4 RESULTADOS
4.1 Etapa de seleção
Os biofilmes foram elaborados e analisados quanto às propriedades de barreira ao vapor de água e propriedades mecânicas (resistência máxima à tração e porcentagem de alongamento na ruptura). Os biofilmes das formulações 17, 18 e 19 representam os pontos centrais da matriz de experimentos mostrada na Tabela 3.4.
4.1.1 Propriedades de barreira ao vapor de água
Os valores da taxa de permeabilidade ao vapor de água (TPVA) calculados de acordo com a eq. 3.1 para as formulações estudadas encontram-se na Tabela 4.1. A variação da TPVA em relação ao biofilme controle pode ser melhor visualizada na Figura 4.1.
Tabela 4.1– Valores médios da taxa de permeabilidade ao vapor de água (TPVA) dos biofilmes e sua variação em relação ao controle, elaborados na etapa de seleção de acordo com o delineamento experimental apresentado na Tabela 3.4.
Formulação TPVA3
(g.dia-1.m-2)
Variação da TPVA em relação à formulação controle
(%) 1 55 ± 10 a,b,c,d,e 4,3 2 51 ± 5 a,b,c -2,7 3 60 ± 7 a,b,c,d,e,f 13,0 4 65 ± 11 a,b,c,d,e,f 23,2 5 47 ± 19 a,b -11,9 6 74 ± 6 c,d,e,f 39,5 7 84 ± 9 f,g 59,5 8 47 ± 6 a,b -10,3 9 62 ± 4 a,b,c,d,e,f 17,3 10 43 ± 2 a -18,9 11 52 ± 10 a,b,c -1,6 12 81 ± 6 e,f 52,4 13 83 ± 4 f,g 57,3 14 107 ± 9 g 103,2 15 45 ± 2 a -15,1 161 53 ± 6 a,b,c,d - 172 43 ± 3 a -17,8 182 71 ± 1 b,c,d,e,f 35,1 192 78 ± 15 d,e,f 47,6
1 Formulação controle, sem ingredientes antimicrobianos. 2 Pontos centrais do delineamento experimental.
3 Valores com letras iguais indicam que não há diferença significativa (p>0,05).
Figura 4.1. Taxa de permeabilidade ao vapor de água (TPVA) dos biofilmes elaborados na etapa de seleção de acordo com o delineamento experimental apresentado na Tabela 3.4. Formulação 16 - sem ingredientes antimicrobianos. Formulações 17, 18 e 19 representam os pontos centrais (C).
A Tabela 4.2 indica os valores obtidos para a TPVA por ingrediente estudado na etapa de seleção. 0,0 20,0 40,0 60,0 80,0 100,0 120,0 140,0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 (C) 18 (C) 19 (C) Formulação T P V A ( g. di a -1 .m -2 )
Tabela 4.2 – Valores médios da taxa de permeabilidade ao vapor de água (TPVA) por ingrediente estudado na etapa de seleção dos biofilmes (nível –1: 0,00% para todos os ingredientes; nível +1 : cravo, canela e pimenta vermelha = 0,30%; óleo essencial de laranja = 0,20%; mel = 0,50%, extrato de própolis = 0,70%; café = 1,00%).
Ingrediente TPVA (g.dia-1.m-2)
Níveis
- 1 + 1
Cravo em pó 65,63 ± 3,85 60,54 ± 3,85
Canela em pó 67,58 ± 3,79 58,58 ± 3,79
Óleo essencial de laranja 68,50 ± 3,74 57,67 ± 3,74
Pimenta vermelha em pó 54,46 ± 3,51 71,71 ± 3,51
Mel 60,83 ± 3,86 65,33 ± 3,86
Extrato de própolis 65,29 ± 3,86 60,88 ± 3,86
Café em pó 55,96 ± 3,63 70,21 ± 3,63
Análise de variância (ANOVA) foi aplicada nos resultados indicando que a adição de cravo em pó, canela em pó, mel, extrato de própolis e óleo de laranja não influenciou estatisticamente a TPVA dos biofilmes. No entanto a adição de pimenta vermelha em pó e café em pó aumentou significativamente a TPVA, conforme pode ser observado nas Figuras 4.2 e 4.3.
Figura 4.2. Taxa de permeabilidade ao vapor de água (TPVA) em função da adição de pimenta vermelha em pó (nível –1: 0,00%, nível 0: 0,15%, nível +1: 0,30%) nos biofilmes.
Figura 4.3. Taxa de permeabilidade ao vapor de água (TPVA) em função da adição de café em pó (nível –1: 0,00%, nível 0: 0,50%, nível +1: 1,00%).
Os valores de permeabilidade ao vapor de água (PVA) calculados de acordo com as eq. 3.2a e 3.2b, para as formulações dos biofilmes são apresentados na Tabela 4.3.
Pimenta Vermelha em pó . - 1 0 1 4 8 53 58 63 68 73 78 T P V A ( g. di a -1 .m -2 ) Café em pó T P V A ( g. di a -1 .m -2 ) - 1 0 1 49 54 59 64 69 74 79
Tabela 4.3 – Valores médios de permeabilidade ao vapor de água (PVA) dos biofilmes e sua variação em relação ao controle, elaborados na etapa de seleção de acordo com o delineamento experimental apresentado na Tabela 3.4.
Formulação PVA3
(g.µm.m-2.dia-1.mmHg-1)
Variação da PVA em relação à formulação controle (%) 1 479 ± 82 c,d,e,f + 79,3 2 691 ± 104 g,h + 66,4 3 427 ± 61 b,c,d,e + 65,7 4 480 ± 96 c,d,e,f + 47,7 5 223 ± 78 a,b - 37,3 6 407 ± 22 b,c,d,e + 65,9 7 665 ± 98 f,g,h + 64,9 8 661 ± 97 f,g,h + 47,3 9 418 ± 8 b,c,d,e + 55,6 10 196 ± 6 a - 12,5 11 692 ± 90 g,h + 40,4 12 523 ± 17 d,e,f,g + 61,5 13 756 ± 50 h,i + 74,7 14 957 ± 41 i + 77,2 15 289 ± 18 a,b,c - 50,3 161 353 ± 27 a,b,c,d - 172 600 ± 34 e,f,g,h + 59,0 182 495 ± 20 c,d,e,f,g + 27,2 192 556 ± 119 d,e,f,g,h + 45,7
1 Formulação controle, sem ingredientes antimicrobianos. 2 Pontos centrais do planejamento experimental.
3 Valores com letras iguais indicam que não há diferença significativa(p>0,05).
DMS (diferença mínima significativa) : 206 g.µm.m-2.dia-1.mmHg-1.
A partir dos dados apresentados na Tabela 4.3, observa-se que os biofilmes das formulações 5, 10, 15 e 16 (controle) apresentaram os menores valores de permeabilidade, sendo que a formulação 10 apresentou o menor valor médio e, portanto representa a formulação de melhor desempenho em relação à esta propriedade. A Figura 4.4 indica que a adição de alguns ingredientes ou combinação deles promoveu modificações desejáveis na permeabilidade dos biofilmes, o que também foi verificado para a variável taxa de permeabilidade ao vapor de água.
0 200 400 600 800 1000 1200 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 (C) 18 (C) 19 (C) Formulação P V A ( g .µ m .m -2 .d ia -1 .m m H g -1 )
Figura 4.4. Permeabilidade ao vapor de água (PVA) dos biofilmes elaborados na etapa de seleção de acordo com o delineamento experimental apresentado na Tabela 3.4. Formulação 16 - sem ingredientes antimicrobianos. Formulações 17, 18 e 19 representam os pontos centrais (C).
A Figura 4.5 indica que o café em pó foi o ingrediente que apresentou um efeito mais significativo na permeabilidade ao vapor de água (PVA), confirmando os resultados apresentados anteriormente. As formulações 5, 10 15 e 16 (controle) possuem todos os ingredientes estudados exceto o café em pó.
Figura 4.5. Influência dos ingredientes antimicrobianos na permeabilidade ao vapor de água (PVA) dos biofilmes estudados na etapa de seleção (p≤0,05).
Como observado anteriormente, a pimenta vermelha em pó influenciou negativamente a TVPA, portanto pode-se concluir que o biofilme da formulação 15, que contém este ingrediente, em relação a esta propriedade deve ser considerado como aquele que apresenta restrições para a sua aplicação como material de embalagem.
4.1.2 Propriedades mecânicas
4.1.2.1 Resistência máxima à tração (Rmáx)
Os valores de Rmáx para as formulações dos biofilmes, calculados de acordo com a eq. 3.3 estão apresentados na Tabela 4.4.
0 3 6 9 12 15 C:Mel A:Cravo AF+BG+DE F:P.Verm. G:Óleo de Laranja D:Própolis B:Canela AG+BF+CD BD+CF+EG AD+CG+EF AB+CE+FG AE+BC+DF AC+BE+DG E:Café
Tabela 4.4 – Valores médios de resistência máxima à tração (Rmáx) dos biofilmes e sua variação em relação ao controle, elaborados na etapa de seleção de acordo com o delineamento experimental apresentado na Tabela 3.4.
Formulação Rmáx3
(MPa) relação ao controle (%) Variação da Rmáx em
1 1,0 ± 0,1 a - 79,3 2 1,6 ± 0,2 b,c,d - 66,4 3 1,6 ± 0,1 c,d - 65,7 4 2,4 ± 0,4 f,g,h - 47,7 5 2,9 ± 0,4 h,i - 37,3 6 1,6 ± 0,2 b,c,d - 65,9 7 1,6 ± 0,3 c,d - 64,9 8 2,5 ±0,3 f,g,h - 47,3 9 2,1± 0,2 d,e,f - 55,6 10 4,1± 0,5 j - 12,5 11 2,8 ± 0,3 g,h - 40,4 12 1,8 ± 0,2 d - 61,5 13 1,2 ± 0,2 a,b,c - 74,7 14 1,1 ± 0,1 a,b - 77,2 15 2,3 ± 0,3 e,f,g - 50,3 161 4,7 ± 0,6 k - 172 1,9 ± 0,3 d,e - 59,0 182 3,4 ± 0,3 i - 27,2 192 2,5 ± 0,4 f,g,h - 45,7
1 Formulação controle, sem ingredientes antimicrobianos. 2 Pontos centrais do planejamento experimental.
3 Valores com letras iguais indicam que não há diferença significativa(p>0,05).
DMS (diferença mínima significativa): 0,5.MPa.
Os resultados apresentados na Tabela 4.4 indicam que os valores obtidos para a resistência máxima à tração dos biofilmes com adição de ingredientes antimicrobianos são significativamente menores, em todos os casos, em relação ao do biofilme controle, formulação 16 (sem ingredientes antimicrobianos) indicando que a adição dos ingredientes afetou significativamente esta propriedade (ver Figura 4.6).
0,0 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 (C) 18 (C) 19 (C) Formulação RM á x ( M P a )
Figura 4.6. Resistência máxima à tração (Rmáx) dos biofilmes elaborados na etapa de seleção de acordo com o delineamento experimental apresentado na Tabela 3.4. Formulação 16 – sem ingredientes antimicrobianos. Formulações 17, 18 e 19 representam os pontos centrais (C).
A Figura 4.7 mostra que somente a canela não promoveu modificações na resistência máxima à tração dos biofilmes em relação ao controle, enquanto que o café em pó seguido da pimenta vermelha em pó e do cravo influenciaram significativamente esta propriedade. A adição de própolis, mel e óleo essencial de laranja também influenciou significativamente os resultados de resistência máxima à tração dos biofilmes. A granulometria dos ingredientes antimicrobianos em pó pode ter sido a causa da diminuição da resistência máxima à tração apresentada pelos biofilmes, principalmente a do café em pó, significativamente maior que a da pimenta vermelha em pó, conforme indicado na Tabela 3.1.
Figura 4.7. Influência dos ingredientes antimicrobianos sobre a resistência máxima à tração (Rmáx) dos biofilmes estudados na etapa de seleção (p≤0,05).
A Tabela 4.5 mostra os valores da Rmáx obtidos, por ingrediente utilizado, de acordo com os limites máximo (+1) e mínimo (-1).
Tabela 4.5 - Valores médios da Rmáx por ingrediente estudado na etapa de seleção (nível –1: 0,00% para todos os ingredientes da tabela; nível +1 : cravo, canela e pimenta vermelha = 0,30%; óleo essencial de laranja = 0,20%; mel = 0,50%; extrato de própolis = 0,70%; café = 1,00%).
Ingrediente Rmáx (MPa)
Níveis
- 1 + 1
Cravo em pó 2,5 ± 1,0 1,9 ± 0,7
Canela em pó 2,2 ± 1,0 2,2 ± 0,9
Óleo essencial de laranja 2,0 ± 1,0 2,4 ± 1,0
Pimenta vermelha em pó 2,7 ±1,0 1,7 ± 0,6 Mel 2,5 ± 1,0 1,9 ± 1,0 Extrato de própolis 2,5 ± 1,0 1,9 ± 0,7 Café em pó 2,7 ± 1,1 1,7 ± 0,7 0 3 6 9 12 15 B:Canela BD+CF+EG AG+BF+CD AC+BE+DG
AD+CG+EF G:O. Laranja
AF+BG+DE AB+CE+FG
C:Mel
D:Propolis
AE+BC+DF A:Cravo
Os valores apresentados na Tabela 4.5 auxiliam a interpretação dos resultados da resistência máxima à tração dos biofilmes. O gráfico Pareto apresentado na Figura 4.7 indica que somente a canela em pó não influenciou esta propriedade, porém pode ser observado na Tabela 4.5 que a adição de cravo em pó, pimenta vermelha em pó, mel, extrato de própolis e café em pó diminuiu a resistência máxima à tração dos biofilmes, ou seja, os valores da Rmáx foram inferiores nos biofilmes elaborados com estes ingredientes antimicrobianos (nível +1). O óleo essencial de laranja, por outro lado, aumentou a resistência máxima à tração do biofilme. Vale ressaltar que o valor obtido para esta propriedade da formulação controle (sem ingredientes antimicrobianos) foi de 4,7 ± 0,6 MPa e a do ponto central (nível 0) foi de 2,6 ± 0,6 MPa.
4.1.2.2 Alongamento na ruptura (%)
Na Tabela 4.6, estão apresentados os resultados obtidos da porcentagem de alongamento na ruptura. A adição dos ingredientes antimicrobianos nos biofilmes reduziu esta propriedade conforme pode ser observado na Figura 4.8.
Tabela 4.6 – Valores médios do alongamento na ruptura (%) dos biofilmes elaborados na etapa de seleção de acordo com o delineamento experimental apresentado na Tabela 3.4.
Formulação Alongamento na ruptura (%) 3 Variação do alongamento na ruptura (%)
1 61,0 ± 11 b - 63,0 2 41,0 ± 3,3 a - 75,1 3 112,1 ± 8,1 d - 31,9 4 81,4 ± 7,5 c - 50,6 5 103,1 ± 16,2 d - 37,4 6 111,2 ± 10,0 d - 32,5 7 60,3 ± 6,6 b - 63,4 8 67,4 ± 8,4 b,c - 59,1 9 65,9 ± 12,4 b,c - 60,0 10 67,9 ± 13,4 b,c - 58,8 11 39,6 ± 5,4 a - 76,0 12 65,8 ± 7,6 b,c - 60,0 13 65,2 ± 11,6 b,c - 60,4 14 55,0 ± 6,0 a,b - 66,6 15 112,8 ± 13,4 d - 31,5 161 164,7 ± 17,1 e - 172 70,9 ± 14,4 b,c - 56,9 182 59,9 ± 4,4 b - 63,6 192 61,3 ± 7,8 b - 62,8
1 Formulação controle, sem ingredientes antimicrobianos.
2 Pontos centrais do planejamento experimental da etapa de seleção dos ingredientes. 3 Valores com letras iguais indicam que não há diferença significativa(p>0,05).
0,0 20,0 40,0 60,0 80,0 100,0 120,0 140,0 160,0 180,0 200,0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 (C) 18 (C) 19 (C) Formulação A lo n g a m e n to n a R u p tu ra ( % )
Figura 4.8. Alongamento na ruptura (%) dos biofilmes elaborados na etapa de seleção de acordo com o delineamento experimental apresentado na Tabela 3.4. Formulação 16- sem ingredientes antimicrobianos. Formulações 17, 18 e 19 representam os pontos centrais (C).
A Figura 4.9 mostra a influência de cada ingrediente isoladamente, no alongamento na ruptura apresentado pelos biofilmes, indicando que somente o cravo em pó não alterou significativamente esta propriedade. No entanto, o café em pó seguido pela canela em pó, mel, óleo essencial de laranja, pimenta vermelha em pó e extrato de própolis, influenciaram esta propriedade.
Figura 4.9. Influência dos ingredientes antimicrobianos no alongamento na ruptura (%) na etapa de seleção dos bilfilmes.
A Tabela 4.7 mostra os valores numéricos obtidos do alongamento na ruptura, por ingrediente, considerando a concentração nos limites máximos (+1) e mínimo (-1).
Tabela 4.7 - Valores médios do alongamento na ruptura (%) por ingrediente estudado na etapa de seleção (nível –1: 0,00% para todos os ingredientes da tabela; nível +1 : cravo, canela e pimenta vermelha = 0,30%; óleo essencial de laranja = 0,20%; mel = 0,50%; extrato de própolis= 0,70%; café = 1,00%).
Ingrediente Alongamento na ruptura (%)
Níveis
- 1 + 1
Cravo em pó 80 ± 39 79 ± 29
Canela em pó 92 ± 37 66 ± 23
Óleo essencial de laranja 85 ± 39 73 ± 25
Pimenta vermelha em pó 83 ± 41 76 ± 24 Mel 88 ± 39 70 ±25 Extrato de própolis 81 ± 38 77 ± 28 Café em pó 102 ± 33 57 ± 13 0 4 8 12 16 20 24 A:Cravo AE+BC+DF AF+BG+DE D:Propolis F:Pimenta AG+BF+CD BD+CF+EG G:Oleo de Laranja AD+CG+EF
AB+CE+FG AC+BE+DG C:Mel
Pode-se concluir que a adição dos ingredientes canela em pó, óleo essencial de laranja, pimenta vermelha em pó, mel, extrato de própolis e café em pó nos biofilmes diminuiu significativamente a porcentagem de alongamento na ruptura dos biofilmes.
De fato, todos os ingredientes antimicrobianos utilizados, exceto o óleo essencial de laranja, foram adicionados na forma de pó, o que pode justificar a redução da porcentagem de alongamento na ruptura apresentada, em relação ao controle. Os biofilmes elaborados com esses ingredientes não são homogêneos e portanto apresentam mais de uma fase na sua estrutura, e por isso, nos locais do biofilme onde existe ingrediente antimicrobiano pode ocorrer uma maior facilidade de ruptura.
Conclusão da etapa de seleção
Os resultados obtidos na etapa de seleção indicaram que as propriedades mecânicas (porcentagem de alongamento na ruptura e a resistência máxima à tração) dos biofilmes com adição dos ingredientes antimicrobianos foram modificadas em relação aos obtidos para a formulação controle (formulação 16), que, em geral, diminuiu os valores das propriedades mecânicas dos biofilmes.
O resultado era esperado, pois apesar dos ingredientes antimicrobianos em pó (cravo, canela, pimenta vermelha e café) e do mel e extrato de própolis terem sido bem incorporados na matriz de fécula de mandioca e plastificantes (sacarose e açúcar líquido invertido), uma estrutura heterogênea foi formada na qual a ruptura do biofilme foi facilitada e a resistência à tração diminuída.
A permeabilidade ao vapor de água e a taxa de permeabilidade ao vapor de água de alguns biofilmes com ingredientes antimicrobianos apresentaram valores estatisticamente iguais aos valores do biofilme controle (formulação 16). A presença de sólidos (pós) na estrutura do biofilme pode justificar o fato de que alguns biofilmes terem apresentado valores elevados com respeito às propriedades de barreira ao vapor de água.
A adição de café em pó influenciou negativamente e de forma mais intensa que os demais ingredientes todas as propriedades estudadas dos biofilmes. Uma provável explicação é o fato do café possuir granulometria maior (Tabela 3.1) que a dos outros
ingredientes utilizados e por este motivo pode não ter sido incorporado de forma homogênea na matriz do biofilme. É provável que a adição do café em pó tenha criado pequenos furos no biofilme permitindo que o vapor de água permeasse mais facilmente. Quanto às propriedades mecânicas, os prováveis furos criados no biofilme, provavelmente alteraram o alongamento na ruptura por promoverem mais pontos onde a ruptura foi facilitada.
Concluiu-se que os outros ingredientes antimicrobianos (cravo em pó, canela em pó, mel, extrato de própolis, pimenta vermelha em pó e óleo essencial de laranja) poderiam ser selecionados para a etapa de otimização, pois não foi possível identificar claramente quais deles apresentaram melhor desempenho em todas as propriedades de embalagem estudadas.
Como informação complementar, constatou-se que o mel e o extrato de própolis requereram uma etapa a mais no processo de elaboração dos biofilmes pois foi necessário o resfriamento do gel de amido formado antes da adição destes ingredientes. Ainda, no caso do óleo essencial de laranja, o tempo de elaboração dos biofilmes foi prolongado, uma vez que a adição deste ingrediente foi realizada, previamente à sacarose, para posterior adição dos outros ingredientes da formulação, para a sua incorporação homogênea.
A pimenta vermelha em pó também diminuiu a taxa de permeabilidade ao vapor de água e a resistência máxima à tração dos biofilmes, pois assim como o café em pó, apresenta dados de granulometria que também podem alterar a sua estrutura.
Existem vários relatos científicos referentes ao efeito dos ingredientes antimicrobianos cravo em pó e canela em pó sobre microrganismos comumente encontrados em produtos de panificação (GUYNOT et al., 2005; MATAN et al., 2005; NIELSEN; RIOS, 2000). Além disso, os compostos antimicrobianos presentes no cravo e na canela (eugenol, aldeído cinâmico entre outros) são citados na literatura como os mais eficazes, entre os antimicrobianos naturais conhecidos, na inibição do crescimento de microrganismos (BURT, 2004; DAVIDSON, 1997; FRAZIER; WESTHOFF, 1993; PAULI, 2001).
De acordo com as conclusões acima citadas, na etapa de otimização, somente dois ingredientes antimicrobianos, foram selecionados: cravo em pó e canela em pó.
4.2 Etapa de otimização
Os biofilmes foram elaborados e analisados quanto às propriedades de barreira ao vapor de água e propriedades mecânicas (resistência máxima à tração e porcentagem de alongamento na ruptura), conduzindo os mesmos procedimentos da etapa de seleção. Os biofilmes das formulações 9, 10 e 11 representam os pontos centrais da matriz de experimentos mostrada na Tabela 3.5.
4.2.1 Propriedades de barreira ao vapor de água
Os valores da taxa de permeabilidade ao vapor de água (TPVA) e da permeabilidade ao vapor de água (PVA) calculados de acordo com as eq. 3.1, 3.2a e 3.2b para as formulações estudadas encontram-se na Tabela 4.8. A variação da TPVA e da PVA em relação ao biofilme controle pode ser melhor visualizada nas Figuras 4.10 e 4.11, respectivamente.
Tabela 4.8 – Valores médios da taxa de permeabilidade ao vapor de água (TPVA) e permeabilidade ao vapor de água (PVA) dos biofilmes elaborados na etapa de otimização de acordo com o delineamento experimental apresentado na Tabela 3.5. Formulação TPVA3 (g.dia-1.m-2) PVA3 (g.µm.m-2.dia-1.mmHg-1) Variação da TPVA (%) Variação da PVA (%) 1 114 ± 11 c 786 ± 116 a -26,9 0,1 2 111 ±18 b,c 1203 ± 195 b -28,8 53,2 3 81 ± 7 a,b 620 ± 109 a -48,1 -21,0 4 82 ± 13 a,b 816 ± 290 a,b -47,4 3,9 5 105 ± 15 a,b,c 770 ± 155 a -32,7 -1,9 6 91 ± 4 a,b,c 923 ± 49 a,b -41,7 17,6 7 90 ± 12 a,b,c 724 ± 160 a -42,3 -7,8 8 83 ± 5 a,b 710 ± 7 a -46,8 -9,6 91 84 ± 2 a,b 677 ± 18 a -46,2 -13,8 101 77 ± 10 a 639 ± 47 a -50,6 -18,6 111 79 ± 3 a 729 ± 102a -49,4 -7,1 122 156 ± 8 d 785 ± 107 a - -
1 Pontos centrais do delineamento experimental.
2 Formulação controle, sem ingredientes antimicrobianos.
3 Valores com letras iguais indicam que não há diferença significativa(p>0,05).
DMS (Diferença Mínima Significativa): 30 g.dia-1.m-2 para TPVA e 416 g.µm.m-2.dia-1.mmHg-1 para PVA.
Observa-se na Figura 4.10 que o biofilme controle (12) apresenta TPVA significativamente superior aos demais biofilmes. Estes resultados indicam que os ingredientes antimicrobianos cravo em pó e canela em pó reduziram esta propriedade nas condições utilizadas neste estudo. É provável que os ingredientes antimicrobianos tenham formado uma barreira à passagem do vapor de água por serem menos permeáveis que os ingredientes utilizados na formulação base do biofilme (fécula de mandioca, açúcar invertido e sacarose).
Os resultados encontrados podem ser considerados coerentes e em alguns casos mais promissores do que em dados encontrados na literatura. García et al. (2004) obtiveram o valor de 870 g.µm.m-2.dia-1.mmHg-1 para a permeabilidade ao vapor
de água para biofilmes à base de metilcelulose (1% da formulação do biofilme) e 1040 g.µm.m-2.dia-1.mmHg-1para biofilmes elaborados com 1% de quitosana na formulação total do biofilme. Rhim et al. (1998) relataram o valor de 19.006 g.µm.m-2.dia-1. mmHg-1para a permeabilidade ao vapor de água para filmes elaborados com adição de proteína isolada de soja, glicerina e amido dialdeído (10% sobre o peso da proteína de soja).
Fakhouri et al. (2005) produziram biofilmes com 5% de glúten de trigo e 10% de gelatina usando sorbitol como plastificante e obtiveram o valor de 225 g.µm.m-2.dia -1.mmHg-1 para a permeabilidade ao vapor de água. Os resultados são similares aos apresentados por Aydinli e Tutas (2000) que reportaram o valor de 244 g.µm.m-2. dia-1. mmHg-1para biofilmes à base de goma locusta (LBG) tendo o polietileno glicol (PGE 200) como plastificante. 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Formulação T P V A ( g .d ia -1 .m -2 )
Figura 4.10. Valores médios da taxa de permeabilidade ao vapor de água (TPVA) dos biofilmes elaborados na etapa de otimização de acordo com o delineamento experimental apresentado na Tabela 3.5. Formulação 12 – biofilme controle sem ingredientes antimicrobianos e formulações 9, 10 e 11, pontos centrais.
0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Formulação P V A ( g . µµµµ m .m -2 .d ia -1 .m m H g -1 )
Figura 4.11. Valores médios da permeabilidade ao vapor de água dos biofilmes
elaborado na etapa de otimização de acordo com o delineamento experimental apresentado na Tabela 3.5. Formulação 12, biofilme controle
sem ingredientes antimicrobianos. Formulações 9, 10 e 11 – pontos centrais.
Observa-se na Figura 4.11 que o efeito da adição dos ingredientes antimicrobianos na formulação do biofilme não foi similar ao obtido para a taxa de permeabilidade ao vapor de água. Este fato ocorreu porque no cálculo da TPVA (eq. 3.1) a espessura dos bilfilmes não é considerada e por ser , em geral, muito variável, a mesma pode influenciar os resultados da PVA (eq. 3.2a) calculados e mascarar possíveis efeitos positivos ou não da adição dos ingredientes.
A Figura 4.12 ilustra como os ingredientes influenciaram a TPVA dos biofilmes, indicando que a adição de cravo em pó até uma dada concentração reduziu significativamente esta propriedade. Concentrações acima de 0,34% (nível + 1) deste ingrediente, no entanto aumentaram a TPVA do biofilme. A mesma tendência ocorreu
para a canela em pó, porém o aumento da TPVA somente foi verificado para concentrações próximas de 0,4% (nível máximo +1,41).
Figura 4.12 Influência dos ingredientes cravo e canela em pó sobre a taxa de permeabilidade ao vapor de água (TPVA) de biofilmes elaborados de acordo com o delineamento experimental apresentado na Tabela 3.5.
4.2.2 Propriedades mecânicas
4.2.2.1 Resistência máxima à tração
Na Tabela 4.9 estão mostrados os resultados obtidos de resistência máxima à tração dos biofilmes elaborados na etapa de otimização de acordo com o delineamento experimental apresentado na Tabela 3.5. A adição de cravo em pó e canela em pó reduziu esta propriedade de todos os biofilmes em relação ao controle, conforme pode se melhor visualizado na Figura 4.13.
T P V A ( g. di a -1 .m -2 ) Cravo em pó
-
1,41 1, .41 Canela em pó-
1,41 1,41 73 83 93 103 113Tabela 4.9 - Valores médios da resistência máxima à tração (Rmáx) dos biofilmes elaborados na etapa de otimização de acordo com o delineamento experimental apresentado na Tabela 3.5.
Formulação Rmáx3 (MPa) Variação da Rmáx em relação ao controle (%) 1 2,21 ± 0,38 d - 41,99 2 1,94 ± 0,32 c,d - 49,08 3 2,24 ± 0,32 d - 41,21 4 2,07 ± 0,28 d - 45,67 5 2,06 ± 0,23 c,d - 45,93 6 1,85 ± 0,29 b,c,d - 51,44 7 2,16 ± 0,27 d - 43,31 8 1,71 ± 0,20 b,c - 55,12 91 1,52 ± 0,18 b - 60,10 101 2,21 ± 0,20 d - 41,99 111 1,20 ± 0,17 a - 68,50 122 3,81 ± 0,69 e -
1 Formulações 9, 10 e 11 – pontos centrais.
2 Formulação controle, sem ingredientes antimicrobianos.
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Formulação
R
m á x(
M
P
a
)
Figura 4.13. Valores médios da resistência máxima à tração (Rmáx) dos biofilmes elaborados na etapa de otimização de acordo com o delineamento experimental apresentado na Tabela 3.5. Formulação 12 – biofilme controle sem ingredientes antimicrobianos. Formulações 9, 10 e 11 – pontos centrais.
Os biofilmes das formulações 9, 10 e 11 (pontos centrais) apresentaram valores médios para esta propriedade significativamente diferente, que pode ser explicado pelos diferentes valores da área do corpo de prova considerados para o cálculo da Rmáx (eq. 3.3). Os biofilmes elaborados nesta etapa contêm ingredientes antimicrobianos na forma de pó incorporados na matriz e estes naturalmente apresentam grânulos de tamanho variado (dentro da mesma granulometria) o que pode causar diferenças de espessura mínima do corpo de prova, medida necessária ao cálculo da área dos biofilmes.
Os resultados obtidos para o alongamento na ruptura dos biofilmes estão apresentados na Tabela 4.10. Como pode ser observado na Figura 4.14, os ingredientes antimicrobianos cravo em pó e canela em pó também reduziram esta propriedade. No entanto, em geral, quanto menor a quantidade de ingredientes, maior foi a porcentagem de alongamento na ruptura, fato comprovado pelos valores obtidos em corpos de prova dos biofilmes das formulações 1 e 5, valores estes próximos ao obtido do controle.
Tabela 4.10 –Valores médios do alongamento na ruptura (%) dos biofilmes elaborados na etapa de otimização de acordo com delineamento experimental apresentado na Tabela 3.5.
Formulação Alongamento na ruptura (%) 3 Variação do alongamento na ruptura (%)
1 139,97 ± 11,48 g - 41,99 2 119,91 ± 10,12 f - 49,08 3 101,52 ± 13,47 d,e - 41,21 4 61,95 ± 8,36 a,b - 45,67 5 116,16 ± 15,84 e,f - 45,93 6 57,66 ± 8,94 a - 51,44 7 85,4 ± 15,6 c,d - 43,31 8 88,01 ± 14,29 c,d - 55,12 91 93,92 ± 10,02 d - 60,10 101 77,94 ± 11,51 b,c - 41,99 111 93,99 ± 13,63 d - 68,50 122 171,17 ± 19,14 h -
1 Pontos centrais do delineamento experimental apresentado na Tabela 3.5. 2 Formulação controle, sem ingredientes antimicrobianos.
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Formulação A lo n g a m e n to n a R u p tu ra ( % )
Figura 4.14. Valores médios do alongamento na ruptura (%) dos biofilmes elaborados na etapa de otimização de acordo com o delineamento experimental apresentado na Tabela 3.5. Formulação 12 – biofilme controle sem ingredientes antimicrobianos. Formulações 9, 10 e 11 – pontos centrais. A Figura 4.15 mostra a influência da adição dos ingredientes sobre o alongamento na ruptura dos biofilmes e a adição da canela em pó indicou uma redução de forma menos acentuada desta propriedade se comparada à adição do cravo em pó. A granulometria do cravo em pó indica que este ingrediente possui maior tamanho de partículas que a canela em pó, fato que pode explicar esta diferença no comportamento dos biofilmes, pois as partículas podem estar facilitando a ruptura do filme durante sua tração.
Figura 4.15 Influência dos ingredientes cravo e canela em pó sobre o alongamento na ruptura (%) de biofilmes elaborados de acordo com o delineamento experimental apresentado na Tabela 3.5.
O efeito da adição dos ingredientes antimicrobianos sobre o alongamento na ruptura é melhor visualizado na Figura 4.16, indicando que houve diferenças significativas para as distintas concentrações de cravo em pó, exceto para 0,34% e 0,20% (níveis +1 e 0). Esta informação pode ser importante na definição da formulação de um biofilme a ser utilizado como embalagem antimicrobiana uma vez que o incremento da concentração do ingrediente no biofilme pode representar efeito antimicrobiano mais pronunciado, sem afetar o alongamento na ruptura.
A lo n g a m e n to n a r u p tu ra ( % ) Cravo em pó -1. ,41 1,41 Canela em pó -1,41 1,41 70 80 90 100 110 120 130
Figura 4.16 Porcentagem de alongamento na ruptura em função da quantidade de cravo em pó na formulação dos biofilmes elaborados de acordo com o delineamento experimental apresentado na Tabela 3.5.
A canela em pó modificou, no entanto, de forma menos acentuada o alongamento na ruptura dos biofilmes em comparação à adição do cravo em pó, como pode ser observado na Figura 4.17, que indica claramente que a adição deste ingrediente até 0,06% (nível –1), promoveu um maior alongamento em relação às demais concentrações estudadas (de 0,20% até 0,40%).
Cravo em pó A lo n g a m e n to n a r u p tu ra ( % ) --1,41 -1 0 1 1,41 40 60 80 100 120 140 160
Figura 4.17 Porcentagem de alongamento na ruptura em função da quantidade de
canela em pó na formulação dos biofilmes, elaborados de acordo com delineamento experimental apresentado na Tabela 3.5.
De maneira análoga que para o ingrediente cravo em pó pode-se dizer que a informação acima é relevante e pode contribuir na definição de uma possível formulação de um biofilme antimicrobiano. O valor para a porcentagem de alongamento na ruptura foi mantido mesmo quanto houve a utilização de 0,20% (nível 0), 0,34% (nível +1) ou 0,40% (nível +1,41) de canela em pó na formulação base do biofilme. A adição de canela em pó em maior quantidade pode por outro lado, significar um incremento no poder de inibição microbiana do biofilme.
4.3 Ensaios preliminares com produtos de panificação
Realizou-se a avaliação de amostras de pão tipo forma e pão doce tipo “bisnaguinha” embaladas de acordo com a Figura 4.18. Esta avaliação foi realizada tanto com a utilização de biofilmes elaborados de acordo com formulações definidas para a etapa de seleção (Tabela 3.4) quanto para a etapa de otimização de ingredientes (Tabela 3.5). Canela em pó A lo n g a m e n to n a r u p tu ra ( % ) -1,41 -1 0 1 1,41 72 92 112 132 152
Figura 4.18 Pão de forma embalado com biofilme (embalagem primária) e o conjunto embalado em filme plástico.
Os resultados mostraram que em geral o biofilme teve suas características preservadas após contato com a amostra de pão e às vezes tornava-se mais frágil e pegajoso. As amostras dos pães por outro lado na maioria das vezes tornaram-se mais secas (perda de umidade) após 24 horas em contato com o biofilme (sob distintas condições de temperatura e umidade). Os biofilmes elaborados, por terem como base fécula de mandioca, são hidrofílicos e provavelmente absorveram a umidade dos pães embalados.
Amostras de pão tipo forma e pão doce tipo “bisnaguinha” embaladas de acordo com a Figura 4.19 foram avaliadas e os resultados indicaram que tanto a textura dos pães quanto as características dos biofilmes foram mantidas nestas condições.
Figura 4.19 Pão de forma embalado com biofilme (posicionado sob a amostra de pão) e o conjunto embalado em filme plástico.
4.4 Efeito do biofilme antimicrobiano em amostra de pão tipo forma
Os conjuntos formados por biofilme, amostra de pão tipo forma e embalagem plástica selada foram preparados de acordo com o planejamento apresentado na Tabela 3.7 e Figura 3.12 e conjuntos formados sem a presença de amostra de biofilme foram utilizados como amostras controle.
Na Tabela 4.11 são apresentados os valores da população de bolores e leveduras obtidos nas amostras de pão tipo forma armazenadas em contato com os biofilmes por 3 dias (3D) e sete dias (7D). Os resultados são expressos em log UFC/g. Os resultados das amostras controle C1 e C2 respectivos para cada biofilme também estão apresentados.
Tabela 4.11 – População de bolores e leveduras encontrada em fatias de pão tipo forma após 3 dias (3D) e 7 dias (7D) de armazenamento.
Biofilme População de bolores e leveduras (log UFC/g)1,2 3 dias de embalagem (3D) 7 dias de embalagem (7D)
1 2,9 est.3 5,0 C1 3,1 est.3 4,9 C2 2,3 est.3 3,5 2 2,7 est.3 5,1 C1 2,5 est.3 3,1 C2 2,3 est.3 2,3 3 2,6 est.3 5,0 C1 3,4 est.3 5,1 C2 1,7 est.3 4,3 4 2,3 est.3 4,2 C1 2,5 est.3 3,1 C2 2,3 est.3 2,3 5 3,1 est.3 5,1 C1 3,1 est.3 3,0 C2 3,1 est.3 2,8 6 2,8 est.3 5,7 C1 3,1 est.3 4,9 C2 2,4 est.3 3,6 7 3,2 est.3 5,0 C1 3,1 est.3 4,9 C2 2,4 est.3 3,6 8 2,9 est.3 6,0 C1 1,7 est.3 2,8 C2 1,7 est.3 2,2 94 3,0 est.3 4,5 C1 3,4 est.3 5,1 C2 1,7 est.3 4,3 104 1,7 est.3 4,3 C1 3,1 est.3 4,9 C2 2,3 est.3 3,5 114 2,5 est.3 5,2 C1 3,1 est.3 3,0 C2 3,1 est.3 2,8 125 3,3 est.3 5,2 C1 1,7 est.3 2,8 C2 1,7 est.3 2,2
1 Média da contagem em duplicata.
2 UFC/g: unidades formadoras de colônias/g.
3 est.: estimado. Utilizado para valores médios abaixo de 25 UFC.
4 Biofilme 9, 10 e 11 :pontos centrais do delineamento experimental apresentado na Tabela 3.5.
O número de colônias de bolores e leveduras nas fatias de pão tipo forma embaladas (com presença ou não de biofilme) por 3 dias, na grande maioria dos casos, esteve abaixo do limite mínimo da faixa de contagem considerada (25 UFC). Nesse período não se observou, visualmente, colônias de bolores ou leveduras nas fatias. Após 7 dias de armazenamento, no entanto, verificou-se a presença de colônias de bolores na superfície de fatias de pão tipo forma, que na maioria dos casos, aumentou de forma relevante em relação ao valor obtido para 3 dias de armazenamento, como pode ser observado na Tabela 4.11.
De um modo geral, as fatias de pão tipo forma embaladas com os biofilmes apresentaram valores similares ou maiores que seus respectivos controles (C1 e C2) o que indica que a presença dos biofilmes, nas condições dos ensaios, após 7 dias de embalagem, não promoveu efeito inibitório do crescimento dos microrganismos estudados. As amostras de pão tipo forma elaboradas com propionato de cálcio (C2) e armazenados por 7 dias apresentaram, em geral, populações de bolores e leveduras menores que os respectivos valores da amostra controle (C1) e do biofilme.
Visualmente, as colônias que cresceram no meio de cultura utilizado na análise microbiológica apresentaram aspecto algodonoso com coloração variada: verde, rosa, ou branca. Algumas vezes, constatou-se numa mesma placa o crescimento de colônias com as três cores diferentes.
Na Figura 4.20 são apresentados exemplos das colônias formadas no meio de cultura provenientes de amostras de pão tipo forma em contato com biofilmes armazenadas por 7 dias.
Figura 4.20. Aspecto das colônias de bolores e leveduras formadas no meio de cultura de fatias de pão tipo forma embaladas e armazenadas por 7 dias.
A Figura 4.21 apresenta o aspecto visual de algumas amostras de pães tipo forma armazenadas em contato com os biofilmes após 10 dias de embalagem.
Figura 4.21. Aspecto visual de fatias de pão tipo forma embaladas em contato com biofilmes antimicrobianos e armazenadas por 10 dias à temperatura ambiente (valor médio de 25 ºC): Biofilme de formulação 4 (A); Biofime de formulação 2 (B); Biofilme de formulação 1 (C), (Tabela 3.5).
A determinação dos valores da atividade de água dos biofilmes e das fatias de pão tipo forma não foi prevista no início do presente trabalho porém a medida que os resultados da contagem microbiológica começaram a ser determinados, julgou-se que a avaliação desta propriedade era importante para a melhor compreensão desses resultados. Desta forma, os valores de atividade de água de alguns biofilmes e das respectivas fatias de pão tipo forma embaladas junto com os mesmos foram determinados e são indicados na Tabela 4.12, assim como os valores da atividade de água dos respectivos controles C1 e C2. As avaliações foram realizadas após 7 dias da embalagem dos biofilmes com as fatias de pão. Após 3 dias de armazenamento os biofilmes apresentaram aspecto muito similar, visualmente ao inicial ou seja antes de ser embalado junto com as amostras de pão tipo forma.
Tabela 4.12 – Atividade de água (aw) de biofilmes e fatias de pão tipo forma embalados por 7 dias.
Amostra aw do pão aw do biofilme
Biofilme 6 + fatia de pão1 0,958 (25,0 ºC) 0,937 (25,2 ºC) Biofilme 7 + fatia de pão1 0,962 (25,2 ºC) 0,957 (25,2 ºC)
C1 (pão sem propionato) 0,958 (25,2 ºC) Não se aplica
C2 (pão com propionato) 0,966 (24,9 ºC) Não se aplica
Biofilme3 + fatia de pão1 0,960 (25,2 ºC) 0,952 (25,1 ºC) Biofilme 9 + fatia de pão1 0,959 (25,3 ºC) 0,947 (25,2 ºC)
C1 (pão sem propionato) 0,964 (25,1 ºC) Não se aplica
C2 (pão com propionato) 0,964 (25,2 ºC) Não se aplica
1 Fatia de pão sem propionato de cálcio.
Conforme citado anteriormente, (FARKAS, 1997), a atividade de água de pães apresenta valores em torno de 0,95 enquanto a dos biofilmes, antes do contato com fatias de pão, encontrava-se ao redor de 0,75 devido à atividade de água do ambiente interno dos dessecadores nos quais foram acondicionados.
Os valores apresentados na Tabela 4.12 mostram que os biofilmes apresentaram aumento nos valores de atividade de água ao longo do armazenamento com as fatias de pão tipo forma. Após 7 dias de contato, os biofilmes analisados apresentaram valores de atividade de água próximos aos valores apresentados para as fatias de pão tipo forma indicando que aumentou a umidade do biofilme.
O aspecto dos biofilmes armazenados com as fatias após período superior a sete dias foi alterado conforme pode ser visualizado na Figura 4.22, apresentando aspecto enrrugado, destacando-se facilmente das placas de petri e umedecidos de maneira perceptível ao tato. Apesar disso, apresentavam-se flexíveis, coesos e com os ingredientes antimicrobianos adicionados ainda incorporados à matriz dos biofilmes. O crescimento de bolores no próprio biofilme foi constatado visualmente e, em geral, foi observado na superfície de contato das fatias de pão tipo forma. O motivo provável é o possível maior valor de atividade de água nesta região do biofilme do que nas demais.
Figura 4.22. Aspecto visual de amostras de biofilmes anteriormente embaladas em contato com amostras de pão tipo forma por 10 dias à temperatura ambiente (valor médio de 25ºC).
Pode-se supor que os biofilmes, ao terem sua atividade de água elevada a valores acima de 0,80 tornaram-se um meio propício ao desenvolvimento de bolores e leveduras. Segundo Jay (1992), a atividade de água mínima, para a maioria dos bolores é de 0,80 e para as leveduras esse valor é de 0,88. Desta forma, é provável que os bolores e leveduras presentes nas fatias de pão tipo forma tiveram maior disponibilidade de substrato pois além da própria fatia, o biofilme à base de fécula de mandioca também tornou-se um meio para o seu crescimento pela adequada atividade de água adequada e por ser fonte de carboidratos.
Devido às alterações na atividade de água dos biofilmes embalados em contato com as fatias de pão, a avaliação do efeito antimicrobiano do cravo e da canela em pó aplicados no biofilme à base de fécula de mandioca foi prejudicada uma vez que o material estudado (biofilme) modificou-se de forma importante ao longo do período de embalagem. Apesar deste fato, a possibilidade da aplicação dos ingredientes cravo e canela em pó em biofilmes para promoção de efeito antimicrobiano em sistemas alimentícios não pode ser descartada e talvez possa ser observada em estudos conduzidos em condições diferentes às utilizadas no presente trabalho.
