Práticas de Microbiologia

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Laboratório de Microbiologia DEQ/UFPE

Recife - Pernambuco

1998

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Apresentação

A inexistência de um texto de práticas de Microbiologia Geral adaptado às nossas condições do nosso laboratório, e destinado aos cursos superiores de Engenharia Química, Química Industrial e outros, nos motivaram à realização deste manual. Os experimentos foram selecionados de modo a englobar a maioria dos assuntos contidos no programa referentes à primeira unidade do curso e podem ser facilmente efetuados em laboratórios de recursos limitados.

Cada experimento, poderá ser efetuado por um grupo de dois ou mais alunos. Muitas vezes o experimento pode ser dividido entre vários grupos da classe, sendo que cada grupo deve fazer o experimento numa determinada condição. Neste caso, o instrutor dever fazer uma discussão a posteiori e global do problema apresentado.

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PRÁTICA N 1

OBJETIVOS:

 Discriminar as funções e/ou aplicações  Limpar

 Acondicionar

1. FUNÇÕES E/OU APLICAÇÕES DO MATERIAL DO LABORATÓRIO DE MICROBIOLOGIA

1.1. Material Permanente

a. Autoclave - câmara de vapor com parede dupla, equipada com

dispositivos que permitem o enchimento da câmara com vapor saturado e sua manutenção em determinadas temperatura e pressão por quaisquer períodos de tempo. O autoclave é um equipamento indispensável ao laboratório de microbiologia na esterilização de meios de cultura, água, suspensões etc.(ver modo de operação)

b. Estufas de Esterilização (Fornos de Pasteur) - esteriliza a seco

toda vidraria convenientemente acondicionada, a temperatura de 170

a 200o _{C por 1-2 horas.}

c. Refrigerador - utilizado na conservação de culturas de

microrganimos sob baixa temperatura, diminuindo o tempo de geração

d. Estufa bacteriológica - favorece o crescimento de microrganismos

pela incubação na temperatura adequada.

Incubação = manutenção do meio semeado em determinadas

condições para promover o desenvolvimento dos microrganismos.

e. Mesa agitadora (rumbeira) - favorece o crescimento de

microrganismos aeróbios, pela dissolução do oxigênio no meio, através da agitação da mesa, em movimentos rotatórios.

f. Cabine de fluxo laminar - câmara asséptica, dotada de exaustor e

lâmpada fluorescente, sendo utilizada em repiques de microrganismos

g. Fermentador - equipamento onde ocorrem as fermentações, podendo

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1.2. Vidraria

a. Tubo de ensaio (tubo de cultura) - utilizado no cultivo de

microrganismos em pequeno volume de meio e na conservação de culturas puras de microrganismos.

b. Placa de Petri - facilita o isolamento de microrganismos devido à

grande superfície de crescimento que apresenta, possibilitando o aparecimento de colônias separadas.

Colônia = aglomerado de células em meio sólido, geralmente

originadas de uma única célula progenitora.

c. Pipeta - para diluir preparações diversas e inocular culturas líquidas

Inocular = inserir, introduzir

Inóculo (ou semente) = concentração de células suficientes para

cultivar uma de meio com bom rendimento

d. Pipeta Pasteur - é um tubo de vidro espichado em capilar, utilizada

para transportar pequenos volumes de líquido

e. Alça de Drigalsky - obtida a partir de uma pipeta Pasteur longa,

dobrada em ângulo reto e depois em 45C na chama. É utilizada para

espalhar microrganismos em meio de cultura sólido.

f. Balão de fundo chato- utilizado geralmente para guardar meios de

cultura.

g. Erlenmeyer - utilizado para propagação celular de microrganismos

em meio líquido sob agitação em mesa agitadora.

h. Fernbach - idem

i. Lâmina - para examinar microrganismos ao microscópios

Lâmina Escavada - possui uma ou duas depressões possibilitando

observar a mobilidade de microrganismos suspensos numa gota de líquido (Ensaio em gota pendente)

j. Lamínula - utilizada para recobrir preparações microscópicas “in

vivo

1.3.Materiais utilizados em titul ações, destilações,

preparações de solução e de meios de cultura - Bequer, bastão

de vidro, bureta, funil, proveta, balão volumétrico, condensador dentre outros.

1.4. Diversos

a.Lápis dermatográfico - utilizado para escrever em superfície de

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b.Algodão bruto (ou cardado) - serve para proteger o material

esterilizado, do contato com o ar ambiente.

c.Cabo de Kolle - feito com material isolante, adaptado em três formas

(círculo, ele, agulha). Serve de suporte para um fio de platina ou uma liga níquel-cromo, sendo utilizado em inoculação de microrganismos.

2. DESINFECÇÃO

a. Desinfecção do ar:

- através da vaporização de uma solução de hipoclorito de sódio a 1%;

- pelo uso de lâmpadas de luz ultravioleta.

- pode ser feita periodicamente com a vaporização de uma solução de formalina (formol a 40%), no entanto, esta solução não se pode usar para a desinfecção de ambientes ocupados;

b. Desinfecção da bancada:

Antes da realização de um determinado trabalho de microbiologia, a bancada deve ser limpa com uma solução detergente seguida de uma solução alcoólica a 70%.

c. Desinfecção da vidraria:

- vidraria contaminada - deverá ser inicialmente esterilizada em

autoclave para que toda flora presente seja destruída e, em seguida lavada com uma solução detergente ou sabão neutro;

- vidraria sem contaminação - idem ao anterior, porém sem

necessidade de autoclavação.

Observação: não é costume se utilizar solução sulfocrômica na lavagem

dos materiais do laboratório de microbiologia, uma vez que esta solução contém cromo que é um metal que pode intoxicar as células vivas e também por ser de difícil remoção no material

3. ACONDICIONAMENTO

a. Placas de Petri - embrulhadas com papel, geralmente formando

conjunto de 3 unidades. A quantidade depende da necessidade do trabalho.

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b. Pipetas - obtura-se as boquilhas com mecha de algodão (1cm) para

filtrar o ar soprado e para proteger o operador durante a manipulação; em seguida são enroladas uma a uma com papel, anotando a capacidade de cada uma.

c. Tubos de ensaio, balões de fundo chato, Erlenmeyers, fernbachs

-são preparados introduzindo-se um tampão de algodão cardado na boca do recipiente. Esse tampão deve ser feito, enrolando o algodão no sentido da fibra em quantidade suficiente para facilitar o manuseio, isto é, não deve ser nem muito apertado, nem muito frouxo.

d. Lâminas - mergulhadas em solução alcoólica, ficam aptas a serem

utilizadas a qualquer momento, evitando paralelamente que sejam arranhadas.

ATENÇÃO: Toda vidraria utilizada no laboratório de microbiologia

antes de ser preparada para esterilização deverá estar limpa e seca.

ESTERILIZAÇÃO EM AUTOCLAVE

Operação: ligar o aparelho à rede elétrica. Após a colocação do

material dentro do autoclave, a tampa é fechada e a torneira de remoção de ar ou vapor é deixada aberta para remover todo o ar. Quando todo o ar for removido, deixe que um fluxo de vapor fluente persista por cerca de 5 minutos, antes de fechar a torneira. A partir de então a pressão internamente irá aumentar e chegar à pressão de

esterilização usada, que é de 15 lb/pol2_{, ou 1atm, ou 1 kgf/cm}2_,

correspondendo a uma temperatura de 1210_{C. O tempo de exposição do}

material no interior deste equipamento irá depender do volume de líquido a ser esterilizado. Para pequenos volumes, até 3 litros, podem

ser esterilizados durante 20 a 30 minutos a uma pressão de 15 lb/pol2_.

Com relação a maiores volumes, será necessário, uma exposição mais prolongada. Quando a temperatura requerida para a esterilização é alcançada, deve-se começar a contar o tempo, usando um relógio de laboratório (com alarme). Decorrido o tempo desliga-se o aparelho da corrente elétrica e mantém-se a autoclave e a torneira de ar e vapor fechados, até o manômetro voltar ao ponto zero, pois quando a pressão da autoclave é aliviada rapidamente, os líquidos dentro dos tubos e frascos fervem violentamente, fazendo com que os tampões sejam arremessados para fora dos mesmos.

Concluída a esterilização, abre-se a torneira de vapor; em seguida a tampa do autoclave é levantada.

PRÁTICA N 2

OBJETIVOS:

 Trabalhar assepticamente  Cultivar microrganimos

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INTRODUÇÃO

O homem no seu meio ambiente convive com inúmeras formas de vida. Os microrganismos ocupam lugar de destaque tanto pelos benefícios como pelos malefícios que proporcionam ao homem, sendo encontrados na natureza em abundância e variedade de formas. Para que os mesmos sejam cultivados artificialmente é necessário conhecer suas exigências nutricionais e suas condições físicas de crescimento, trabalhar com material esterilizado e obdecer às normas de prática asséptica.

Dependendo da finalidade da operação, os microrganimos podem ser cultivados em: lâminas, placas, tubos, balões, fernbach ou recipientes de maior capacidade. O cultivo em lâmina é utilizado quando se deseja acompanhar microscopicamente o crescimento e reprodução de um microrganismo. Emprega-se o cultivo em placas quando se quer isolar espécies microbianas distintas, devido à extensa área de superfície que apresenta. Porém, devido à pequena quantidade de meio em exposição ao ar, com frequência ocorre ressecamento e/ou aparecimento de contaminações.

Cultivando os microrganismos em tubos, há facilidade de manipulação das culturas, além da vantagem de economizar meio e espaço físico. Para se obter grandes volumes de cultura, o microrganismo é cultivado inicialmente em balões, fernbach, para depois ser transferido para recipiente maior, cuja capacidade é função da necessidade do trabalho.

NORMAS DE PRÁTICA ASSÉPTICA

1. Não trabalhar em corrente de ar, nem ambiente agitado pelo acúmulo de pessoas;

2. Não falar nem respirar em frente ao recipiente aberto contendo material de estudo;

3. Abrir o recipiente inclinado junto à chama, onde o ar está rarefeito de formas vivas;

4. Retirar o tampão de algodão com o dedo mínimo e a palma da mão sem tocar na boca do recipiente e sem encostar o tampão em lugar algum;

5. Flambar a boca do recipiente sempre que for iniciar uma inoculação, para que uma corrente de ar quente seja formada de dentro para fora; 6. Introduzir o mais rápido possível a alça ou pipeta sem tocar nas

paredes do recipiente;

7. Ao terminar a inoculação, flambar a boca do recipiente e ajustar o tampão, conservando o material ao abrigo da poeira e umidade.

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PROCEDIMENTO PRÁTICO

 Limpar a bancada;

 Marcar todo material (placa e tubos), especificando o tipo de meio e a fonte da inoculação;

 Fundir dois meios de cultura diferentes (por exemplo AN e CZ);  Distribuir os meios em placas de Petri e tubos (inclinar);

 Esperar solidificar;

 Fazer inoculações nas superfícies dos meios distribuídos em placas;-Incubar na temperatura ambiente por 2 a 5 dias, não esquecendo de guardar placas sem inocular, uma de cada meio utilizado para controle da esterilização e da eficácia da técnica utilizada.

FONTES: água poluída, fermento de padaria, ar, garganta, mãos,

cabelo, suor etc.

DIFERENCIAÇÃO MACROSCÓPICA DOS MICRORGANISMOS

Os microrganimos crescem e reproduzem quando cultivados e inoculados adequadamente. Podemos fazer avaliação dos grupos aos quais eles pertencem, por observações das características das colônias nos meios em que eles foram cultivados. O crescimento em meio líquido pode ser evidenciado pela turvação, pela formação de pequena massa de célula que flotam (velo) ou por sedimentação das células. Em placas de Petri estuda-se o crescimento dos microrganismos em meio sólido, observando-se o aparecimento de colônias cujos aspectos macroscópicos auxiliam na diferenciação de grupos microbianos.

I) Descrição de colônias em placas de Petri:

Após o período de incubação preestabelecido as colônias de microrganismos cultivados em placas de Petri podem ser descritas de acordo com os seguintes critérios:

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a. forma:

circular rizoide irregular filamentosa

b. quanto à dimensão

puntiforme com menos de 1 mm de diâmetro

c. cromogênese

-cor do pigmento

-pigmento solúvel ou insolúvel no meio

d. superfície

plana ,elevada, convexa, lisa, rugosa, seca, brilhante, translúcida, opaca, pregueada, pulverulenta

II) Descrição da cultura em caldo nutriente

O crescimento em caldo de cultura pode apresentar-se sob diferentes formas.

a. turbidez: mais ou menos acentuada

b. forma da película: uma massa de células que flutua à superfície

do caldo

c. sedimento: depósito de células no fundo do tubo.

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. As colônias de fungos são geralmente grandes e filamentosas, algumas vezes ocupam toda a placa onde estão cultivadas.

. As colônias de leveduras são pequenas e leitosas, enquanto as de bactérias são menores e brilhantes sendo algumas tão pequenas que se denominam puntiformes.

PRÁTICA N 3

OBJETIVOS:

 Distinguir os diversos componentes de um microscópio ótico composto

 Focalizar “in vivo”: células de leveduras em suspensão, microrganismos (algas, protozoários e bactérias móveis em água)

COMPONENTES DE UM MICROSCÓPIO ÓTICO COMPOSTO I - PARTE MECÂNICA:

1. Base ou pé - dispositivo de tamanho e peso suficiente para assegurar

o equilíbrio estável do instrumento, evitando trepidações;

2.Corpo, braço ou coluna - haste destinada a sustentar o tubo

microscópico e conter os mecanismos de movimento; alguns apresentam articulação, facilitando a observação do pesquisador;

3.Tubo ou canhão microscópico - cilindro oco que serve de suporte

para os dois sistemas de lentes (oculares e objetivas);

4. Revólver - peça giratória onde ficam fixadas as lentes objetivas,

permitindo que cada lente possa ser colocada em foco ( uma de cada vez),

isto é, em coincidência com o eixo ótico;

5. Platina - plataforma horizontal com uma abertura circular no centro

por onde passam os raios luminosos. Existem platinas móveis;

6. Pinça ou presilhas - alças flexíveis e ajustáveis, situadas na platina.

São utilizadas para fixar a lâmina;

7. “Charriot” - dispositivo facultativo que permite a movimentação da

lâmina em dois sentidos: horizontal e vertical, pela manipulação de dois parafusos;

8. Sistema de cremalheira - peça munida de dentes, controlada pelos

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a) Macrométrico - ocasiona diferentes aproximações entre a objetiva e a preparação, variando a distância vertical de vários centímetros. Serve para trazer o objeto ao foco aproximado;

b) Micrométrico - permite mínimos deslocamentos verticais da ordem de centésimos de milímetros, sendo utilizado na focalização final;

Observação: Nos microscópios mais modernos existe um único

parafuso que oferece o controle destes dois movimentos.

II - PARTE ÓTICA 1. Fonte luminosa: 1.1. Natural - luz solar 1.2. Artificial - lâmpada

1.2.1. Direta - quando a lâmpada está fixada no eixo ótico

1.2.2. Indireta - quando se utiliza fonte luminosa anexa ao

microscópio.

2. Espelho - girando em torno de um eixo, é utilizado para refletir os

raios luminosos; pode ser côncavo ou plano, aumentando ou diminuindo a intensidade da luz, respectivamente;

3. Diafrágma - controla a extensão angular do feixe luminoso,

reduzindo o ângulo do cone de luz, de modo que não exceda o diâmetro da objetiva após atravessar o objeto;

4. Condensador - conjunto de lentes convergentes que projeta sobre a

preparação o feixe de luz em forma de um amplo cone; por deslocamentos verticais diminui ou concentra a luz no objeto;

5. Lentes objetivas - são as lentes que ficam próximas ao objeto,

formando na parte superior do tubo microscópico uma imagem invertida e ampliada do objeto. Podem ser: a) a seco - quando o meio entre o objeto e a lente é o ar, podendo ser de pequeno, médio ou grande aumento; b) de imersão - quando a lente fica mergulhada numa camada de líquido;

6. Sistema de lentes oculares - apresenta um conjunto de lentes: lente

de campo (corretora) que corrige a esfericidade da imagem e a lente ampliadora que atua em conjunto com o observador como uma simples lente de aumento, aumentando a imagem formada pela objetiva.

MANIPULAÇÃO DO MICROSCÓPIO

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Retirar o microscópio da caixa ou armário pelo braço e colocá-lo na mesa apropriada (chumbada e nivelada); a seguir ligar a fonte luminosa e dispor a objetiva no revólver e regular a altura do banco, de maneira a permitir um trabalho confortável.

2. Iluminação de campo

Se a luz utilizada é uma luz natural, usar a face plana do espelho, caso contrário, a face côncava. Em qualquer caso, a luz deve cobrir completamente a superfície do espelho e este deve estar centrado de maneira que o cone luminoso refletido atravesse completamente o condensador (que deve estar completamente levantado, com o diafragma aberto) bem como a abertura da platina, de tal sorte que o campo do microscópio (isto é, o espaço da platina visualizado com a ocular) fique totalmente iluminado.

3. Adaptação da preparação

Colocar a lâmina contendo a preparação sobre a platina e prendê-la, depois, com o auxílio do Charriot, deslocar o conjunto de tal forma que a preparação contida na lâmina, fique sobre a abertura da platina, perfeitamente iluminada pelo cone luminoso.

4. Escolha da objetiva

a) preparações a fresco (“In vivo”): trabalhar apenas com objetivas a

seco, começando pela de menor aumento;

b) preparações coradas (“In vitro”):

- focalizar inicialmente com a objetiva a seco de menor aumento; - girar o revólver de maneira que nenhuma das objetivas fique em uso; - colocar sobre a preparação uma pequena gota de óleo de imersão; - colocar no eixo ótico a objetiva de maior aumento (imersão)

5. Iluminação da preparação

Para as preparações coradas que dão imagens por absorção, usar o máximo de iluminação com o condensador completamente elevado e o diafragma totalmente aberto. Para as preparações a fresco, que dão imagens por refração, iluminar menos a fim de que o fenômeno seja mais perceptível. Começar descendo o condensador, a uns dois terços da sua abertura, depois olhando pela ocular, regular o cone luminoso, fechando aos poucos o diafragma.

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É a operação que consiste em trazer o objeto para o foco da objetiva, formando a imagem que, ampliada pela ocular, será vista pelo observador. A focalização consta das seguintes etapas:

a) girar o revólver colocando a objetiva de menor aumento no eixo ótico;

b) ajustar a iluminação de campo; c) centralizar a preparação;

d) aproximar ao máximo a preparação, da objetiva de menor aumento, por meio do mecanismo de movimento. Durante este trabalho deverá ser observada a aproximação diretamente com a vista, não devendo ser utilizado a ocular;

e) observando então pela ocular, imprimir movimento moderado de afastamento entre a preparação e a objetiva, até que seja distinguida a imagem do objeto;

f) movimentar o micrométrico para focalização final;

g) regular o diafragma e o condensador para visualizar com mais nitidez;

h) para trocar de objetiva basta o revólver e em seguida ajustar o foco imprimindo movimentos lentos no micrométrico;

i) ao término da observação, girar o revólver até a menor objetiva e apagar a luz. Retirar a lâmina e colocar num recipiente com detergente.

OBSERVAÇÃO: Quando o microscópio é binocular deve-se ajustar a

distância inter-ocular de tal forma que o observador visualize um só campo de luz. Trabalhando com microscópio monocular, procurar manter ambos os olhos abertos, a fim de evitar fadiga.

7. Causas de erro na observação

a) Obscuridade total do campo - má centralização do aparelho de iluminação

b) Obscuridade parcial - revólver mal centrado, verificar se o ponto em que há resistência não foi atingido ou foi ultrapassado.

c) Falta de nitidez da imagem

- preparação invertida ou com sujos;

- ocular suja - verificar se rodando-a, o sujo acompanha o movimento; limpar a objetiva;

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- objetiva suja ou com arranhão - limpar com mistura xilol-éter;

- aparelho de iluminação - falta de centralização, poeiras depositadas ou objetos estranhos interpostos na marcha dos raios;

d) Dificuldade subjetiva

Corpúsculos de forma diversas que parecem deslocar-se no campo. Com alguma prática, verifica-se que eles são independentes da preparação, e provêm do observador; repousar um pouco e repetir a operação;

e) Movimento Brauniano

Quando os microrganismos deslocam-se num só sentido devido à correntes líquidas formadas por evaporação da água durante a observação nas preparações “In vivo”. Salientando que o movimento dos microrganismos é aleatório.

8. Conservação dos microscópios

O aparelho deve estar sempre protegido, seja com capa plástica, seja com caixa própria e guardado em ambiente provido de luz artificial para evitar o crescimento de fungos. A cada utilização o pó do microscópio deverá ser removido com um pano limpo.

Evitar a ação de vapores ácidos e contato com reativos; só manuseá-lo com mãos limpas; só observar preparações limpas e ter o cuidado de não deixar escorrer nada sobre a platina ao adaptar a preparação. Se isto ocorrer, limpar imediatamente, se necessário com água destilada, enxugando a seguir.

As oculares devem ser limpas externamente com papel de seda e internamente, por um técnico, só quando necessário.

A objetiva de imersão é limpa com papel de filtro ou algodão umedecido com uma mistura de xilol e éter na proporção de 1:1, que deve ser imediatamente removido com papel ou algodão limpo.

A permanência de xilol sobre a lente causa desvitrificação da mesma.

Nunca deixe ficar óleo na lente, pois ali resinifica e depois para limpar, exige excesso de dissolvente, podendo este penetrar no sistema, dissolvendo o bálsamo que liga as diversas partes.

As objetivas a seco são limpas com um linho macio e ocasionalmente, com papel umedecido com água destilada.

A parte interior das objetivas não deve ser limpa usualmente e quando é feito deverá ser praticada por pessoa habilitada. Deve-se remover a objetiva e passar suavemente um pincel macio ou uma bucha de pano macio na extremidade de uma haste. Não se deve assoprar para

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evitar a umidade. Esta operação deverá ser feita com muito cuidado para não descentralizar as objetivas.

As lentes do aparelho de iluminação são limpas como as demais, com freqüência, pois delas depende a boa iluminação fornecida.

A parte mecânica é limpa e polida com uma flanela e a cremalheira com óleo detergente fino.

Para uma boa conservação do microscópio o operador deverá seguir uma rotina diária que vai desde uma simples remoção do pó até uma lubrificação mensal de todas as partes móveis com um óleo fluido. A cada trimestre o aparelho deve ser enviado a um técnico especializado para uma inspeção rigorosa, limpeza e lubrificação geral.

PRÁTICA N 4

OBJETIVOS:

 Realizar coloração simples

 Observar microrganismos diferentes sob objetiva de imersão

 Diferenciar leveduras de bactérias considerando o tamanho celular

OBSERVAÇÕES “IN VITRO”

Os microrganismos são usualmente transparentes, tornando difícil o estudo de detalhes morfológicos quando são examinados em seu estado natural, assim torna-se necessário a utilização de técnicas de coloração.

As observações microscópicas “in vitro” são realizadas com o microrganismo previamente fixado ã lâmina. Nestas condições as células microbianas são observadas mortas.

Após a fixação, submete-se a preparação à etapa de coloração pela adição de soluções adequadas em função da técnica de coloração desejada.

As técnicas de coloração não só facilitam a visibilidade das células microbianas, como também, propiciam a visualização de determinadas estruturas celulares em função de afinidades específicas com determinados corantes, e facilitam identificação de microrganismos devido a comportamento diferentes frente à ação de soluções diferenciadoras.

A menos que algum aspecto morfológico específico, dependente de idade da cultura, deva ser demonstrado, o microbiologista deve usar sempre cultura nova nas observações microscópicas. As células com o tempo de cultivo, modificam o metabolismo, alterando a afinidade com muitos corantes. Excluindo os organismos que têm um tempo de geração especialmente grande, uma cultura com 24 horas de cultivo dará sempre bons resultados.

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SUBSTÂNCIAS CORANTES

Segundo Langeron, corantes são substâncias coradas que gozam da propriedade de transmitir cor a outros corpos.

Muitas são as substâncias corantes empregadas na rotina diária dos laboratórios, a maioria derivados da anilina, podendo ser classificados em naturais e artificiais. Entre os naturais destacam-se: o carmim, a hematoxilina. Os artificiais são agrupados em função dos grupos químicos presentes e da afinidade com estruturas celulares, podendo ser:

a) Básicos ou nucleares: violeta de genciana, cristal violeta, verde de

malaquita, azul de metileno, fucsina básica, azul de toluidina, verde de metila etc.

b) Ácidos ou citoplasmáticos : eosina, fluoresceína, fucsina ácida,

orange G, vermelho congo, ácido picrico etc

c) Neutros: eosinato de azul de metileno e de azul AZUR, giensa etc.

PREPARAÇÃO E FIXAÇÃO DE ESFREGAÇO

Em processos de coloração de rotina, uma boa observação microscópica depende tanto da preparação do esfregaço como de sua fixação à lâmina.

TÉCNICA

. Flambar a alça de platina (“em círculo”) ao rubro, deixar esfriar,

conservando-a próxima à chama;

. Depositar com o auxílio da alça, gotas da suspensão microbiana na

lâmina, se for o caso, suspender a amostra da cultura na própria lâmina;

. Espalhar bem o material na lâmina, empregando movimentos

rotacionais na alça de platina ( do centro para a periferia), a fim de se obter um esfregaço de forma oval, bem fino e uniforme;

. Secar a fina película do material (esfregaço) ao ar ou pela passagem

na chama do bico de Bunsen;

. Fixar o esfregaço, passando o dorso da lâmina três vezes ou mais na

chama, a fim de que o material fique bem aderido à lâmina;

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A fixação do esfregaço com água pode formar aerossóis (partículas projetadas durante a fervura de líquidos); evita-se introduzindo a lâmina no cone azul da chama (parte redutora, a mais quente), permanecendo alguns instantes a fim de secar o material.

A preparação e fixação do esfregaço requer cuidados evitando-se tratamentos bruscos, para que as células da amostra a serem observadas não fiquem aglomeradas dificultando a observação, como também não tenham seus arranjos característicos destruídos.

COLORAÇÃO SIMPLES

Denomina-se de coloração simples à coloração em que se adiciona qualquer solução corante ao esfregaço fixado durante um determinado tempo (30s a 3 min) em função do corante utilizado. Depois lava-se a lâmina em água corrente, seca-se e observa-se usando a objetiva de imersão.

Essa coloração tem a finalidade de nos dá uma visão da forma, do tamanho e dos arranjos das células, bem como de outros detalhes estruturais.

TÉCNICA

1. Preparar e fixar o esfregaço;

2. Cobrir com algumas gotas de uma solução corante (azul de metileno, cristal violeta, fucsina, safranina);

3. Deixar o corante agir por 60s; 4. Lavar em água corrente;

5. Secar cuidadosamente na chama ou com papel absorvente;

6. Observar com a objetiva de imersão (não esquecer de colocar 1 gota de óleo de imersão antes de adaptar a referida objetiva no eixo ótico).

Obsevação: Não se deve facilitar com os papéis absorventes usados,

especialmente se os microrganismos em estudo forem patógenos.

PRÁTICA N 5

OBJETIVOS:

 Realizar coloração Diferencial de Gram

 Observar ao microscópio sob imersão as preparações in vitro

 Diferenciar as formas de bactérias (cocos, bacilos) e arranjos celulares ( em cadeia, tétrades, cúbicos, em cachos).

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COLORAÇÕES DIFERENCIAIS

As colorações diferenciais distinguem grupos de microrganismos entre si, devido à diferenças químicas existentes entre as células microbianas.

Nesta técnica de coloração utiliza-se inicialmente soluções de corantes e mordentes; numa segunda etapa um agente diferenciador; para finalmente realizar outra coloração que contrasta com a primeira.

COLORAÇÃO DIFERENCIAL DE GRAM

Em 1884, CHRISTIAN GRAM descobriu um método de coloração, baseado no fato de que, quando certas bactérias são coradas pelo cristal de violeta e depois tratadas pelo iodo (solução iodo-iodetada, dita lugol),forma-se um composto de coloração escura entre o iodo e o corante, o qual é fortemente removido pelo tratamento subseqüente com álcool (diferenciador). São as bactérias Gram positivas, as que tomam o corante de Gram (cristal violeta). Outras bactérias, ditas Gram negativas, deixam-se descorar facilmente pelo álcool. Assim sendo, se após a ação do álcool, fizermos uma coloração de fundo pela safranina ou pela fucsina básica, as bactérias Gram negativas aparecerão vermelhas.

MECANISMO DA COLORAÇÃO DE GRAM

As bactérias Gram positivas e Gram negativas interagem com o corante cristal violeta devido à ligações irônicas entre os grupos básicos dos corantes e grupos ácidos dos constituintes celulares. O iodo em solução penetra nos dois tipos de células e forma um precipitado com o corante. O agente descorante (álcool etílico ou acetona) nas células Gram negativas passa facilmente através da membrana celular dissolvendo o complexo corante-iodo, deixando a célula incolor. Nas células Gram positivas o álcool penetra com dificuldade e a dissolução do complexo é lenta. A maior parte do complexo corante-iodo permanece na célula que retém assim a sua coloração. Pela adição do contra-corante (safranina ou fucsina básica) as células Gram positivas permanecem violetas enquanto as Gram negativa interagem com o mesmo, ficando vermelhas.

As diferenças químicas entre os constituintes da parede celular das bactérias são responsáveis pela retenção ou não do cristal violeta.

Todas as células desprovidas de parede celular (certos protozoários), bem como as células artificialmente despojadas de parede celular (mesmo que sejam Gram positivas), comportam-se como Gram negativas.

As bactérias Gram negativas contêm uma concentração elevada de lipídeos, e suas paredes são também mais delgadas com relação às bactérias Gram positivas. O descoramento extrai os lipídeos aumentando a porosidade ou permeabilidade da parede favorecendo a retirada do complexo cristal violeta-iodo.

As paredes celulares das bactérias Gram. positivas em virtude de sua composição diferente (menos conteúdo lipídico, presença de ácido

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teicóico, maior quantidade de peptoglicano (mucocomplexo) cujos aminoácidos encontram-se mais intercruzados, deixando a parede mais compacta), tornam-se desidratadas durante o tratamento com o descorante; a porosidade diminui, a permeabilidade se reduz e o complexo cristal violeta-iodo não é extraído.

O método de Gram é dentre os processos de coloração para bactérias, o mais importante.

Todas as leveduras quando submetidas a esta coloração comportam-se como Gram positivas, enquanto os fungos filamentosos e para os protozoários, geralmente não se aplica esta técnica por não ser conveniente.

REGRAS GERAIS DA COLORAÇÃO PELO MÉTODO DE GRAM

1 - Os cocos, são geralmente Gram-positivos, com exceção dos

pertencentes ao gênero Neisseria (Gonococos , Meningococos ).

2 - Os bacilos, são geralmente Gram-negativos, excetuando-se os

pertencentes aos gêneros: Corynebacterium (bacilo diftérico); Bacillus (B. subtilis ), B. antracis (do carbúnculo) e Clostridium (bacilo do tétano

Cl . tetani ; Cl. botulinum (do botulismo).

TÉCNICA DA COLORAÇÃO DE GRAM

1. Preparar um esfregaço;

2. Depois de frio cobrir o esfregaço com solução de cristal de violeta (1 minuto);

3. Cobrir com solução de lugol (mordente) - 1 minuto; 4. Lavar em água corrente;

5. Descorar pelo álcool absoluto (evitar o descoramento deficiente ou em excesso;

6. Lavar em água corrente;

7. Contrastar, rapidamente com safranina (30 segundos); 8. Lavar em água corrente;

9. Secar com papel fino;

10.Examinar com objetiva de imersão.

AMOSTRAS:  Bacillus subtilis  Escherichia coli  Aerobacter aerogenes  Staphylococcus aureus  Sarcina lutea  Micrococcus

(20)

PRÁTICA N 6

OBJETIVOS:

 Realizar coloração Especial de esporos

 Observar ao microscópio sob imersão as preparações coradas

COLORAÇÃO DE ESPOROS

Os esporos são células de resistência, não sendo característica predominante de todos os microrganismos. Algumas bactérias são capazes de formar esporos, como por exemplo: bactérias do gênero

Bacillus e Clostridium. TÉCNICA

1. Preparar o esfregaço e fixar;

2. Cobrir o esfregaço com papel de filtro; 3. Adicionar o corante verde malaquita; 4. Aquecer até emissão de vapores;

5. Repetir as operações 3 e 4 por 3 minutos; 6. Lavar em água corrente;

7. Adicionar safranina (0,5 a 1 minuto); 8. Lavar em água corrente;

9. Secar e observar em imersão

RESULTADO: Os esporos coram-se em verde e o resto da célula em

vermelho.

PRÁTICA N 7

OBJETIVOS:

 Preparar meios de cultura de usos em práticas microbiológicas  Distribuir convenientemente, esterilizar em autoclave

(21)

Meios de cultura são associações de substâncias que permitem o cultivo dos microrganismos fora do seu meio natural.

Nas preparações dos meios de cultura todos os nutrientes devem ser dissolvidos em água para que possam ser absorvidos pelas células microbianas.

Nos laboratórios geralmente utiliza-se água destilada no preparo destes meios, no entanto nas unidades industriais costuma-se utilizar água de rios ou poços. A água deve ter boa origem e composição química constante; quando necessário, deve ser devidamente tratada.

Como constituinte básico dos meios de cultura, além da água, pode-se especificar: as fontes de carbono, as fontes de nitrogênio, os sais. Em meios de cultura solidificados, além destes componentes deve-se introduzir agar, gelatina ou sílica gel com a função específica de solificar esses meios.

NORMAS DE PREPARAÇÃO

 Pesagem dos componentes: os diversos componentes dos meios de cultura podem ser pesados separadamente, ou consecutivamente num único recipiente (Béquer). Para quantidades inferiores a 1g utiliza-se uma balança analítica (semi-analítica).

O agar-agar geralmente é pesado separadamente, sendo o valor da pesagem em função da quantidade do meio a ser distribuído nos recipientes. Utiliza-se de 10 a 20g deste agente solidificante em pó para cada litro de solução nutriente.

 Solubilização dos componentes: adicionar os nutrientes previamente pesados a um Béquer contendo água destilada em quantidade suficiente para dissolvê-los. Os extratos de carne e de leveduras podem ser aquecidos ligeiramente para facilitar a solubilização. Deve-se evitar o uso de fogo direto e prolongado para não haver queima do material e consequente escurecimento do meio.

O agar não é solúvel a frio, devendo se necessário ser solubilizado em um banho-maria ou em autoclave a vapor fluente.

 Ajuste do pH nos meios: deve-se deixar resfriar ao máximo os meio líquidos, antes de acertar o pH. No caso dos meios solidificados ajustar na menor temperatura em que não haja solidificação.

São empregadas para ajuste do pH soluções de hidróxido de sódio ou ácido clorídrico a 0,1 N, conforme o caso. Na maioria dos casos pode-se verificar o pH através do uso de um papel de tornassol.

Em meios solidificados, o pH ácido só deverá ser ajustado depois da esterilização para evitar a hidrólize do agar quando em temperatura elevada. Neste caso o pH ácido é ajustado com uma solução estéril de ácido lático.

 Clarificação: em alguns casos há necessidade de clarificação dos meios que durante o preparo tornam-se turvos. A clarifição pode ser feita simplesmente pelo calor ou pelo uso de clara ou albumina de ovo,

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aquecendo em seguida até ebulição e filtrando-se em gase ou algodão hidrófilo.

 Distribuição, esterilização e conservação: os meios de cultura depois de preparados são distribuídos em recipientes adequados (tubos, balões, Erlenmeyeres), especificando o respectivo nome ou sigla e a data do preparo dos mesmos. Terminada a distribuição, os tubos, balões ou Erlenmeyers são arrolhados com algodão ou tampas metálicas especiais, acondicionados em cestas e levados à esterilização em autoclave. A temperatura e o tempo de exposição neste equipamento depende da composição e da quantidade de meio de cultura recipiente (vide esterilização).

Após a esterilização, os meios são resfriados espera-se 72 horas antes de usá-los ou estocá-los em geladeira, a fim de que se possa detectar algum tipo de contaminação, ou falha de esterilização.

COMPOSIÇÃO DE MEIOS DE CULTURA

AGAR NUTRITIVO Extrato de carne... 3,0g Peptona... 5,0g Agar... 20,0g Água destilada... 1000ml pH = 6,8 - 7,0

BATATA GLICOSE AGAR - BGA

Batatas descascadas e cortadas em fatias ... 300g Água destilada... 1000ml

As batatas devem ser manuseadas com o mínimo de exposição ao ar. Aquecer em 500ml de água até completamente cozidas. Filtrar através de gase, completar o volume para 1000ml e adicionar:

Agar ... 15,0g Glicose... 20,0g pH = 6,8 - 7,0

CZAPECK (CZ)

NaNO3 (nitrato de sódio)... 3,0g

K2HPO4 (fosfato monoácido de potássio)... 1,0g

MgSO4 (sulfato de magnésio)... 0,5g

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FeSO4 (sulfato ferroso)... 0,01g Sacarose... 30,0g Agar... 20,0g Água destilada...1000ml pH = 6,6 CALDO GLICOSADO Extrato de carne... 3,0g Peptona... 5,0g Glicose...10,0g Água destilada...1000ml pH = 6,8 - 7,0 CALDO LACTOSADO Peptona... 5,0g Extrato de carne... 3,0g Lactose... 5,0g Água destilada...1000ml pH = 6,8 - 7,0 GODOY Peptona... 1,0g Caldo-de-cana... 500g Agar... 15g

Juntar ao caldo-de-cana uma clara de ovo batida. Aquecer até fervura, filtrar completando o volume até 1000ml. Juntar a peptona e o agar. GLICOSE LEVEDURA (GL) Peptona ... 10,0g Extrato de carne... 3,0g NaCl... 5,0g Extrato de levedura... 10,0g Glicose... 10,0g Agar... 12-15g Água destilada... 1000mL pH 6,9 -7,1 EMB Peptona ... 10,0g Lactose... 5,0g Sacarose... 5,0g

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K2HPO4... 2,0g

Agar... 12-15g Água destilada... 1000mL

Dividir em balões de 250 mL, 100mL e 200mL de meio.

Esterilizar a 120o_{C por 20 minutos.}

Quando for distribuir em placas para uso, fundir e adicionar para cada 100 mL de meio, 1mL de solução estéril de eosina (4%) e 1mL de solução estéril de azul de metileno (0,65%). As placas podem ser guardadas por uma semana em refrigerador.

GLICOSE AGAR (GA)

Extrato de carne ... 3,0g Peptona... 5,0g Glicose... 10,0 Agar... 20,0g Água destilada... 1000ml pH = 6,8 - 7,0 VERDE-BRILHANTE Peptona ... 10,0g Lactose... 10,0g Bile de boi... 20,0g Verde brilhante... 0,0133g Água destilada... 1000mL pH = 7,2

Autoclavar a 115o_{C por 15 min. Para adicionar o verde brilhante}

pode-se preparar uma solução a 0,1% em água destilada (0,1g de verde brilhante em 100mL de água destilada) e dela juntar 13,3 mL ao meio de cultura.

Distribuir 10mL do caldo em tubos grande com tubinhos de Duhran. SORO DE LARANJA Triptona... 10,0g Extrato de leveduras... 3,0g Glicose... 4,0g Fosfato dipotássico... 15,0g Soro de laranja...200,0ml Água destilada...800,0ml

(25)

Preparar o soro de laranja aquecendo 1 litro do suco

recém-extraído, a aproximadamente 93C. Adicionar 30g de diatomácea e

misturar. Filtrar com sucção através de um funil de Buchner usando papel de filtro grosseiro recoberto com o auxílio de filtração. Refiltrar os primeiros mililitros. Ajustar o pH a 5,5 , distribuir em recipientes adequados.

PRÁTICA N 8

OBJETIVOS:

 Isolar bactérias, fungos filamentosos e leveduras de ambientes diversos

 Identificar morfologicamente as espécies isoladas

Os microrganismos em seus ambientes naturais (água, solo, ar etc) existem como uma população mista. Para que possamos estudar uma determinada espécie de microrganismo nas suas características morfológicas e bioquímicas individuais é necessário separá-la das diversas espécies contidas nessa população , obtendo uma cultura pura e é formada por microrganismso derivados de uma única célula original.

O isolamento de microrganismos requer técnicas adequadas de inoculação destes microrganismos em meios de cultura adequados que possibilitem o seu rápido crescimento, livre de contaminações.

Para o cultivo, em condições laboratoriais, de microrganismos é necessário o conhecimento de suas exigências nutritivas e das condições físicas requeridas. Extensas pesquisas determinaram exigências nutritivas de muitas espécies de microrganismos e esta informação resultou no desenvolvimento de numerosos meios de cultura. Por causa da grande variedade das necessidades nutritivas dos microrganismos há, também, grandes diferenças na composição dos meios utilizados. Do mesmo modo, existem amplas variações no que se refere ao ambiente físico que favorece seu crescimento. Alguns

microrganismos, por exemplo crescem abaixo de 0C; outros exigem

temperatura acima de 45C e podem desenvolver-se até mesmo a 70 C.

certas bactérias necessitam do oxigênio atmosférico; outras são indiferentes ou inibidas pelo oxigênio.

(26)

 Técnica de sementeira em superfície e de esgotamento do inóculo: - Com o uso de uma alça de platina, coloca-se uma porção de espécime na superfície de um meio de cultura com ágar.

- Espalhar a amostra de lado a lado, na superfície da placa ,

tracando linhas de acordo com as figuras 1 e 2 , de modo que as bactérias individuais se separem umas das outras.

- Incubar as placas na temperatura adequada

- Examinar as placas que apresentarem colônias isoladas

- Selecionar uma colônia característica da espécie estudada e anotar seus aspectos macroscópicos, tais como: tamanho, forma, consistência, cor da colônia e de seu reverso, se há pigmento solúvel etc.

- Transferir com a ajuda de uma alça de platina, material da colônia escolhida para um tubo contendo meio inclinado e incubar à temperatura e tempo adequados.

- Examinar as características do microganismo através de observações microscópicas “in vivo” e “in vitro” com colorações específicas utilizando para isso um microscópio ótico luminoso.

 Técnica da placa derramada (pour-plate): O princípio da técnica é o da diluição do material em tubos de agar liquefeito.

- Transfere-se uma alça de platina da suspensão original para o tubo A (agar fundido). O tubo é rolado entre as mãos, permitindo a mistura completa do inóculo com o meio. Transferências similares são efetuadas do tubo A para o B e, deste, para o C.

- Os conteúdos de cada tubo são derramados em placas separada - Incubar as placas na temperatura e período de tempo adequados - Examinar as placas que apresentarem colônias isoladas

- Selecionar uma colônia característica da espécie estudada e anotar seus aspectos macroscópicos, tais como: tamanho, forma, consistência, cor da colônia e de seu reverso, se há pigmento solúvel etc.

(27)

- Transferir com a ajuda de uma alça de platina, material da colônia escolhida para um tubo contendo meio inclinado e incubar à temperatura e tempo adequados.

- Examinar as características do microganismo através de observações microscópicas “in vivo” e “in vitro” com colorações específicas utilizando para isso um microscópio ótico luminoso.

 Técnica das diluições sucessivas: se o microrganismo suspeito, numa população mista, está presente em número maior do que outros germes, pode ser obtido em cultura pura por meio de uma série de diluições em meios apropriados.

- Transfere-se 1ml ou 1g do material a ser examinado para um Erlenmeyer A contendo 99ml de água estéril. Homogeniza-se permitindo a mistura completa do inóculo com a água. A partir daí, transfere-se 1ml para um tubo B com 9ml de água estéril, agita-se e repete a operação para os tubos restantes (C, D, E). Obtém-se assim uma série de diluições decimais.

- De cada tubo transferir para duas placas estéreis, amostra de 1ml, depois adicionar a cada placa cerca de 15 ml de meio fundido e

resfriado a 45o_C;

- Incubar as placas na temperatura e período de tempo adequados;

- Examinar as placas que apresentarem colônias isoladas.

Maiores detalhes sobre esta técnica estão no esquema apresentado na figura 2.

FIGURA 2 - Esquema de diluição da técnica das diluições sucessivas. Visando facilitar o entendimento e treinar o alunos nas técnicas de isolamento acima referidas, foram selecionadas de algumas técnicas sobre bactérias, bolores e leveduras. Estas técnicas deveram ser

(28)

realizadas em grupo de três alunos e realizadas num período de 1 a 2 semanas.

ISOLAMENTO DE Streptomyces sp. DO SOLO

MATERIAL

Amostra de terra seca

Erlenmeyer com 99 ml de água estéril

4 tubos de ensaio contendo cada um 9 ml de água estéril 1 balão com meio de Czapeck (CZ)

Placas de Petri esterilizadas Tubos de ensaio com meio Cz Placa com meio AVP

TÉCNICA

1o_{DIA - Pesar um grama de terra e suspender no Erlenmeyer que}

contém água estéril. Agitar para obter uma suspensão dos microrganismos existentes.

Transferir com pipeta estéril, 1 ml da suspensão para um dos tubos de água estéril; agitar bem e deste tubo retirar 1ml e transferir para outro tubo com água e assim sucessivamente sendo realizada uma série de diluições 10- 2_{, 10}- 3_{, 10}- 4_,10- 5_,10 -6_.

De cada tubo transferir para duas placas estéreis, amostra de 1ml, depois adicionar a cada placa cerca de 15 ml de meio de

CZ fundido e resfriado a 45o_C.

Agitar para homogenizar. Esperar o meio solidificar em repouso por mais ou menos 3 minutos, inverter as placas e incubar à temperatura ambiente durante 5 a 7 dias.

(29)

2o_{DIA - Observar as colônias que cresceram e escolher colônias}

típicas de Streptomyces: pequenas, secas, de cores variadas. Na escolha da colônia devem ser anotados aspectos macroscópicos, tais como: tamanho, cor, forma, bordos, características da superfície da colônia, brilho, presença de pigmento solúvel. Transferir com alça de platina parte da colônia para um tubo com CZ e para uma placa com meio de CZ e para uma placa com AVP, fazendo nesta última uma estria no centro com auxílio de uma alça em L. Incubar.

3o_{DIA - Observar o crescimento no tubo de cultura. Testar a atividade}

anti-microbiana da cepa utilizando a placa de AVP que apresenta uma estria central; inocular diferentes germes (bactérias, leveduras) fazendo estrias perpendiculares à estria central, começando a 30 mm da estria central e terminando junto à mesma. Fazer placas testemunhas inoculando apenas

as estrias de microrganismos-testes. Incubar as placas a 30o_C

ou 37o_{C dependendo da temperatura dos}

microrganismos-testes.

4o_{DIA - Observar se houver inibição e medir (o halo correspondente) a}

distância em milímetros do crescimento do microrganismo-teste até a estria de Streptomyces.

OBSERVAÇÃO:

A prática deverá ser encerrada mediante a entrega do relatório e do tubo de cultura isolada.

(30)

ISOLAMENTO DE BACILOS ESPORULADOS DO SOLO

MATERIAL

Amostra de terra seca

1 Erlenmeyer com 99 ml de água estéril

1 tubos de ensaio contendo 10ml de caldo glicosado 4 tubos de ensaio contendo cada um 9 ml de água estéril 1 balão com meio de Agar Nutritivo (AN)

Placas de Petri esterilizadas Tubos de ensaio com meio AN

TÉCNICA

1o_{DIA - Pesar um grama de terra e suspender no erlenmeyer que}

Transferir com pipeta estéril, 1 ml da suspensão para um tubo de caldo glicosado. Imergir o tubo em água fervente pelo espaço de tempo de 5 minutos. Resfriar e transferir 1 ml do caldo para um tubo com 9ml de água estéril, agitar para homogenizar e repetir a operação para mais 3 tubos. Obtém-se

assim uma série de diluições decimais 10- 4_,10- 5_,10- 6_{. De cada}

diluição transferir para duas placas estéreis, amostra de 1ml, depois adicionar a cada placa cerca de 15 ml de meio de AN

fundido e resfriado a 45o_C.

Agitar para homogenizar. Esperar o meio solidificar em repouso por mais ou menos 3 minutos, inverter as placas e incubar à temperatura ambiente durante 48 horas.

(31)

típicas de bacilos esporulados: grandes, com bordos irregulares, de superfície rugosa. Na encolha da colônia devem ser anotados aspectos macroscópicos, tais como: tamanho, cor, forma, bordos, brilho, presença de pigmento solúvel. Transferir com alça de platina parte da colônia para um tubo com AN e incubar à temperatura ambiente.

3o_{DIA - Observar o crescimento no tubo de cultura em AN. Fazer}

lâmina ïn vivo” para observar se há movimento. Realizar uma coloração de Gram e uma de esporos.

OBSERVAÇÃO:

(32)

ISOLAMENTO DE BACTÉRIAS MESOFÍLICAS DE ÁGUA

MATERIAL

Amostra de água poluída

4 tubos de ensaio contendo cada um 9 ml de água estéril 1 balão com meio de Agar Nutritivo (AN)

TÉCNICA

1o_{DIA - Pesar 1 mL da amostra e suspender no Erlenmeyer que contém}

99mL de água estéril. Agitar para obter uma suspensão dos microrganismos existentes.

Transferir com pipeta estéril, 1 ml da suspensão para um dos tubos de água estéril; agitar bem e deste tubo retirar 1ml e transferir para outro tubo com água e assim sucessivamente

sendo realizada uma série de diluições 10- 3_{, 10}- 4_,10- 5_,10- 6_.

De cada diluição transferir para duas placas estéreis, amostra de 1ml, depois adicionar a cada placa cerca de 15 ml de meio

de AN fundido e resfriado a 45o_C.

(33)

anotados aspectos macroscópicos, tais como: tamanho, cor, forma, bordos, consistência, características da superfície da colônia brilho, presença de pigmento solúvel. Transferir com alça de platina parte da colônia para um tubo com AN e incubar à temperatura ambiente.

OBSERVAÇÃO:

(34)

ISOLAMENTO DE BACTÉRIAS MESOFÍLICAS DE

SORVETE

MATERIAL

Amostra de sorvete

4 tubos de ensaio contendo cada um 9 ml de água estéril 1 balão com meio de Agar Nutritivo (AN)

TÉCNICA

1o_{DIA - Pesar 10 mL da amostra e suspender no Erlenmeyer que}

contém 90mL de água estéril. Agitar para obter uma suspensão dos microrganismos existentes.

Transferir com pipeta estéril, 1 ml da suspensão para um dos tubos de água estéril; agitar bem e deste tubo retirar 1ml e transferir para outro tubo com água e assim sucessivamente

sendo realizada uma série de diluições 10- 2_,10- 3_{, 10}- 4_,10- 5_,10- 6_.

De cada diluição transferir para duas placas estéreis, amostra de 1ml, depois adicionar a cada placa cerca de 15 ml de meio

de AN fundido e resfriado a 45o_C.

(35)

anotados aspectos macroscópicos, tais como: tamanho, cor, forma, bordos, consistência, características da superfície da colônia brilho, presença de pigmento solúvel. Transferir com alça de platina parte da colônia para um tubo com AN e incubar à temperatura ambiente.

OBSERVAÇÃO:

(36)

ISOLAMENTO DE BACTÉRIAS COLIFORMES

MATERIAL

Amostra de água de banheiro, ou pedaço de queijo coalho ou carne de sol;

Tubos com meio de verde-brilhante-lactose-bile (VB) Tubos de ensaio contendo caldo lactosado

1 balão com meio de Agar Nutritivo (AN)

Placas de Petri com meios diferenciais (EMB ou Endo ouTTC) Tubos de ensaio com meio AN

TÉCNICA

1o_{DIA - Inocular o tubo de Verde-brilhante com o material a ser}

pesquisado, incubar a 35o_{C por 48 horas.}

2o_{DIA - Inocular o tubo fermentado em placas de Petri com meio}

diferencial seguindo um dos esquemas abaixo.

Incubar à 35o_{C durante 48 horas.}

(37)

típicas de coliformes. Na escolha da colônia devem ser anotados aspectos macroscópicos, tais como: tamanho, cor, forma, bordos, consistência, brilho, presença de pigmento solúvel. Transferir com alça de platina parte da colônia para um tubo com AN e para um tubo com caldo lactosado (CL)

incubar à 35o_C.

4o_{DIA - Observar se o tubo de caldo lactosado fermentou e então se o}

tubo tiver dado resultado positivo (presença de bolha de ar) prosseguir a análise com o tubo de cultura com o meio de agar-nutritivo (AN). Realizar uma coloração de Gram e uma de esporos. Anotar os resultados e comparar com a literatura.

OBSERVAÇÃO:

(38)

ISOLAMENTO DE BACTÉRIAS DO IOGURTE

(Lactobacillus e Streptococcus )

MATERIAL

Uma amostra de Iogurte natural

Placa de Petri com meio de Agar-glicose-levedura (GL) Tubos de ensaio com meio de leite desengordurado

Tubos de ensaio com meio de Agar-glicose-levedura (GL)

TÉCNICA

1o_{DIA - Fundir e resfriar o meio de cultura; em seguida distribuir em}

placas de Petri. Quando o meio solidificar fazer estrias com o material pesquisado na superfície de cada uma das placas. Cada aluno deverá realizar a técnica de esgotamento utilizando apenas uma placa, segundo o desenho abaixo:

ou então, com uma alça em L fazer estrias paralelas a partir da gota depositada na primeira placa e continuando em mais duas placas do mesmo meio, segundo o esquema abaixo:

(39)

repouso por mais ou menos 3 minutos, inverter as placas e

incubar em condições anaeróbicas ou sob tensão de CO2 (por

exemplo, utilizando uma lata cuidadosamente no fundo da lata e a seguir fechar bem, por um período de 48 a 72 horas.

distintas.

Na escolha da colônia devem ser anotados aspectos macroscópicos, tais como: tamanho, cor, forma, bordos, consistência, brilho, presença de pigmento solúvel. Transferir com alça de platina parte da colônia para um tubo com meio de GL e para um tubo com meio de leite (o qual pode conter um corante indicador). Incubar.

3o_{DIA - Observar o se há coagulação no tubo com meio de leite.}

Verificar se há crescimento no tubo de GL e realizar uma coloração de Gram. Incubar. Comparar com os dados obtidos na prática com os fornecidos pela literatura.

OBSERVAÇÃO:

(40)

ISOLAMENTO DE BOLORES DO SOLO

MATERIAL

Uma amostra de terra seca

Um Erlenmeyer com 99 ml de água estéril 4 tubos com 9 ml de água estéril

Um balão com meio de Czapeck (CZ) fundido 8 placas de Petri estéreis

4 tubos e quatro placas com meio de Czapeck

TÉCNICA

1o_{DIA - Pesar um grama de terra e suspender no Erlenmeyer que}

Transferir com pipeta estéril, 1 ml da suspensão para um dos tubos de água estéril; agitar bem e deste tubo retirar 1ml e transferir para outro tubo com água e assim sucessivamente sendo realizada uma série de diluições 10- 2_{, 10}- 3_{, 10}- 4_,10- 5_,10 -6_.

De cada tubo transferir para duas placas estéreis, amostra de 1ml, depois adicionar a cada placa cerca de 15 ml de meio de

CZ fundido e resfriado a 45o_C.

Agitar para homogenizar e incubar à temperatura ambiente durante 5 a 7 dias.

2o_{DIA - ( 5 a 7 dias depois) Observar as colônias que cresceram e}

escolher colônias típicas de bolores: filamentosas, grandes, de cores variadas.

(41)

Na escolha da colônia devem ser anotados aspectos macroscópicos, tais como: tamanho, cor, forma, bordos, consistência, brilho, presença de pigmento solúvel. Transferir com alça de platina parte da colônia para um tubo com CZ e para uma placa com meio de CZ. Incubar.

3o_{DIA - Observar o crescimento da colônia gigante na placa e a partir}

da cultura crescida no tubo, preparar um cultivo em câmara úmida. Incubar

4o_{DIA - Observar a lâmina ao microscópio para determinar tipos de}

hifas, tipo de esporos assexuados, e se possível a classe e o gênero do fungo em estudo

OBSERVAÇÃO:

(42)

ISOLAMENTO DE BOLORES DO MATERIAL MOFADO

MATERIAL

Uma amostra de pão, queijo, fruta ou outro material mofado

Placa de Petri com meio de Czapeck (CZ) e Batata-glicose-agar (BGA) Tubos de ensaio com meio de CZ e BGA

1o_{DIA - Fundir e resfriar os meios de BGA e CZ; em seguida}

acidificar com ácido lático a pH 3,5. Distribuir em placas de Petri. Esperar solidificar. Com o auxílio de uma alça em agulha incubar material mofado no centro de cada um dos meios contidos em placas. Incubar à temperatura ambiente durante 5 dias.

2o_{DIA - ( 5 a 7 dias depois) Observar as colônias que cresceram e}

escolher colônias típicas de bolores: filamentosas, grandes, de cores variadas.

Na encolha da colônia devem ser anotados aspectos macroscópicos, tais como: tamanho, cor, forma, bordos, consistência, brilho, presença de pigmento solúvel. Transferir com alça de platina parte da colônia para um tubo com CZ e para uma placa com meio de CZ. Incubar.

3o_{DIA - Observar o crescimento da colônia gigante na placa e a partir}

da cultura crescida no tubo, preparar um cultivo em câmara úmida. Incubar

4o_{DIA - Observar a lâmina ao microscópio para determinar tipos de}

hifas, tipo de esporos assexuados, e se possível a classe e o gênero do fungo em estudo

(43)