TÍTULO: EFEITO DA ALDOSTERONA SOBRE A APOPTOSE NO CÓRTEX RENAL (IN VIVO) TÍTULO:
CATEGORIA: CONCLUÍDO CATEGORIA:
ÁREA: CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E SAÚDE ÁREA:
SUBÁREA: MEDICINA VETERINÁRIA SUBÁREA:
INSTITUIÇÃO: UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO INSTITUIÇÃO:
AUTOR(ES): FERNANDA NASTRI GOUVÊA AUTOR(ES):
ORIENTADOR(ES): DEISE CARLA ALMEIDA LEITE DELLOVA ORIENTADOR(ES):
COLABORADOR(ES): GIOVANA KREMPEL FONSECA MERIGHE, KELLY PRISCILA PANDOLFI, PAULA IRUSTA FERREIRA, SANDRA APARECIDA DE OLIVEIRA
Efeito da aldosterona sobre a apoptose no córtex renal (in vivo)
1. RESUMO
A aldosterona pode participar da progressão da doença renal, uma vez que estudos correlacionam o aumento nos níveis circulantes deste mineralocorticóide ao surgimento de injúrias ao tecido renal e um dos possíveis mecanismos envolvidos nesse cenário é a apoptose. Neste estudo, a apoptose foi detectada no rim de ratos (pela técnica de TUNEL), após o tratamento com a aldosterona e/ou espironolactona, por 21 dias. A aldosterona aumentou o número de células em apoptose na região cortical renal e este efeito foi antagonizado pela espironolactona, sugerindo a participação do receptor MR no efeito hormonal.
Palavras-chave: aldosterona, apoptose, TUNEL, MR.
2. INTRODUÇÃO
A aldosterona é um importante hormônio secretado pela zona glomerulosa do córtex da glândula adrenal e o controle da secreção deste mineralocorticoide se faz por variações na concentração plasmática dos íons potássio e sódio, pelos reguladores do sistema renina-angiotensina-aldosterona (SRAA) e pelo hormônio adrenocorticotrófico (ACTH) (ELIAS et al., 2012).
O mecanismo de ação clássico da aldosterona ocorre pela sua ligação com o receptor para mineralocorticoides (MR) no citoplasma celular, e então, o complexo aldosterona-MR é translocado para o núcleo celular, onde atua como um fator de transcrição para proteínas, envolvidas principalmente com o transporte iônico (GOOD, 2007).
Além do importante papel fisiológico, a aldosterona tem atraído à atenção devido a sua participação na progressão da lesão renal, uma vez que estudos apontam o envolvimento deste hormônio e do receptor MR em processos patológicos que incluem: proteinúria, inflamação, remodelação e fibrose, em diversos órgãos alvo, como os rins, vasos e coração (FOURKIOTIS et al., 2012; GÜICHARD et al., 2013; RAFIQ et al., 2011). Já há algum tempo, a apoptose tem
sido associada com a perda progressiva de células renais e o desenvolvimento de nefropatias (SUGIYAMA et al., 1996).
Alguns autores relataram que os hormônios esteróides podem induzir a apoptose em diferentes tecidos (DORSCHEID et al. 2001; ELMORE, 2007). MATHEW e colaboradores (2008), PATNI e colaboradores (2007) e CHEN e colaboradores (2009) demonstraram que a aldosterona pode causar a apoptose em células mesangiais renais, em células do túbulo proximal e em podócitos, respectivamente, e que o antagonismo ao MR atenuou (mesmo que parcialmente) os efeitos pró-apoptóticos deste hormônio.
A compreensão do papel exato da aldosterona, principalmente de sua participação no estímulo da apoptose, aguarda esclarecimentos, e o entendimento deste mecanismo em condições de doença é importante, pois pode fornecer pistas sobre a patogênese da doença renal e novas formas de tratamento.
3. OBJETIVOS
O presente estudo teve por objetivo avaliar o efeito da aldosterona, sobre a indução de apoptose no tecido renal (in vivo), verificando também a participação do receptor MR no efeito hormonal.
4. METODOLOGIA
Os experimentos foram realizados em ratos da linhagem Wistar (250 - 300 g), tratados com aldosterona e/ou espironolactona (antagonista competitivo do receptor MR) por 21 dias, ou que não receberam tratamento (grupo controle ou Sham). Em lâminas histológicas, observou-se a apoptose na região cortical renal, por meio da marcação do DNA fragmentado, utilizando a técnica de TUNEL. Os procedimentos experimentais foram submetidos e aprovados pelo Comitê de Ética no Uso de Animais, antes do início das atividades.
5. DESENVOLVIMENTO
5.1. Tratamentos
O tratamento com aldosterona (150 µg/Kg/dia) (grupo aldo) foi feito por meio do implante de minibombas osmóticas na região cervical dorsal (sob anestesia geral) e a administração da espironolactona (20 mg/Kg/dia) (grupo espiro) foi feita na água de bebida. Os ratos do grupo aldo+espiro receberam os dois tipos de tratamento e os do grupo Sham foram submetidos ao procedimento fictício para implante das mini bombas osmóticas.
Após 21 dias, os ratos foram devidamente anestesiados com tiletamina-zolazepan e xilazina; em seguida, realizou-se a laparotomia mediana para o acesso aos rins, que foram perfundidos com PBS e uma solução contendo paraformaldeído 16%. Após a lavagem e fixação, as amostras de tecido renal foram coletadas e parafinadas para a composição das lâminas histológicas.
5.2. Técnica TUNEL (Terminal Deoxyribonucleotide Transferase
(TdT)-mediated dUTP Nick-end Labeling)
A detecção da apoptose foi realizada por meio de um kit (de detecção de morte celular in situ (DeadEnd™ Fluorometric TUNEL, Promega®) de acordo com as orientações do fabricante. Resumidamente, a marcação do DNA fragmentado em células apoptóticas se faz pela incorporação da fluoresceína no final da fita de DNA, utilizando a enzima deoxinucleotídeo terminal transferase. A fluoresceína envolve o DNA fragmentado e permite a visualização do mesmo em microscópios de fluorescência. O procedimento começou com a desparafinização e hidratação dos cortes histológicos do tecido renal, como uso de xilol e diferentes concentrações de álcool etílico (100%, 95%, 85%, 70% e 50%), respectivamente. Depois, as lâminas foram secas e, na sequência, o tecido foi tratado com proteinase K (20 µg/mL) e lavado com uma solução de PBS. Por último, o tecido renal foi incubado com o reagente de TUNEL (Promega®), à 37ºC (em atmosfera umidificada), por 60 min. As amostras foram analisadas utilizando a microscopia de fluorescência (Axio Scope.A1 – Zeiss®), na faixa de excitação de 450-500nm e de detecção de 515-565nm (verde).
5.3. Análise estatística
A apoptose foi quantificada na região cortical, a partir da contagem aleatória de células TUNEL positivas (Figura 1) (3 campos de 40X/rato, em cada grupo). As comparações estatísticas foram feitas pelo teste Bonferroni (p<0,05), com o auxílio do programa GraphPad Prism 5®.
6. RESULTADOS
O grupo tratado com aldosterona apresentou aumento em 42% na contagem de células TUNEL positivas na região do córtex renal, em relação ao grupo Sham (Figuras 1B e 2). O tratamento com a espironolactona, um antagonista do mineralocorticóide, sozinho, não levou ao aumento da contagem das células TUNEL positivas (Figuras 1C e 2), em relação ao grupo Sham, mas reverteu o efeito da aldosterona (Figuras 1D e 2).
Figura 1. Detecção de células TUNEL positivas (em apoptose) no córtex renal, por microscopia de fluorescência. A. Situação controle (Sham): no detalhe (seta), 1 célula TUNEL positiva em glomérulo; B. Tratamento com aldosterona: observa-se o aumento da marcação fluorescente (células em apoptose) no glomérulo; C.
D
C
Tratamento com espironolactona: a contagem das células TUNEL positivas foi semelhante ao Sham. D. Tratamento concomitante com aldosterona e espironolactona: nota-se a redução do número de células TUNEL positiva, em relação ao tratamento com aldosterona. 40 X.
Figura 2. Número de células TUNEL positivas (em apoptose) na região cortical renal de rato (in vivo), de acordo com o tratamento: Sham, espironolactona (espiro, 20 mg/Kg/dia), aldosterona (aldo, 150 ug/Kg/dia) e aldosterona mais espironolactona (aldo + espiro). *p<0,001 vs. Sham. &p<0,001 vs. aldo. N=4. 40X.
7. CONSIDERAÇÕES FINAIS
Estes resultados indicam que a aldosterona foi capaz de induzir a apoptose no córtex renal de ratos, assim como observado por LIANG et al. (2011). Este efeito da aldosterona parece ser dependente do receptor mineralocorticóide, uma vez que foi antagonizado pela espironolactona.
8. FONTES CONSULTADAS
CHEN C., LIANG W., JIA J., VAN GOOR H., SINGHAL P.C., DING G.; Aldosterone induces apoptosis in rat podocytes: role of PI3-K/Akt and p38MAPK signaling pathways. Nephron Experimental Nephrology, 113, pp. e26–e34, 2009.
DORSCHEID D.R., WOJCIK K.R., SUN S., MARROQUIN B., WHITE S.R.; Apoptosis of Airway Epithelial Cells Induced by Corticosteroids. American Journal of
ELIAS L.L.K., ROSA F.F., ANTUNES-RODRIGUES J., CASTRO M.; Glândula Adrenal. In: AIRES MM. Fisiologia, 4º ed. Rio de Janeiro, Guaabara Koogan, 2012, pp. 1079-1095.
ELMORE S.; Apoptosis: a review of programmed cell death. Toxicologic Pathology, 35(4): 495–516. 2007.
FOURKIOTIS V.G., HANSLIK G., HANUSCH F., LEPENIES J., QUINKLER M.; Aldosterone and the kidney. Hormone and Metabolic Research, 44:194–201, 2012. GOOD D.W.; Nongenomic actions of aldosterone on the renal tubule. Hypertension, 49: 728–739, 2007.
GÜICHARD J.L., CLARK D.3rd, CALHOUN D.A., AHMED M.I.; Aldosterone receptor antagonists: current perspectives and therapies. Vascular Health and Risk Management, 9:321-31, 2013
LIANG W. et al. Disparate effects of eplerenone, amlodipine and telmisartan on podocyte injury in aldosterone-infused rats. Nephrology Dialysis Transplantation, 26:789–799, 2011.
MATHEW, J.T., PATNI H., CHAUDHARY, A.N., LIANG, W., GUPTA, A., CHANDER, P.N., DING, G., SINGHAL, P.C.; Aldosterone induces mesangial cell apoptosis both in vivo and in vitro. American Journal of Physiology - Renal Physiology, 295: F73– F81. 2008.
PATNI H., MATHEW J.T., LUAN L., FRANKI N., CHANDER P.N., SINGHAL P.C.; Aldosterone promotes proximal tubular cell apoptosis: role of oxidative stress.
American Journal of Physiology - Renal Physiology, 293:F1065–F1071, 2007.
RAFIQ K., HITOMI H., NAKANO D., NISHIYAMA A.; Pathophysiological roles of aldosterone and mineralocorticoid receptor in the kidney. Journal of Pharmacology Sciences, 115:1-7, 2011.
SUGIYAMA H., KASHIHARA N., MAKINO H., YAMAZAKI Y., OTA Z.: Apoptosis in glomerular sclerosis. Kidney International, 49: 103–111, 1996.
