro não diluído Soro diluído
2 – 8 °C –20 °C 2 – 8 °C
9. Execução do teste
9.1. Generalidades
Antes da utilização, todos os reagentes e as tiras deve ser colocados em temperatura ambiente (20 – 25 °C). As tiras só devem ser retiradas do saco de alumínio após a temperatura ambiente tiver sido alcançada. Os reagentes devem ser misturados imediatamente antes da utilização. Após a utilização, o kit deve ser armazenado novamente a 2 – 8 °C.
Só deve ser retirada a quantidade de reagente necessária para a execução do teste. O reagente restante não deve ser colocado de volta nos vasos, pois isto pode levar a uma contaminação.
As tiras não podem ser usadas mais de uma vez. Os reagentes e as tiras não devem ser utilizadas se a embalagem estiver danificada ou se o vaso não é impermeável.
O tampão de amostra, o tampão de lavagem, o substrato e o reagente bloqueador não são específicos para o teste; eles podem também ser utilizados em outros ELISA RIDASCREEN® para a detecção de anticorpos contra Chlamydias.
9.2. Fabricação do tampão de lavagem
1 parte do concentrado do tampão de lavagem Wash é misturada com 19 partes de água destilada. Para isso, coloca-se 50 ml do concentrado em um cilindro de mesa de 1000 ml e enche-se com 1000ml de água destilada. Cristais eventualmente disponíveis no concentrado devem ser dissolvidos anteriomente com calor (banho-maria a 37 °C). Solução de lavagem diluída pode ser utilizada por no máximo 4 semanas quando armazenadas de 2 - 8 °C ou por 5 dias quando armazenados em temperatura ambiente (20 - 25 °C).
9.3. Preparação das amostras
As amostras de soro a serem examinadas bem como os controles serão diluídas a 1:21 antes do início do teste com o tampão de amostra Diluent. A diluição é feita diretamente na microplaca. O controle Cut Off deve ser feito em dose dupla. Os controles (IgA, IgG, IgM), respectivos às doses, devem ser usados.
A1 Controle negativo B1 Controle Cut Off C1 Controle Cut Off D1 Controle positivo
Após o inserimento de um número suficiente de cavidades para os controles e a amostras no quadro de suporte, são pipetados, para a dose de IgG, respectivamente 100 µl de tampão de amostra nas cavidades da placa e, depois, é adicionado 5 µl de amostra ou controle. Para a mistura completa, a placa deve ser brevemente agitada:
100 µl Diluent + 5 µl de soro ou controle
Para doses de IgA e IgM, as amostras devem ser expostas na placa a uma absorção IgG (p. ex. com o RIDA® RF-Absorbens, n°do art. Z0202) e somente depois são ajustadas com o tampão de amostra com a diluição necessária para o teste. Ao utilizar o RIDA® RF-Absorbens o seguinte procedimento deve ser considerado:
1) Colocar 25 µl de RIDA® RF-Absorbens nas cavidades para as amostras 2) adicionar 5 µl de soro; misturar
3) depois, colocar 5 µl dos controles nas cavidades respectivas 4) Adicionar 100 µl de Diluent aos controles
5) Adicionar 75 µl de Diluent às amostras; misturar
Atenção!
Os controles não devem ser absorvidos.
9.4. Primeira incubação
Depois a placa será incubada a 37 °C por 45 minutos em um incubador ou em uma câmera úmida. O chão das cavidades não deve entrar em contato com os materiais condutores de calor (papel úmido ou metal). A microplaca deve estar tampada durante a incubação.
Atenção!
A microplaca não deve ser colocada em uma incubadora fria, que só se esquenta até 37 °C durante a incubação. A incubadora já deve estar na temperatura de 37 °C.
9.5. Lavagem
As cavidades devem ser esvaziadas em um contentor de dejetos com solução de hipocloreto para a desinfecção. Depois a placa é batida em papel absorvente para retirar restos de humidade. Então, lava-se 5 vezes, cada vez com 300 µl de tampão de lavagem diluído. Com isso, deve fazer um esvaziamento completo após cada lavagem, batendo em uma parte inutilizada do papel.
Com a utilização de uma máquina automática de lavagem, deve-se observar o ajuste correto do equipamento com relação ao tipo de placa utilizado. Depois da lavagem, a placa é batida em papel absorvente para retirar restos de humidade.
9.6. Segunda incubação
Adição de 100 µl de conjugado Conjugate IgA, Conjugate IgG ou Conjugate IgM nas respectivas cavidades. Depois a placa é incubada por 30 minutos a 37 °C (ver ponto 9.4.). 9.7. Lavagem
Lavar 5 vezes de acordo com o ponto 9.5. 9.8. Terceira incubação
Adição de 100 µl do substrato Substrate em todas as cavidades. Depois a placa será incubada a 20 minutos a temperaura ambiente (20 – 25 °C), coberta. Depois, a reação é bloqueada com a adição de100 µl de reagente bloqueador Stop em todas as cavidades. Após a cuidadosa mistura (batida suave na beira da placa) a absorbância é medida em um fotômetro de placa a 450 nm (comprimento das ondas de referência 620 nm). A compensação do valor zero é feita com o ar. A medição deve ser feita dentro de uma hora após a adição do reagente bloqueador.
Atenção:
ao utilizar uma câmara húmida, para retirar a água condensada, a parte inferior da microplaca deve ser limpa antes da medição.
10. Controle de qualidade – Sinais da expiração do reagente
Para o controle de qualidade, os controles positivo, negativo e Cut Off devem ser feitos a cada execução de teste. O controle Cut Off é feito em dose dupla e o valor médio é formado de ambas as medições. O teste é validado se o valor de absorbância (O.D.) dos controles estiverem de acordo com os seguintes critérios:
Tab. 3. Critérios para o controle de qualidade
O.D.
Controle negativo < 0,5
Controle positivo > 0,9
Controle Cut Off (valor médio)
> 0,55 < 1,5
Um desvio dos valores necessários, bem como um escurecimento de reagente ou coloração em azul do substrato antes da adição nas cavidades, pode ser uma indicação de expiração do reagente.
Se os valores prescritos não são alcançados, antes da repetição do teste deve-se controlar o seguinte:
Validade dos reagentes utilizados
Funcionalidade dos equipamentos utilizados (por ex. calibragem)
Execução correta do teste
Controle visual dos componentes do kit para verificar se há contaminação ou impermeabilidade; uma solução de substrato tingida de azul não pode mais ser usada
Se, após a repetição do teste, as condições não forem alcançadas novamente, entre em contato com o distribuidor R-Biopharm local.
11. Avaliação e interpretação
11.1. Cálculo do índice das amostras
1. O valor médio de absorbância do controle de cut off é calculado.
2. Através da divisão do valor de absorbância das amostras pelo valor médio calculado, obtém-se o índice das amostras.
p. ex.: controle Cut Off 1 O.D. = 0,821 controle Cut Off 2 O.D. = 0,865
valor médio = 0,843
11.2. Resultado do teste
Tab. 4: Avaliação do índice das amostras
IgA, IgG, IgM negativo duvidoso positivo
Índice das amostras < 0,9 0,9 - 1,1 > 1,1
12. Limites do método
Os ELISA RIDASCREEN® Chlamydophila pneumoniae detectam anticorpos IgA, IgG ou IgM, altamente específicos, contra C. pneumoniae. Uma relação entre a altura de um valor de absobância alcançado e dos sintomas presentes ou altamente clínicos não pode ser ignorada aqui. O teste não é adequado para localizar o local da infecção. Os resultados alcançados devem ser interpretados em conjunto com o quadro clínico e outros métodos diagnóstico (p. ex. isolamento do agente patogênico).
Um resultado negativo não exclui uma infecção, pois a retirada do soro pode ter sido feita cedo demais, quando od anticoporpos ainda não podem ser comprovados. Se a suspeita clínica continuar, um soro de repetição deve ser examinado depois de duas semanas.
Geralmente, para um melhor resultado diagnóstico, nos exames sorológicos dois soros consecutivos de um paciente devem ser paralelamente examinados. Importante para a interpretação de um resultado é o procedimento do título.
A cotaminação endêmica da população com C. pneumoniae é muito alta. Os anticorpos são também frequentemente comprováveis. Geralmente trata-se aqui, porém, de um título de anticorpo relativamente baixo, que são causados por infecções anteriores.
No caso de infecção primária com C. pneumoniae os anticorpos IgM são normalmente comprováveis. Um título maior de IgG é disponível de três as seis semanas após o início da doença. No caso de uma infecção reincidente, normalmente os anticorpos IgM não são comprováveis; os títulos dos anticorpos IgA e IgG, ao contrário, aumentam muito rapidamente. Resultados de IgG nos recém-nascidos devem ser interpretados com cuidado, pois eles podem ter sido causados por anticorpos maternias. A detecção de anticorpos IgM é útil em bebês menores de seis meses.
Através de um título IgG muito alto, podem ocorrer resultados negativos falsos com doses de IgA e IgM. Além disso, reultados negativos podem ocorrer com doses de IgM através de fatores reumáticos. Isto pode ser evitado através de uma absorção do soro antes da execução do teste (veja o ponto 9.3).
Anticorpos IgA são descritos como uma boa indicação de uma infecção crônica com C. pneumoniae.
Reações cruzadas com anticorpos contra Chlamydophila psittaci não foram examinadas com o presente teste devido à baixa prevalência desta doença e à falta de amostras positivas.
O teste não é validado como adequado para o controle da terapia.
Um resultado positivo não exclui a presença de outros agentes patogênicos como causa para uma doença.
13. Características de desempenho
Tab. 4: Coeficiente de variação em % da variação inter-ensaio (n=10) Variação inter-ensaio IgA IgG IgM
Controle positivo 3,76% 3,07% 3,97% Controle negativo 18,19% 12,49% 13,29% Controle Cut Off 7,88% 5,18% 5,59%
Tab. 5: Coeficiente de variação em % da variação intra-ensaio (n=10) Variação-intra-ensaio IgA IgG IgM
Controle positivo 2,93% 2,43% 1,56% Controle negativo 16,21% 11,60% 10,35% Controle Cut Off 6,13% 4,27% 4,16%
Tab. 6: Sensibilidade e especificidade em comparação no teste de microimunofluorescência (MIF) Número de amostras Sensibilidae Especificidade IgA 100 97% 94% IgG 178 100% 83% IgM 61 91% 98%
Além disso, foram examinados 22 amostras de pacientes no teste IgG que estavam infeccionadas com Chlamydia trachomatis, Rickettsia conorii ou outros agentes patogênicos, que causam quadros clínicos similares aos da C. pneumoniae (HSV-2, L. pneumophila, C. burnetii, M. pneumoniae). No teste IgA, 18 destas amostras foram exminadas e no teste IgM, 12 amostras, bem como dois soropositivos de fatores reumáticos. Nos soros examinados, não foram verificadas reações cruzadas ou resultados ELISA relevantes.
Literatura
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