Fermentação de Lactobacillus plantarum em soro de tofu para produção
de exopolissacarídeos
Alceu Alves Azambuja
Trabalho
apresentado
à
disciplina
BIO7016
–
Trabalho de Conclusão de
Curso, como requisito para
conclusão
do
Curso
de
Graduação em Bacharelado
em Ciências Biológicas.
ORIENTADOR: Márcio José Rossi
COORIENTADOR: Carla Maísa Camelini
Florianópolis
2014
Azambuja, A.A.
Fermentação de Lactobacillus plantarum para produção de exopolissacarídeos [TCC]. Alceu Azambuja; Orientador, Márcio José Rossi - Florianópolis, SC, 2014.
58 p.
Trabalho de Conclusão de Curso - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas. Curso de Ciências Biológicas.
1. Bactéria ácido lática. 2. Cultivo submerso. 3. Concentração. 4. Nanofiltração I. Rossi, Márcio José. II. Universidade Federal de Santa Catarina. Curso de Ciências Biológicas. III. Fermentação de Lactobacillus plantarum para produção de exopolissacarídeos.
Alceu Alves Azambuja
Fermentação de Lactobacillus plantarum em soro de tofu para produção
de exopolissacarídeos
Este Trabalho de Conclusão de Curso foi julgado para obtenção do Título de
“Bacharel em Ciências Biológicas”, e aprovado em sua forma final pelo Curso
de Ciências Biológicas.
Florianópolis, 24 de fevereiro de 2014.
__________________________________
Profa Dra Maria Risoleta F. Marques
Coordenadora do Curso de Ciências Biológicas
BANCA EXAMINADORA
__________________________________
Dr. Márcio José Rossi
Presidente
__________________________________
Dr. José Miguel Müller
Examinador
__________________________________
MSc. Douglas Henrique Cardoso Cortez
AGRADECIMENTOS
Gostaria de agradecer a todos aqueles que participaram de minha
jornada acadêmica.
Aos grupos SIMBIOSIS, AISEC Florianópolis, ao DMS, a FEJESC, a
Liga Empreendedora Florianópolis, a Voe Ideias e a Agência Veterana.
Aos meus amigos Bia, Vandy, Bidu, Benito, Thiago, Renato, Cris,
João, Brunão, Leticia, Uchoa, Fran, Ana e Fe. Aos meus irmãos e camaradas
da Frat. πkAu Gustavo, Raphael, Lucas, Luan e Ziemath.
E um agradecimento muito especial à Carla, que colaborou com todo
seu conhecimento e paciência na produção deste trabalho, à minha mãe
Valquiria que teve a sorte de ter um filho como eu, minha irmã Karine que
apesar dos pesares nos damos bem, ao meu padrasto Tio Sérgio que a mais de
10 anos é meu paizão e à minha afilhada Iris.
Resumo
Os alimentos funcionais podem trazer benefícios fisiológicos específicos, além
da propriedade de alimentar e nutrir, graças à presença de ingredientes
fisiologicamente saudáveis, como os probióticos e prebióticos. Dentre os
probióticos está o Lactobacillus plantarum, que pertence ao grupo das
bactérias ácido láticas (BAL). A obtenção de energia desses microrganismos
ocorre pela fermentação de carboidratos produzindo ácido lático, e também
exopolissacarídeos (EPS) no meio de cultivo. Os EPS apresentam aplicações
tecnológicas consideráveis, que se destacam em setores da indústria de
alimentos, sendo amplamente utilizados por suas propriedades prebióticas.
Para explorar a obtenção dos EPS foi estabelecido um processo de produção de
biomassa de L. plantarum em biorreator Airlift com controle das variáveis de
processo, que permitiu a padronização dos EPS obtidos. O cultivo foi realizado
em dois substratos líquidos, meio MRS e soro de tofu suplementado (STS),
inoculado em um escalonamento de 10% do volume final. Para concentração
dos EPS empregou-se a técnica de nanofiltração e para a separação foi
realizada precipitação com etanol. O cultivo controlado em biorreator permitiu
obter um rendimento em biomassa de 2,7 g.L
-1e 3,2 g.L
-1, de EPS de 210
mg.L
-1e 350 mg.L
-1nos meios MRS e STS, respectivamente. No processo de
nanofiltração a 35 °C e 6 bar foi obtido o extrato concentrado no final do
processo com FRV 4,0 e aumento de 80 % dos teores de EPS presentes no
concentrado. Verificou-se que a maior parte da resistência ao fluxo foi causada
pela camada polarizada de 59,37 %, seguida da resistência pela membrana de
39,8 %, enquanto a resistência devido ao fouling foi responsável por apenas
0,83 % da resistência total. Verificou-se que a utilização de soro de tofu
Palavras-chave: bactérias ácido láticas, cultivo submerso, nanofiltração,
concentração
Abstract
Functional foods can have specific physiological benefits, in addition to the
property of feed and nurture, thanks to the presence of physiologically healthy
ingredients, such as prebiotics and probiotics. Among the probiotic ones is
Lactobacillus plantarum, a bacteria belonging to lactic acid bacteria (LAB)
group. In these microorganisms, energy obtention happens by fermenting
carbohydrates into lactic acid and exopolysaccharides (EPS) on culture media.
EPS present considerable technological applications that stand out in food
industry, being widely used for its prebiotic properties. In order to explore EPS
obtention a biomass production process for L. plantarum was set up in an airlift
bioreactor, with process control, allowing EPS production standardization.
Cultivation was performed in two liquid substrates, MRS medium and
supplemented tofu whey (STS), inoculated in a scaling of 10% of the final
volume. For EPS concentration, a nanofiltration technique was used and for
separation ethanol precipitation was used. Controlled cultivation in bioreactor
allowed for yield values of 2.7 g.L
-1and 3.2 g.L
-1(biomass) and 210 mg.L
-1and 350 mg.L
-1(EPS) in MRS and STS, respectively. At the end of the
nanofiltration process at 35°C and 6 bar, a concentrated extract was obtained
with VRF 4.0 and an 80 % increase on EPS content. It was verified that most
of flow resistance was caused by the polarized layer (59.37 %), followed by
membrane resistance (39.8 %), while fouling resistance was responsible for
only 0.38% of total resistance. Thus, it was observed that supplemented tofu
serum increased EPS production and nanofiltration process was efficient for
concentration of these prebiotic compounds from L. plantarum culture media.
Lista de Tabelas e Figuras
Tabela 1 Composição do soro de tofu (ST).
Tabela 2 Composição dos meios de cultura caldo nutriente (CN), Man Rogosa
e Sharpe (MRS) e soro de tofu suplementado (STS).
Figura 1 Análise de parâmetros de crescimento do L. plantarum no meio MRS.
Figura 2 Análise de parâmetros de crescimento do L. plantarum no meio STS.
Figura 3 Variação da concentração de oxigênio dissolvido e vazão de ar
durante o cultivo do L. plantarum em biorreator Airlift. Meio de cultura MRS.
Figura 4 Variação da concentração de oxigênio dissolvido e vazão de ar
durante o cultivo do L. plantarum em biorreator Airlift. Meio de cultura STS.
Figura 5 Análise do µ
xe µ
EPSdo cultivo de L. plantarum no meio de cultura
MRS.
Figura 6 Análise do µ
xe µ
EPSdo cultivo de L. plantarum no meio de cultura
Figura 8 Fluxo de permeado em função da temperatura de processamento sobre
a água e o extrato do cultivo de L. plantarum em STS.
Figura 9 Fluxo de permeado em função da pressão de processamento sobre a
água e o extrato do cultivo de L. plantarum em STS.
Figura 10. Concentração de EPS ao longo do processo de nanofiltração em
STS.
Figura 11. Média das duplicatas da concentração de EPS ao longo do processo
de nanofiltração em STS.
Figura 12. Percentual de resistência no fluxo de permeado causado pela
resistência total da membrana (Rt), resistência da membrana (Rm), resistência
do fouling (Rf), resistência por polarização (Rp).
Sumário
1.
Introdução ... 1
2. Objetivos ... 5
2.1 Objetivo Geral ... 5
2.2 Objetivo Específico ... 5
3 Revisão da literatura ... 7
3.1 Báctérias ácido láticas ... 7
3.2 Lactobacillus plantarum ... 8
3.3 Polissacarídeos... 10
3.4 Soro de tofu ... 12
3.5 Biorreator ... 13
3.6 Nanofiltração ... 15
4. Material e Métodos ... 17
4.1 Microrganismo... 17
4.2 Procedimentos de desinfecção e esterilização ... 17
4.3 Meios de cultura ... 18
4.4 Preparo do inóculo ... 19
4.5 Cultivo em biorreator Airlift ... 20
4.6 Separação das células ... 20
4.7 Concentração dos EPS ... 21
4.9.2 Determinação da biomassa ... 22
4.9.3 Determinação de glicose ... 23
4.9.4 Cálculo da velocidade especifica de crescimento e produção de EPS
... 24
4.9.5 Determinação dos EPS ... 24
4.9.6 Cálculo do fator de redução volumétrica ... 25
4.9.7 Cálculo das resistências da membrana de nanofiltração ... 26
5. Resultados e Discussão ... 29
5.1 Cultivo em biorreator e estudos cinéticos ... 29
5.2 Nanofiltração ... 35
6. Conclusões ... 45
1. Introdução
O interesse por diferentes produtos obtidos por meio de processos
biotecnológicos fermentativos utilizando microrganismos tem aumentado nos
últimos anos. Entre os produtos de relevante significância estão os alimentos
funcionais, nutracêuticos e os medicamentos obtidos de fontes naturais. Esses
produtos podem ser obtidos pela sua extração, utilização integral dos
microrganismos ou recuperação de sua biomassa principalmente na indústria.
Os alimentos funcionais são todos os alimentos ou bebidas que,
consumidos na alimentação cotidiana, podem trazer benefícios fisiológicos
específicos, graças à presença de ingredientes fisiologicamente saudáveis. As
substâncias biologicamente ativas encontradas nestes alimentos podem ser
classificadas como: probióticos e prebióticos.
Os probióticos são microrganismos não patogênicos que quando
administrados em quantidades adequadas exercem benefícios para a saúde do
hospedeiro, dentre estes incluem as bactérias ácido láticas (BAL). Essas
bactérias compreendem um grupo amplo de microrganismos, mas que
apresentam características morfológicas, metabólicas e fisiológias comuns.
Dentre essas características estão a capacidade de converter açúcares, ácidos
orgânicos, proteínas ou gorduras em componentes de sabor e aroma, além dos
metabólitos como o ácido lático e exopolissacarídeos (EPS).
Os EPS são fibras incluídas no grupo de prebióticos, que são definidos
como ingredientes de alimentos não digeríveis que podem beneficiar o
hospedeiro no sentido de selecionar a microbiota intestinal. O L. plantarum é
uma alternativa viável de utilização como probiótico e também como
prebiótico, pois secretam elevadas quantidades de EPS no meio de cultivo.
A fermentação desses microrganismos pode ser realizada em
biorreator com meios de cultura quimicamente definidos utilizados em
pesquisas de laboratório. Os nutrientes ideais para composição dos meios de
cultura para cultivo de BAL estão presentes na composição do meio elaborado
por Man, Rogosa & Sharpe (1960), denominado MRS. Porém, em escala
industrial, por razões econômicas, são utilizados substratos complexos de
composição variável, subprodutos de outras indústrias. Esses substratos devem
ser adaptados para o cultivo por meio de processos de extração, suplementação
e balanceamento da composição do meio visando aumentar o rendimento da
produção do microrganismo selecionado, utilizando experimentos de triagem
previamente ao cultivo em biorreatores.
Como alternativa ao meio MRS existe o soro de tofu, originado da
fabricação de “queijos” de soja, é um subproduto com baixa aplicação
industrial devido ao seu elevado conteúdo de água, mas com uma quantidade
considerável de sólidos totais, por esses motivos o resíduo pode ser utilizado
como substrato na fermentação de L. plantarum e obtenção de EPS.
O potencial desses produtos vem sendo explorado pelas indústrias de
alimentos, utilizando processos de separação e concentração. A separação de
polissacarídeos, de acordo sua massa molar, pode ser utilizada para purificação
de extratos brutos.
O processo de concentração por membranas tem sido amplamente
utilizado com a finalidade de manter a alta qualidade desses compostos. Esse
processo é baseado no princípio da permeação seletiva de moléculas através de
membranas. A nanofiltração faz uso de membranas com menores diâmetros de
poros, sendo mais eficiente na concentração dos polissacarídeos bioativos.
Nesse contexto, estudar a produção e extração de EPS em meios de
cultura que aproveitem resíduos da indústria alimentícia é extremamente
importante para o desenvolvimento e crescimento de setores da própria
indústria alimentícia.
2. Objetivos
2.1 Objetivo Geral
O presente trabalho teve como objetivo estabelecer processos eficientes de
produção e extração de EPS de L. plantarum cultivada em diferentes
substratos.
2.2 Objetivos Específicos
Verificar qual meio de fermentação proporciona maior rendimento na
produção dos EPS;
Determinar parâmetros de crescimento de L. plantarum visando a produção
de EPS;
Concentrar o extrato EPS de L. plantarum por nanofiltração em condições
ideais de operação;
Realizar a extração de EPS do meio de cultivo e quantificar seu teor no
concentrado e no permeado.
3 Revisão da literatura
3.1 Báctérias ácido láticas
As BAL compreendem um grupo amplo de microrganismos, que
apresentam características morfológicas, metabólicas e fisiológicas comuns.
Elas não são definidas sistematicamente com base em relações evolutivas, mas
sim em um grupo funcional utilizado por microbiologistas para as bactérias que
são inofensivas tanto para a qualidade alimentar quanto para a saúde humana e
que crescem espontaneamente fermentando alimentos (D’SOUZA et al., 2002).
São bactérias Gram-positivas, no formato de cocos, bacilos ou bacilos
cocóides, não esporulantes, geralmente imóveis. Pertencem a este grupo as
famílias Lactobacillaceae e Streptococcaceae. A obtenção de energia desses
microrganismos ocorre pela fermentação de carboidratos produzindo ácido
lático, podendo ser homo ou heterofermentativas. As homofermentativas
produzem ácido láctico como produto principal da fermentação da glicose e as
heterofermentativas produzem ácido lático em menor quantidade e também
produzem etanol e, em alguns casos, ácido acético e dióxido de carbono (CO
2)
(FRANCO, LANDGRAF, 1996; MASSAGUER, 2005).
Embora sua principal função quanto a conversão fermentativa dos
açúcares presentes nas matérias-primas seja a produção de ácido láctico, elas
são capazes de converter açúcares, ácidos orgânicos, proteínas ou gorduras em
peptídeos anti-microbianos e EPS, que se caracterizam por ser uma variedade
de metabólitos de propriedades importantes com componentes de sabor e
aroma característicos, e de melhorar a textura e a viscosidade de produtos
fermentados (DE VUYST, DEGEEST, 1999; RUAS-MADIEDO et al., 2002).
Os EPS produzidos por BAL apresentam aplicações tecnológicas
consideráveis que se destacam em alguns setores da indústria de alimentos,
sendo ainda amplamente utilizadas na produção de alimentos por suas
propriedades probióticas (TORINO et al., 2005).
Dentro das BAL tem o gênero Lactobacillus, que tem microrganismos
encontrados no intestino de seres humanos e outros animais, com seu número
variando de acordo com as espécies, a idade do hospedeiro ou a localização
dentro do intestino. Desses organismos apenas algumas espécies são
envolvidas em processos fermentativos industriais e residem no intestino
humano, sendo estas L. crispatus, L. gasseri, e L. plantarum (CATALOUK,
GOGEBAKAN, 2004).
3.2 Lactobacillus plantarum
Lactobacillus plantarum é uma espécie de bactéria do enorme e
diversificado gênero de Lactobacillus, que compreende cerca de 90 espécies.
Por tradição os indivíduos desse gênero foram divididos em três grupos
funcionais, dependendo das suas capacidades de fermentação, os
obrigatoriamente
homofermentativos
(Grupo
I),
os
facultativos
heterofermentativos (Grupo II) e os obrigatoriamente heterofermentativos
(Grupo III) (KANDLER, WEISS, 1986). Os indivíduos do Grupo I são capazes
de fermentar exclusivamente hexoses em ácido lático, enquanto que os do
Grupo II além de fermentarem hexoses em ácido lático são capazes de
fermentar pentoses e/ou glutamato. Já os pertencentes ao Grupo III fermentam
hexoses em ácido láctico, ácido acético e/ou etanol e dióxido de carbono.
O L. plantarum é facultativa heterofermentativa e se difere das demais
Lactobacillus spp. pois tem o genoma relativamente grande, o que indica a
capacidades para se adaptar a diversas condições diferentes (KLEEREBEZEM
et al., 2003). Inclui a capacidade de fermentar muitos carboidratos diferentes e
uma alta tolerância ao baixo pH (DAESCHEL, NES, 1995). Isso ocorre devido
ao fato do L. plantarum frequentemente predominarem nos alimentos de forma
espontânea e também sobreviverem à passagem através das condições ácidas
do estômago humano, onde o pH é geralmente inferior a 4,0 (JOHANSON et
al., 1993). Essa BAL também pode possuir atividade da tanase (OSAWA et al.,
2000; VAQUERO et al., 2004 ), e são capazes de metabolizar os ácidos
fenólicos (BARTHELMEBS et al., 2000; BARTHELMEBS et al., 2001).
Essa espécie de bactéria é versátil e encontrada em uma variedade de
nichos ambientais, ocorrendo frequente e espontaneamente, em número
elevado, na maioria dos alimentos fermentados, especialmente quando o
alimento tem como base material vegetal, por exemplo, azeitonas em salmoura
(FERNÁNDEZ GONZALEZ et al., 1993), alcaparras (PULIDO et al., 2005) ,
chucrute (DEDICATORIA et al., 1981; PLENGVIDHYA et al., 2007), picles
(MCDONALD et al., 1993). Essas bactérias têm grande importância em
produtos como o leite e seus derivados. Elas são usadas como culturas
iniciadoras na indústria e na fermentação do alimento animal, uma vez que
contri buem para a conservação, o sabor e a textura dos fermentados (DE
VUYST, DEGEEST, 1999; RUAS-MADIEDO et al., 2002).
Por outro lado, o L. plantarum pode estar envolvido na deterioração de
alimentos, tais como carne, vinho (BENEDUCE et al., 2004) ou suco de
laranja (ALWAZEER et al., 2002), e é encontrado geralmente no sistema
gastrointestinal humano desde a boca até ao reto (MOLIN et al., 1993;
AHRNÉ et al., 1998).
3.3 Polissacarídeos
Os polissacarídeos pertencem a uma classe de polímeros constituídos
de monômeros de açúcar de cadeias longas, elevado peso molecular e
hidrossolúvel. Atuam como agentes espessantes, gelificantes, estabilizantes e
encapsuladores (DE VUYST; DEGEEST, 1999). Por apresentarem tais
características, são amplamente utilizados em formulações de produtos
nutricêuticos e prebióticos.
Os prebióticos são definidos como ingredientes de alimentos não
digeríveis que podem beneficiar o hospedeiro no sentido de selecionar a
microbiota intestinal (BROWNAWELL et al., 2012). Já a atividade biológica
dos polissacarídeos depende de sua estrutura química, relacionada ao tipo da
cadeia principal e de suas ramificações, da massa molar, e da solubilidade em
água
(
ZHANG et al., 2013).
A capacidade de produzir esses polissacarídeos é verificada em
diferentes microrganismos, como fungos e bactérias. Eles são gomas
hidrossolúveis que apresentam características vantajosas na sua utilização pela
indústria alimentícia, farmacêutica, entre outras. Sua aplicabilidade oferece
vantagens sobre as de outras fontes de origem vegetal ou animal, pois a
produção ocorre independentemente das condições climáticas e disponibilidade
de matéria-prima. Os parâmetros de produção são controlados e estabelecidos
de acordo com as melhores condições para o microrganismo (GRANDI, 2010).
Os polissacarídeos são conhecidos como biopolímeros e sua
classificação é feita de acordo com a localização morfológica em três grupos:
intracelulares, localizados no citoplasma da célula e usados como fonte de
carbono, integrantes da parede celular, como os peptideoglucanos e ácidos
teicóicos; e extracelulares associados ou não à célula microbiana (CERNING,
1990; 1995). Quando são excretados para o meio extracelular, denominados
EPS, podem estar aderidos à célula na forma de cápsula, associados com a
sobrevivência celular, ou sintetizados e excretados na forma de um
polissacarídeo livre de aspecto limoso, com pouca ou nenhuma aderência
celular (SUTHERLAND, 1972; CERNING, 1990).
No ambiente natural, os EPS oferecem proteção natural à célula
microbiana contra agentes de dessecação, fagocitose, antibióticos, compostos
tóxicos variados, estresse osmótico, adesão às superfícies sólidas e formação
de biofilmes, além de contribuírem para o reconhecimento celular (DE
VUYST; DEGEEST, 1999; RUAS-MADIEDO et al., 2002). Sua síntese
depende de um maquinário enzimático próprio de cada espécie, e um exemplo
de microrganismo capaz de converter açúcares em EPS são as BAL.
Essa capacidade de produzir EPS é altamente variável entre as BAL,
característica que depende tanto do microrganismo quanto da composição do
meio de fermentação e das condições de crescimento. (GAMAR et al., 1997;
DE VUYST et al., 1998).
Na indústria de alimentos, a aplicação dos polissacarídeos de origem
microbiana oferecem vantagens sobre os polímeros de outras fontes. Tais
vantagens estão relacionadas principalmente à produção sob condições
controladas, que possibilita a utilização de diferentes substratos e maior rapidez
na obtenção do produto, sem necessitar de grande espaço para a produção,
tornando-se assim uma classe alternativa para utilização na indústria. Produtos
lácteos fermentados por bactérias produtoras de EPS têm sido relacionados
com uma elevada viscosidade e um menor grau de sinérese, quando
comparados com produtos produzidos por outras não produtoras de EPS
(CERNING, 1990; MARSHALL, RAWSON, 1999).
3.4 Soro de tofu
O soro de tofu (ST) é um subproduto do processo de produção do
“queijo” de soja, recentemente este tem sido utilizado no lugar do soro de leite
e outros meios de crescimento para o cultivo de bactérias ácido láticas
(NGUYEN et al., 2003).
Dentre as vantagens de utilizar o ST como alternativa é seu baixo
valor comercial (NGUYEN et al., 2003) e o fato do material ser considerado
um problema ambiental e industrial (PEÑAS et al., 2006). O ST é uma fonte
rica de carbono, como sacarose, rafinose, estaquiose e os oligossacarídeos, que
é consumida pelas bactérias ácidas láticas, além de ser considerado uma fonte
rica em proteínas e sais minerais (SHURTLEFF & AOYAGI, 1984). Nguyen
et al. (2003) avaliaram o crescimento de L. paracasei ssp. paracasei em soro
de tofu, e como resultados obtiveram uma elevada contagem de células viáveis,
superior aquelas observadas em cultivo utilizando soro de leite (NGUYEN et
al., 2003).
Estas condições levam a uma substituição eficiente e bem aceita pelo
mercado entre os meios sintéticos, como o meio desenvolvido por Man,
Rogosa & Sharpe (MRS) (MAN et al., 1960), produzido especialmente para
crescimento de bactérias ácido lá ticas, e o ST com suplementação, que é um
meio de cultura de baixo custo pode alavancar a produção de prebióticos.
3.5 Biorreator
Os cultivos em biorreatores são utilizados nos processos
biotecnológicos para o aumento da escala produtiva de microorganismos,
antibióticos, enzimas, hormônios, anticorpos, cultura de células e tecidos
vegetais (ZHANG et al., 1995; CAMACHO et al., 2001; MARTIN et al., 2004;
MARTIN et al. 2005).
Os biorreatores podem ser divididos de acordo com o processo de
fermentação podendo ser no estado sólido e fermentação submersa (FSm).
Para a FSm existem diferentes tipos de biorreatores, sendo os
fermentadores aerados os mais utilizados na indústria (CRUEGER;
CRUEGER, 1990). Pela adaptação dos reatores químicos feita no início do
desenvolvimento dos bioprocessos. Cerca de 90 % é de tanque agitado
tradicional representa a maioria dos biorreatores utilizados, sendo a minoria
restante é representada pelos biorreatores pneumáticos, sem agitação mecânica
como os Airlifts e colunas de bolhas (CHISTI, 1989).
Os biorreatores de tanque agitado apresentam algumas desvantagens
para o cultivo de certos microorganismos, principalmente devido ao alto grau
de agitação requerido para a transferência de oxigênio, causando danos às
células pela alta tensão de cisalhamento das pás do agitador (NIENOW, 1998).
Já o biorreator Airlift evita esse problema, já que o sistema de circulação do
fluido no biorreator é gerado pela diferença de densidade do líquido dividido
em duas zonas distintas, onde somente uma recebe a injeção de ar. A
circulação do fluido no biorreator Airlift afeta a turbulência, a transferência de
massa gás-líquido e de calor, e também as forças de cisalhamento que os
micro-organismos estão expostos, e às quais possuem limites de tolerância
(CHISTI; MOO-YOUNG, 1988).
A FSm é uma área que tem se desenvolvido nas últimas décadas,
possibilitando um maior controle do processo, menor risco de contaminação, e
obtenção de biomassa com maior pureza, já que a biomassa é facilmente
separada do meio de cultivo e os polissacarídeos isolados. Além disso, é
possível recuperar os polissacarídeos secretados pela bactéria no meio de
cultura durante o seu desenvolvimento, aumentando o rendimento do processo
(CAMELINI et al., 2010).
As pequenas bolhas de ar no biorreator aumentam a área superficial de
transferência de oxigênio e o tubo de corrente de ar uniformiza as forças de
cisalhamento por todo biorreator, fatores que incrementam a produção de
biomassa (KUNAMNENI et al., 2007).
Uma das grandes vantagens do biorreator Airlift é a simplicidade do
projeto e da construção (MORESI, 1981), possibilitando uma manutenção fácil
e barata. A ausência de partes mecânicas móveis para a agitação reduz o perigo
de contaminação, pois facilita a limpeza e a esterilização. A injeção do gás
serve para agitar e aerar, eliminando o gasto de energia e promovendo um
aumento na capacidade de transferência de massa e calor (SIEGEL,
ROBINSON, 1992), tornando-se atrativo para utilização em processos
aeróbios.
Outra vantagem dos Airlifts sobre os demais biorreatores, em
processos biológicos, está relacionada ao fato da força de cisalhamento, devida
à turbulência, sobre as células ou pellets suspensos no meio, ser muito menor.
O campo de cisalhamento também é mais homogêneo, sendo relativamente
constante ao longo do biorreator, apresentando padrões de escoamento melhor
definidos (MERCHUK, 1986). Mesmo com sobreposição de movimentos ao
acaso, há total direcionalidade do escoamento do líquido (SIEGEL,
ROBINSON, 1992). Um fluxo menos turbulento parece ter um efeito positivo
na produção de células sensíveis ao cisalhamento. Já foi demonstrado
experimentalmente, que mesmo em meios altamente viscosos, o uso de
biorreatores Airlift pode ser vantajoso (KESSLER et al., 1993).
As vantagens dos biorreatores Airlift são os fracos campos de
cisalhamento, boa capacidade de mistura e operação asséptica por longos
períodos, tornados possíveis graças à eliminação dos agitadores, selos e
conexões. Produção contínua de cerveja, vinagre, ácido cítrico e biomassa de
levedura, bactérias e fungos, tem sido conduzida em Airlifts com diferentes
capacidades de trabalho (MORESI, 1981).
3.6 Nanofiltração
Para a separação dos polissacarídeos produzidos no cultivo, em função
de sua massa molar, pode ser utilizada a cromatografia líquida, seguida de
precipitação por solventes orgânicos. O etanol é o principal álcool utilizado
para a recuperação dos polissacarídeos (MIZUNO et al., 1990; CAMELINI et
al., 2005). Geralmente, o volume de álcool necessário para uma recuperação
total do polissacarídeo tem proporção de 3:1 de extrato aquoso contendo os
polissacarídeos. Essa quantidade é elevada e gera resíduos na recuperação do
produto.
No entanto, uma alternativa que pode ser utilizada para reduzir o
volume do extrato com polissacarídeo, concentrar o volume do extrato com
polissacarídeo e separar as moléculas pela sua massa molar são as membranas
de filtração densas ou microporosas. Esse processo contribui para a diminuição
da quantidade de álcool utilizado na precipitação, conjuntamente com a
possibilidade de seleção do polissacarídeo de interesse. A tecnologia permite
um aumento da produção do polissacarídeo visando a escala piloto e industrial.
A tecnologia de membranas em processos biotecnológicos tem sido
utilizada na área de concentração e separação de compostos bioativos. A
separação de polissacarídeos conforme sua massa molar, assim como de
oligossacarídeos, pode ser utilizada para purificar extratos brutos
(BOTELHO-CUNHA et al., 2010).
O processo de concentração por membranas tem sido amplamente
utilizado com a finalidade de manter a alta qualidade desses compostos. Esse
processo é baseado no princípio da permeação seletiva de moléculas através de
membranas, denominado nanofiltração (NF; MELLO et al., 2010).
A NF faz uso de membranas com menores diâmetros de poros, sendo
mais eficiente na concentração dos polissacarídeos bioativos (CAMELINI,
2010). Além disso, os processos com membranas apresentam vantagens como
o uso de baixas temperaturas; baixo consumo de energia; redução do impacto
ambiental, devido à eliminação do uso de solventes; além da manutenção das
propriedades creditadas a estes compostos (XU et al., 2004; MELLO et al.,
2010).
4. Material e Métodos
4.1 Microrganismo
Utilizou um isolado de L. plantarum (CCT 0580, ATCC 8014)
adquirido na forma liofilizada da Coleção Tropical de Culturas André Tosello,
Campinas, SP. O isolado foi reidratado conforme orientação do fornecedor e
cultivada em meio de cultivo MRS, sendo mantida em tubos eppendorf com
meio MRS contendo 20 % de glicerol a 24° C até a sua utilização.
4.2 Procedimentos de desinfecção e esterilização
A esterilização de meios de cultura e utensílios foi realizada em
autoclave a 121 °C e 1 atm. Os meios de cultura, com volumes inferiores a 1 L
foram esterilizados durante 15 min, já os meios de cultura em volumes de 5 L,
para fermentações em biorreator Airlift foram esterilizados durante 30 min.
Todos os materiais e acessórios para manipulação direta com a
bactéria foram esterilizados durante 20 min. O biorreator Airlift de aço inox foi
esterilizado durante 45 min com vapor a 121 °C, gerado por uma autoclave de
20 L, conectada por uma derivação da entrada de ar. Os procedimentos de
inoculação dos meios e de repicagens foram realizados sob condições
assépticas em capela de fluxo laminar.
4.3 Meios de cultura
Foram utilizados os meios para fermentação Caldo Nutriente, MRS e o
soro de tofu (fornecido pela empresa Tofutura Indústria de Alimentos Ltda),
além de soro de tofu suplementado. A composição desses meios é apresentada
na Tabela 1 e na Tabela 2.
Tabela 1 Composição do soro de tofu (ST).
Determinações analíticas
ST
Proteínas (%m/v)
0,35±0,02
Carboidratos (%m/v)
0,85±0,02
Lipídios (%m/v)
<0,10
Umidade (%m/v)
98,44±0,01
Cinzas (%m/v)
0,36±0,01
Acidez total (mL sol. N 100 mL
-1) 1,78±0,04
pH
5,20±0,01
Sólidos solúveis (º Brix)
2,1±0,01
Condutividade elétrica (µS/cm)
3,75±0,07
Isoflavonas totais (mg L
-1)
33,50±0,17
Tabela 2 Composição dos meios de cultura caldo nutriente (CN), Man Rogosa
e Sharpe (MRS) e a suplementação do soro de tofu (STS).
4.4 Preparo do inóculo
O inóculo foi obtido a partir da bactéria ativada em um escalonamento
de 10% V/V, ou seja, partindo de um inóculo inicial de 2 mL armazenado em
glicerol estéril 20 % a -20 °C, foi inoculado em 20 mL de caldo nutriente e
esse por sua vez inoculado em 200 mL, tanto para o meio MRS quanto para o
meio STS. Cada etapa do escalonamento foi realizada a 30
oC por 18 h, até
atingir um volume de inóculo final para o biorreator Airlift de 5 L. Todo
procedimento foi realizado em pH inicial de 6,0, corrigido com HCl 1 mol.L
-1.
CN
MRS STS
(g.L
-1) (g.L
-1) (g.L
-1)
Peptona
5
10
-Extrato de Carne
1,5
10
-Extrato de Levedura
1,5
5
1
Glicose
-
20
11,5
Tween 80
-
1
1
Citrado de Amônio
-
2
-Acetato de Sódio
-
5
-MgSO4
-
0.1
0.2
MnSO4
-
0.05
0.05
K2HPO4
-
-
1,4
Citrato de Sódio
-
-
3
KH2PO4
-
2
1
Cloreto de sódio
5
-
-Ingredientes
4.5 Cultivo em biorreator Airlift
Para padronizar a produção de EPS e o cultivo de L. plantarum foi
feito cultivo nos meios MRS e STS em biorreator Airlift com pH, temperatura
e aeração controlados. O cultivo foi realizado a uma temperatura de 30 °C.
Com a função de auxiliar na manutenção do pH em 6,0 foi utilizado
HCl/NaOH 0,1 mol.L
-1. Também foram utilizados de 0,2 a 0,4 mL.L
-1do
antiespumante polipropilenoglicol no meio de cultivo. O biorreator Airlift foi
programado para manter as condições de O
2acima do valor crítico.
Durante os cultivos foram coletadas amostras de 30 mL a cada 2 h, e
essas foram avaliadas quanto a biomassa produzida (gravimetria), EPS
produzido e glicose consumida ao longo do cultivo.
4.6 Separação das células
Após o cultivo, os meios de cultura e as amostras foram centrifugados
para separação dos microrganismos a 1100g por 30 min e congelados a -4°C
até sua utilização para análises e concentração por nanofiltração.
Os microrganismos separados das amostras foram desidratados a 55
°C, até peso constante e pesados em balança de precisão. Os dados foram
utilizados para medir o aumento de biomassa ao longo do cultivo em
biorreator. O sobrenadante da centrifugação foi utilizado na etapa de NF dos
EPS.
4.7 Concentração dos EPS
A concentração dos polissacarídeos por membranas foi realizada no
Laboratório de Separação por Membranas (LABSEM), Departamento de
Engenharia Química e Engenharia de Alimentos, Universidade Federal de
Santa Catarina.
Para concentração dos polissacarídeos totais foi utilizada uma
membrana de NF em um equipamento piloto operando com fluxo tangencial.
Foi utilizada uma membrana orgânica de polifluoreto de vinilideno com ponto
molar de corte de 150-300 g.mol
-1e área filtrante útil de 0,9m
2(Modelo
HL2521TF, GE Osmonics®, Filadélfia, EUA).
Dezesseis litros de extrato polissacarídico foram submetidos à NF por
aproximadamente 90 min, sendo este o tempo necessário para concluir a
operação de concentração em um sistema sem reciclo de permeado, atingindo
um fator de redução volumétrico (FRV) igual a 4,0.
Os parâmetros de operação controlados durante o processo de NF foram
35±1 ºC, e pressão transmembranar de 6 bar, para serem preservadas as
propriedades do extrato. Esta concentração foi realizada a partir da reciclagem
do concentrado e remoção do permeado utilizando 16 L de extrato aquoso. As
amostras de concentrado e permeado foram coletadas em diferentes tempos do
procedimento, relacionados aos valores de FRV de 1,5; 2,0; 2,5; 3,0; 3,5 e 4,0.
Para a separação dos compostos foi realizada precipitação por
solventes orgânicos. O solvente utilizado foi o EtOH 96 °GL, principal álcool
utilizado para a recuperação dos EPS, na proporção de 3:1 de extrato aquoso.
As amostras foram centrifugadas a 1100 g durante 15 min, e os precipitados
foram desidratados a 55 °C, até peso constante, e pesados em balança de
precisão.
No cultivo em biorreator Airlift o volume de 500 µL das amostras
foram adicionados 1000 µL de etanol PA para precipitação dos
polissacarídeos, e submetidas à centrifugação. Já nas amostras da NF alíquotas
de 40 mL dos retentados dos diferentes FRV, foram adicionados 80 mL de
EtOH 96 ºGL para precipitação dos polissacarídeos e determinação por
gravimetria.
4.9 Métodos analíticos
4.9.1 Conservação das amostras
As amostras de 30 mL retiradas ao longo do cultivo em biorreator
foram armazenadas congeladas a -4 °C para posterior análise do aumento de
biomassa e consumo de glicose. Já na NF foram retiradas amostras de 40 mL
tanto do retentado quanto do permeado de cada FRV, estas foram também
congeladas a -4 °C para posterior análise de quantidade de EPS retido no
processo.
A concentração celular foi determinada através da massa seca, para
isso, amostras de volume conhecido foram filtradas em papel de filtro
previamente pesado e secadas a 55 °C até peso constante (tempo mínimo de 48
h). A concentração celular foi, então, determinada pela Equação 1:
Onde:
X = concentração de biomassa (g.L
-1)
m
a+f= massa da amostra seca + massa do papel filtro (g)
m
f= massa do papel filtro (g)
V
a= volume da amostra (L)
O mesmo processo serviu para calcular a quantidade de EPS produzida
ao longo dos cultivos em biorreator Airlift e no processo de NF.
A taxa de conversão de substrato em biomassa foi calculada seguindo
a equação 2.
4.9.3 Determinação de glicose
A concentração de glicose nas amostras de cultivo foi determinada
pelo método enzimático GOD, fundamentado na clássica reação de Trinder,
envolvendo a oxidação da D-glicose, pela glicose oxidase, a ácido glucônico e
peróxido de hidrogênio. O peróxido de hidrogênio, na presença de peroxidase,
reage com o fenol e 4-amino pantipirina para formar uma antipirilquinonimina
vermelha cuja intensidade de cor é proporcional à concentração da glicose na
amostra, podendo ser medida por espectrofotometria. Neste estudo, foi
utilizado o reagente comercial Glicose Liquiform da Labtest. A determinação
da absorbância em espectrofotômetro foi feita a 480 nm, uma curva padrão de
glicose foi preparada com concentrações na faixa de 0 a 3 g.L
-1.
4.9.4 Cálculo da velocidade especifica de crescimento e produção de EPS
Pelo fato da concentração celular aumentar durante um cultivo
descontínuo, aumentando consequentemente a concentração das enzimas
responsáveis pela transformação do substrato, seria mais coerente analisar o
valor da velocidade instantânea com relação à referida concentração celular. A
velocidade específica de crescimento celular e a produção de EPS foram
determinadas pelo método proposto por Le Duy e Zajic (HISS, 2001).
4.9.5 Determinação dos EPS
A massa molar e a quantificação do polissacarídeo de maior massa
molar nas amostras do cultivo foram determinadas por CLAE-IR utilizando a
coluna TSK Gel 5000 PW (7.8×300 mm, Tosoh Corporation) com pré-coluna
acoplada no cromatógrafo Perkin Elmer série 200 com detector de Indíce de
Refração Perkin Elmer série 200a acoplado ao detector UV a 280 nm, fase
móvel NaOCH
30,003 mol.L
-1
, fluxo 1 mL.min
-1. A curva padrão foi realizada
com padrões dextranas de massa molar de 12 a 2.000 g.mol
-1(Sigma, EUA)
com concentração de 3 mg.mL
-1e injeção de 20 µL. As amostras foram
analisadas na concentração de 3 mg.mL
-1dissolvidas na fase móvel.
4.9.6 Cálculo do fator de redução volumétrica
Para a NF o FRV foi calculado pela razão entre o volume inicial de
extrato polissacarídico utilizado na alimentação e o volume final de
concentrado após a NF. Durante a NF foi medido o fluxo do permeado J.(L.h
-1
.m
-2), a cada cinco minutos e calculado de acordo com a Equação 3:
Onde:
J = fluxo permeado
V
p=
volume permeado
t = tempo
A
p= área de permeação
O desempenho do processo de filtração foi medido baseado na
quantidade de EPS presente no concentrado. Amostras do concentrado e do
permeado foram coletadas em diferentes intervalos de tempo, durante o ensaio,
cada um relacionado com os valores FRV. A eficiência do processo foi
determinada tendo em conta a porcentagem de polissacarídeos retidas, o que
demonstra a capacidade da membrana para filtrar o compostos de interesse. A
porcentagem de retenção foi calculada de acordo com a Equação 4:
Onde:
C
p= concentração total de polissacarídeo no permeado
C
c= concentração total de polissacarídeo no concentrado
Antes de realizar o processo de concentração do EPS o permeado do
fluxo foi medido com água filtrada, adotando as mesmas condições descritas
anteriormente. O valor obtido a partir do fluxo de permeado com água foi
utilizada como referência para verificar o estado da membrana após o uso e
limpeza. Antes de depois de cada experimento, o equipamento foi limpo com
uma solução alcalina (0,1 %), seguindo as instruções do fabricante.
4.9.7 Cálculo das resistências da membrana de nanofiltração
Depois de realizada a NF, as resistências do fluxo do permeado foram
determinadas. As análises de resistências foram baseadas na limpeza da
membrana
com
água,
considerando
diferentes
fenômenos
de
reversibilidade/irreversibilidade. Nessa condição, as diferentes taxas de fluxo
resultaram em diferentes incrustações e resistências polarizadas. Neste estudo,
foi calculado a resistência total (R
t) utilizando o valor final de fluxo (j
f), mais o
valor de viscosidade do permeado (μ
p) e da pressão transmembrana (
P
t)
utilizada no experimento. Estes cálculos estão presentes na Equação 5.
A resistência da membrana (R
m) foi determinada utilizando o valor de
viscosidade da água (μ
w) e o valor do fluxo medido com água no início do
experimento enquanto a membrana foi limpa (J
w), conforme a Equação 6.
A resistência causada por fouling (R
f) foi determinada usando a
Equação 7. Esse procedimento foi realizado utilizando o fluxo de água filtrada
através da membrana após a remoção da camada polarizada, lavando-a com
água (J
WF).
Desde que R
té a soma das resistências R
m, R
F, e R
p, a resistência
produzido pela polarização, causada pela concentração e a existência de uma
camada de gel de polarização (R
p), foi determinado pela diferença entre os
parâmetros, presente na Equação 8.
(5)
(6)
(7)
5. Resultados e Discussão
5.1 Cultivo em biorreator e estudos cinéticos
Os dados representados entre as Figuras 1 a 6 referem-se aos cultivos
submersos em biorreator Airlift em meio MRS e STS, para produção de
biomassa e EPS de L. plantarum. Embora para o cultivo em meio STS não se
tenha amostras iniciais suficientes para afirmar a existência de uma fase lag, no
meio MRS observou-se uma fase lag de pelo menos 5 h. Os cultivos foram
conduzidos durante 45 h, apesar da glicose ter sido consumida em menos
tempo. Esse maior tempo foi devido à complexidade nutricional dos meios.
Figura 1 Análise das grandezas de crescimento do L. plantarum no meio MRS
() X(g.L
-1), ()glicose, (
Figura 2 Análise das grandezas de crescimento do L. plantarum no meio STS
() X (g.L
-1), () glicose, (
) EPS (g.L
-1).
Ao final de 30 h de cultivo obteve-se uma concentração final de
biomassa de 2,7 g.L
-1e 3,2 g.L
-1para os meios MRS e STS, respectivamente.
A taxa de conversão em biomassa foi de 20,5% para o cultivo em MRS e de
19,8 % para o cultivo em STS, com 41 e 45 h, respectivamente. Vale ressaltar
que Feltrin et al. (1998) obtiveram até 2,2 g.L
-1de biomassa de L. plantarum
em cultivo a 35 °C com duração de 24 h no meio MRS.
A continuidade do crescimento do L. plantarum em meio STS após o
término da glicose deve-se ao consumo de outros nutrientes presentes no soro
de tofu, como sacarose, rafinose, estaquiose e oligossacarídeos (OUNIS et al.,
2007). O mesmo ocorreu no meio MRS com o consumo das proteínas do
extrato de carne e peptonas.
Nas Figuras 1 e 2 observa-se que a produção de EPS acompanhou o
aumento da biomassa ao longo do tempo para os dois cultivos, fato este
também observado por Zhang et al. (2013) em seus estudos com L. plantarum.
O pH se manteve estabilizado em torno de 6,0 e o biorreator manteve
as condições de O
2acima do valor crítico para ambos os cultivos Figuras 3 e 4.
A concentração crítica foi determinada preliminarmente com valor de 10 %.
Figura 3 Variação da concentração de oxigênio dissolvido e vazão de ar
durante o cultivo do L. plantarum em biorreator Airlift. Meio de cultura MRS.
(
) OD, () vvm
Embora os cultivos tenham sido conduzidos em condições não críticas
para o oxigênio, o cultivo em meio MRS esteve mais no limite dessa condição,
provavelmente por causa da maior concentração de células e nutrientes
metabolizados em maior velocidade, conforme se observa nas velocidades
específicas nas Figuras 5 e 6.
Figura 4 Variação da concentração de oxigênio dissolvido e vazão de ar
durante o cultivo do L. plantarum em biorreator Airlift. Meio de cultura STS.
(
) OD, () vvm.
Foi observado que o L. plantarum produziu dois EPS de massas
molares 2,9 x 10
5Da e 1,7 x 10
6Da. Esses EPS foram encontrados tanto no
meio MRS, quanto no STS utilizado no cultivo. Após a purificação do EPS de
maior massa molar, por diálise, esse foi utilizado como padrão para
quantificação por HPLC-IR. O rendimento máximo desse polissacarídeo foi de
210 mg.L
-1e 350 mg.L
-1para os meios MRS e STS, respectivamente, com 30 h
de cultivo (Figura 1 e 2)
Zhang et al. (2013) obtiveram em seus experimentos com L.
plantarum em MRS a produção de 69 mg.L
-1de EPS com massa molar de 1,15
x 10
6Da. Já Tallon et al. (2003) verificaram em cultivo também em meio MRS
a 25 °C a produção de 126 mg.L
-1e de 135,8 mg.L
-1a 18 °C, e encontraram
dois EPS distintos de 8,5 x 10
5Da e 4 x 10
4Da. O EPS de elevada massa molar
foi escolhido para o monitoramento, por HPLC-IR, nos cultivos devido a sua
considerável atividade biológica como anti-oxidante (Zhang et al., 2013).
Figura 5 Análise do µx e µ
EPSdo cultivo de L. plantarum no meio MRS. ()
µ
x, (
) µ
EPSFigura 6 Análise do µx e µ
EPSdo cultivo de L.plantarum no meio STS. () µ
x,
É importante observar que diferentes EPS podem ser obtidos com L.
plantarum controlando-se fatores como pH, temperatura e OD, e que a
composição do meio de cultura parece não afetar o tamanho dessas moléculas.
Comparando os cultivos, o meio STS foi mais favorável dentro de 30 h
de cultivo tanto para o aumento de biomassa quanto para a produção de EPS,
nas mesmas condições operacionais. Entretanto, sem a suplementação de
glicose no soro de tofu o crescimento não ocorre. Essa foi também uma
constatação em ensaios preliminares de cultivo. Pode-se dizer que o soro de
tofu é um suplemento nutricional importante para o crescimento e formação de
EPS, mas não como um meio em si para crescimento.
As diferenças encontradas em cada um dos experimentos em relação à
quantidade de biomassa, EPS e massa molecular de EPS encontrados confirma
as observações de Ruasmadiedo et al. (2002) e De Vuyst et al. (1999), de que
fatores exógenos, tais como fonte de carbono, oxigênio dissolvido e tempo de
cultivo interferem na produção de EPS e no crescimento do L. plantarum.
A Figura 6 mostra também que o cultivo no meio STS foi realizado
com facilidade pelas células, acompanhado pela produção de EPS, o que não
aconteceu no meio MRS (Figura 5). Isso é constatado pelo perfil de velocidade
específica de crescimento, onde as células no meio STS iniciaram o cultivo
numa velocidade alta, enquanto no meio MRS as células atingem a velocidade
máxima em 25 h, embora essa velocidade tenha sido, tanto no máximo quanto
na média, maior que no meio STS.
5.2 Nanofiltração
O processo de separação por membranas tem sido bastante utilizado
em cultivos com BAL para separação de lactato, ácido lático e até mesmo do
próprio microrganismo, mecanismos descritos por Timmer et al. 1994, Dey et
al. 2012 e Sikder et al. 2012 em seus trabalhos. Embora não tenha nenhum
trabalho descrevendo a utilização deste processo para separação de EPS,
Camelini et al. (2013) realizaram um processo semelhante para separação de
EPS de A. subrufescens, tornando plausível a comparação da forma de extração
e comportamento da membrana de nanofiltração utilizada no experimento.
O comportamento do fluxo de permeado (J) durante a NF de extratos
de L. plantarum é demonstrado na Figura 7. Verificou-se o declínio em função
do tempo, e a média do fluxo foi de 9,0 L.m
-2.h
-1, os processos foram
realizados a uma temperatura e pressão fixa de 35 ± 1ºC, 6 bar,
respectivamente e teve duração de 90 min. O fluxo permeado médio obtido
para o extrato da biomassa fúngica de A. subrufescens foi de 58,9 L.m
-2.h
-1, e
26,8 L.m
-2.h
-1para o seu meio de cultivo (CAMELINI et al. 2013).
A diferença entre o fluxo de permeado de água e do extrato indica a
formação de uma camada de gel polarizada e ao fouling, fenômenos
normalmente presentes nos processos de separação por membranas. Esses
fenômenos colaboraram para a redução do fluxo de permeado em cerca de 60
%.
Figura 7. Decaimento do fluxo ao longo do processo de nanofiltração para
extrato de STS.
A influência da temperatura e da pressão durante a NF do extrato de
cultivo de L. plantarum foi comparado com fluxo de água, e os resultados estão
expressos nas Figuras 8 e 9, respectivamente. Os efeitos da pressão e da
temperatura no fluxo do permeado foram caracterizados pela diferença entre a
os fluxos de permeado para água e para o extrato de STS, alterando a
temperatura de 20 a 45 °C e a pressão de 1 a 7 bar.
A Figura 8 mostra o fluxo sobre efeito da temperatura a uma pressão
constante de 6 bar com variação da temperatura, é possível notar um pequeno
aumento do fluxo de permeado com o aumento da temperatura, porém este
aumento é baixo quando comparado com o que Camelini et al. (2013)
encontraram em seus experimentos com extratos aquosos fúngico, resultando
em um aumento de até 30 % do fluxo com o aumento da temperatura.
Figura 8. Fluxo de permeado em função da temperatura de processamento
sobre a água e o extrato do cultivo de L. plantarum em STS (
) extrato ()
água.
A Figura 9 mostra o fluxo sobre efeito da pressão a uma temperatura
constante de 35 °C com variação da pressão, demonstrando que o aumento da
pressão resultou num aumento de fluxo de 30 %.
Figura 9. Fluxo de permeado em função da pressão de processamento sobre a
água e o extrato do cultivo de L. plantarum em STS (
) extrato () água.
As Figuras 10 e 11 apresentam os dados de EPS na amostra inicial e
nos concentrados do meio de cultura, representando as duplicatas e a média dos
valores verificados em cada amostra, respectivamente. Verifica-se que o teor
de EPS no concentrado em diferentes valores de FRV foram todos diferentes
do resultado encontrado para o extrato inicial.
Analisando separadamente cada um dos gráficos, observa-se na Figura
10 que a concentração dos EPS ao longo do tempo é equivalente à uma
equação polinominal, ou seja quanto maior for o FRV maior será a quantidade
de exopolissacarídeo precipitada após o processo de NF, aumentando de forma
exponencial os compostos precipitados.
y = 3,7725x R² = 0,915 y = 14,742x R² = 0,9955 0 20 40 60 80 100 120 0 2 4 6 8 F lu jo ( L .h -1.m -2) p ( bar)
