UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS ESCOLA DE VETERINÁRIA E ZOOTECNIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA ANIMAL
Disciplina: SEMINÁRIOS APLICADOS
CONTRIBUIÇÃO DOS MICROSSATÉLITES DE DNA NA
CARACTERIZAÇÃO RACIAL
Bruna Paula Alves da Silva Orientador: Prof. Dr. José Robson Bezerra Sereno
GOIÂNIA 2011
BRUNA PAULA ALVES DA SILVA
CONTRIBUIÇÃO DOS MICROSSATÉLITES DE DNA NA
CARACTERIZAÇÃO RACIAL
Seminário apresentado junto à Disciplina Seminários Aplicados do Programa de Pós-Graduação em Ciência Animal da Escola de Veterinária e Zootecnia da Universidade Federal de Goiás.
Nível: Mestrado
Área de Concentração: Produção Animal
Linha de Pesquisa: Fatores genéticos e ambientais que influenciam o desempenho dos animais
Orientador: Prof. Dr. José Robson Bezerra Sereno - EMBRAPA CERRADOS
Comitê de Orientação: Prof. Dr. Emmanuel Arnhold - UFG Dra. Raquel Soares Juliano - EMBRAPA PANTANAL
GOIÂNIA 2011
SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS... iv
LISTA DE TABELAS... v
LISTA DE QUADROS... vi
LISTA DE ABREVIATURAS... vii
1 INTRODUÇÃO... 1
2 REVISÃO DE LITERATURA... 3
2.1 Marcadores moleculares... 3
2.1.1 Marcadores microssatélites... 4
2.1.1.1 Aplicações dos marcadores microssatélites... 6
2.1.1.2 Vantagens e desvantagens da utilização de marcadores microssatélites... 6
2.1.2 Técnicas utilizadas para a genotipagem de marcadores moleculares... 7
2.1.2.1 Reação em cadeia da polimerase... 7
2.1.2.1.1 Vantagens e desvantagens de utilização da PCR... 10
2.1.2.2 Eletroforese... 11
2.1.3 Seqüenciamento de DNA... 13
2.1.3.1 Seqüenciamento manual de DNA... 13
2.1.3.2 Seqüenciamento automático de DNA... 13
2.2 Caracterização genética por marcadores microssatélites... 15
2.3 Diversidade genética... 27
3 CONSIDERAÇÕES FINAIS... 29
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 A: genótipo homozigoto, B: genótipo heterozigoto, ambos para uma região genômica que compreende um microssatélite de elementos (CA)/(GT). C: gel de eletroforese com diferentes genótipos homozigotos, com banda única e heterozigotos, com duas bandas, em indivíduos diplóides... 5 Figura 2 Slippage... 9 Figura 3 Esquema dos quatro primeiros ciclos de uma reação de PCR... 10 Figura 4 Padrão de bandas observado para os alelos do microssatélite
TGLA122. Raias 1 e 20, DNA ladder 10pb. Raia 2, marcador de DNA de tamanho padrão. Raias 3,4,..., 19, DNA dos animais estudados. Os números ao lado esquerdo da figura indicam o tamanho dos fragmentos de DNA em pares de bases... 15 Figura 5 Dendrograma construído utilizando o método de UPGMA a partir
dos 15 locus analisados. EA: Eqüino Árabe. JB: Jumento Brasileiro. JP: Jumento Pêga. JN: Jumento Nordestino... 26 Figura 6 Agrupamento individual dos 215 indivíduos das três raças asininas
e da raça eqüina Árabe, pelo método estatístico Bayesiano utilizando o programa STRUCTURE. EA: Eqüino Árabe, JB: Jumento Brasileiro, JN: Jumento Nordestino e JP: Jumento Pêga.... 27
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Probabilidade de paternidade (PP) nas famílias em que não ocorreu exclusão de paternidade... 18 Tabela 2 Polimorfismo de 15 loci de microssatélites em 87 amostras de
DNA de galinhas caipiras de ovos azuis... 20 Tabela 3 Número de alelos (NA), heterozigosidades observada (Ho) e
esperada (He) e Conteúdo de Informação Polimórfica (PIC), em função dos loci analisados... 22 Tabela 4 Locus em desequilíbrio Hardy-Weinberg... 23 Tabela 5 Número de indivíduos (N), riqueza alélica (AR), média do
número de alelos por locus considerando-se o número amostral (i.e), heterozigosidade observada (Ho), heterozigosidade esperada (He), coeficiente de endogamia (FIS)... 25 Tabela 6 Estimativa aos pares de diferenciação genética e distância
genética entre as três raças de asininos e a raça eqüina Árabe. As estimativas de FST encontram-se acima na diagonal e abaixo se encontra a identidade genética de Nei’s. Todas as estimativas de FST foram significativas (p<0,01)... 26
LISTA DE QUADROS
Quadro 1 Probabilidade de Exclusão (PE) para cada microssatélite e Probabilidade de Exclusão Combinada (PEC) para todos os marcadores... 16 Quadro 2 Famílias excluídas nos testes de paternidade e marcadores
LISTA DE ABREVIATURAS
DNA - Ácido desoxirribonucléico EHW - Equilíbrio de Hardy-Weinberg FAO - Food and Agriculture Organization He - Heterozigosidade Esperada
Ho - Heterozigosidade Observada
ISAG - Sociedade Internacional de Genética Animal MoDAD - Meansurement of Domestic Animal Diversity PCR - Reação em Cadeia da Polimerase
PE - Probabilidade de Exclusão
PEC - Probabilidade de Exclusão Combinada PP - Probabilidade de Paternidade
1 INTRODUÇÃO
O conhecimento da estrutura genética de raças, espécies e populações se faz importante para a caracterização racial e consequentemente para preservação de animais que estejam sendo extintos. O estudo genético utilizando-se marcadores microssatélites possibilita definir a diversidade genética entre animais e raças, proporcionando maior eficiência dos programas de acasalamentos por meio do estudo da genealogia dos animais, otimizando o sistema de criação destes e auxiliando os criadores na escolha de métodos mais adequados ao sistema de produção em que estes animais estão inseridos.
Com vistas a implementar programas de conservação se faz necessária a utilização de técnicas que auxiliem a análise de parentescos e a identificação genética de indivíduos para direcionar os acasalamentos visando a manutenção da diversidade genética (EGITO et al., 2005).
Os marcadores moleculares têm sido bastante utilizados para identificar genes de interesse econômico, mapeamento genético, estudos evolucionários, identificação de paternidade, introgressão de genes úteis, diagnóstico precoce de doenças, caracterização assistida por marcadores e caracterização genética de populações locais (AMARANTE & WOMACK, 2004).
O avanço da biologia molecular, a descoberta de marcadores moleculares do tipo microssatélites de DNA e o uso da Reação em Cadeia da Polimerase, possibilitou a identificação de polimorfismos em vários sítios genômicos nos animais, revolucionando o monitoramento genético de populações (SILVA, 2007).
Os marcadores microssatélites são neutros e altamente polimórficos, sendo utilizados para estimação de distâncias genéticas, estruturação populacional, identificação racial, realização de testes de paternidade, estudos de caracterização genética e possibilitam o estabelecimento das relações filogenéticas entre diversas raças (KUMAR, 2000; MAUDET et al., 2002).
A reação em cadeia da polimerase possibilita a realização de testes altamente sensíveis, dependendo da habilidade de extrair DNA em quantidade suficiente e com qualidade adequada à técnica que vai ser utilizada, considerando
que o DNA é a base para se produzir conhecimentos genéticos (COELHO et al., 2004).
As estratégias de conservação animal se baseiam na caracterização das raças e populações para verificar a diversidade genética existente entre estas. Durante muito tempo a caracterização dos recursos genéticos animais baseou-se em características morfológicas e produtivas, sendo estas insuficientes para distinguir raças e influenciadas pelo ambiente. As estratégias de conservação devem se embasar na combinação de dados fenotípicos e genotípicos (EGITO et al., 1999).
A caracterização genética se faz importante aos programas de conservação animal, considerando que esta avalia as distâncias entre populações, facilitando na escolha dos animais a serem utilizados na conservação animal, in situ e ex situ, utilizando estimativa de índices de similaridade entre os indivíduos analisados, além de auxiliar programas de acasalamentos que favoreçam a variabilidade genética entre e dentro das populações (EGITO et al., 2001).
Objetivou-se descrever a importância dos microssatélites de DNA para a caracterização racial de diferentes espécies, visando manter a diversidade genética dentro das raças.
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Marcadores moleculares
Os marcadores moleculares ou marcadores genéticos podem ser entendidos como sendo técnicas que permitem determinar pontos de referência nos cromossomos, capazes de diferenciar indivíduos. Dessa forma, os marcadores de DNA podem ser definidos como características de DNA que são herdadas geneticamente e diferenciam indivíduos (MILACH, 1998).
Para realizar a caracterização genética de populações os marcadores moleculares têm sido muito utilizados, quantificando a diversidade genética, principalmente de animais domésticos. Estes são loci que possuem características capazes de serem identificadas, sendo que estas características possibilitam a diferenciação dos indivíduos (MENEZES et al., 2006).
Os marcadores podem ser classificados de acordo com a metodologia para identificá-los, sendo elas a hibridização ou amplificação de DNA. Os marcadores moleculares RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) e os locus VNTR (Variable Number of Tandem Repeats) ou minissatélites são identificados por hibridização, enquanto os marcadores do tipo RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA), SCAR (Sequence Characterized Amplified Regions), STS (Sequence Tagged Sites), AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) e microssatélites são identificados por amplificação e foram desenvolvidos após a descoberta da PCR, que por sua vez, permitiu a amplificação de DNA in vitro (MILACH, 1998).
Vários tipos de marcadores moleculares detectam o polimorfismo genético diretamente do DNA, entre estes, destacam-se a classe conhecida como microssatélites ou SSR (Simple Sequence Repeats), ou ainda STR (Short Tandem Repeats), por serem bastante polimórficos, ou seja, possuem grande habilidade para detectar diferenças entre indivíduos (FALEIRO, 2007).
2.1.1 Marcadores microssatélites
Para a confecção de mapas genéticos, as análises que mais se destacam são as obtidas por marcadores microssatélites, que são sequências repetidas de DNA, apresentando loci discretos e alelos co-dominantes. Os microssatélites são sequências de um a seis nucleotídeos de comprimento, que se repete em tandem, ocorrendo consecutivamente uma após a outra. Possuem maior capacidade de ganhar alelos que perder, sendo que um lócus de um microssatélite tem aproximadamente quatro a dez alelos, além de serem facilmente amplificados por meio da técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR), podendo ser analisados depois de passar pela eletroforese (STRACHAN & READ, 2002; MENEZES et al., 2006).
Para obtenção de marcadores microssatélites, existem diversos protocolos como: derivados de EST (Expressed Sequence Tag), ou seja, etiquetas de sequências expressas; por meio de bibliotecas genômicas enriquecidas; transferibilidade, entre outros (ZAHA et al., 2003).
Os microssatélites apresentam freqüentemente uma heterozigosidade esperada acima de 0,7 e são altamente polimórficos, o que possibilita uma discriminação bastante precisa de indivíduos próximos, além disso, são também abundantes e dispersos de forma uniforme no genoma, proporcionando facilidade para que suas informações sejam compartilhadas em laboratórios (BRONDANI et al., 1998).
A Food Agriculture Organization (FAO) e a International Society of Animal Genetics (ISAG) estabeleceram, em 1995, um grupo de consultores com o objetivo de elaborar uma série de recomendações técnicas e diretrizes para avaliação da diversidade genética de raças de animais domésticos. Por meio do projeto chamado Meansurement of Domestic Animal Diversity (MoDAD) foi selecionada uma lista de loci de microssatélites que podem ser utilizados para estudos da diversidade genética e caracterização de raças de ovinos, caprinos, suínos, bovinos e aves. Esta lista foi ampliada em 2004, quando foram incluídos novos marcadores microssatélites (FAO, 2004).
Os marcadores microssatélites que apresentam homologia em diversas espécies devem ser preferíveis, em razão de facilitarem os estudos em laboratórios, possibilitando reduzir custos e economizar tempo (FAO, 2004).
O polimorfismo encontrado nos marcadores diz respeito ao número de vezes que o núcleo de bases se repete (FERREIRA & GRATTAPAGLIA, 1998). Na Figura 1 estão ilustrados a base genética e o polimorfismo em marcadores microssatélites.
FIGURA 1 - A: genótipo homozigoto, B: genótipo heterozigoto, ambos para uma região genômica que compreende um microssatélite de elementos (CA)/(GT). C: gel de eletroforese com diferentes genótipos homozigotos, com banda única e heterozigotos, com duas bandas, em indivíduos diplóides
2.1.1.1 Aplicações dos marcadores microssatélites
As maiores aplicações dos marcadores de DNA têm sido utilizadas para a sexagem de embriões, testes de paternidade, registro genealógico e utilização com vistas a detectar doenças genéticas ou características funcionais em determinadas raças (GARCIA, 2006). Os microssatélites são muito utilizados na investigação da estrutura populacional de diversas espécies de animais domésticos, considerando os métodos de agrupamento, os quais possibilitam a inferência de estrutura de populações e a designação de indivíduos a populações (FABUEL et al., 2004; MARTÍNEZ et al., 2006).
A utilização de marcadores moleculares possibilita quantificar a diversidade genética de populações, além da realização de testes de paternidade, que podem ser feitos em vegetais, humanos e animais. Os marcadores mais utilizados para a realização dos exames de paternidade são os do tipo RFLP, microssatélites e minissatélites (CURI & LOPES, 2001).
2.1.1.2 Vantagens e desvantagens da utilização de marcadores microssatélites
Os marcadores moleculares possibilitam avaliação precoce dos animais para características determinadas, pois esta tecnologia utiliza amostras de DNA, podendo ser realizadas análises logo após o nascimento ou ainda na fase embrionária, inclusive em programas de transferência de embriões e produção in vitro, otimizando a seleção genética (GARCIA, 2001; GARCIA & PORTO-NETO, 2006).
Outro benefício se refere à possibilidade de se selecionar características que apresentam dificuldades técnicas para serem mensuradas como, precocidade sexual e de terminação de carcaça ou características que demonstram alto custo de análises, como maciez da carne e resistência a doenças e ainda características como a longevidade (GARCIA, 2006).
A principal desvantagem da utilização de marcadores microssatélites de DNA em escala comercial é o alto custo, necessitando de estudos que
apresentem formas de aumentar a rapidez e diminuir os custos com a genotipagem de animais (CURI & LOPES, 2001).
Outra desvantagem são os erros de identificação de paternidade, que prejudicam os programas de melhoramento genético por reduzirem o ganho genético anual da população, por isso devem ser minimizados. Quando se investiga biologicamente a paternidade é realizada uma análise da herança genética do filho, apurando a parte genética herdada da mãe e transmitida pelo pai. Se estes possuírem características hereditárias transmitidas ao filho, não pode ser excluído da paternidade. Qualquer característica constante do nascimento ao longo da existência e que é geneticamente determinada, não sofrendo influência do meio, como doenças ou qualquer outra condição submetida, pode servir como parâmetro para identificar a paternidade. Os polimorfismos de DNA baseiam-se na variabilidade da composição das bases dos ácidos nucléicos, proporcionando o estudo a partir do código genético (CURI & LOPES, 2001).
2.1.2 Técnicas utilizadas para a genotipagem de marcadores moleculares
2.1.2.1 Reação em cadeia da polimerase
A PCR (Polimerase Chain Reaction) transformou a genética molecular, uma vez que, permitiu a rápida clonagem e a análise do DNA. Esta técnica representa um método in vitro rápido e versátil, utilizado para amplificação seletiva de sequências-alvo de DNA específicas a partir de DNA total previamente extraído. Para que a amplificação seja seletiva precisa-se de alguma informação prévia, utilizada para desenhar dois oligonucleotídeos iniciadores, denominados
primers, específicos para a seqüência-alvo e apresentam em média 15 a 25
nucleotídeos de extensão. Depois que os primers são adicionados ao DNA-molde desnaturado, estes se ligam especificamente às sequências de DNA complementares ao seu sítio-alvo, flanqueando e delimitando a região a ser analisada (STRACHAN & READ, 2002).
A síntese de novas fitas de DNA inicia-se em presença de uma DNA-polimerase termoestável apropriada e dos quatro desoxirribonucleosídeos trifosfatos (dATP, dCTP, dGTP e dTTP). As novas fitas são complementares a cada uma das fitas de DNA do segmento alvo de DNA, formando um fragmento de DNA com seqüência idêntica à do DNA analisado e previamente selecionado pelo par de primers. A PCR é uma reação em cadeia, pois as fitas de DNA sintetizadas atuam como moldes para mais sínteses de DNA nos ciclos subseqüentes. Considerando que o ciclo de duplicação molecular é repetido várias vezes, após 25 ciclos de síntese de DNA, além do DNA que iniciou a reação os produtos da PCR incluem cerca de 10 cópias da sequência-alvo específica. Em menos de 24 horas os resultados podem ser obtidos (STRACHAN & READ, 2002).
A PCR é utilizada para aumentar pequenas quantidades de DNA (LITT & LUTY, 1989). Depois de obtidos os microssatélites, os fragmentos são amplificados via PCR com iniciadores, primers, específicos de 20 a 30 bases, que complementam as sequências que flanqueiam a região a ser amplificada e são utilizados para delimitar tal região (FERREIRA & GRATTAPAGLIA, 1998).
O polimorfismo é causado pelo deslizamento (slippage) da DNA polimerase que ocorre durante o processo de replicação. O slippage é um mecanismo interno que ocasiona elevada taxa de mutação (ELLEGREN, 2004).
Acredita-se que durante a replicação de uma região repetitiva, as fitas de DNA separam-se e se associam novamente de forma incorreta, gerando cópias de trechos de DNA, alelos, com diferentes tamanhos ou números de repetições no próximo ciclo de replicação (Figura 2), seja por meio da inserção ou da deleção de uma unidade de repetição (BARBOSA, 2010).
FIGURA 2 - Slippage
Fonte: http://www.virtuallaboratory.net/Biofundamentals/lectureNotes/AllGraphics/slippage.jpg Os reagentes necessários para que ocorra uma reação da PCR são: DNA molde, primers, DNA polimerase, MgCl2, solução tampão e dNTPs. Os primers possuem hidroxila livre (OH-) na extremidade, onde serão adicionados novos dNTPs pela enzima DNA polimerase. A DNA polimerase termoestável que tem sido mais utilizada é a Taq DNA polimerase. O reagente MgCl2 doa íons Mg2+, cofatores indispensáveis para a atividade da Taq DNA polimerase. A solução tampão é usada para manter o pH e as condições iônicas ideais para a reação e os dNTPs são desoxinucleosídeos trifosfatados, monômeros utilizados na síntese das fitas complementares às fitas-molde da molécula de DNA inicial. A PCR ocorre em um equipamento denominado termociclador (BARBOSA, 2010).
A PCR tem como objetivo principal amplificar regiões específicas de DNA (Figura 3), com o intuito que se tenha um grande número de cópias,
considerando que apenas uma cópia de uma seqüência não é suficiente para ser analisada (BARBOSA, 2010).
FIGURA 3 - Esquema dos quatro primeiros ciclos de uma reação de PCR Fonte: http://www.geocities.com/avinash_abhyankar/molecular/pcr_basics_files/image003.gif
2.1.2.1.1 Vantagens e desvantagens de utilização da PCR
A clonagem de DNA por meio da PCR realiza-se em poucas horas, utilizando para isso um equipamento simples, que varia a temperatura no processo. As etapas consistem em desnaturação, síntese e pareamento, considerando que uma reação de PCR consiste de trinta ciclos, com cada ciclo durando cerca de três a cinco minutos em um termociclador automatizado. Necessita-se também algum tempo para a construção e a síntese dos oligonucleotídeos, que são utilizados como primers, no entanto, existem programas comerciais que projetam primers e sintetiza comercialmente os oligonucleotídeos desejados de forma rápida. Dessa forma a PCR apresenta velocidade e facilidade de utilização (STRACHAN & READ, 2002).
A PCR demonstra sensibilidade, pois é capaz de amplificar sequências a partir de quantidades mínimas do DNA-alvo, até mesmo do DNA de uma única
célula. Este fato torna essa técnica muito útil na análise forense, onde a quantidade de material biológico é muito pequena (DUARTE et al., 2001).
Por meio da PCR, que por sua vez, apresenta robustez e possibilidade de análise de amostras degradadas, pode-se amplificar sequências específicas a partir de amostras em que o DNA está degradado ou em um meio onde é difícil o isolamento do DNA. Lembrando que apenas um fragmento do DNA é isolado e amplificado pela PCR, se torna possível a análise com sucesso de amostras antigas e já decompostas, restos mortais, entre outros (DUARTE et al., 2001).
Uma limitação da técnica de PCR se diz respeito à contaminação. Se o DNA contaminante estiver em níveis comparáveis aos do DNA-alvo, sua amplificação pode confundir a interpretação dos resultados referentes à tipagem, causando erros na conclusão. Para evitar estas possibilidades pode-se utilizar um controle negativo, em que se realiza a mesma reação de PCR, mas não se coloca amostras e outra forma seria a separação física das áreas do laboratório destinadas ao trabalho com PCR e com produto que já foi amplificado (DUARTE et al., 2001; BOROVIK et al., 2011).
2.1.2.2 Eletroforese
A eletroforese compreende uma técnica de genotipagem que possibilita separar moléculas em função da sua massa, forma e compactação. Esta técnica é sensível, rápida e precisa. A molécula, o DNA, migra nos suportes, que podem ser géis de agarose ou acrilamida, em razão da ação de uma corrente elétrica, com diferentes velocidades que dependem do tamanho e forma. As moléculas de DNA migram para o pólo positivo quando submetidas a um campo elétrico, porque são carregadas negativamente e o atrito com o gel, suporte, reage como força oposta à migração. Dessa forma, quanto maior a molécula, maior o atrito e mais lenta a migração (VIEIRA, 2011).
Na presença de compostos intercalantes, como o brometo de etídio, o DNA pode ser visualizado, pois esta molécula emite fluorescência por exposição à luz ultravioleta (UV) em presença desse composto e as moléculas de um mesmo tamanho podem ser visualizadas em um mesmo ponto do gel, formando uma
faixa fluorescente, enquanto se existirem mais de um tamanho de molécula na amostra, estas serão separadas na migração, sendo visíveis bandas em diferentes localizações do gel (ZAHA et al., 2003).
As duas substâncias mais utilizadas para eletroforese, géis de agarose e géis de acrilamida, formam tramas de poros de tamanhos variáveis, o que possibilita a separação dos fragmentos, sendo sua eficiência dependente da concentração do polímero e da intensidade da voltagem e amperagem aplicadas. Em qualquer uma das escolhas, estas substâncias são dissolvidas numa solução-tampão eletrolítica, a mesma que deve recobrir o gel na cuba de eletroforese e possibilitar a passagem de corrente elétrica, chamado Tampão de Corrida. Geralmente, utiliza-se o TBE (Tris-Borato EDTA) e o TAE (Tris-Acetato EDTA). A escolha do tipo de gel a ser utilizado depende do tamanho do fragmento e da diferença de tamanho dos fragmentos de DNA que se deseja visualizar (KOCH & ANDRADE, 2008).
Antes da aplicação das amostras no gel, elas são misturadas a outra solução, tampão da amostra, para aumentar a viscosidade da amostra e impedir que esta comece a flutuar no tampão de corrida antes que a voltagem seja aplicada no sistema, além de possibilitar a visualização da corrida em razão do tampão possuir um corante. Geralmente utiliza-se uma mistura do corante Azul de Bromofenol, Xileno-Cianol e Glicose, dissolvidos no tampão de corrida, de acordo com cada reação (VIEIRA, 2011).
No gel são utilizadas concentrações de 0,5 a 4% de agarose, sendo que quanto maior a concentração maior a capacidade de distinguir fragmentos de tamanhos próximos. Para acrilamida as concentrações variam de 4 a 25% no gel, apresentando definição maior que a agarose. A eletroforese convencional possui a desvantagem de identificar os fragmentos quanto ao tamanho e não quanto à seqüência, contudo, apresenta baixo nível de dificuldade de realização e versatilidade (VIEIRA, 2011).
2.1.3 Seqüenciamento de DNA
2.1.3.1 Seqüenciamento manual de DNA
O DNA pode ser seqüenciado de forma manual produzindo-se fragmentos pela interrupção controlada da replicação enzimática. Considerando que a DNA polimerase é utilizada para copiar uma determinada seqüência de um DNA unifilamentar, como em uma reação de PCR comum, tem-se como diferença destas reações que, além dos quatro desoxirribonucleosídeos (dATP, dTTP, dCTP, dGTP marcados com radioatividade), a mistura de incubação contém um análogo 2’, 3’-didesoxi de um deles. A incorporação desse análogo bloqueia o posterior crescimento da nova cadeia porque ele não tem a hidroxila 3’ terminal necessária para formar a ligação fosfodiéster seguinte. Assim, são produzidos fragmentos de vários comprimentos, nos quais o análogo didesoxi está na ponta 3’. A mesma amostra é submetida a esta reação em quatro eppendorfs diferentes e em cada eppendorf existe um dos quatro nucleotídeos modificados diferentes (STRYER, 1996).
O resultado final em cada reação são fragmentos de diferentes tamanhos, em razão da parada da reação a cada vez que o nucleotídeo amplificado é incorporado. Estes conjuntos de fragmentos, um para cada análogo didesoxi são então submetidos à eletroforese e a seqüência de bases do novo DNA é lida na auto-radiografia (STRYER, 1996).
2.1.3.2 Seqüenciamento automático de DNA
Os seqüenciadores de DNA realizam automaticamente a análise das fitas de DNA previamente amplificadas, cujos didesoxirribonucleotídeos (dNTPs) incorporados na PCR foram marcados previamente com compostos fluorescentes, com cores diferentes para cada dNTP. O produto da PCR é aplicado em um gel no interior de um capilar e dessa forma, a migração do DNA ocorre até passar pelo detector do equipamento. O gel é rastreado por um feixe
de laser, excitando os marcadores, que emitem luz em um comprimento de onda específico, de acordo com o corante utilizado. A luz é detectada e o padrão do espectro analisado com o auxílio de programas que permitem gerar as sequências de DNA. Usando detectores de fluorescência controlados por computador, os sistemas automáticos podem identificar aproximadamente 10 mil bases por dia, enquanto os métodos manuais identificam 50 mil bases por ano (VOET et al., 2002).
Os sistemas automatizados de genotipagem de locus microssatélites são os mais utilizados, por proporcionarem análises de fragmentos produzidos por PCR por meio de primers marcados com fluorescência. Os sistemas multiplex possibilitam a genotipagem em grande escala, com seus sistemas de genotipagem multiloco, semi-automatizados, detectando e analisando simultaneamente em analisadores automáticos vários fragmentos microssatélites, o que fornece grande precisão na detecção alélica, diminuindo os custos, o tempo de análise e os erros que ocorrem quando se realiza uma análise manual e visual (RANGEL et al., 2005).
Diversos STRs são amplificados utilizando-se vários pares de primers, que compõem o kit comercial chamado PCR multiplex. O produto da reação de amplificação dos STRs pode ser detectado por seus tamanhos, por meio da migração em gel de eletroforese de alta resolução, localizado dentro de um capilar. Quando se utiliza a tecnologia de coloração fluorescente com detecção por laser é possível avaliar STRs de mesmo tamanho, simplesmente marcando cada um com uma coloração diferente. Cada kit PCR multiplex utiliza diferentes colorações e amplifica diferentes STRs, como por exemplo os kits comerciais, Profiler Plus™ que analisam simultaneamente dez marcadores, kit Power Plex® para dezesseis STRs e o Identifiler™ para dezesseis marcadores (KASHYAP et al., 2004).
Uma PCR multiplex pode ser operada para quatro ou cinco marcadores, sendo que duas reações podem ser suficientes para realização de testes de paternidade (CURI & LOPES, 2001).
2.2 Caracterização genética por marcadores microssatélites
A caracterização genética de populações proporciona o estudo da variabilidade genética. A variabilidade genética total de uma espécie resulta do conjunto representado pela contribuição da variabilidade intra e inter-populacional. Estes parâmetros são importantes para a conservação dos recursos genéticos, evitando a extinção de animais ameaçados (SILVA, 2007).
Em experimento realizado com 40 famílias (touro/vaca/bezerro) de animais da raça Gir, sendo estes puros de origem e registrados na Associação Brasileira dos Criadores de Zebu, realizou-se testes de paternidade por meio de amostras de sangue, utilizando-se microssatélites de DNA. Os primers utilizados são recomendados pela ISAG e alguns microssatélites analisados nesse estudo geralmente não são utilizados para esse propósito. As regiões microssatélites foram amplificadas pela PCR e os produtos resultantes separados por eletroforese em gel de poliacrilamida desnaturante. Os fragmentos de DNA foram detectados utilizando-se coloração por nitrato de prata. Visualizaram-se os fragmentos amplificados sob luz branca e estes foram fotografados em filme polaróide 667 (Figura 4) (CURI & LOPES, 2001).
FIGURA 4 - Padrão de bandas observado para os alelos do microssatélite TGLA122. Raias 1 e 20, DNA ladder 10pb. Raia 2, marcador de DNA de tamanho padrão. Raias 3,4,..., 19, DNA dos animais estudados. Os números ao lado esquerdo da figura indicam o tamanho dos fragmentos de DNA em pares de bases
Foi determinada a constituição genotípica dos indivíduos para cada marcador, utilizando-se a análise do tamanho do fragmento em pares de bases (pb). Calcularam-se as frequências alélicas e a probabilidade de exclusão (PE) para cada marcador microssatélite, além da probabilidade de exclusão combinada (PEC) para o conjunto de microssatélites que foram utilizados. As famílias em que não ocorreu exclusão de paternidade foram submetidas ao cálculo de probabilidade de paternidade (PP). A PEC demonstra a probabilidade de ocorrer exclusão de paternidade em pelo menos um sistema genético utilizado e tanto a PEC quanto a PE estão apresentadas no Quadro 1 (CURI & LOPES, 2001).
QUADRO 1 - Probabilidade de Exclusão (PE) para cada microssatélite e Probabilidade de Exclusão Combinada (PEC) para todos os marcadores Microssatélites PE TGLA 122* 0,4323 TGLA 126* 0,3035 ETH 3* 0,2769 SPS 115* 0,3114 ETH 225* 0,1878 BM 1824* 0,2599 ETH 10* 0,3403 BMS 2533 0,6289 POTCHA 0,2705 PEC = 0,9789
*microssatélites recomendados pelo ISAG para a realização de testes de paternidade em bovinos Fonte: Adaptado de CURI & LOPES (2001)
A tabela acima mostra que os microssatélites BMS2533 e TGLA122 apresentaram alto polimorfismo e PE adequadas e o valor obtido para PEC, 0,9789 se aproximou do ideal, 0,99, resultado que poderia ser obtido aumentado-se um marcador microssatélite ao teste de paternidade. Os marcadores ETH10, SPS115, TGLA126, ETH3, POTCHA, BM1824 e ETH225 apresentaram PE baixa, sendo o ETH3, ETH225 e BM1824, recomendados pelo ISAG para testes de paternidade em bovinos. Em contraste, o microssatélite BMS 2533, que por sua
vez, não é utilizado para essa finalidade, demonstrou alta PE, o que mostra a importância de se caracterizar diferentes populações ou linhagens dentro da raça em estudo, pois diferentes populações não apresentam obrigatoriamente o mesmo número de alelos e mesmas frequências alélicas (CURI & LOPES, 2001).
Os resultados de PE obtidos para os microssatélites BM1824 e ETH225 demonstraram que microssatélites adequados para testes de paternidade em raças bovinas européias, podem não ser apropriados para raças zebuínas. Os marcadores microssatélites que excluíram a possibilidade de paternidade nas famílias (Touro (T), Vaca (V) e Bezerro (B)) estão apresentados no Quadro 2 (CURI & LOPES, 2001).
QUADRO 2 - Famílias excluídas nos testes de paternidade e marcadores microssatélites responsáveis pela exclusão
Família TGLA 122 TGLA 126 BM18 24 BMS2 533 SPS1 15 ET H3 ETH 10 ETH2 25 POTC HA TB/V5/ B5 x x TA/V18/ B18 x x x TA/V19/ B19 x x x TA/V20/ 20 x x x x x TC/V23/ B23 x x TC/V24/ B24 x x TA/V25/ B25 x x x TA/V26/ B26 x x TA/V33/ B33 x x x x x TA/V34/ B34 x x x TA/V37/ B37 x x x x
Fonte: Adaptado de CURI & LOPES (2001)
O cálculo da probabilidade de paternidade foi realizado para todas as famílias que não foram excluídas da paternidade, sendo estas apresentadas na Tabela 1 (CURI & LOPES, 2001).
TABELA 1 - Probabilidade de paternidade (PP) nas famílias em que não ocorreu exclusão de paternidade TA TB TC TD V/B PP V/B PP V/B PP V/B PP V1/B1 0,9521 V2/B2 0,9801 V21/B21 0,9998 V22/B22 0,9999 V4/B4 0,8691 V3/B3 0,8714 V28/B28 0,9964 V9/B9 0,8691 V6/B6 0,9228 V29/B29 0,9972 V11/B11 0,9521 V7/B7 0,9529 V30/B30 0,9972 V12/B12 0,9521 V8/B8 0,9396 V31/B31 0,9998 V14/B14 0,9521 V10/B10 0,9574 V17/B17 0,8691 V13/B13 0,8994 V32/B32 0,9521 V15/B15 0,9844 V35/B35 0,9521 V16/B16 0,9905 V36/B36 0,9521 V27/B27 0,9741 V39/B39 0,9521 V28/B28 V40/B40 0,9964 0,8994 Média = 0,9295 0,9474 0,9981 0,9999 Média geral = 0,9512
Fonte: Adaptado de CURI & LOPES (2001)
A probabilidade de paternidade variou entre 0,8691 e 0,9999, com média de 0,9512, sendo que somente oito famílias atingiram a probabilidade recomendada de 0,99, fato que pode ter sido causado pelo baixo poder informativo de alguns microssatélites utilizados (CURI & LOPES, 2001).
Em estudo que avaliou a variabilidade genética de galinhas caipiras brasileiras de ovos azuis foram utilizadas 87 amostras de sangue e 15 marcadores microssatélites. Após a extração do DNA total foi feita a análise dos
loci microssatélites e a amplificação dos fragmentos de DNA foi realizada pela
PCR. Utilizaram-se iniciadores marcados com fluoróforos para quinze loci de microssatélites: LEI0234, LEI0248, LEI0221, LEI0214, LEI0192, LEI0217, LEI0254, LEI0194, LEI0212, MCW0371, ADL0278, MCW0183, MCW0216, MCW0330 e MCW0081, sendo os cinco últimos recomendados pela FAO. Os produtos amplificados foram submetidos à genotipagem em seqüenciador automático e as seqüencias analisadas com programa Gene Mapper ID Software
v.3.2 e a análise estatística realizada utilizando o programa Arlequin v.3.5. Foram calculados para todos os lócus de microssatélite as frequências alélicas, genotípicas e estimativas de heterozigosidade esperada (He) e observada (Ho) e desvios do Equilíbrio de Hardy-Weinberg (FONTEQUE, 2011).
O mesmo autor demonstrou que a amplificação das amostras de DNA de 87 galinhas nos 15 loci de microssatélite gerou um total de 168 alelos, com
amplicons variando entre 83 e 490 pares de base, estes fatos demonstraram que
os quinze loci de microssatélites utilizados foram eficientes na amplificação e genotipagem do DNA, apresentando alto polimorfismo e um número médio de 11,2 alelos. O número máximo de 28 alelos foi identificado para o marcador LEI0212, o que pode significar que este locus encontra-se em uma região de elevada taxa de mutação ou de seleção positiva a mutação. Foram produzidos 288 genótipos com a combinação de alelos dos 15 loci.
As heterozigosidades esperada e observada são medidas de variabilidade genética eficientes. A He representa a probabilidade que dois alelos escolhidos ao acaso em uma população sejam diferentes, enquanto a Ho representa a proporção de indivíduos heterozigotos observados nas amostras da população. A heterozigosidade de um marcador diz respeito à probabilidade de um indivíduo ser heterozigoto no locus marcador, sendo este parâmetro dependente do número de alelos e da freqüência destes na população e apresentando polimorfismo informativo quando possui heterozigosidade maior que 70% (NEI, 1973; BELKHIR, 1999).
A heterozigosidade média observada é considerada elevada quando apresenta valores superiores a 0,7 e reduzida quando apresenta valores inferiores a 0,5. Em relação à heterozigosidade média esperada os valores superiores a 0,5 indicam que os marcadores possuem elevada diversidade genética (MENEZES, 2005).
A heterozigosidade média esperada foi 0,76 e a observada foi 0,49 para a população estudada, conforme demonstrado na Tabela 2. Os quinze loci apresentaram desvio do Equilíbrio de Hardy-Weinberg (EHW) para a população (FONTEQUE, 2011).
Os desvios de EHW podem ocorrer em razão de fatores como acasalamentos direcionados, antepassados comuns, subdivisões dentro da
população, seleção natural e artificial, fluxo de genes a partir de população externa ou migração (MENEZES, 2005).
TABELA 2 - Polimorfismo de 15 loci de microssatélites em 87 amostras de DNA de galinhas caipiras de ovos azuis
Locus NA1 Ho2 He3 T4(pb) Valor de P5 s.d. LEI0248 12 0.70115 0.76447 210-258 0.00000 0.00000 LEI0221 14 0.81609 0.86944 125-233 0.00000 0.00000 LEI0214 13 0.29885 0.80845 127-279 0.00000 0.00000 LEI0192 19 0.66667 0.89104 230-378 0.00000 0.00000 MCW0371 17 0.26437 0.84905 98-229 0.00000 0.00000 LEI0217 19 0.55172 0.83702 174-330 0.00000 0.00000 LEI0254 02 0.08046 0.34981 83-87 0.00000 0.00000 LEI0194 08 0.17241 0.77138 125-181 0.00000 0.00000 LEI0212 28 0.45977 0.87403 310-490 0.00000 0.00000 ADL278 05 0.56322 0.58328 102-114 0.00894 0.00011 LEI0234 12 0.63218 0.82526 208-304 0.00000 0.00000 MCW0183 07 0.62069 0.75809 292-396 0.00000 0.00000 MCW0216 05 0.35632 0.73145 124-142 0.00000 0.00000 MCW0330 02 0.54023 0.73483 265-285 0.00000 0.00000 MCW0081 05 0.65517 0.69796 109-130 0.00000 0.00000 Média 11,20 0,49195 0,75637 s.d. 7,38 0,21266 0,13819 1
Número de alelos por locus. 2Freqüência de heterozigosidade observada. 3Freqüência de heterozigosidade esperada. 4Tamanho do alelo em pares de base. 5Locus em desequilíbrio (P<0,05)
Fonte: FONTEQUE (2011)
As populações de galinhas caipiras brasileiras de ovos azuis são pequenas, geralmente endogâmicas e submetidas ao ambiente comum de criação de aves caipiras, sendo selecionadas de forma natural e artificial, fatos que podem justificar a população estar em desvio do EHW. Os resultados encontrados para heterozigosidades médias e número médio de alelos demonstram que existe elevada variabilidade genética em galinhas caipiras brasileiras de ovos azuis (FONTEQUE, 2011).
Em um experimento que verificou a utilização de 27 microssatélites para caracterização genética de raças caprinas brasileiras, coletou-se 332 amostras casualizadas de pêlos de caprinos das raças Moxotó, Canindé, Serrana Azul, Marota, Repartida e Graúna. Foi extraído o DNA das amostras de dez pêlos selecionados por animal. Os 27 microssatélites foram analisados com as sequências direta e reversa dos iniciadores, amplificados mediante a técnica de reação em cadeia de polimerase (PCR), submetidos à eletroforese em gel de poliacrilamida em seqüenciador automático, os resultados das análises de fragmentos e a tipificação alélica foram obtidos por meio dos programas informáticos Genescan Analysis v.3.7 e Genotyper 2.5 (MENEZES et al., 2006).
As frequências alélicas foram calculadas com base na contagem direta dos alelos encontrados e estas frequências juntamente com as heterozigosidades foram calculadas por meio do programa Genetix versão 4.01. Os resultados encontrados de polimorfismo dos loci analisados estão apresentados na Tabela 3. (MENEZES et al., 2006).
O Conteúdo de Informação Polimórfica (PIC) é um indicador da qualidade do marcador em estudos genéticos, sendo útil para a segregação, identificação de populações e controle de paternidade. Os marcadores que apresentam valores de PIC superiores a 0,5 são considerados muito informativos, outros com valores variando entre 0,25 e 0,50 são considerados mediamente informativos e com valores inferiores a 0,25 são classificados como pouco informativos (BOTSTEIN et al., 1980).
Os marcadores que apresentaram elevado grau de heterozigosidade média observada, sendo esta com valores superiores a 70% foram TGLA122, MM12, CSSM60, BM6526, HSC E BM8125, enquanto os marcadores MAF209, BM6506, SPS115, ETH225, INRA63, HAUT27, ETH10 e INRA23 demonstraram nível reduzido de heterozigosidade, com valores inferiores a 50%. A heterozigosidade média esperada foi superior a 50% para a maioria dos loci (85%). O PIC apresentou valores superiores a 50% em mais de 75% dos loci analisados (MENEZES et al., 2006).
TABELA 3 - Número de alelos (NA), heterozigosidades observada (Ho) e esperada (He) e Conteúdo de Informação Polimórfica (PIC), em função dos loci analisados
LOCI NA Ho He PIC CSSM66 23 0,680 0,819 0,908 OarFCB304 16 0,669 0,795 0,777 MM12 14 0,733 0,752 0,724 BM6526 14 0,716 0,744 0,724 INRA6 13 0,638 0,847 0,830 HSC 11 0,731 0,789 0,761 BM1329 11 0,678 0,741 0,698 OarFCB11 11 0,659 0,687 0,643 MAF65 11 0,508 0,717 0,675 CSRM60 10 0,720 0,755 0,718 BM6506 10 0,371 0,406 0,391 BM1818 10 0,671 0,761 0,737 TGLA122 10 0,754 0,829 0,807 CSRD247 09 0,666 0,748 0,717 HAUT27 09 0,461 0,479 0,436 SRCRSP8 09 0,675 0,776 0,742 INRA23 09 0,495 0,666 0,612 INRA5 08 0,623 0,709 0,667 OarFCB48 08 0,598 0,632 0,572 ILSTS011 07 0,524 0,786 0,752 McM527 07 0,631 0,699 0,651 BM8125 06 0,713 0,769 0,733 INRA63 06 0,454 0,572 0,480 SPS115 05 0,412 0,503 0,398 ETH10 05 0,493 0,650 0,576 ETH225 04 0,416 0,483 0,383 MAF209 03 0,037 0,043 0,042
O equilíbrio de Hardy-Weinberg dos loci está apresentado na Tabela 4 para cada raça caprina analisada (MENEZES et al., 2006).
TABELA 4 - Locus em desequilíbrio Hardy-Weinberg
Locus S. Azul Moxotó Marota Canindé Repartida Graúna
CSRD247 ─ ─ ─ ─ 0,099 ─ ETH225 ─ ─ ─ ─ 0,000 0,053 HAUT27 ─ ─ ─ ─ 0,024 ─ ILSTS011 ─ 0,000 ─ 0,000 ─ ─ INRA63 0,079 ─ ─ 0,006 0,094 ─ INRA5 0,014 ─ 0,087 ─ ─ ─ SPS115 0,072 0,000 ─ 0,002 0,005 ─ BM6526 0,000 0,080 ─ ─ ─ ─ CSRM60 ─ ─ 0,039 0,071 ─ ─ CSSM66 ─ ─ ─ ─ 0,001 0,002 ETH10 ─ ─ ─ ─ 0,019 0,067 INRA6 0,000 0,062 ─ 0,065 ─ 0,000 MM12 ─ 0,025 ─ ─ ─ ─ HSC ─ 0,013 0,047 ─ 0,086 ─ McM527 ─ 0,026 ─ ─ ─ ─ SRCRSP8 ─ 0,022 0,093 0,075 ─ 0,012 OarFCB48 0,056 ─ 0,043 ─ ─ ─ OarFCB11 ─ 0,032 0,085 ─ ─ ─ INRA23 0,016 ─ 0,000 0,000 ─ 0,000 MAF209 0,000 0,000 0,000 ─ 0,051 0,000 MAF65 0,000 0,000 0,003 ─ ─ 0,017
Fonte: Adaptado de MENEZES et al. (2006)
A raça Moxotó apresentou onze locus em desequilíbrio, a Serrana Azul, Marota e Repartida apresentaram nove, a Graúna oito e a Canindé sete locus em desequilíbrio Hardy-Weinberg. Dessa forma, verifica-se que foram poucos microssatélites que demonstraram desequilíbrio, considerando que 70% dos marcadores apresentaram estar em EHW. Os desequilíbrios podem acontecer em
populações ameaçadas de extinção como as deste estudo em razão de fatores como antepassados comuns e seleção natural (MENEZES et al., 2006).
Com vistas a avaliar a diversidade genética de raças asininas criadas no Brasil foram analisados 215 indivíduos das raças Jumento Brasileiro, Jumento Nordestino e Jumento Pêga, além da raça eqüina Árabe utilizada como outgroup. O DNA foi obtido por meio de amostras sangüíneas. Foram utilizados 15 loci microssatélites, sendo eles, ASB02, AHT04, ASB17, ASB23, COR07, COR58, COR82, HMS03, HMS07, HMS45, HTG07, LEX73, TKY312, TKY344, UCDEQ425, amplificados pela PCR. Os loci TKY312 e TKY344 não são recomendados pela FAO e ISAG para o estudo da diversidade de asininos no MoDAD. Para amplificação dos fragmentos utilizou-se sistemas multiplex e seqüenciador automático de DNA. Os programas GeneScan 2.0 e Genotyper 2.1 foram utilizados para a genotipagem dos alelos observados (ALMEIDA, 2009).
No estudo citado foram calculadas He, Ho, PIC e a probabilidade de exclusão média e verificado o EHW. Gerou-se um dendrograma a partir da distância genética (DA) pelos algoritmos de agrupamento Neighbor-Joining (NJ), utilizando o programa SplitsTree4 (HUSON & BRYANT, 2006) e baseando-se nos genótipos dos 15 locus microssatélites, os indivíduos foram agrupados em determinadas populações pela metodologia Bayesiana no programa STRUCTURE (PRITCHARD et al., 2000). Os testes foram baseados no modelo de miscigenação (ALMEIDA, 2009).
Os locus genotipados foram polimórficos para todas as raças, exceto a raça Pêga que apresentou um alelo para o locus ASB17. O número médio de alelos por locus foi 6,07 e o número total de alelos para todos os locus analisados foi 91. As heterozigosidades esperadas para cada locus foram maiores que as heterozigosidades observadas, variando de 0,08 (ASB17) a 0,787 (AHT04), enquanto a heterozigosidade observada variou de 0,038 (ASB17) a 0,757 (HTG07). Os locus que apresentaram equilíbrio de Hardy-Weinberg foram HMS3, HTG07, COR82, HMS07, UCDEQ425, HMS45, TKY312, AHT04, ASB23. O locus HGT07 apresentou a menor estimativa de endogamia (0,1018) e a maior estimativa foi para o locus ASB17 (0,3616) (ALMEIDA, 2009).
Entre todas as raças foram observados valores significativos de diferenciação genética. Os índices estimados de diversidade para cada raça
demonstraram um número médio de seis alelos. As raças locais apresentaram maior diversidade que a raça eqüina Árabe, com as maiores médias de riqueza alélica (acima de 8,5), conforme a Tabela 5. A avaliação do desempenho forense dos 15 marcadores indicou que para a maioria dos locus demonstrou um padrão consistente de poder de exclusão de paternidade, com 99,85% de probabilidade de excluir um provável parental em testes onde o provável pai e/ou mãe e a cria são conhecidos (ALMEIDA, 2009).
TABELA 5 - Número de indivíduos (N), riqueza alélica (AR), média do número de alelos por locus considerando-se o número amostral (i.e), heterozigosidade observada (Ho), heterozigosidade esperada (He), coeficiente de endogamia (FIS)
Raça N AR He (s.d.) Ho (s.d.) FIS
Jumento Brasileiro 74 9,067 0,4986 (0,0508) 0,5201 (0,0159) -0,044 Jumento Nordestino 65 8,838 0,5668 (0,0534) 0,4953 (0,0174) 0,127 Jumento Pêga 48 8,773 0,4657 (0,0600) 0,4611 (0,0199) 0,01 Eqüino Árabe (outgroup) 28 7,822 0,6721 (0,0472) 0,5681 (0,0280) 0,159 Fonte: ALMEIDA (2009)
A raça Nordestina apresentou o maior número de alelos e o maior coeficiente de endogamia, fato que pode ser justificado pela diminuição de 75% de sua população na década de 80. O FIS desta raça demonstra que se faz necessário manter a máxima variabilidade existente nesta população por meio de alternativas como a troca de reprodutores entre as propriedades, criação de núcleos de conservação animal, coleta de germoplasma e criopreservação (ALMEIDA, 2009).
As maiores distâncias genéticas foram observadas entre as raças Brasileira e Nordestina, enquanto as menores distâncias foram observadas entre as raças Pêga e Nordestina (Tabela 6) (ALMEIDA, 2009).
TABELA 6 - Estimativa aos pares de diferenciação genética e distância genética entre as três raças de asininos e a raça eqüina Árabe. As estimativas de FST encontram-se acima na diagonal e abaixo se encontra a identidade genética de Nei’s. Todas as estimativas de FST foram significativas (p<0,01)
Raça Eqüino Árabe J. Brasileiro J. Nordestino J. Pêga Eqüino Árabe ─ 0.3184 0.2867 0.3348 J. Brasileiro 0.3919 ─ 0.1451 0.1322 J. Nordestino 0.3582 0.8028 ─ 0.0656 J. Pêga 0.3739 0.8497 0.9169 ─ Fonte: ALMEIDA (2009)
Construiu-se um dendrograma a partir da reconstrução filogenética pelo método de agrupamento UPGMA com base na matriz de distância genética (Figura 5) (ALMEIDA, 2009).
FIGURA 5 - Dendrograma construído utilizando o método de UPGMA a partir dos 15 locus analisados. EA: Eqüino Árabe. JB: Jumento Brasileiro. JP: Jumento Pêga. JN: Jumento Nordestino
Fonte: ALMEIDA (2009)
Conforme está apresentado na Figura 6, o agrupamento com K=2 diferenciou as espécies asininas e eqüina, enquanto K=5 discriminou todas as populações, demonstrando uma sub-estruturação na população de jumentos Nordestinos, onde cada um dos 215 animais está representado por uma linha vertical dividida em segmentos classificados de acordo com a cor e tamanho
correspondente à proporção relativa do genoma do animal correspondendo a um agrupamento particular (ALMEIDA, 2009).
FIGURA 6 - Agrupamento individual dos 215 indivíduos das três raças asininas e da raça eqüina Árabe, pelo método estatístico Bayesiano utilizando o programa STRUCTURE. EA: Eqüino Árabe, JB: Jumento Brasileiro, JN: Jumento Nordestino e JP: Jumento Pêga
Fonte: ALMEIDA (2009)
2.3 Diversidade genética
A importância de se verificar a diversidade ou variabilidade genética intra e inter-raciais se fundamenta no fato de que para realizar a conservação de recursos genéticos animais deve-se manter a variabilidade genética intra-racial para evitar a erosão genética e inter-racial para evitar a extinção das raças (GAMA, 2004).
A utilização de marcadores moleculares para a caracterização genética tem sido uma ferramenta eficaz para quantificação da diversidade genética de animais domésticos (MENEZES et al., 2006).
A diversidade das espécies domésticas reflete-se na quantidade de raças existentes e na variação dentro de cada raça (EGITO et al., 2002). O método mais utilizado para realizar a quantificação da diversidade genética é a análise de genótipos de indivíduos que não sejam aparentados entre si, que sejam por sua vez, selecionados da população que esteja sendo investigada (GROENEN et al., 2003).
Os níveis determinantes da diversidade gênica de uma espécie são a heterozigosidade, que representa a variação genética dentro do indivíduo, diferenças genéticas entre indivíduos dentro de uma população e diferenças genéticas entre populações (OLLIVIER & FOULLEY, 2005).
3 CONSIDERAÇÕES FINAIS
A caracterização genética de raças é fundamental para que se possa conhecer a estrutura genética de raças e espécies, com vistas a auxiliar na investigação da diversidade genética entre populações e dentro delas, para que se utilize a conservação animal de forma precisa e eficiente com animais que realmente apresentam diversidade genética e que são fundamentais ao processo, diminuindo custos e esforços que não sejam necessários.
Os marcadores microssatélites tem apresentado resultados adequados e satisfatórios para a caracterização racial, facilitando o estudo genético animal e proporcionando dados necessários sobre a genealogia, testes de paternidade, mapeamento genético e o estudo de árvores filogenéticas, fundamentais aos programas de seleção e conservação de recursos genéticos animais.
REFERÊNCIAS
1 ALMEIDA, L. D. Diversidade genética de raças asininas criadas no Brasil, baseada na análise de locos microssatélites e DNA mitocondrial. 2009. 83 f. Dissertação de Mestrado. Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária, Universidade de Brasília, Brasília.
2 AMARANTE, M. R. V.; WOMACK, J. E. Marcadores moleculares mapeados no cromossomo Y bovino, com emprego do painel de células somáticas híbridas irradiadas (WG-RH). In: SIMPÓSIO DA SOCIEDADE BRASILEIRA DE MELHORAMENTO ANIMAL, 5. 2004, Pirassununga, Anais... Pirassununga: SBMA, 2004.
3 BARBOSA, A. C. O. F. Avaliação de critérios de compatibilidade entre pares de primers para otimização de sistemas multiplex de genotipagem. 2010. 75 f. Dissertação (Mestrado em Biologia: Biologia Celular e Molecular) – Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Goiás, Goiânia, 2010.
4 BELKHIR, K. Gnetix: logiciel sous Windows TM pour la genétique des populations. Laboratoire Genóme, Populations, Interations. CNRS UPR 9060. 1999.
5 BOROVIK, C.L.; TAJARA E.; ROCHA J.C.; FARAH L.M.S.; NACCACHE N.F.; NETTO R.C.M.; JOFFE R. Guia de boas práticas laboratoriais em citogenética e genética molecular humana: comitê de normatização e recomendações para procedimentos utilizados em laboratórios que prestam serviços na área de genética humana. Sociedade Brasileira de Genética. Disponível em: http://www.sbg.org.br. Acesso em: 12 set. 2011.
6 BOTSTEIN, D.; WHITE, R.L.; SKOLMICK, H. et al. Construction of a genetic linkage map in man using restriction fragment lenght polymorphisn. American Journal of Human Genetics, v.32, p.314-331, 1980.
7 BRONDANI, R. P. V.; BRONDANI, C.; TARCHINI, R.; GRATTAPAGLIA, D. Development, characterization and mapping of microsatellite markers in
Eucalyptus grandis and E. urophylla. Theoretical and Applied Genetics, v. 97,
p.816-827, 1998.
8 COELHO, E. G. A.; OLIVEIRA, D. A. A.; TEIXEIRA, C. S.; SAMPAIO, I. B. M.; RODRIGUES, S. G.; ALVES, C. Comparação entre métodos de estocagem de DNA extraído de amostras de sangue, sêmen e pêlos e entre técnicas de extração. Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia, Belo Horizonte, v.56, n.1, p.111-115, 2004.
9 CURI, R. A.; LOPES, C. R. Teste de paternidade em bovinos. Biotecnologia Ciência e Desenvolvimento, n.21, p.40-45, 2001.
10 DUARTE, F. A. M.; PEREZ, A. M.; PENA, S. D.; BARROS, M. P. M.; ROSSI, E. O. A avaliação do DNA como Prova Forense. Ribeirão Preto: FUNPEC. 2001. 283p.
11 EGITO, A. A.; ALBUQUERQUE, M. S. M.; MARIANTE, A. S. Situação atual da caracterização genética animal na Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia. SIMPÓSIO DE RECURSOS GENÉTICOS PARA A AMÉRICA LATINA E CARIBE, 1., 1999. Brasília. Anais... Brasília: Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, 1999.
12 EGITO, A. A.; ALBUQUERQUE, M. S.; MARIANTE, A. S. Caracterização genética de raças naturalizadas. In: SIMPÓSIO DE RECURSOS GENÉTICOS PARA AMÉRICA LATINA E CARIBE, 3., 2001, Londrina. Anais... Londrina: Instituto Agronômico do Paraná, 2001. p.121-126.
13 EGITO, A. A.; MARIANTE, A. S.; ALBUQUERQUE, M. S. M. Programa brasileiro de conservação de recursos genéticos animais. Archivos de Zootecnia, Córdoba, v.51, p.39-52, 2002.
14 EGITO, A. A.; PAIVA, S. R.; ALBUQUERQUE, M. S. M.; ABREU, U. G. P.; McMANUS, C.; CASTRO, S. T. R.; MARIANTE, A. S.; GRATTAPAGLIA, D. Desempenho de marcadores de DNA para determinação de parentesco na raça bovina Pantaneira. In: REUNIÃO ANUAL DA SOCIEDADE BRASILEIRA DE ZOOTECNIA, 42., 2005, Goiânia. Anais... Goiânia: SBZ, 2005.
15 ELLEGREN, H. Microsatellites: simple sequence with complex evolution. Nature, v.5, p.438-445, 2004.
16 FABUEL, E.; BARRAGÁN, C.; SILIÓ, L.; RODRÍGUEZ, M. C.; TORO, M. A. Analysis of genetic diversity and conservation priorities in Iberian pigs based on microsatellite markers. Heredity, v.93, p.104-113, 2004.
17 FALEIRO, F. G. Marcadores genético-moleculares aplicados a programas de conservação e uso de recursos genéticos. Planaltina: Embrapa Cerrados, 2007. 102 p.
18 FAO. Guidelines for Development of National Management of Farm Animal Genetic Resources Plans: Measurement of Domestic Animal Genetic Diversity (MoDAD): recommended microsatellite markers. Rome, Italy. 2004. 58p.
19 FERREIRA, M. E.; GRATTAPAGLIA, D. Introdução ao uso de marcadores moleculares em análise genética. 3.ed. Brasília: Embrapa-Cenargen, 1998. 220p.
20 FONTEQUE, G. V. Investigação da variabilidade genética de quinze loci de microssatélites em galinhas caipiras brasileiras de ovos azuis. 2011. 51 f. Dissertação (Mestrado em Ciência Animal) - Universidade do Estado de Santa Catarina, Lages-SC.
21 GAMA, L. T. Manutenção da variabilidade genética em programas de seleção. In: SIMPÓSIO INTERNACIONAL DE CONSERVAÇÃO DE RECURSOS GENÉTICOS (RAÇAS NATIVAS PARA O SEMI-ÁRIDO), 1., 2004, Recife. Anais… Recife: 2004. p.38-44.
22 GARCIA, J. F. Practical considerations of embryo manipulation: preimplantation genetic typing. Theriogenology, v.56, p.1393-1399, 2001.
23 GARCIA, J. F. Biotecnologia da reprodução em bovinos. In: SIMPÓSIO INTERNACIONAL DE REPRODUÇÃO ANIMAL APLICADA, 2. 2006, Londrina. Anais... Londrina: II Simpósio Internacional de Reprodução Animal Aplicada, 2006. p.195-201.
24 GARCIA, J. F. e PORTO-NETO, L. P. Uso de marcadores moleculares em programas de transferência de embriões. Acta Scientiae Veterinariae, v.34, Sup. 1, p.197-203, 2006.
25 GROENEN, M. A. M.; JOOSTEN, R.; BOSCHER, M-Y.; AMIGUES, Y.; RATTINK, A.; HARLIZIUS, B.; VAN DER POEL, J. J.; CROOIJMANS, R. The use of microsatellite genotyping for population studies in the pig using individual and pooled DNA samples. Archivos de Zootecnia, Córdoba, v.52, p.145-155, 2003.
26 HUSON, D. H.; BRYANT, D. Application of phylogenetic networks in evolutionary studies. Molecular Biology and Evolution, v.23, n.2, p.254-267, 2006.
27 KASHYAP, V.K.; SITALAXIMI T.; CHATTOPADHYAY P.; TRIVEDI R. Dna Profiling Technologies in Forensic Analysis. International Journal Human Genetics, v.4, n.1, p.11-30, 2004.
28 KOCH, A. C.; ANDRADE, F. M. A utilização de técnicas de biologia molecular na genética forense: uma revisão. Revista Brasileira de Análises Clínicas, v.40, n.1, p.17-23, 2008.
29 KUMAR, D. DNA markers for the differentiation of farm animal breeds. In: SAHAI, R.; VIJH, R. K. (Ed). Domestic Animal Diversity: Conservation and sustainable development. Karnal: SI Publications, 2000. p.305-312.
30 LITT, M.; LUTY, J. A. A hypervariable microsatellite revealed by in vitroamplification of a dinucleotide repeat within the cardiac muscle actin gene. American Journal of Human Genetics, v.44, n.3, p.397-401, 1989.
31 MARTÍNEZ, A. M.; ACOSTA, J.; VEJA-PLA, J. L.; DELGADO, J. V. Analysis of the genetic structure of the canary goat populations using microsatellites. Livestock Science, v.102, p.140-145, 2006.
32 MAUDET, C.; LUIKART, G.; TABERLET, P. Genetic diversity and assignment tests among seven French cattle breeds based on microsatellite DNA analysis. Jornal of Animal Science, v.80, p.942-950, 2002.
33 MENEZES, M. P. C. Variabilidade e relações genéticas entre raças caprinas nativas brasileiras, ibéricas e canárias. 2005. 110 f. Tese (Doutorado Integrado em Zootecnia) - Universidade Federal da Paraíba, Universidade Rural de Pernambuco e Universidade Federal do Ceará, Areia-PB.
34 MENEZES, M. P. C.; MARTINEZ, A. M.; RIBEIRO, M. N.; PIMENTA FILHO, E. C.; DELGADO BERMEJO, J. V. Caracterização genética de raças caprinas nativas brasileiras utilizando-se 27 marcadores microssatélites. Revista Brasileira de Zootecnia, Viçosa, v.35, n.4, p.1336-1341, 2006.
35 MILACH, S. C. K. Marcadores de DNA. Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento, Ano 1, n.5, 1998.
36 NEI, M. Analysis of gene diversity in subdivided populations. Proceedings of the National Academy of Sciences, v.70, n.12, Part I, p.3321-3323, 1973.
37 OLLIVIER, T. L.; FOULLEY, J. L. Aggregate diversity: New approach combining within-and between-breed genetic diversity. Livestock Production Science, Amsterdam, v.95, p.247-254, 2005.
38 PRITCHARD, J. K.; STEPHENS, M.; DONNELLY, P. Inference of population structure using multilocus genotype data. Genetics, v.155, n.2, p.945-959, 2000.
39 RANGEL, P. N.; BRONDANI, R. P. V.; GARCIA, R. A. V.; PELOSO, M. J.; BRONDANI, C.; BLAIR, M. Desenvolvimento e aplicações de sistemas de genotipagem muitiloco semi-automatizados baseados em marcadores microssatélites para feijoeiro. CONAFE, 2005.
40 SILVA, P. V. C. Caracterização genética de javalis por meio de marcadores microssatélites. 2007. 51 f. Dissertação (Mestrado em Genética e Melhoramento Animal) - Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, Universidade Estadual Paulista Julio de Mesquita Filho, Jaboticabal.
41 STRACHAN, T.; READ, A. P. Genética Molecular Humana. 2.ed. Porto Alegre: Artmed, 2002. 576p.
42 STRYER, L. Bioquímica. 4.ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 1996. 1000p.
43 VOET, D.; VOET, J.; PRATT, C. W. Fundamentos de Bioquímica. Porto Alegre: Artmed, 2002. 931p.
44 VIEIRA, D. P. Técnicas de PCR: Aplicações e Padronização de Reações. Disponível em: http://www.etall.hpg.ig.com.br/aula1b.pdf. Acesso em: 11 set. 2011.
45 ZAHA, A.; SCHRANK, A.; LORETO, E.; FERREIRA, S.; HENRIQUE B.; SCHRANK, I. S. Biologia Molecular Básica. 3.ed. Porto Alegre: Mercado Aberto, 2003. 421p.
