VANESSA CRISTINA DIAS BÓBBO
SUBSTITUIÇÃO DIETÉTICA COM PROTEÍNA DE SOJA REDUZ MARCADORES SISTÊMICOS DA INFLAMAÇÃO E PARÂMETROS METABÓLICOS INDEPENDENTEMENTE DA REDUÇÃO DE ADIPOSIDADE
CAMPINAS 2015
DEDICATÓRIA
À Angelina Pavarin Bóbbo. Aos meus pais.
AGRADECIMENTOS
Ao meu pai, que me ensinou com sua simplicidade e inteligência o que eu considero mais importante em minha vida.
À minha mãe, pelo essencial apoio, cuidado e companheirismo de agora e sempre.
Ao Edu, que me escutou, instigou e acompanhou de perto nesta trajetória. À minha orientadora Eliana Araújo, por toda atenção, inspiração, incentivo, positividade, e confiança. Obrigada por ter me dado a oportunidade de ser sua
orientanda, e por ter construído comigo uma amizade.
Aos brilhantes professores Maria Helena Melo e Lício Velloso, pela inspiração e incentivo em estudar, e pela oportunidade de aprender junto a eles. Em
especial ao professor Lício, que me acolheu em seu laboratório e fundamentalmente possibilitou a realização deste estudo. À amiga Letícia Paiva, inseparável companheira de Unicamp. Ao pessoal do laboratório de sinalização celular, por todo carinho, ajuda e
sorrisos.
À Erika Anne, Gerson e Joseane, que tão prontamente atenderam às minhas solicitações e possibilitaram o bom andamento deste estudo.
À Milena Fioravante, por ter me ajudado com as orientações nutricionais aos voluntários.
Ao Henrique Ceretta, pela valiosa ajuda com as análises estatísticas. Ao Antônio Calixto, pela também valiosa ajuda com o ELISA.
Aos voluntários da pesquisa, pela grande colaboração, confiança e agradável convivência durante o acompanhamento.
Aos amigos e família, pelo amor e suporte incondicional. À Capes e à GSK, pela concessão da bolsa.
“…A soul in tension that's learning to fly Condition grounded but determined to try Can't keep my eyes from the circling skies…”
RESUMO
O aumento da prevalência de obesidade é atualmente um dos maiores problemas de saúde pública no mundo. Entretanto, até o momento o tratamento de pacientes obesos e/ou com sobrepeso consiste na mudança no comportamento alimentar e aumento da atividade física. Estudos recentes têm mostrado que os regimes de substituição de refeições são seguros e estão associados com a maior perda de peso do que os planos de dieta individualizados. O suplemento pode ser utilizado como substituto de refeição, pois possui propriedades que favorecem a perda de peso e o controle de diversos parâmetros metabólicos. As isoflavonas da soja são fitoestrógenos não-esteróides, que podem se ligar aos receptores de estrógenos e mimetizar suas ações. Vários estudos em humanos e animais sugerem que a soja desempenha um papel benéfico na redução da obesidade e, portanto, no diabetes mellitus tipo 2. Os objetivos deste trabalho são avaliar e relacionar marcadores inflamatórios séricos, parâmetros metabólicos e antropométricos de pacientes obesos e diabéticos submetidos à dieta com proteína de soja e comparar aos pacientes que receberam orientações sobre alimentação e mudanças no estilo de vida. No decorrer de um ano, a cada dois meses, foram acompanhados em avaliações 38 pacientes obesos e portadores de diabetes mellitus tipo 2 tratados apenas com hipoglicemiantes orais. Os pacientes foram randomicamente divididos em dois grupos: O grupo ILS (Intervention of Life Style, ou intervenção no estilo de vida) recebeu orientação nutricional para uma dieta de 2000 kCal/dia e aconselhamento sobre mudanças no estilo de vida. O grupo SR (Soya Replacement, ou substituto de soja) recebeu as mesmas orientações, porém com substituição completa de uma das refeições por um composto rico em proteína de soja. Foi detectado que a substituição dietética com o composto rico em proteína de soja resultou em redução significativa da massa corporal e da adiposidade acompanhados pela redução dos níveis sanguíneos de hemoglobina glicada e dos marcadores inflamatórios séricos TNF-α e MCP-1. Pacientes do grupo ILS não apresentaram modificação significativa dos parâmetros testados. Apesar de a substituição dietética com composto rico em proteína de soja ter promovido redução de adiposidade e de
marcadores inflamatórios, tais parâmetros variaram de forma independente. Em conclusão, a substituição dietética por composto rico em proteína de soja, juntamente com o acompanhamento e orientações oferecidos em consultas de enfermagem, devem ser considerados como abordagem eficaz no controle de peso, de parâmetros metabólicos e inflamatórios em pacientes obesos com diabetes mellitus tipo 2.
Palavras Chave: Enfermagem, Diabetes mellitus tipo 2, Inflamação, Proteínas de soja, Resistência à insulina.
ABSTRACT
The increasing prevalence of obesity is currently one of the major public health problems in the world. However, by the time the treatment of obese patients and/or overweight patients is the change in feeding behavior and increased physical activity. Recent studies have shown that meal replacement plans are safe and associated with greater weight loss than the individualized diet plans. Soya suplement may be used as a meal replacement, because it has properties that promote weight loss and control of various metabolic parameters. Soya isoflavones are non-steroidal phytoestrogens, which can bind to estrogen receptors and mimic their actions. Several studies in humans and animals suggest the beneficial role of soya in reducing obesity and therefore in diabetes mellitus type 2. The aims of this study are to evaluate and relate serum inflammatory markers, metabolic parameters and anthropometric parameters of obese and diabetic patients undergoing diet with soya protein, and compare to patients receiving guidance on diet and lifestyle changes. Over the course of a year, every two months, were accompanied in consultation 38 obese and diabetic patients in treatment with oral antidiabetics only. Patients were randomly divided into two groups: the ILS Group (Intervention of Life Style) received nutritional guidance to a diet of 2000 kCal/day and advice on changes in lifestyle. The SR Group (Soya Replacement) received the same guidelines, but with complete replacement of one of the meals by a compound rich in soya protein. It was detected that the dietary substitution with the compound rich in soya protein resulted in a significant reduction in body weight and adiposity accompanied by reduction in blood levels of glycated haemoglobin and serum inflammatory markers of TNF-α and MCP-1. Patients from ILS showed no significant modification of all parameters tested. Although dietary substitution with compound rich in soya protein have promoted reduction of adiposity and of inflammatory markers, such parameters were varied independently. In conclusion, dietary substitution by compound rich in soya protein, along with tracking and guidance offered in nursing consultations, should be regarded as effective approach in controlling weight, metabolic and inflammatory parameters in obese patients with diabetes mellitus type 2.
Key Words: Nursing, Diabetes Mellitus, Type 2, Inflammation, Soybean Proteins, Insulin Resistance.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Body mass in Kg, BMI in Kg/m2, and adiposity in % of body mass for ILS and SR groups at times of evaluation………..………..25 Figura 2. Glucose in mg/dl and HbA1c in % for ILS and SR groups at times of evaluation………...………..………….27 Figura 3. TNF-α, MCP-1, MCP-2, and TGF1β in pg/ml for ILS and SR groups at times of evaluation……….……….…29
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Supplement Facts………..…24 Tabela 2. Mean and SD values of anthropometric parameters for SR and ILS groups with analysis intermoments for each group……….……….26 Tabela 3. Mean and SD values of metabolic parameters for SR and ILS groups with analysis intermoments for each group………..………..…28 Tabela 4. Correlations between variables using mean difference intermoments for both groups………..………..……….30
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
Akt Proteína Quinase B
AMDIT Almased® Multicenter Diabetes Intervention Trial (Ensaio de intervenção multicêntrico em Diabetes Almased®)
AMPK Adenosina Monofosfato Quinase BIA Análise de Bioimpedância
CEP Comitê de Ética em Pesquisa
CETS Centro de Educação do Trabalhador de Saúde
Cm Centímetro
CT Colesterol Total
CYP7A1 Enzima Colesterol 7-Alfa Hidroxilase DM2 Diabetes Mellitus tipo 2
ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Assay ERE Elemento de Resposta ao Estrógeno FGF Fator de Crescimento de Fibroblasto
Fosfo-CREB Proteína Ligante ao Elemento de Resposta do AMP Cíclico
Gli Glicemia
HbA1c Hemoglobina Glicada
HDL Lipoproteína de Alta Densidade ILS Intervention of Life Style
IKK I-Capa-B-Quinase
IL Interleucina
IMC Índice de Massa Corpórea
IRS1 Substrato do Receptor de Insulina 1 IκB-α I-Capa-B-Alfa
JNK C-Jun N-Terminal Quinase
Kg Quilograma
Kg/m2 Quilogramas por Metro Quadrado
LDL Lipoproteína de Baixa Densidade LPL Lipoproteína Lipase
LRH1 Homólogo Receptor de Fígado 1 LXR-α Receptor X Alfa
mg/dl Miligramas por Decilitro NF-Κb Fator Nuclear Capa B
OMS Organização Mundial de Saúde PCR Proteína C-Reativa
pg/ml Picograma por Mililitro
PKR Proteína Quinase Ativada por RNA
PPAR Receptor Ativado por Proliferador de Peroxisoma
RE Receptor de Estrógeno
SHP Proteína Heterodímera Pequena
SR Soya Replacement
TCLE Termo de Consentimento Livre e Esclarecido
TG Triglicérides
SUMÁRIO
1.Introdução ... 1 2. Objetivos ... 8 2.1. Objetivo Geral ... 8 2.2. Objetivos específicos ... 8 3. Métodos... 8 3.1. Desenho do Estudo ... 83.2. Informações técnicas acerca do suplemento alimentar ... 9
3.3. Seleção de participantes ... 10
3.3.1. Critérios de inclusão ... 11
3.3.2. Critérios de exclusão ... 11
3.4. Delineamento do seguimento dos participantes... 11
3.4.1. Grupo SR ... 12
3.4.2. Grupo ILS ... 12
3.5. Descrição dos procedimentos ... 13
3.5.1. Verificação da Altura ... 13
3.5.2. Verificação da circunferência da cintura e quadril... 13
3.5.3. Verificação da massa corpórea ... 13
3.5.4. Bioimpedância Corporal ... 13
3.5.5. Aferição da Pressão Arterial Sistêmica ... 14
3.5.6. Coleta de sangue ... 14
3.5.7. Verificação de Creatinina e Albumina urinária ... 14
3.5.8. Avaliação dos marcadores inflamatórios ... 14
3.6. Forma de Análise dos Resultados ... 15
3.7. Aspectos Éticos ... 15
4. Resultados ... 17
Capítulo 1: Soya protein dietary substitution improves systemic markers of inflammation and metabolic parameters independently of the reduction of adiposity ... 18
5. Conclusão ... 34
6. Referências ... 34
APÊNDICE 2 - Critérios para Seleção do Estudo ALMASED® – Dados do
Voluntário ... 43
ANEXO 1 - Orientações Nutricionais ... 44
ANEXO 2 - Autorização do CETS ... 49
ANEXO 3 - Parecer consubstanciado do CEP- Projeto Principal ... 50
1. Introdução
O aumento da prevalência de obesidade em várias regiões do mundo vem se tornando um dos mais importantes problemas de saúde pública da atualidade. Mais de 300 milhões de pessoas no planeta são consideradas obesas, isto é, com Índice de Massa Corpórea (IMC) maior ou igual a 30 quilogramas por metro quadrado (Kg/m2). Segundo projeções da Organização Mundial de Saúde
(OMS), caso não ocorra nenhuma alteração nos padrões de comportamento atuais; em 2030, haverá cerca de 2,16 bilhões de adultos com sobrepeso e 1,12 bilhões de obesos. Se esta tendência se mantiver, é estimado que a população com Diabetes Mellitus tipo 2 (DM2) aumente de 171 milhões para 366 milhões de indivíduos até 2030(1,2).
A obesidade é resultante do desequilíbrio entre ingestão calórica e gasto energético. Quando prevalecer a ingestão alimentar, resultará num estado de balanço energético positivo e portanto o ganho de peso(3,4).
O problema da obesidade se deve a interação complexa entre diversos fatores genéticos, metabólicos, hormonais e ambientais, ainda não totalmente esclarecidos. Ela está associada a um maior risco de morte prematura, principalmente por predispôr o indivíduo a uma série de doenças crônicas não transmissíveis, como hipertensão arterial sistêmica, dislipidemia, doença hepática gordurosa não-alcoólica, doenças cardiovasculares, certos tipos de câncer e principalmente resistência à insulina e DM2(5,6). A partir de um IMC de 24, qualquer
aumento de um ponto no IMC leva a um aumento de duas vezes no risco relativo para o DM2(7).
Durante a última década, estudos demonstraram que um estado de inflamação crônica subclínica está associado à obesidade, DM2 e resistência à insulina(8). A resposta inflamatória que surge na presença da obesidade se dá tanto
pelo consumo excessivo de nutrientes (por exemplo, lipídios) quanto pelo próprio tecido adiposo(9). Antes considerado apenas um reservatório energético, atualmente
é também considerado um órgão endócrino, que se comunica com o sistema nervoso central e com tecidos periféricos(10,11). Esta comunicação se dá por meio da
metabolismo, incluindo leptina, resistina, adiponectina, visfatina, glicerol, ácidos graxos não esterificados, Fator de Necrose Tumoral Alfa (TNF-α), Interleucina 6 (IL-6), Proteína 1 Quimiotáxica de Monócitos (MCP-1), Proteína 2 Quimiotáxica de Monócitos (MCP-2), e fractalquinas(9,12,13,14).
Sabe-se que na condição de obesidade, o tecido adiposo de humanos e camundongos é caracterizado por um infiltrado de macrófagos. Pequenas proteínas conhecidas como quimiocinas são responsáveis pelo direcionamento de leucócitos circulantes a sítios de inflamação, através de quimiotaxia. Quimiocinas como MCP-1 e MCP-2 atraem células mononucleares a sítios de inflamação crônica, como o tecido adiposo de indivíduos obesos. É sabido que no contexto da obesidade, MCP-1 está associado a infiltração de macrófagos em tecido adiposo, evento pró inflamatório que leva à resistência à insulina(15). Além do mais, esta condição está
correlacionada com a alta incidência de morte de adipócitos, já que estes macrófagos parecem atuar na remoção de células mortas e consequente remodelação do tecido adiposo, e são fonte adicional de citocinas pró-inflamatórias e outros mediadores solúveis(9,16,17). Tais citocinas prejudicam a sinalização de leptina
e insulina nos tecidos periféricos e também no hipotálamo, região do encéfalo de importante função na homeostase corporal. O defeito na regulação desses hormônios no hipotálamo prejudica a homeostase, o que por sua vez culmina no desarranjo contínuo do controle da fome e termogênese, podendo perpetuar a obesidade(18).
A liberação de diversas substâncias já mencionadas pelo tecido adiposo, principalmente citocinas pró inflamatórias, favorecem o desenvolvimento de resistência à insulina. A indução da inflamação em tecido adiposo acontece por ativação de proteínas quinases c-Jun N-terminal Quinase (JNK), I-Capa-B-Quinase (IKK) e Proteína Quinase Ativada por RNA (PKR), levando a fosforilação do Substrato do Receptor de Insulina 1 (IRS1) em serina, inibindo a cascata de sinalização de insulina. A consequência desta inibição é promover a resistência à insulina. Além do mais, a ativação destas proteínas também estimulam a produção de moduladores inflamatórios, como Fator Nuclear Capa B (NF-κB), com consequente produção de mais citocinas pró-inflamatórias(9).
Combinado a isso, há evidências de que a exposição de células β pancreáticas a altas concentrações de ácidos graxos não esterificados (condição
existente na obesidade) leva a deficiência na secreção de insulina estimulada por glicose, bem como problemas na biossíntese de insulina. Assim, diante da disfunção em células β e da resistência à insulina causada por tecido adiposo, ocorre o desenvolvimento do DM2(14).
Entretanto nos últimos anos várias evidências têm indicado que os estrógenos são reguladores importantes da adiposidade. Eles são conhecidos por modular a distribuição de gordura corpórea e o metabolismo do tecido adiposo, diretamente por meio da adipogênese e da lipólise ou indiretamente através da modulação do balanço energético(19). Os Receptores de Estrógeno (REs) podem
ativar ou inibir a transcrição de diversos genes. Quando um ligante de REs os tornam ativos, no núcleo estes se ligam aos Elementos de Resposta ao Estrógeno (ERE) em regiões promotoras de genes alvo. Após a ligação, há a regulação da expressão gênica. Sabe-se que na membrana plasmática, os REs podem atuar junto a outras moléculas sinalizadoras por meio de fosforilação, como em tirosinas quinases e proteínas quinases(20).
A regulação da adiposidade pelo estrógeno se dá pela supressão da transcrição do gene da Lipoproteína Lipase (LPL), proteína responsável por regular o metabolismo de lipídios, através do catabolismo dos Triglicérides (TG) em ácidos graxos livres e glicerol. Assim, o estrógeno leva a redução do acúmulo de ácidos graxos em adipócitos(21).
Da mesma forma, o estrógeno suprime a expressão de Receptor Ativado por Proliferador de Peroxisoma Alfa (PPARα) e Receptor Ativado por Proliferador de Peroxisoma Gama (PPARγ), que agem como o LPL, influenciando no armazenamento de ácidos graxos em células adiposas(22,23).
Sabe-se que o estrógeno também tem efeitos neuroprotetores. Sua ação em células neuronais inibe a cascata de apoptose por meio de ativação de proteínas anti-apoptóticas, através da via da Proteína Ligante ao Elemento de Resposta ao AMP Cíclico (fosfo-CREB) e via da Proteína Quinase B (Akt). Além disso, há evidências de que o estrógeno é capaz de agir no desenvolvimento e diferenciação de células no cérebro, como no evento de formação de novas células neuronais – a neurogênese(24). O estrógeno também pode modular o receptor de leptina no
Além disso, o estrógeno desempenha papel importante na homeostase glicêmica e sensibilidade à insulina(25). A estimulação de REs leva ao efeito de
sensibilização à insulina: a ação do estrógeno em seus receptores promove fosforilação de Proteína Ativada por Adenosina Monofosfato (AMPK) e Akt. Assim, estimula-se a captação de glicose e ação da insulina em músculo esquelético(20,26).
Estudos com mulheres pós-menopausadas mostram a relação da menopausa ao desenvolvimento de obesidade visceral e resistência à insulina, e maior risco de desenvolvimento de DM2(27). Além disso, animais knockout para REs
apresentam vários fenótipos que se assemelham a humanos, tais como o aumento adiposidade, intolerância à glicose e resistência à insulina, demonstrando a implicação fundamental de estrógenos nesses processos metabólicos(28).
Diante do exposto, é possível afirmar que a obesidade e o DM2 não são doenças com um único fator predisponente, e sim o resultado de um grupo heterogêneo de condições com múltiplas causas. Tal complexidade contribui de forma significativa para a dificuldade de encontrar terapias mais eficientes para a resolução desse problema. Além disso, a adoção de padrões comportamentais que priorizam atividades profissionais sedentárias, e o aumento do consumo de dietas ricas em gorduras, são os principais fatores ambientais associados ao progressivo aumento da prevalência dessas doenças nos dias atuais(29,30).
Até o momento as medidas terapêuticas não invasivas eficazes para o tratamento de pacientes obesos e ou com sobrepeso residem na perda de peso por meio de mudanças no estilo de vida. Há um consenso generalizado de que em longo prazo, mudança no comportamento alimentar e aumento da atividade física diária, são os pilares na prevenção e no tratamento da obesidade(31,32).
Estudos recentes têm mostrado que os regimes de substituição de refeições por compostos alimentares industrializados são seguros e estão associados com a maior perda de peso do que os planos de dieta individualizados(33,34). Estudos da década passada já mostraram que esses
compostos tornaram-se bastante populares nos Estados Unidos como estratégia para perda de peso. Muitos norte-americanos (15% das mulheres e 13% dos homens) supostamente já usavam substitutos de refeições como meio para perda de
peso, o que sugere que eles podem ser facilmente incorporados ao estilo de vida do paciente(35).
Vários desses compostos têm como elemento básico proteínas de origem vegetal, como aquela encontrada na soja. Sua proteína contém a maioria dos aminoácidos essenciais encontrados em fontes de proteína animal, além de diversos componentes descritos como possuidores de atividades biológicas que são alvos de investigações em diversas partes do mundo(36). As isoflavonas de soja, em particular
os fitoestrógenos genisteína e daidzeína, são compostos semelhantes ao estrógeno, mais especificamente ao estradiol 17-beta, por ter estrutura química semelhante, devido aos anéis benzênicos de suas moléculas(37,38).
A genisteína e a daidzeína conseguem se ligar aos REs levando a supressão da transcrição do gene da LPL, atuando na distribuição de gordura corporal(21,38,39).
Assim como o estrógeno, há indícios de que o consumo de isoflavonas em humanos leva a fosforilação da AMPK em tecido adiposo e músculo esquelético(40). Assim, AMPK ativada levaria ao desenvolvimento de uma cascata de
reações, aumentando a expressão de genes relacionados à oxidação de ácidos graxos e captação de glicose(41).
Em recente metanálise, foi encontrado que a suplementação com isoflavonas de soja reduziu significativamente o peso corporal em população de mulheres pós menopausadas. Este estudo também revelou que os resultados mais significativos se deram em voluntárias com IMC menor que 30 kg/m2, que utilizaram
a suplementação de isoflavonas de soja por menos de 6 meses, com dose menor que 100 miligramas (mg)/dia(42).
No entanto há outros mecanismos moleculares pelos quais as proteínas da soja parecem levar a efeitos metabólicos importantes no controle de doenças relacionadas à obesidade. Em estudo realizado com linhagem de células murinas pré-osteoblásticas foi verificado que a exposição a baixas concentrações de genisteína é capaz de ativar REs, levando a estimulação da osteogênese e a regulação negativa da atividade transcripcional do PPARγ, o que por sua vez leva a inibição da adipogênese. Por outro lado, a exposição a altas concentrações proporcionou um efeito inverso, ou seja, aumento da atividade de PPARγ com aumento da adipogênese e regulação negativa da osteogênese. A ativação do
PPARγ pareceu se dar por inibição da via da Proteína Quinase Ativada por Mitógeno (MAPK)(43). Desta forma esse estudo sugeriu que o efeito da genisteína de soja
sobre o peso corporal acontece de maneira dose-dependente por meio da modulação da atividade do PPARγ que regula a expressão de genes responsáveis pela captação de ácidos graxos(43). Além disso, Gigleux et al demonstrou que a
proteína de soja ingerida por 34 pacientes hiperlipidêmicos levou a redução significativa dos níveis plasmáticos da Lipoproteína de Baixa Densidade (LDL) comparáveis àqueles pacientes que faziam uso apenas de estatinas as quais sabidamente são agentes hipolipemiantes(44).
Por outro lado, há estudos que demonstram que a proteína de soja pode reduzir o colesterol sérico por meio da excreção de ácidos biliares(45). A excreção de
ácidos biliares é regulada por diversos fatores. A via clássica de liberação é dependente da enzima Colesterol 7-Alfa Hidroxilase (CYP7A1)(46).
Em estudo realizado por Arellano-Martínez et al, ratos alimentados com 20% de proteína de soja combinada a 0,2% de colesterol apresentaram aumento da expressão de CYP7A1, e redução da expressão de proteínas cuja função é inibir a produção de ácidos biliares como a Proteína Heterodímera Pequena (SHP), o Homólogo Receptor de Fígado 1 (LRH1) e o fator de crescimento de fibroblasto (FGF)(47). No fígado, o Receptor X Alfa (LXR-α) é o fator de transcrição que
estimulado pela presença de esterol, aumenta a expressão de CYP7A1(46). Notou-se
neste estudo que o aumento da expressão de LXR-α em animais que consumiram proteína de soja também regulou a expressão dos transportadores de colesterol para o lúmen intestinal, contribuindo para a redução de níveis séricos de colesterol(47).
Outro importante mecanismo pelo qual a soja exerce seus efeitos é dependente da microbiota intestinal. Quando ocorre a degradação da daidzeína pelas beta-glucosidases no ambiente da microflora intestinal, há produção de importante metabólito que atua como fitoestrógeno – o equol(48). Estima-se que 30 a
40% da população produza este metabólito após consumo de fitoestrógenos(49). É
possível afirmar que a capacidade em produzir equol está associada a melhoria dos niveis de lípides séricos(50).
Além de melhorias no peso corporal, glicemia e níveis de lipídios circulantes, investigações recentes têm mostrado o poder anti-inflamatório da soja. O
consumo de proteínas da soja é capaz de reduzir as concentrações de marcadores inflamatórios sistêmicos como a Proteína C-Reativa (PCR), IL6 e TNF-α(51). Em
estudo controlado e randomizado realizado com mulheres idosas, foi observado que as mulheres que consumiram proteína de soja ou isoflavonas de soja por um ano não tiveram aumento dos níveis de IL6, se comparadas ao grupo que recebeu placebo(50).
Em ratos com esteatohepatite não alcoólica alimentados com dieta hiperlipídica combinada a genisteína foi observada a redução de TNF-α e IL-6, em fígado e sangue. A ação anti-inflamatória da genisteína parece se dar pela inibição da JNK, da translocação NF-κB, e da fosforilação de I-Capa-B-Alfa (IκB-α)(52). O
bloqueio destas vias inflamatórias estacionou a evolução da esteatohepatite não alcoólica nestes animais(52).
Além desses efeitos há trabalhos que demonstram que a utilização da soja está relacionada com a redução tanto in vitro como in vivo do estresse oxidativo, e estimulação da produção de óxido nítrico o que leva a um efeito protetor para a hipertensão arterial sistêmica(53), devido a inibição da atividade tirosina
quinase, cuja atividade está relacionada a proteínas da via de sinalização da insulina e angiotensina(43,54,55).
Por conseguinte, devido aos múltiplos efeitos da soja muitos autores sugerem que novos estudos devem ser realizados sobretudo em seres humanos. Deste modo, este estudo se justifica pela importância em compreender melhor os benefícios da dieta com a proteína de soja já que ela está presente em vários produtos alimentares disponíveis no mercado o que explica a relevância de pesquisas que avaliem o potencial de exploração desse produto.
Portanto, nossa hipótese se baseia nas evidências de que um regime de substituição de refeição pelo uso de proteína da soja pode ser mais eficaz na melhora do controle glicêmico, diminuição do sobrepeso e obesidade, por ser capaz entre outros fatores de diminuir o estado de inflamação subclínica, quando comparados a intervenções de estilo de vida que consistem apenas em uma dieta de baixo valor calórico e na diminuição do sedentarismo, o que infelizmente, tem se demonstrado ineficiente.
2. Objetivos
2.1. Objetivo Geral
Avaliar os marcadores inflamatórios em pacientes com diabetes tipo 2 submetidos a dieta com proteína de soja e comparar à aqueles que não utilizaram este produto.
2.2. Objetivos específicos
Avaliar a expressão de TNF-α, MCP-1, MCP-2, TGFβ1.
Relacionar a modulação dos marcadores inflamatórios com parâmetros metabólicos e antropométricos.
3. Métodos
3.1. Desenho do Estudo
Estudo clínico randomizado e controlado, de abordagem quantitativa, prospectivo, de caráter exploratório, com um período de duração de 12 meses. Este estudo foi desenvolvido a partir do ensaio clínico “Evaluation of Almased® on glycemic control and metabolic effects in patients with type 2 diabetes: a five country randomized controlled trial.” (Avaliação de Almased® no controle glicêmico e metabólico em pacientes com diabetes tipo 2: Um ensaio controlado randomizado em cinco países), respeitando o protocolo Almased® Multicenter Diabetes Intervention Trial (AMDIT). Trata-se de um ensaio de intervenção em diabetes, multicêntrico, controlado e randomizado. Os países participantes foram: Alemanha, Brasil, Inglaterra, Índia e Estados Unidos da América. O objetivo deste estudo foi avaliar a efetividade do suplemento alimentar à base de proteína de soja Almased® no controle glicêmico e metabólico em pacientes com diabetes tipo 2 durante um período de 12 meses, em diferentes populações. Este estudo contou com financiamento concedido pela Universidade de Freiburg (Alemanha). Este estudo está associado ao projeto “O tecido adiposo marrom em humanos – conexões funcionais com o hipotálamo, com a ação da insulina e ácidos biliares”.
3.2. Informações técnicas acerca do suplemento alimentar
O alimento oferecido é classificado como suplemento alimentar, e possui marca registrada Almased®. Trata-se de proteína de soja e iogurte, apresentado em forma de pó seco para ingestão oral. Apesar de possuir mel em sua composição, apresenta um índice glicêmico de 27 em uma porção de 50 gramas, portanto seguro para pacientes diabéticos (baixo índice glicêmico: menor que 55). O suplemento foi custeado pela empresa fabricante do produto, em associação com a universidade financiadora.
Ingredientes que compõem o suplemento: proteína de soja isolada, mel, iogurte desnatado em pó, cloreto de potássio, carbonato de magnésio, citrato de cálcio, vitamina C, niacina, riboflavina (vitamina B2), vitamina E, óxido de zinco, fumarato ferroso, sulfato de manganês, pantotenato de cálcio, vitamina B2, vitamina B6, vitamina B1, vitamina A, ácido fólico, iodeto de potássio, seleneto de sódio, biotina, vitamina D3, vitamina B12.
O quadro a seguir traz informações nutricionais constantes no rótulo do produto:
Quadro 1: Informações nutricionais Almased® Porção: 50 gramas ou 8 colheres de sopa
Quantidade por porção % com base em Valores diários* Calorias 180 -- Calorias de gorduras 9 -- Gorduras Totais 1g 1,5% Gorduras Saturadas 0,5g 2,5% Gorduras Trans 0g ** Gorduras Poliinsaturadas 0,1g ** Gorduras Monoinsaturadas 0,4g ** Colesterol 0 0% Sódio 340mg 15% Potássio 500mg 14% Carboidratos Totais 15g 6% Fibras 0,5g 2% Açúcares 15g ** Proteínas 27g 54% Vitamina A 794UI 16% Vitamina C 16mg 27% Vitamina E 6UI 20% Vitamina B1 0,5mg 33% Vitamina B2 0,6mg 35% Vitamina B6 0,7mg 35% Cálcio 215mg 22% Ferro 4,9mg 27%
*Valores diários baseados em dieta com 2000 calorias **Valores diários não estabelecidos
3.3. Seleção de participantes
O tamanho da amostra foi definido pelo protocolo AMDIT, no qual deve-se incluir 50 indivíduos aptos de acordo com critérios de inclusão e exclusão, com a possibilidade de participar na intervenção do estilo de vida (Intervention Of Life Style - ILS) ou no regime de substituição de refeição (Soya Replacement - SR) durante
período de um ano. Dentre eles, 35 foram designados à dieta SR com suplemento alimentar à base de proteína de soja e os outros 15 apenas à ILS.
Os indivíduos foram selecionados em centro de saúde e em ambulatório especializado de um hospital universitário da cidade de Campinas, e foram acompanhados em ambulatório do hospital universitário.
3.3.1. Critérios de inclusão
Foram incluídos pacientes de ambos os sexos, independente da etnia, maiores de 21 anos, com diabetes mellitus tipo 2(56) , não insulino-dependentes, com
hemoglobina glicada (HbA1c) entre 8 a 10%; IMC entre 25-40 kg/m2; e pressão
arterial sistêmica menor que 160 / 100 milímetros de mercúrio.
3.3.2. Critérios de exclusão
Foram excluídos os indivíduos que podem ter dificuldade em aderir à intervenção no estilo de vida, ou aqueles com condições médicas que possam interferir com os objetivos do estudo. Portanto os pacientes fisicamente incapazes, com transtornos psicóticos, usuários de álcool (14 doses de bebidas alcoólicas/semana) ou drogas ilícitas (relato nos últimos 12 meses), em uso atual de medicamentos para perda de peso (anfetaminas), com história de cirurgia bariátrica, em tratamento crônico com corticosteróides sistêmicos, que tiveram câncer nos últimos cinco anos, vírus da imunodeficiência humana positivo (auto-relato), tuberculose ativa (auto-relato), angina, história de parada cardíaca, arritmia, fibrilação atrial não controlada, transplante de coração, história de aneurisma da aorta, frequência cardíaca em repouso menor de 45 ou superior a 100 batimentos / minuto, e mulheres grávidas ou amamentando.
3.4. Delineamento do seguimento dos participantes
Após aceitação em participar do estudo, leitura do Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE) (Apêndice 1) junto à pesquisadora, e assinatura do termo, os participantes foram distribuídos aleatoriamente para o programa de ILS ou SR, após avaliação dos critérios de elegibilidade. A
randomização se deu através de sorteio, realizado pelo próprio paciente. Os indivíduos deveriam estar preparados para modificar sua dieta e praticar atividades físicas. A universidade financiadora disponibilizou verba para o suprimento dos gastos que cada paciente possuiu com transporte e alimentação para os dias de consulta e exames.
Foram coletadas informações demográficas como: nome, endereço, número de telefone, data de nascimento, raça/etnia, histórico médico, comorbidades, medicamentos utilizados no momento da pesquisa foram registrados em uma ficha elaborada pela pesquisadora (Apêndice 2). Os indivíduos realizaram seguimento ambulatorial a cada dois meses para o controle de peso, avaliação da glicemia de jejum (Gli) e HbA1c, bem como receberam orientações (Anexo 1) e aconselhamentos acerca de sua dieta e da prática de atividade física (0, 2, 4, 6, 8, 10, 12 meses). A dieta orientada aos pacientes era baseada no consumo de 2000 quilocalorias / dia. Além disso, fizeram exames completos para avaliação de perfil glicêmico, perfil lipídico, hemograma, uréia e creatinina séricas, controle dos parâmetros antropométricos e coleta de sangue para avaliação dos marcadores inflamatórios (0, 6, 12 meses).
3.4.1. Grupo SR
Durante os primeiros seis meses, SR foi oferecido como um substituto de uma refeição principal. A quantidade consumida foi definida em 7 colheres-medida ou 8 colheres de sopa niveladas (50 gramas/dia), e o produto deve ser diluído em água, leite desnatado, iogurte desnatado ou suco não calórico. Durante os seis meses seguintes, SR foi adicionado à dieta antes de uma das principais refeições (25 gramas/dia). O grupo SR recebeu aconselhamentos relacionados à utilização do produto e sobre intervenções de estilo de vida.
3.4.2. Grupo ILS
A intervenção no estilo de vida se deu por sessões (30 minutos) de aconselhamento e recomendações para melhorar a motivação e aderência ao plano, por meio de mudança no comportamento alimentar do participante e seus familiares, melhora no controle glicêmico e metabólico, e aumento da atividade física.
3.5. Descrição dos procedimentos
3.5.1. Verificação da Altura
A estatura ou altura é uma medida linear da distância desde o chão ou a superfície do pé para a parte superior (vértice) do crânio. Ela é medida em uma postura ereta normal, sem sapatos(57). A estatura foi verificada com o uso da balança
Líder 1050, e é dada em metros (m).
3.5.2. Verificação da circunferência da cintura e quadril
A circunferência da cintura deve ser medida na altura do umbigo, a postura do sujeito no momento da medição influencia a exatidão da medição. Assim, o protocolo recomenda que o indivíduo esteja com os braços ao longo do corpo, os pés próximos um do outro, para que o peso seja distribuído uniformemente entre os pés. Ela deve ser avaliada no final de uma expiração normal(58). A circunferência do
quadril deve ser tomada em torno da parte mais larga das nádegas(58). As
circunferências foram verificadas com auxílio de uma fita métrica, e dadas em centímetros (cm).
3.5.3. Verificação da massa corpórea
A massa corpórea dada em quilogramas foi verificada no início do acompanhamento, e a cada 2 meses, utilizando a balança Líder 1050. O indivíduo deveria estar vestindo roupas leves, sem portar objetos nos bolsos, sem sapatos.
3.5.4. Bioimpedância Corporal
A porcentagem de gordura corpórea (BIA) e a massa magra em Kg foram verificadas no ínicio do acompanhamento, após 6 meses e após 12 meses, utilizando o bioimpedômetro Body impedance analyzer – Data Input Nutribox®, conectado a um notebook. O indivíduo devia estar deitado em maca apropriada, com os braços ao longo do corpo, sem portar objetos metálicos e sem sapatos. Após cinco minutos em repouso, foram colocados 4 eletrodos (dois em membro superior
direito, dois em membro inferior direito), conectados ao aparelho. O software do aparelho solicitou dados do paciente (idade, sexo, massa corpórea e altura), que levou em conta para definir valores ideais para cada indivíduo. A aquisição do bioimpedômetro e dos eletrodos foi financiada pela Universidade de Freiburg.
3.5.5. Aferição da Pressão Arterial Sistêmica
Os ruídos de Korotkoff foram auscultados a partir do braço direito do indivíduo, depois de descansar 5 minutos e sentado. Utilizamos o esfigmomanômetro OMRON® HEM 742INT. Duas medidas foram tomadas para verificação da pressão arterial sistólica e diastólica e a média destas medições foi utilizada como a pressão arterial final.
3.5.6. Coleta de sangue
O sangue foi coletado pela pesquisadora a partir de uma veia da fossa antecubital, respeitando os protocolos de proteção de transmissão de patógenos e em seguida imediatamente armazenados no gelo para posterior centrifugação e separação do plasma que foi armazenado em – 80 °C para posterior análise por técnica de ELISA, ou Enzyme-Linked Immunosorbent Assay. O sangue em jejum para dosagens de HbA1c, Gli, Colesterol Total (CT), Lipoproteína de Alta Densidade (HDL), LDL, Triglicérides (TG), uréia sérica, creatinina sérica e hemograma, foi coletado em cada visita agendada ao laboratório de análises clínicas de um hospital universitário, e o resultado encaminhado ao prontuário do paciente.
3.5.7. Verificação de Creatinina e Albumina urinária
A partir da coleta de uma amostra de urina, foi verificada creatinina e albumina urinária através de fitas reagentes Siemens Microalbustix®, seguindo orientações do fabricante. A verificação foi feita na inclusão, após 6 meses e após 12 meses de acompanhamento. A aquisição das fitas reagentes foi financiada pela universidade de Freiburg.
Após a extração do soro, avaliamos os marcadores de inflamação TNF-α, MCP-1, MCP-2, TGF-1, por meio de ELISA “sanduíche”, utilizando os kits de ELISA “Biolegend Legend Max” (dosagem de MCP-1, MCP-2, TGFβ1) e kit ELISA “Quantikine – R e D systems” (dosagem de TNF-α). Para a realização da técnica, os procedimentos aconteceram segundo a orientação do fabricante de cada kit, e os resultados foram dados em picogramas por mililitro (pg/ml) para cada citocina.
3.6. Forma de Análise dos Resultados
Para estudar as associações entre os grupos e as variáveis categóricas foi aplicado o teste Qui-quadrado(59). Este teste é utilizado quando queremos
verificar se existe associação entre duas variáveis categóricas. Para os casos onde pelo menos 20% das caselas da tabela de valores esperados apresentavam contagem menor do que 5 foi aplicado o teste exato de Fisher(60).
As comparações entre os grupos com relação às variáveis quantitativas, em cada um dos tempos avaliados, foram realizadas por meio do teste não-paramétrico de Mann-Whitney(59). Já para as comparações entre os períodos com
relação às variáveis quantitativas, em cada um dos grupos avaliados, foi aplicado o teste de Friedman(59). Para essas comparações o nível de significância foi corrigido
segundo o critério de Bonferroni(61). Ao todo foram realizadas 5 comparações para
cada variável, então o nível de significância assumido foi de 1%. Para as comparações entre os períodos onde foi obtida uma diferença significante foi aplicado o teste da Soma de Postos Sinalizados de Wilcoxon(59) com a correção de
Bonferroni (1,67%) para realizar as comparações múltiplas.
As correlações entre as variáveis quantitativas foram estimadas por meio do coeficiente de correlação de Spearman(59). Este coeficiente é não paramétrico e
varia de -1 a 1, onde valores mais próximos de -1 indicam uma relação negativa ou inversa entre as variáveis, valores próximos a 1 uma relação positiva e valores próximos a 0 indicam ausência de correlação. Cohen (1988) sugere a seguinte classificação do coeficiente de correlação: 0,1 a 0,29 (fraca), 0,30 a 0,49 (moderada) e maior ou igual a 0,50 (forte).
Foi solicitado ao Centro de Educação do Trabalhador de Saúde (CETS) autorização para recrutamento de pacientes da rede básica de saúde da cidade de Campinas, concedida em 08 de abril de 2013 pelo secretário municipal de saúde do município (Anexo 2). Foi solicitado concomitantemente ao comitê de ética da Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas a autorização para a utilização das amostras de sangue e dados de pacientes do protocolo AMDIT, realizando adequação ao projeto, respeitando as premissas da Resolução nº 466, de 12 de dezembro de 2012 (Parecer número 1.010.311, de 09/04/2015, número CAAE: 42705915.0.0000.5404) (Anexo 3).
Autorização prévia foi concedida ao estudo “O tecido adiposo marrom em humanos – conexões funcionais com o hipotálamo, com a ação da insulina e ácidos biliares”, cujo TCLE já constava a coleta de sangue a descrição de outros procedimentos (Anexo 4).
Não houve participação de grupos vulneráveis no estudo.
Não houve qualquer interferência nas consultas médicas dos sujeitos, que continuarão sendo acompanhados conforme a rotina do serviço.
Os riscos foram mínimos, e foram decorrentes dos procedimentos aos quais os voluntários foram submetidos. A coleta de amostras de sangue periférico não ofereceu riscos significativos. A duração e a forma como estes procedimentos serão realizados foi explicada detalhadamente aos sujeitos, e aqueles que se manifestaram desconfortáveis não foram incluídos.
Os participantes foram examinados clinicamente e bioquimicamente no início do estudo, para certificação de que nenhum dos itens de exclusão da pesquisa estará presente. O suplemento alimentar usado está comercialmente disponível nos EUA e Alemanha. A confidencialidade da fonte dos dados foi mantida. A cada participante foi atribuído um número, e toda a análise de dados foi feita segundo este número.
4. Resultados
Os resultados deste estudo são apresentados no formato alternativo e inclui um artigo.
Capítulo 1: Soya protein dietary substitution improves systemic markers of inflammation and metabolic parameters independently of the reduction of
adiposity
Vanessa Cristina Dias Bóbbo1,2, Letícia Paiva Santanna1, Milena Fioravante2, Maria
Helena Melo Lima1, Eliana Pereira de Araújo1,2, Lício Augusto Velloso2.
1. Faculty of Nursing. University of Campinas, 13083-887 Campinas, Brazil. 2. Obesity and Comorbidities Research Center. Laboratory of Cell Signaling.
University of Campinas, 13084-761 Campinas, Brazil
Abstract
Obesity is the main risk factor for type 2 diabetes. Increased adiposity results in the activation of an inflammatory response in a number of metabolically active tissues, which contributes to the development of insulin resistance. Reducing adiposity by different approaches leads to the improvement of insulin resistance. In the present study, we evaluate the impact of a dietary substitution with a soya protein-rich meal on anthropometric, metabolic and inflammatory parameters in 38 obese subjects with type 2 diabetes treated with oral hypoglycemic agents, only. The patients were randomized into a group that received nutritional counseling for a low carbohydrate, low fat diet (2000 Kcal/day), or a similar diet accompanied by the the substitution of one meal by a preparation rich in soya protein. Dietary substitution with soya protein-rich preparation resulted in significant reductions of body mass, body adiposity, glycated hemoglobin and the inflammatory markers TNF-α and MCP-1. Patients of the control group presented no significant change of any of the parameters evaluated in the study. Despite the fact patients under soya protein-rich meal substitution presented reductions of both adiposity and inflammatory markers, these changes occurred independently. In conclusion, the dietary substitution with a soya protein-rich meal should be considered as an attractive dietary adjuvant approach to tackle anthropometric, metabolic and inflammatory parameters in obese subjects with type 2 diabetes.
Introduction
Metabolic inflammation is a common feature of obesity and is regarded as an important determinant of insulin resistance(1). In addition to their direct impact on the
genesis of obesity due to their energetic value(2), dietary fats contribute to the
development of metabolic inflammation by distinct mechanisms, such as induction of endoplasmic reticulum stress(3,4), activation of Toll-Like Receptor 4 (TLR4)(5),
activation of Protein Kinase R (PKR)(6) and modification of gut microbiota, which
favors the absorption of increased amounts of dietary fats and the leakage of lipopolysaccharides from the intestine to the blood stream(7). The inflammatory
activity induced by all these mechanisms trigger intracellular kinases that target and inhibit important proteins of the insulin signaling pathway and are regarded as the most important mechanisms linking obesity to type 2 diabetes (T2D)(2,8). In distinct
clinical and experimental settings the reduction of obesity-associated inflammation resulted in the improvement of the insulin resistance phenotype(9). In the most
extreme cases, body mass reduction obtained as a result of bariatric surgery produced consistent improvement of inflammatory markers, which was accompanied by reduction of insulin resistance(10). However, even in less extreme approaches,
such as in dietary counseling, the reduction of adiposity is accompanied by reduction of metabolic inflammation and improvement of insulin sensitivity(11).
Unfortunately, most studies evaluating the impact of behavioral approaches as a means for controlling obesity and its accompanying metabolic conditions have failed to produce consistent and long-lasting results. The main reason for the failure is fact that only few patients can sustain for long time the tight caloric restriction needed to obtain the expected benefits of the dietary approach.
An approach that can be used to overcome the low rates of adherence to rigorous diets is to use nutrients that can, per se, favor body mass reduction even in the presence of only mild reductions of total caloric intake. In the present study we hypothesized that meal substitution with a soya protein-rich preparation (SR) would reduce body mass and improve metabolic and inflammatory parameters in obese diabetic patients even under a mild caloric restriction. Our results shown that dietary substitution with SR resulted in significant reductions of body mass, body adiposity,
glycated hemoglobin and the inflammatory markers Tumor Necrosis Factor Alpha (TNF-α) and Monocite Chemoattractant Protein 1 (MCP-1).
Patients and Methods
Patients. Patients were recruited from the Clinics Hospital of the University of Campinas and from primary health care centers from the city of Campinas, Brazil. The study was approved by the Ethics Committee of the University of Campinas (# 293/2011, CAAE 0237.0.146.000-11, referring to the collection of data and blood samples; and # 1.010.311, CAAE 42705915.0.0000.5404, concerning the storage and use of samples of blood for cytokine detection). Fifty-six patients were included according to the criteria for inclusion and exclusion. We included subjects of both genders, regardless of ethnicity; with a minimum age of 21 years; with T2D, and in use of oral hypoglycemic agents, only; with glycated hemoglobin between 8-10%; BMI between 25-40 kg/m2; and systemic arterial pressure lower than 160/100 mmHg. Were
excluded subjects with physical limitations; psychotic disorders; users of alcohol, illicit drugs or medications for weight loss (amphetamines); previously submitted to bariatric surgery; in chronic treatment with systemic corticosteroids; with cancer diagnosed in the past five years; infected with human immunodeficiency virus (HIV); active tuberculosis; diagnosed with severe heart disease; and women who were pregnant or breast-feeding. Patients with limitations for joining the lifestyle intervention, or those with medical conditions that could interfere with the goals of the study were discontinued. After acceptance to participate, reading and signing the informed consent, patients were randomized into the intervention program in lifestyle group (ILS) or soya protein-rich meal group (SR), and instructed to follow a diet with low carbohydrate and low fat, according to the recommendations of the American Diabetes Association(12). ILS group took place by sessions (30 minutes) of advice and
recommendations to improve the motivation and adherence to the plan. SR group received counseling related to use of the product and lifestyle interventions. During the first six months, SR (composition in Table 1) was offered as a replacement for a main meal (lunch or dinner), 50 g/day diluted in water, skim milk, nonfat yogurt or non-caloric juice. During the following six months, the amount of SR was reduced by half
(25 g/day) consumed prior to any of the main meals. The patients underwent follow-up every two months, for 12 months.
Anthropometric measurements. Anthropometric evaluation occurred at inclusion and after six and 12 months. Bioimpedance was employed to determine body composition using the impedance analyzer Nutribox (Pöcking, Germany).
Laboratory testing. Blood samples were collected during inclusion and every two months for glucose and glycated hemoglobin determination. Additional biochemical, hematological, hormonal and inflammatory markers were determined in blood samples collected during inclusion and after six and 12 months. All measurements were performed by automated methods following the recommendations of the manufacturers. Urinary biochemistry was determined at inclusion and after six and 12 months using Siemens Microalbustix reagents strips (Erlangen, Germany).
Inflammatory marker measurements. The inflammatory markers TNF-α, MCP-1, MCP-2, and Transforming Growth Factor Beta 1 (TGFβ1) were determined in serum samples obtained during inclusion and after six and 12 months. MCP-1, MCP-2, and TGFβ1 were determined using enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) kits from Biolegend (San Diego, USA) and TNFα was determined using an ELISA kit from R&D Systems (Minneapolis, USA). All ELISA determinations followed the recommendations of the manufacturers.
Table 1. Supplement Facts
Serving Size: 8 tablespoons (50g)
Amount per serving % Daily Value*
Calories 180 --
Calories from fat 9 --
Total fat 1g 1.5% Saturated fat 0.5g 2.5% Trans fat 0g ** Polyunsaturated fat 0.1g ** Monounsaturated fat 0.4g ** Cholesterol 0 0% Sodium 340mg 15% Potassium 500mg 14% Total carbohydrates 15g 6% Dietary fiber 0.5g 2% Sugars 15g ** Protein 27g 54% Vitamin A 794UI 16% Vitamin C 16mg 27% Vitamin E 6UI 20% Vitamin B1 0.5mg 33% Vitamin B2 0.6mg 35% Vitamin B6 0.7mg 35% Calcium 215mg 22% Iron 4.9mg 27%
*Percent daily values are based on a 2.000 calorie diet
**Daily value not stabilished
Statistical analysis. Comparisons between the groups with regard to quantitative variables, in each of the assessed times, were performed by using non-parametric test of Mann-Whitney(13). As for comparisons between periods with respect to
quantitative variables, in each of the groups evaluated, was applied the Friedman test(13). For these comparisons the significance level was fixed according to
comparisons between periods we employed the test of Flagged Posts sum Wilcoxon test(13) with the Bonferroni correction (1.67%) to perform multiple comparisons.
Correlations between quantitative variables were estimated by means of the Spearman's rank correlation coefficient(13).
Results
SR improves anthropometric parameters. For ILS, we have 7 men and 4 women, and 11 men and 16 women for SR. The mean age was 62,4 years old. Patients undergoing SR presented a significant reduction of body mass, BMI and whole body adiposity at six and 12 months after beginning of intervention (Fig. 1). Patients of the control group presented no significant changes in any of the anthropometric parameters evaluated (Fig. 1). There were no significant differences between groups for any of the anthropometric parameters evaluated (Table 2).
Table 2. Mean and SD values of anthropometric parameters for SR and ILS groups with analysis intermoments for each group
ILS SR Intermoments analysis p-value* Variable t. ILS SR N Mean SD N Mean SD Body mass (Kg) 0 9 87.84 11.46 27 79.74 15.84 0.8948 0.0017 6 9 87.94 12.92 27 77.66 15.60 12 9 87.87 13.75 27 78.21 15.25 BMI (Kg/m2) 0 9 31.72 4.97 27 29.65 4.29 0.8948 0.0017 6 9 31.67 4.80 27 28.85 4.10 12 9 31.61 4.75 27 29.08 4.06 Adiposity (%) 0 9 23.46 10.89 25 27.72 11.06 0.7165 0.0016 6 9 24.70 14.36 25 22.54 9.02 12 9 26.51 14.05 25 23.18 10.61 Waist (cm) 0 9 108.44 9.18 27 102.19 9.58 0.5523 0.1167 6 9 96.98 35.09 27 100.81 9.09 12 9 109.22 10.69 27 102.57 11.33 Hip (cm) 0 9 108.50 14.37 27 103.83 9.95 0.2437 0.0040 6 9 109.17 9.16 27 101.98 9.49 12 9 106.67 14.79 27 102.63 10.56 Waist/Hip 0 9 1.01 0.06 27 0.99 0.07 0.0970 0.4948 6 9 0.89 0.30 27 0.99 0.06 12 9 1.03 0.07 27 1.00 0.07 *Friedman’s test
SR improves glycated hemoglobin levels. Patients undergoing SR presented a significant reduction of glycated hemoglobin levels at six and 12 months after beginning of intervention (Fig. 2). There were no significant changes in fasting blood
glucose levels (Fig. 2). Patients of the control group presented no significant changes in any of the metabolic parameters evaluated. There were no significant differences between groups for any of the metabolic parameters evaluated (Table 3).
SR improves metabolic inflammation. Patients undergoing soya protein-rich meal substitution presented a significant reduction of blood TNF-α and MCP-1 levels at six and 12 months after beginning of intervention (Fig. 3). There were no significant changes in blood MCP-2 nor TGFβ1 levels (Fig. 3). Patients of the control group presented no significant changes in any of the inflammatory parameters evaluated (Fig. 3). There were no significant differences between groups for any of the inflammatory parameters evaluated (Fig. 3).
Table 3. Mean and SD values of metabolic parameters for SR and ILS groups with analysis intermoments for each group
ILS SR
Intermoments analysis
p-value*
Variable t. N Mean SD N Mean SD ILS SR
Glucose (mg/dl) 0 5 179.20 39.56 24 169.92 57.96 0.4493 0.3757 6 5 147.80 31.12 24 143.38 35.21 12 5 138.60 23.50 24 148.25 43.59 HbA1c (%) 0 5 8.82 0.49 17 8.60 1.09 0.4493 < 0.0001 6 5 7.70 0.96 17 6.95 1.12 12 5 8.24 2.22 17 6.97 0.98 Triglycerides (mg/dl) 0 8 175.88 108.18 25 212.56 71.90 0.6873 0.0686 6 8 179.00 107.67 25 202.84 106.59 12 8 200.75 151.64 25 202.08 98.46 Total Chol (mg/dl) 0 8 196.63 54.92 25 183.72 30.44 0.6873 0.0464 6 8 191.38 28.03 25 169.12 42.16 12 8 187.00 46.76 25 180.96 42.20 HDL (mg/dl) 0 7 56.43 40.65 25 42.28 8.94 0.0538 0.2351 6 7 59.43 40.31 25 43.12 8.73 12 7 47.71 19.22 25 44.92 7.94 LDL (mg/dl) 0 8 115.88 45.52 24 101.00 25.78 0.4169 0.2140 6 8 108.75 22.31 24 91.46 31.17 12 8 102.88 29.52 24 98.25 37.54 *Friedman’s test
Inflammatory markers change independently of adiposity in patients under SR. Spearman correlation rank was employed to evaluate if changes on inflammatory markers were dependent on changes of adiposity. As depicted in Table 4, there were no significant correlations between changes in adiposity and changes of neither TNF-α nor MCP-1 in the sera of patients undergoing SR. Conversely, the reductions of glycated hemoglobin levels were significantly correlated with the reduction of body adiposity in patients undergoing SR for six months. In patients undergoin ILS there were neither correlations between changes in adiposity and glycated hemoglobin levels nor in changes in adiposity and inflammatory markers (Table 4).
Table 4. Correlations between variables using mean difference intermoments for both groups
ILS SR
Variable 1 Vs. Variable 2 R p-value R p-value
Adiposity t.0-t.6 HbA1c t.0-t.6 0.3024 0.36 0.4865 0.01 Adiposity t.0-t.6 TNF-α t.0-t.6 0.1005 0.76 0.0988 0.62 Adiposity t.0-t.6 MCP-1 t.0-t.6 0.3927 0.23 0.3823 0.06 Adiposity t.0-t.12 HbA1c t.0-t.12 0.010 0.97 0.1261 0.56 Adiposity t.0-t.12 TNF-α t.0-t.12 0.4046 0.21 0.0797 0.69 Adiposity t.0-t.12 MCP-1 t.0-t.12 0.0596 0.86 0.2580 0.19 Discussion
Lack of medium- and long-term adhesion is one of the most important problems contributing to the failure of behavioral approaches to control body mass and the metabolic conditions that frequently accompany obesity(15,16). In order to achieve the
expected anthropometric and metabolic results, diets must lead to uncomfortable negative energy balance and most subjects are unable to sustain such conditions for long periods(16). One approach that can overcome the low adherence is to introduce
a meal substitution, which can serve both as bond between the health-care provider and the patient and also allow the introduction of a specific nutrient that may improve the general outcomes of the behavioral approach.
Soya protein is known for contain the most essential amino acids found in animal protein sources and various components with biological activities(17). Soya
phytoestrogens genistein and daidzein are compounds of chemical structure similar to estradiol-17 beta(18), and can bind to estrogen receptors, leading to suppression of
lipoprotein lipase gene transcription, acting on body fat distribution (18).
Phytoestrogens also can act on phosphorylation of AMPK in adipose tissue and skeletal muscle(19), increasing the expression of genes related to the oxidation of fatty
Soya protein intake leads to reduction of serum cholesterol non-HDL and triglycerides(21), through the excretion of bile acids(22), or by intestinal microbiota
dependent mechanism: degradation of daidzein by beta-glucosidases produces equol, a metabolite that can act like phytoestrogen(23,24).
Here we used a meal prepared from soya protein extract to treat patients with T2D under treatment with oral glucose lowering agents, only. The protocol was divided into two parts: during six months, patients were oriented to substitute one of the main meals with the soya preparation; and, during the following six months, patients used half the amount of the preparation prior to one of the main meals. Control subjects were accompanied by the same team and with the same frequency as the SR group and received similar nutritional counseling. As a whole, the study included 41 patients in the SR group and 15 patients in the ILS group. Completion of the protocol was achieved by 66% in SR group and 73% in the ILS group. Dropouts occurred mostly because of unwillingness to continue under follow up and the rates of dropout are similar to the ones observed in other studies that adopted behavioral approaches to treat T2D patients(21,24,25).
In general, SR promoted beneficial changes in anthropometric, metabolic and inflammatory parameters. In all cases, improvement occurred overtime in intragroup analysis, only. There were no significant differences between groups for any of the parameters evaluated. Because for some parameters evaluated there were trends for differences between ILS and SR groups, we suspect that the small number of patients enrolled by the study was a limiting factor for the evaluation. Nevertheless, even with a small number of subjects, we observed improvement of a number of important parameters in SR group, which was not reproduced in the ILS group.
The reduction of body adiposity promoted by SR could, at first, explain, per se, the reductions of glycated hemoglobin and markers of inflammation. In fact, in a number of studies employing different methods to promote body mass reduction, glucose intolerance improvement and reduction of metabolic inflammation are common outcomes(19,26). However, rather unexpectedly, correlation analysis showed that,
whereas glycated hemoglobin reduction was indeed associated with reduction of body mass, reductions of TNF-α and MCP-1 were not. This finding raises an important question regarding a potential autonomous anti-inflammatory action of the soya protein-rich preparation. In fact, there are some experimental and clinical
studies using different types soya protein preparations that reported beneficial anti-inflammatory outcomes.
Soya protein consumption is able to reduce the concentrations of systemic inflammatory markers such as C-reactive protein, IL-6 and TNF-α(27). In randomized
and controlled trial conducted with older women was observed that women who consumed soya protein or soya isoflavones for a year did not had increased levels of IL6, compared to placebo group(24).
Knockout mice for apolipoprotein-E (model of atherosclerosis) treated with soya protein presented protective effect to occurrence of atherosclerosis. This effect can be explained by the reduction in RNA-m expression of MCP-1, as well as the reduction of infiltrated macrophages in aortas samples(28). In rats with non-alcoholic
esteatohepatitis fed with high-fat diet combined with genistein was observed a reduction of TNF-α and IL-6 in liver and blood. The blocking of inflammatory pathways interrupted the evolution of non-alcoholic esteatohepatitis in these animals(29).
In conclusion, meal substitution by a soya protein-rich preparation results in significant improvement in anthropometric, metabolic and inflammatory parameters. Reduction in inflammatory markers occurs independently of changes in body adiposity, as determined by bioimpedance analysis. Thus, soya protein-rich meal may exert an autonomous anti-inflammatory activity and should be considered as an interesting nutritional approach for obese subjects with T2D.
Acknowledgements. We thank Dr. E. Roman, A. Calixto, G. Ferraz and M. Cruz for technical assistance. Dr. D. Tsukumo and Dr. C. Lalli for clinical assistance. H. Ceretta for statistical analysis. Sao Paulo Research Foundation provided the grants for this study. The authors belong to the National Institute of Science and Technology – Diabetes and Obesity and to the Obesity and Comorbidities Research Center, Brazil.
References
1. Velloso LA, Eizirik DL, Cnop, M. Type 2 diabetes mellitus-an autoimmune disease? Nature Reviews. Endocrinology. 2013; 9:750-5.
2. Lumeng CN, Saltiel AR. Inflammatory links between obesity and metabolic disease. J Clin Invest. 2011;121(6):2111–17.
3. Ozcan U, et al. Endoplasmic reticulum stress links obesity, insulin action, and type 2 diabetes. Science. 2004; 306(5695):457–461.
4. Cnop M, Foufelle F, Velloso LA. Endoplasmic reticulum stress, obesity and diabetes. Trends Mol Med. 2012 Jan;18(1):59-68.
5. Tsukumo DM, Carvalho-Filho MA, Carvalheira JBC, Prada PO, Hirabara SM, Schenka AA, Araujo EP, Vassallo J, Curi R, Velloso LA, Saad MJA. Loss-of-Function Mutation in Toll-Like Receptor 4 Prevents Diet-Induced Obesity and Insulin Resistance. Diabetes. 2007; 56:1986–98.
6. Nakamura T, Furuhashi M, Li P, Cao H, Tuncman G, Sonenberg N, Gorgun CZ, Hotamisligil GS. Double-stranded RNA-dependent protein kinase links pathogen sensing with stress and metabolic homeostasis. Cell. 2010; 140: 338–48.
7. DiBaise JK, Frank DN, Mathur R. Impact of the Gut Microbiota on the Development of Obesity: Current Concepts. Am J Gastroenterol Suppl. 2012; 1:22 – 27.
8. Guo S. Insulin signaling, resistance, and the metabolic syndrome: insights from mouse models into disease mechanisms. J Endocrinol. 2014 Feb; 220(2): T1–T23.
9. Andersson DP, Hogling DE, Thorell A, Toft E, Qvisth V, Naslund E, Thorne A, Wiren M, Lofgren P, Hoffstedt J, Dahlman I, Mejhert N, Ryden M, Arner E, Arner P. Changes in Subcutaneous Fat Cell Volume and Insulin Sensitivity After Weight Loss. Diabetes Care. 2014;37:1831–36.
10. Pereira JA, Claro BM, Pareja JC, Chaim EA, Astiarraga BD, Saad MJA, Muscelli E. Restored insulin inhibition on insulin secretion in nondiabetic severely obese patients after weight loss induced by bariatric surgery. International Journal of Obesity. 2003; 27, 463–8.
11. Foster GD, Makris AP, Bailer BA. Behavioral treatment of obesity. Am J Clin Nutr. 2005; 82(suppl):230S–5S.
