Rachel de Barros Oliveira
ESTUDO DA ALFA-SINUCLEÍNA E DO SISTEMA DOPAMINÉRGICO NAS LINHAGENS DE RATOS
ISOGÊNICAS SHR E SLA16.
FLORIANÓPOLIS 2018
Dissertação submetida ao Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e do Desenvolvimento da Universidade Federal de Santa Catarina para a obtenção do Grau Mestre em Biologia Celular e do Desenvolvimento
Orientador: Prof. Dr. Geison de Souza Izidio
AGRADECIMENTOS
O presente trabalho é resultado de uma árdua jornada intelectual (ainda que apenas no começo), mas também de um nível razoável de equilíbrio físico e emocional que não teria conseguido sozinha e por isso esses são meus mais profundos e sinceros agradecimentos a todos que participaram deste caminho.
Primeiramente ao ser supremo, ao universo, a Deus, a como você chamar essa força que nos guia pelos caminhos da vida. Obrigada por me guiar para onde eu precisava estar, por sempre me mostrar que tudo tem um motivo, por me mostrar que as coisas simples são as mais importantes e por me ensinar tanto. Obrigada.
Ao meu orientador, meu mestre e meu exemplo, Dr. Geison Izídio. Uma das melhores pessoas que eu conheci no meu mestrado, obrigada por me acolher quando eu “caí de paraquedas” no seu laboratório, obrigada por me mostrar os encantos desta ilha maravilhosa, obrigada por me ensinar que o bar é essencial (mesmo que você não vá para beber), obrigada pelas conversas sobre a vida e sobre a ciência. Obrigada por não me deixar perder o brilho nos olhos e sempre sorrir, obrigada por ser meu exemplo.
À Dra. Renata Marchette, obrigada por ser tudo pra mim, meu porto seguro, minha mãe, meu exemplo de pesquisadora e de ser humano. Obrigada por toda a paciência, por me ensinar tudo o que você sabe, por todo o cuidado, carinho e preocupação. “Não é sobre ter todas as pessoas do mundo pra si... É sobre saber que em algum lugar a Rê cuida de ti”. Obrigada mãe tamagoshi.
A todos os integrantes novos e velhos do Laboratório de Genética do Comportamento. Minha família de segunda a sexta e muitas vezes até mais do que isso. Obrigada a minha doutoranda do coração Natalli Granzoto, por sempre cuidar de mim, pelas conversas, pelos bares, pelo ombro amigo, pelos
puxões de orelha e pelas histórias, você é como uma irmã pra mim. Obrigada a minha eterna mestra dos mares Pâmela Ramborger, por sempre me ouvir, pelos conselhos e pelas companhias de RU, você fez falta. Obrigada Jéssica Squariz, Rafaela Venturi, Guilherme Fadanni, Santiago Caneppa, Laís Véras, Laís Ostaszevski, Eduardo Kuser, por me acolherem, pelas conversas, pelas risadas, pelos lanches, pelas confidências e pelo carinho, vocês foram essenciais no meu crescimento nesses dois anos.
Ao professor Dr. Rodrigo Bainy Leal e a doutoranda Isabella Aparecida Heinrich, por me darem esperança quando eu já estava quase desistindo. Obrigada por me ensinarem o Western Blotting da melhor maneira possível, obrigada pela paciência, pelo carinho e por me ajudarem a revelar bandas tão lindas! Obrigada à doutoranda (quase doutora) Tuane Sampaio, você entrou aos 56 minutos do segundo tempo e fez uma diferença absurda na minha vida e na minha dissertação. Obrigada por sempre ter tempo de me ajudar com um sorriso no rosto, pelas conversas maravilhosas e por todo o carinho de sempre.
Obrigada ao professor Dr. Anicleto Poli, por mesmo tão perto do natal, ter tempo, paciência e animo para me ensinar tudo sobre HPLC e me ajudar sempre que eu precisei. Obrigada por estar sempre presente, disposto e por ser sempre tão carinhoso, o senhor foi um presente de final de mestrado.
Obrigada a todos os meus amigos da Pós Graduação em Farmacologia, que sempre fizeram questão de me incluir em todos os planos e sempre tentaram me ajudar de todas as maneiras possíveis. Obrigada pela oportunidade de aperfeiçoar minha apresentação e por estarem sempre dispostos a ir no container. Um obrigada especial a minha grande amiga Katiane Roversi, não sei nem como te agradecer por tudo, por tentar o blot comigo umas mil vezes, por me ensinar sempre, pelas conversas, pelas companhias de praia, de RU e principalmente pela companhia no container, obrigada por tornar o mestrado tão divertido e animado. Obrigada ao Lucas Mascarin por ser esse amigo-irmão incrível que eu adoro perturbar, obrigada pelas
conversas, por me fazer rir e por ser uma ótima companhia de almoço. Obrigada a Debs, ao Bauru e a Mafalda, por estarem presentes quando eu mais precisava e não sabia, vocês foram incríveis e imprescindíveis para a minha sanidade, obrigada pelos conselhos, todo carinho e amor.
Obrigada a todos os meus amigos da Pós Graduação em Biologia Celular e do Desenvolvimento, por me acolherem assim que eu cheguei. Obrigada por sempre estarem presentes. Em especial, obrigada a minha querida amiga Fernanda Peruzzato, pelas confidências, pelo carinho, preocupação, por ser a melhor dupla sempre e a melhor amizade que eu poderia ter no mestrado.
Obrigada a todos do container, é o melhor bar sem dúvidas! Obrigada a minha família, as pessoas mais importantes do mundo pra mim. Obrigada por não me deixarem desistir, pelo amor que eu sentia mesmo de longe, pelo carinho, pelas conversas, por me lembrarem todos os dias que eu nunca vou estar sozinha, não importa onde esteja. Obrigada por entenderem que eu amo voar, mas que vocês vão ser sempre minha melhor casa.
Antonio Oliveira (I-1) Sonia Beatriz (I-2) Antônio Arismar (I-3) Maria Madalena (I-4) Marcio Antonio (II-1) Marcelo André (II-2) Regina Célia (II-3) Ana Paula (II-4) Helen Lucy (II-5) Rachel (III-1) Victor (III-2)
Um obrigada especial ao meu namorado, Ramon Henrique Philippi Silveira, eu não estaria aqui e nem teria chegado ao final se não fosse por você. Obrigada por ser a pessoa mais paciente que eu conheço, por aguentar minha ansiedade, obrigada por ser meu apoio em todas as horas, por me ouvir sempre, por me entender, por me acompanhar no laboratório nos finais de semana e por ser o melhor companheiro que eu poderia imaginar.
Obrigada a toda a Philippada, vocês foram realmente minha família em Santa Catarina. Obrigada por me fazerem sentir em casa, pelo carinho, amor e aconchego sempre. Obrigada pelas risadas, pelas festas, cantorias e preocupações.
Às minhas amigas Thais Ferrara, Fernanda de Lara, Ana Paula Ribeiro e Ivy Nayra, obrigada por estarem presentes sempre, mesmo de longe.
Obrigada a todos os animais que deram a vida para que esse trabalho se tornasse realidade e a pesquisa pudesse avançar.
À CAPES, ao CNPQ e a FAPESC pelo apoio financeiro, indispensável para realização desse trabalho.
“ Τhey can say, they can say it all sοunds crazy Τhey can say, they can say we've lοst our minds Ι don't care, I don't care if they call us crazy Runaway tο a wοrld that we design [...] Every night Ι lie in bed Τhe brightest colors fill my head Α million dreams are keeping me awake Ι think οf what the wοrld could be Α vision οf the one Ι see Α million dreams is all it's gοnna take Α million dreams fοr the wοrld we're gonna make. “ A Million Dreams – The Greatest Showman Benj Pasek & Justin Paul
RESUMO
Modelos animais são uma ferramenta extremamente importante da ciência, especialmente nos estudos genéticos de ansiedade/emocionalidade. Duas linhagens isogênicas Lewis (LEW) e Spontaneously Hypertensive Rats (SHR) se destacam por seu comportamento contrastante relacionado à ansiedade/emocionalidade, por isso vêm sendo muito utilizadas. Estudos com essas duas linhagens levaram à descoberta da região genômica Anxrr16, que tem uma grande influência no comportamento delas. Nessa região está localizado o gene da alfa-sinucleína (Snca), altamente conservado entre diversas espécies e conhecido por seu envolvimento em doenças, como a Doença de Parkinson (DP) e por modular o sistema dopaminérgico. Visando um melhor entendimento dessa região genômica, foi criada a linhagem SLA16 (SHR.LEW-Anxrr16). O presente trabalho teve como objetivo analisar a influência da alfa-sinucleína na locomoção (com base no sistema dopaminérgico) nas linhagens SHR e SLA16. Na primeira parte do trabalho foi verificada a conservação da proteína em diversas espécies de animais vertebrados e foi realizado o sequenciamento da 3’UTR do gene Snca das linhagens SHR e SLA16, em busca de possíveis SNVs. Posteriormente, foi realizada uma busca de possíveis miRNA com ligação na região sequenciada. A segunda parte do trabalho consistiu na quantificação da proteína alfa-sinucleína, no hipocampo, córtex pré-frontal e estriado de machos e fêmeas das duas linhagens. Por fim, a terceira parte
do trabalho consistiu em medir os níveis basais de dopamina (DA) e seu metabólito (DOPAC), nas linhagens SHR e SLA16, no hipocampo, córtex e estriado. Foi encontrado um SNV na 3’UTR, que desencadeou o estudo de possíveis miRNA regulando essa região. Não foram encontradas diferenças entre os animais SHR e SLA16, tanto na análise de Western Blotting quanto na análise de HPLC. Os resultados deste trabalho sugerem que o SNV encontrado na 3’UTR, do gene Snca, pode regular a ligação por miRNAs de maneira diferente, o que equalizaria o sistema dopaminérgico entre as linhagens SHR e SLA16.
Palavras-chave: Alfa-sinucleína; Locomoção; miRNA; Sequenciamento.
ABSTRACT
Animal models are extremely important in science, especially in the genetic studies of anxiety/emotionality. Two inbred strains Lewis (LEW) and Spontaneously Hypertensive Rats (SHR) are distinguished by their contrasting behavior related to anxiety/emotionality. Studies with these two strains led to the discovery of the genomic region Anxrr16, which would have a great influence on their contrasting behavior. In this region the alpha-synuclein gene (Snca) is harbored. It is highly conserved among several species and known for modulating the dopaminergic system and its involvement in diseases such as Parkinson's Disease (PD). In order to better understand the Anxrr16genomic region, the strain SLA16 (SHR.LEW-Anxrr16) was created. Therefore, the present work analyzed the influence of alpha-synuclein (based on the dopaminergic system) in the SHR and SLA16 strains. In the first part of the study, the conservation of the protein was verified, in several species of vertebrate animals, and the sequencing of the 3'UTR of Snca gene was performed to search SNVs between SHR and SLA16 strains. In view of these findings, an analysis of possible miRNA with binding in the sequenced region was performed. The second part of the study consisted of quantification of alpha-synuclein protein in the hippocampus, prefrontal cortex, and striatum of males and females in both strains. Finally, the third part of the study evaluated the basal levels of dopamine (DA) and its metabolite (DOPAC), in the SHR and SLA16 strains, in the
hippocampus, cortex, and striatum. A SNV was found in the 3'UTR of the Snca gene, which led to the study of possible miRNA that would be regulating this region. No significant differences were found between SHR and SLA16 animals, in both Western Blotting and in HPLC analysis. The results of this work suggest that the SNV found at 3' UTR of the Snca gene may be regulated by miRNAs that equalize the dopaminergic system between the SHR and SLA16 strains.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Bases genéticas da linhagem
SLA16... 28
Figura 2: Síntese e liberação da dopamina... 31
Figura 3: Vias centrais dopaminérgicas em ratos... 33
Figura 4: Representação 3D da proteína alfa-sinucleína... 36
Figura 5: Conformações da alfa-sinucleína... 37
Figura 6: Árvore filogenética obtida com resultados do BLAST... 64
Figura 7: Alinhamento das sequências senso... 67
Figura 8: Análise de miRNA... 70
Figura 9: Sequência 3’UTR e análise de miRNA... 71
Figura 10: Expressão de alfa-sinucleína no hipocampo... 73
Figura 11: Expressão de alfa-sinucleína no córtex pré-frontal... 74
Figura 12: Expressão de alfa-sinucleína no estriado... 75
Figura 13: Quantificação de dopamina, DOPAC e o Turnover de DA no hipocampo... 77
Figura 14: Quantificação de dopamina, DOPAC e o Turnover de DA no córtex... 79
Figura 15: Quantificação de dopamina, DOPAC e o Turnover de DA no estriado... 81 Figura 16: Síntese dos dados obtidos pelo presente
estudo em comparação aos resultados de Chiavegatto, et al (2009) com relação a proteína alfa-sinucleína...
82
LISTA DE QUADROS
Quadro 1: Localização e diferenças de alelos associados a SNVs na 3’UTR do gene Snca em humanos... 40 Quadro 2: Quantificação de DNA nas amostras para o
sequenciamento... 52 Quadro 3: Sequência de iniciadores utilizados para
sequenciamento... 53 Quadro 4: Proteínas-alvo e especificações dos anticorpos
utilizados no Western blotting... 57 Quadro 5: Resultados do BLAST... 65 Quadro 6: Características dos quatro miRNAs
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
3’UTR Região 3' não traduzida
aa Aminoácidos
AADC Enzima aminoácido aromático
descarboxilase ADP Adenosina difosfato
Anxrr16 Do inglês: Anxiety related response QTL 16; Tradução: QTL para respostas relacionadas à ansiedade 16
ATP Adenosina trifosfato
blastp Do inglês: Protein-protein BLAST; Tradução: BLAST proteína-proteína
Ca2+ Cálcio
CEUA/UFSC Comitê de Ética no Uso de Animais em pesquisa da Universidade Federal de Santa Catarina
DA Dopamina
DAT Transportador de Dopamina DOPAC Ácido 3,4-dihidroxifenilacético
DP Doença de parkinson
EPM Erro padrão da média
Gpr37 Do inglês: Orphan G protein-coupled receptor 37; Tradução: Receptor órfão acoplado a proteína G 37
HPLC Cromatografia líquida de alta eficiência
L-DOPA Levodopa
LGC Laboratório de genética do
comportamento
MAOB Monoamino oxidase B miR-34b Microrna-34b
miR-34c Microrna-34b
miR-7 Microrna-7
miRNA Micro RNA
Na+ Sódio
NAC Componente não amiloide
NC3Rs Do inglês: National center for the replacement, refinement & reduction of animals in research; Tradução: Centro nacional de reposição, refinamento e redução de animais em pesquisa.
NCBI Do inglês: National center for biotechnology information; Tradução: Centro nacional de informação de biotecnologia
nr Do inglês: Non-redundant protein sequences; Tradução: Sequências proteicas não redundantes
PTN Níveis da proteína alfa-sinucleína QTL Locus para características quantitativas
RGD Rat genome database
RNAm Ácido ribonucleico mensageiro SHR Ratos espontaneamente hipertensos SLA16 Ratos shr.lew-anxrr16
SNc Parte compacta da substância negra SNC Sistema nervoso central
SNV Do inglês: Single Nucleotide Variation; Tradução: Variante de um único nucleotídeo
TH Tirosina hidroxilase
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ... 23
1.1. MODELOS ANIMAIS EM PESQUISAS ... 23
1.2. LINHAGENS DO LABORATÓRIO DE GENÉTICA DO COMPORTAMENTO ... 24 1.3. DOPAMINA ... 29 1.4. ALFA-SINUCLEÍNA ... 34 2. HIPÓTESES CIENTÍFICAS …... 43 3. OBJETIVOS ... 45 3.1. OBJETIVO GERAL ...…... 45 3.2. OBJETIVOS ESPECIFICOS ...…... 45 4. MATERIAL E MÉTODOS ... 47 4.1. ANIMAIS ... 47
4.2. BLAST – BASIC LOCAL ALIGNMENT SEARCH TOOL ... 48
4.3. EXTRAÇÃO DE DNA ... 49
4.4. AMPLIFICAÇÃO E SEQUENCIAMENTO ... 52
4.5. ANÁLISE COMPUTACIONAL DE MIRNA ... 53
4.6. WESTERN BLOTTING ... 54
4.7. CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA (HPLC)... 58
4.8. ANÁLISES ESTATÍSTICAS ... 60
5.1. CONSERVAÇÃO DA PROTEÍNA ALFA-SINUCLEÍNA ENTRE AS ESPÉCIES ... 63 5.2. ANÁLISE DO SEQUENCIAMENTO DA 3’UTR DO GENE SNCA QUE CODIFICA PARA A PROTEÍNA ALFA-SINUCLEÍNA ... 66 5.3. ANÁLISE COMPUTACIONAL DE MIRNA COM LIGAÇÃO NA 3’UTR DO GENE SNCA ... 68 5.4. QUANTIFICAÇÃO DA PROTEÍNA ALFA-SINUCLEÍNA NO
HIPOCAMPO, CÓRTEX FRONTAL E ESTRIADO DE ANIMAIS NAÏVE DAS DUAS LINHAGENS ... 72 5.5. QUANTIFICAÇÃO DOS NÍVEIS BASAIS DE DOPAMINA,
NO HIPOCAMPO, CÓRTEX E ESTRIADO DAS DUAS LINHAGENS (SHR E SLA16) ... 76 6. DISCUSSÃO ... 85 7. CONCLUSÃO ... 99 8. REFERÊNCIAS BIBLIGRÁFICAS ... 101
1. INTRODUÇÃO
1.1. MODELOS ANIMAIS EM PESQUISAS
Animais vêm sendo usados há muito tempo como ferramenta e modelo de estudo por diversos pesquisadores sendo de suma importância para elucidar as bases
neurobiológicas de doenças humanas (FLECKNELL, 2002; VITALE; MANCIOCCO; ALLEVA, 2009). Existem vários argumentos para defender este uso de animais não humanos na
ciência. Um bom exemplo é a similaridade genética, uma vez que humanos, camundongos e ratos possuem cerca de 95% de compatibilidade genética (BRYDA, 2013). Além disso, o genoma das três espécies já foi sequenciado, o que permite comparações importantes para a identificação e caracterização de diversos
genes (GIBBS et al., 2004; LANDER et al., 2001; VENTER et al., 2001; WATERSTON et al., 2002).
De acordo com o Rat Genome Database (RGD), existem diferentes linhagens de ratos estabelecidas, que podem ser
utilizadas nos mais diversos estudos, desde problemas cardiovasculares (KODAVANTI et al., 2000), até modelos para
estudos comportamentais (RAMOS et al., 1997; BICE et al.,
1998; SAGVOLDEN, 2000). Dentre estas, alguns estudos utilizam linhagens isogênicas, onde os indivíduos são geneticamente idênticos uns aos outros, com o objetivo de diminuir a diversidade proveniente da variação genética. Essas linhagens isogênicas são criadas a partir do cruzamento
consanguíneo, por no mínimo 20 gerações, dando origem a animais com genomas homólogos (AITMAN et al., 2008).
O uso de duas ou mais linhagens isogênicas
contrastantes para um determinado comportamento permite, por exemplo, a realização de uma técnica de mapeamento genético conhecida como análise de loci para características quantitativas (QTL, do inglês Quantitative Trait Loci). Esta técnica basicamente é uma ferramenta para a identificação de loci (regiões
cromossômicas contendo um ou mais genes que influenciam um aspecto específico) de características quantitativas, como a ansiedade (RAMOS; MORMÈDE, 1997).
1.2. LINHAGENS DO LABORATÓRIO DE GENÉTICA DO COMPORTAMENTO
Em 1997, Ramos e colaboradores propuseram duas
linhagens isogênicas como modelo genético para o estudo da ansiedade, Spontaneously Hypertensive Rats (SHR) e Lewis (LEW), pois estas linhagens exibem respostas contrastantes para comportamentos relacionados à ansiedade/emocionalidade. Quando comparadas, a linhagem LEW apresenta níveis maiores
de comportamento tipo-ansioso, em testes validados e amplamente utilizados, do que a linhagem SHR. Apesar deste contraste, a locomoção total das linhagens não apresentou
diferenças significativas indicando que essa diferença não é derivada de alterações motoras (RAMOS et al., 1997).
Assim, Ramos e colaboradores, em 1999, realizaram um mapeamento completo do genoma de uma população F2, proveniente de um intercruzamento das linhagens SHR e LEW,
identificando pela primeira vez um QTL localizado no cromossomo 4. Este QTL apresentava forte influência nos comportamentos relacionados à ansiedade/emocionalidade (Ramos et al., 1999) sugerindo, assim, que genes localizados no
cromossomo 4 são importantes nestes comportamentos. O QTL foi denominado Anxrr16 (Anxiety related response QTL 16) pelo
RGD (www.rgd.mcw.edu/wg/home).
Estudos independentes realizados por vários pesquisadores corroboram a influência do cromossomo 4 nas características neurobiológicas como: a resposta ao estresse, descrita por Potenza e colaboradores em 2004; o consumo de etanol (BICE et al., 1998; TERENINA-RIGALDIE; JONES;
MORMÈDE, 2003); e comportamentos relacionados à ansiedade, descrito por Ramos e colaboradores em 1999 e confirmado por Mormède et al. (2002). Todos esses estudos tornaram o
cromossomo 4 um alvo ainda mais importante nas pesquisas das bases moleculares tanto da ansiedade, quanto da emocionalidade (ANSELMI et al., 2016; MEDEIROS; CORRÊA; CORVINO, 2014).
Apesar do grande avanço nos estudos com QTL, o
grande desafio é, após sua identificação, chegar aos genes responsáveis pela característica analisada (FLINT et al., 2005). Uma das maneiras de se localizar os genes responsáveis pela característica desejada é reduzir o tamanho do QTL (MOORE;
NAGLE, 2000). Uma técnica muito utilizada para essa redução é a construção de linhagens congênicas (intervalo específicas)
(CARR et al., 2006; MOORE; NAGLE, 2000). Para a construção
destas linhagens são realizados retrocuzamentos focando em uma região genômica que contenha o locus a ser estudado (locus diferencial) (MEDEIROS et al., 2013).
Atualmente, o Laboratório de Genética do Comportamento possui uma linhagem congênica denominada
SHR.LEW-Anxrr16 (abreviada como SLA16), que foi produzida a partir de retrocruzamentos entre as linhagens LEW (doadora) e SHR (receptora), com o objetivo de se descobrir os genes do
QTL Anxrr16. Nesta linhagem, a região contendo o QTL Anxrr16 da linhagem doadora (LEW), foi transferida para a linhagem receptora (SHR). Assim, surgiu a linhagem SLA16, que apresenta o genoma idêntico à linhagem SHR, exceto o locus Anxrr16, que é proveniente da linhagem LEW.
Quando comparada com seu controle isogênico (SHR), a linhagem SLA16 demonstrou, dentre outras características, maiores índices de locomoção central no campo aberto (MEDEIROS et al., 2013; MEDEIROS; CÔRREA; CORVINO,
2014). Estes altos índices experimentais são relacionados com comportamento menos tipo-ansioso, pois a região central deste
aparato é considerada aversiva em relação à região periférica (MORMÈDE et al., 2002). A figura 1 mostra de maneira
esquemática as bases genéticas da linhagem SLA16.
Figura 1: Bases genéticas da linhagem SLA16. Os ratos SLA16 foram criados a partir de retrocruzamentos entre as linhagens SHR e LEW. A linhagem SLA16 é homozigota para os alelos da linhagem LEW no locus Anxrr16 e o restante do seu genoma é proveniente da linhagem SHR. Imagem criada com o banco de imagens Servier Medical Art e o auxilio de ferramentas do paint e do office do Windows 8.1© 2013 Microsoft Corporation.
A criação desta linhagem proporcionou uma ferramenta importante para a análise do papel do locus Anxrr16 em
comportamentos tipo ansiedade/emocionalidade e aprendizagem/memória (ANSELMI et al., 2016). Essa linhagem também vem sendo utilizada em nosso laboratório como um
dopaminérgico como, por exemplo, o transtorno de déficit de
atenção e hiperatividade e a Doença de Parkinson (DP). Assim, após a sua conclusão fez-se uma busca de genes candidatos na região genômica do Anxrr16.
Um dos genes potencialmente interessantes, que está ali mapeado é o gene Snca, que codifica a proteína alfa-sinucleína.
Este gene já foi avaliado em trabalhos anteriores do nosso grupo. Por exemplo, em 2009, Chiavegatto et al. descobriram, entre as linhagens LEW e SHR, um SNV (do inglês Single Nucleotide Variation) em uma região 3’ não traduzida do gene Snca. O SNV encontrado mostrou-se relacionado com a expressão diferencial do gene Snca em ensaios com a enzima luciferase. Além disso, Chiavegatto et al. (2009) sugeriram o gene Snca, e o sistema dopaminérgico, como um candidato para explicar as diferenças
comportamentais encontradas nas linhagens LEW e SHR.
1.3. DOPAMINA
Em 1959, a dopamina (DA) foi descrita como um
neurotransmissor, da família das catecolaminas, que atua no sistema nervoso central (SNC) (CARLSSON, 1959), conhecida
por regular diversas atividades neuronais e fisiológicas.
A dopamina é sintetizada em terminais pré-sinápticos pela hidroxilação de tirosina mediada pela enzima tirosina hidroxilase (TH), formando a L-DOPA. Posteriormente, a enzima aminoácido aromático descarboxilase (AADC) age na L-DOPA (descarboxilização), produzindo assim a dopamina (FREED;
YAMAMOTO, 1985; KUHN; LOVENBERG, 1983). Depois de sintetizada, a dopamina é deslocada do citosol e passa a ser armazenada em vesículas sinápticas pelo transportador vesicular
de monoaminas (VMAT) (ERICKSON; EIDEN; HOFFMAN, 1992; LIU et al., 1992). A DA contida nas vesículas é liberada, por exocitose (mediante estimulação), na fenda sináptica (TRIFARÓ; VITALE; RODRÍGUEZ DEL CASTILLO, 1992). Após a liberação da dopamina no meio extracelular, ela é reciclada para dentro do
terminal pré-sináptico pelo transportador de dopamina (DAT). De volta ao citosol, ela pode ser reciclada para dentro das vesículas pelo VMAT, ou então degradada pela monoamino oxidase B (MAOB) (EISENHOFER, 2004). A figura 2 mostra uma
Figura 2: Síntese e liberação da dopamina. A imagem retrata de maneira didática a síntese de dopamina, seu posterior envesiculamento, sua liberação na fenda sináptica, receptação por transportadores, e posterior reutilização ou degradação. Na+: sódio; Ca2+: cálcio; L-DOPA: levodopa; ATP: adenosina trifosfato; ADP: adenosina difosfato; DOPAC: ácido diidroxifenilacético; MAO: monoaminas oxidase; VMAT: transportador de monoaminas vesicular. Imagem criada com o banco de imagens Servier Medical Art e o auxilio de ferramentas do paint e do Office do Windows 8.1© 2013 Microsoft Corporation (Adaptado de GOLAN; TASHJIAN; ARMSTRONG, 2009).
locomotora e a modulação do sistema dopaminérgico e pode
acarretar em uma alteração da locomoção, tanto para mais, quanto para menos. Intervenções que diminuem a atividade do sistema dopaminérgico foram descritas por produzirem uma hipoatividade locomotora. Em contraste, o aumento da transmissão do sistema dopaminérgico é correlacionado a uma
hiperatividade locomotora (BENINGER, 1983). A DA atua principalmente através de quatro sistemas de transmissão, ou vias principais no SNC, são elas: mesolímbica, mesocortical
(NAEF et al., 2014), nigroestriatal (YEE et al., 2014; KIM et al., 2015) e túbero-infundibular (LIANG et al., 2014; RIBEIRO et al., 2015), esquematizadas na figura 3.
Figura 3: Vias centrais dopaminérgicas em ratos. Neurônios dopaminérgicos que têm origem na substância nigra e se projetam para o estriado; e neurônios que se projetam da área tegmental ventral para o sistema límbico e córtex pré-frontal são mostrados pelas setas. Imagem adaptada do livro Physiology of Behavior (CARLSON, 2013) e o auxilio de ferramentas do paint e do Office do Windows 8.1© 2013 Microsoft Corporation.
Neurônios dopaminérgicos originários da substância nigra integram o sistema nigroestriatal, no qual os neurônios partem do mesencéfalo localizados na parte compacta da substância negra (SNc) e projetam seus axônios para o estriado, e algumas outras regiões nos núcleos basais (de uma forma
mais limitada). Já os neurônios originados na área tegmental ventral, formam duas vias: a via mesolímbica, que possui neurônios que se estendem para regiões subcorticais límbicas
com emoções, recompensa e motivação; e a via mesocortical,
constituída por projeções para áreas corticais límbicas (córtex entorrinal, córtex piriforme, córtex pré-frontal) e estão relacionadas com memórias de curto prazo e planejamento. Ainda, neurônios dopaminérgicos hipotalâmicos se projetam para a glândula pituitária formando assim a via túbero-infundibular,
que tem como uma de suas funções suprimir a liberação de prolactina (DAHLSTROEM; FUXE, 1964; CAVALCANTI et al., 2014; RICE, PATEL, CRAGG, 2011; TARAZI, 2001).
A dopamina é muito estudada devido ao seu envolvimento em diversas doenças neurológicas e transtornos psiquiátricos (CARLSSON, 1959; LE FOLL et al., 2009). Ela tem um papel extremamente importante no aprendizado, motivação e recompensa (WISE, 2004), está envolvida na modulação de
movimentos voluntários (GRAYBIEL, 2005; PANDEY; MERSHA; DHILLON, 2013) e até mesmo em respostas sexuais (HEATON, 2000).
1.4. ALFA-SINUCLEÍNA
em 1991 (MAROTEAUX; SCHELLER, 1991). Ela é uma proteína
composta de 140 aminoácidos (aa) codificada pelo gene Snca e muito conservada entre diferentes espécies. Altamente expressa no SNC, mas predominantemente encontrada nos terminais pré-sinápticos, essa proteína possui uma região N-terminal
α-helicoidal, um trecho hidrofóbico central de 12 aa referido como
componente não amiloide (NAC) e uma região acídica C-terminal de carga negativa (KAPLAN; RATNER; HAAS, 2003; MCLEAN et al., 2000; NORRIS; GIASSON; LEE, 2004; OTTOLINI et al., 2017; UVERSKY, 2017; WONG; KRAINC, 2017; YU et al., 2007). O domínio N-terminal está envolvido na ligação lipídica, a região central participa da oligomerização e o domínio C-terminal possivelmente atua recrutando proteínas adicionais para a membrana e é necessário para atividades semelhantes às
chaperonas (OTTOLINI et al., 2017). Essa proteína se liga a lipídios nos terminais pré-sinápticos e regula a liberação de vesículas sinápticas (KAPLAN; RATNER; HAAS, 2003; WONG; KRAINC, 2017).
Figura 4: Representação 3D da proteína alfa-sinucleína. As cores em arco íris representam a direção da proteína da parte N-terminal (azul) para a C-terminal (vermelho). Imagens obtidas através do programa Phyre2 (confiança de 100%) utilizando a sequência de amino ácidos encontrada no banco de dados de proteína do NCBI. As imagens A, B, C, D, mostram a mesma proteína porem com rotações diferentes.
A proteína pode aparecer em diferentes conformações como monômeros, tetrâmeros, oligômeros e em formato de fibras (figura 5). A alfa-sinucleína é usualmente encontrada na forma
de monômeros e algumas vezes na forma de tetrâmeros. Porém, oligômeros e fibras aparecem em maior concentração nas
doenças neurodegenerativas, dividindo e classificando assim,
suas conformações patológicas e fisiológicas (DETTMER; SELKOE; BARTELS, 2016; KOPRICH; KALIA; BROTCHIE, 2017; WONG; KRAINC, 2017).
Figura 5: Conformações da alfa-sinucleína. Imagem ilustrativa das conformações fisiológicas (monômeros e tetrâmeros) e patológicas (oligômeros e fibras) da proteína.
A alfa-sinucleína foi identificada como componente fibrilar primário de patologias envolvendo os corpos de Lewy, como a DP. Apesar da grande relação entre a alfa-sinucleína e a DP, essa proteína tem um papel importante em outras doenças
(também denominadas de sinucleinopatias) como na Atrofia de Múltiplos Sistemas, Doença de Gaucher e inclusive nos distúrbios adicionais de armazenamento lisossômico (GOEDERT, 2001; WONG; KRAINC, 2017). Mesmo sendo uma
sua relação com doenças neurodegenerativas, suas funções
fisiológicas ainda não foram completamente elucidadas (GOEDERT, 2001; KALIA; KALIA; LANG, 2015; UVERSKY, 2017).
Dentre as importantes descobertas relacionadas à alfa-sinucleína, podemos destacar que ela esta envolvida na
homeostase celular junto com outras proteínas co-chaperonas, assim como na liberação de neurotransmissores, tráfico vesicular e estresse oxidativo (BUTLER; SAMBO; KHOSHBOUEI, 2017;
KALIA et al., 2011).
A alfa-sinucleína está envolvida na regulação da neurotransmissão de dopamina. Em 2013, Pablo Garcia-Reitboeck e colaboradores descobriram que a deleção do gene Snca resulta na diminuição do número de neurônios dopaminérgicos na substância nigra. Isso corrobora a ideia de que os níveis fisiológicos da alfa-sinucleína podem ter um papel importante para o desenvolvimento e crescimento de neurônios no cérebro. Já a superexpressão dessa proteína leva a
diminuição da atividade da tirosina hidroxilase (TH) regulando negativamente a síntese de dopamina (BUTLER; SAMBO;
KHOSHBOUEI, 2017; PENG et al., 2005; PEREZ et al., 2002)
Variações de nucleotídeos únicos no gene Snca, e no elemento intensificador distal não codificante do mesmo gene, tem a capacidade de alterar os níveis de expressão dessa proteína e até mesmo aumentar os riscos para algumas patologias (CAMPÊLO et al., 2017; KOPRICH; KALIA;
BROTCHIE, 2017; MYHRE et al., 2008; WANG et al., 2008; WONG; KRAINC, 2017). A regulação do gene Snca pela 3’UTR
tem se mostrado muito importante no controle da quantidade da
proteína alfa-sinucleína (MARCHESE et al., 2017). Alguns SNVs vêm sendo associados à 3’UTR (como é possível observar no
quadro abaixo) e alterações como a DP. Essas variações descritas podem alterar ou não a quantidade de RNAm e nos trabalhos analisados, essas variações tem a capacidade de
aumentar a quantidade de RNAm produzido e consequentemente a quantidade de proteína (KABARIA et al., 2015; TAGLIAFIERRO et al., 2017).
Quadro 1: Localização e diferenças de alelos associados a SNVs na região 3’UTR do gene Snca em humanos. (Retirado e adaptado de TAGLIAFIERRO et al., 2017). Tipo de variante Localização no cromossomo (humano) Alelos SNV 4: 90,645,671 T/A SNV 4: 90,645,674 A/G SNV 4: 90,646,886 C/T SNV 4: 90,647,702 A/C SNV 4: 90,647,278 T/C
Outra análise de SNVs na 3’UTR do gene Snca propõe
que uma variação entre duas linhagens de ratos (LEW e SHR na posição 562, substituição de C/T, respectivamente), seja uma das responsáveis pela diferença de expressão da proteína
alfa-sinucleína entre as linhagens. Isso tornaria esse SNV um forte candidato da modulação do comportamento tipo ansioso entre os animais (CHIAVEGATTO et al., 2009).
Níveis altos de RNAm da alfa-sinucleína, foram associados com alcoolismo em estudos com humanos e à
preferência ao etanol em ratos (ANOKHIN et al., 2016; BÖNSCH et al., 2005; LIANG et al., 2003). Ainda, de acordo com um estudo realizado em 2009 por Chiavegatto e colaboradores, existe uma diferença nos níveis de RNAm da alfa-sinucleína (no
hipocampo) entre as linhagens de ratos LEW e SHR. Os ratos
LEW apresentam um nível maior de RNAm no hipocampo, comparado com os animais SHR.
No nosso laboratório, realizamos a análise de RNAm em fêmeas das linhagens SHR e SLA16 (ANSELMI, 2016). Foram encontradas diferenças significativas na expressão de RNAm
entre as duas linhagens, onde a linhagem SLA16 apresentou níveis menores de RNAm no hipocampo e no estriado.
Estudos com microRNA (miRNA) mostram uma possível
regulação da alfa-sinucleína por alguns miRNA como o miR-7, miR-34b, miR-34c (KABARIA et al., 2015; MCMILLAN et al., 2017). Os miRNAs podem ser definidos como pequenos RNAs não codificantes que servem como reguladores pós-transcricionais de expressão gênica. Os miRNA (de animais) são
apenas parcialmente complementares aos seus alvos, os RNAm, e sua ligação pode reprimir a expressão desse RNAm, bem como leva-lo a degradação (STARK et al., 2005). Esses miRNA podem se ligar na 3’UTR do gene da alfa-sinucleína,
conseguindo diminuir a quantidade de proteína produzida. Por isso a identificação de variações nesta região é importante.
Mesmo com uma alta produção de RNAm, uma ligação mais
estável de um miRNA, a este RNAm, poderia causar uma diminuição na quantidade de proteína produzida (ALVAREZ-ERVITI et al., 2013; KABARIA et al., 2015; MCMILLAN et al., 2017; TAGLIAFIERRO et al., 2017).
Considerando que a alfa-sinucleína está fortemente
relacionada com a modulação do sistema dopaminérgico, e este sistema tem relação com a atividade locomotora, uma diferença na quantidade de alfa-sinucleína entre as linhagens, poderia
estar associada à diferença comportamental entre elas. Esse trabalho tem como foco a relação entre a proteína alfa-sinucleína e a modulação do sistema dopaminérgico na atividade motora em relação às diferenças comportamentais encontradas, previamente, entre as linhagens SHR e SLA16.
2. HIPÓTESES CIENTÍFICAS
Devido ao comentado ao longo da introdução, a hipótese geral, que deu origem a este trabalho, é que a diferença de comportamento, descrita entre as linhagens SHR e SLA16, se deve, em grande parte, a uma diferença no sistema dopaminérgico, mas especificamente no gene Snca. Para
investigar isso, o trabalho foi dividido em três blocos experimentais (partes I, II e III) que irão investigar as seguintes hipóteses científicas:
Hipótese 1 – Existem variações (SNVs) na 3’UTR do gene da alfa-sinucleína, entre as linhagens SHR e SLA16, que podem influenciar a ligação de microRNAs;
Hipótese 2 - Há uma menor expressão da proteína alfa-sinucleína nos animais da linhagem SLA16, em comparação aos
da linhagem SHR;
Hipótese 3 - Os animais da linhagem SLA16 possuem uma maior quantidade de dopamina e uma maior recaptação de dopamina, em relação aos animais da linhagem SHR.
3. OBJETIVOS:
3.1. OBJETIVO GERAL:
Analisar o sistema dopaminérgico e a alfa-sinucleína nas linhagens SHR e SLA16.
3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS: Parte I
3.2.1. Verificar o grau de conservação da proteína
alfa-sinucleína entre diferentes espécies de animais vertebrados em relação à espécie Rattus norvegicus, a fim de demonstrar a importância dessa proteína;
3.2.2. Verificar a presença de variações na 3’UTR do
gene Snca, que codifica para a proteína alfa-sinucleína;
3.2.3. Verificar a existência de possíveis miRNA que tenham ligação com a 3’UTR do gene Snca;
3.2.4. Verificar se a presença das variações encontradas podem influenciar a ligação de
miRNAs; Parte II
3.2.5. Verificar se há diferença na quantificação da proteína alfa-sinucleína no hipocampo, córtex pré-frontal e estriado de animais das duas linhagens; Parte III
3.2.6. Verificar se há diferença nos níveis basais de dopamina, no hipocampo, córtex e estriado das duas linhagens (SHR e SLA16).
4. MATERIAL E MÉTODOS:
4.1. ANIMAIS
Os ratos das linhagens SHR e SLA16 foram criados no biotério do Laboratório de Genética do Comportamento (LGC), desmamados 28 dias após o nascimento, separados por sexo e
alojados de 5 a 6 animais por gaiola de polipropileno (41 cm x 34 cm x 16 cm de altura), respeitando a área mínima para cada animal indicada na legislação vigente. As gaiolas são forradas
com maravalha esterilizada, os animais possuem acesso à água e comida ad libitum e são mantidos em ambiente com temperatura controlada (22±2ºC) e ciclos claro/escuro de 12 em 12h (luzes ligadas das 7:00 às 19:00h). Os números amostrais e idades dos animais são descritos a cada protocolo. Visando
reduzir o número de animais utilizados na pesquisa, utilizamos os mesmos animais tanto para a análise de Western Blotting quanto para o sequenciamento. Com objetivo de garantir o bem estar animal, foi observado The Rat Grimace Scale (NC3Rs). Todos os
procedimentos foram executados de acordo com a aprovação do Comitê de Ética no Uso de Animais em pesquisa da
Universidade Federal de Santa Catarina – CEUA/UFSC,
aprovados sob os protocolos N°PP00903, de acordo com a legislação brasileira vigente (Lei nº11.794/2008).
4.2. BLAST – Basic Local Alignment Search Tool Para uma análise sobre a conservância da proteína
estudada, foi realizada uma pesquisa com o programa BLAST do NCBI (National Center for Biotechnology Information). Foi feita uma busca na página principal do NCBI com o termo “Alpha Synuclein” dentro do banco de dados de proteínas. A partir dos
resultados, foi selecionada a proteína alfa-sinucleína de Rattus norvegicus (identificação GenBank: AAS55695.1).
Por fazer parte do próprio NCBI, na mesma página que contém as informações sobre a proteína, existe um link para realizar o BLAST “Run BLAST”. Essa ferramenta utiliza a
sequência da proteína escolhida e faz comparações com outras sequências da mesma proteína, porém de espécies diferentes a fim de informar o grau de conservância entre elas. Foi escolhido o banco de dados “Non-redundant protein sequences (nr)” e o
programa resultou em 100 comparações da sequência da alfa
sinucleína de Rattus norvegicus com diversas outras espécies. Visando aperfeiçoar os dados apresentados neste trabalho, foram selecionadas espécies diferentes conforme a árvore filogenética obtida também pelo BLAST. As espécies foram dispostas por ordem crescente de identidade.
4.3. EXTRAÇÃO DE DNA
Para a extração de DNA, foram utilizados três animais
machos de cada uma das duas linhagens. Os tecidos foram coletados dos mesmos animais eutanasiados para a técnica de Western blotting. Para a extração de DNA, o fígado dos animais foi dissecado a fresco e as amostras mantidas em freezer -80°C até o momento da extração.
No dia anterior à extração foi retirado um pedaço do fígado de cada uma das amostras previamente coletadas (medindo entre 1cm e 2cm), acondicionado em um microtubo devidamente identificado, em seguida foram adicionados 500 µL
de tampão de lise (Tris HCl 10mM, NaCl 10mM, EDTA 25mM, SDS 1%), previamente filtrado, auto clavado e armazenado a -20
ºC, mais 5 µL de proteinase K (na concentração de 20mg/µL)
(Thermo Fisher, EUA) para cada amostra. Após a adição do tampão, todas as amostras foram incubadas overnight em banho-maria a 42ºC.
Foi adicionado em cada amostra um volume de 500 µL de fenol (Bio Agency) equilibrado e então foi realizada a mistura
por inversão (10 minutos). Após a mistura, as amostras foram centrifugadas por 10 minutos a 14.000 x g em temperatura ambiente. Foi retirada a fase superior de cada microtubo e
transferido para um novo microtubo, este passo foi repetido duas vezes até que a fase superior estivesse clara.
Foram então adicionados 500 µL de uma mistura de Fenol-Clorofórmio (1:1) a cada amostra e em seguida misturadas por inversão e levadas a centrífuga por 10 minutos a 14.000 x g
em temperatura ambiente. A fase superior foi transferida novamente para um novo microtubo e então foi adicionado um volume de 500 µL de clorofórmio (Merk), misturado por inversão e centrifugado nas mesmas condições anterior descritas
anteriormente. Foi retirado o sobrenadante e transferido a um novo microtubo, ao qual foi adicionado uma solução de acetato
de sódio 3M (pH 5,2) e 500 µL de isopropanol gelado (Merck). As
amostras foram mantidas em freezer -20ºC por uma hora.
Após uma hora, as amostras foram centrifugadas por 30 minutos a 14.000 x g a temperatura ambiente, foi descartado o sobrenadante e o pellet foi lavado duas vezes com 500 µL de etanol 70% gelado (Synth) e centrifugado por 10 minutos a
14.000 x g em temperatura ambiente. Na última lavagem, o sobrenadante foi retirado e o pellet foi seco por inversão sobre um papel absorvente por aproximadamente uma hora.
O pellet foi então, ressuspenso em 50 µL de água DEPC (Ambion), e cada amostra tratada com 1 µL de RNAse a 20 mg/mL (Promega) por uma hora, na estufa, a 37ºC. A quantidade e a pureza do DNA extraído foram determinadas por dosagem no NanoDrop® (ThermoFisher) observando-se as absorbâncias em
230, 260 e 280 nm, bem como a relações 260/230 nm, 260/280 nm. As dosagens das amostras de DNA estão especificadas no quadro 2.
Quadro 2: Quantificação de DNA nas amostras para o sequenciamento. Amostras DNA (ng/µL) SLA16 – 1 344,2 SLA16 – 2 1063,4 SLA16 – 3 192,6 SHR – 1 793,0 SHR – 3 175,1 SHR – 4 236,5
Após a quantificação, foram feitos os cálculos com a solução estoque da extração para obtenção de uma solução de 10ng/uL de DNA. Para essas diluições foi utilizada água DEPC.
4.4. AMPLIFICAÇÃO E SEQUENCIAMENTO
Os iniciadores senso e antissenso, específicos para o
gene da alfa-sinucleína (Snca) foram desenhados utilizando o Software Primer3, sob a região conservada 3’UTR desse gene, disponível no site da University of California Santa Cruz (UCSC) (http://genome.ucsc.edu/index.html). Os iniciadores foram
selecionados pelo tamanho (18-22 nucleotídeos), conteúdo de
bases nitrogenadas G/C (Guanina/Citosina) em torno de 50%, temperatura de anelamento entre 58-60ºC e tamanho do fragmento amplificador entre 50-150 nucleotídeos. Detalhes da sequência dos iniciadores utilizados podem ser consultados no quadro 3. Os iniciadores foram produzidos pela empresa Síntese
Biotecnologia (Belo Horizonte, MG, Brasil).
Quadro 3- Sequência de iniciadores utilizados para sequenciamento. Os iniciadores foram desenhados para amplificar a região de interesse. A partir da sequência da 3’UTR do gene da alfa sinucleína, foram desenhados os iniciadores que possuíam uma melhor eficiência e maior região sequenciada. As sequências estão representadas de 5’>3’.
Gene Sequência Senso Sequência Antissenso
Snca TCCTAAGATC
TGCCCAGGTG
CAGCACACAA GAGCCTGCTA
O produto amplificado e os iniciadores foram então enviados para a empresa Myleus Biotechnology (Belo Horizonte. MG, Brasil), e sequenciadas por eletroforese capilar em aparelho ABI3730 (454, Solexa, Ilumina). O alinhamento e análise dos
dados de sequenciamento foi feita pelo programa BioEdit v7.0.5. (Ibis Therapeutics, EUA).
As análises de possíveis miRNA (que teriam como alvo a 3’UTR da alfa-sinucleína) foram realizadas através do software
miRDB (http://www.mirdb.org), onde todos os miRNA foram preditos pela ferramenta bioinformática MirTarget2. Foi selecionado “Target search” e então foi feita a procura por gene
alvo. O programa contém várias espécies e para esta análise, foi
utilizado o rato e o termo escolhido para a pesquisa do gene foi “Snca”, o programa então gera os dados de possíveis miRNA que se ligariam a 3’UTR do gene escolhido.
4.6. WESTERN BLOTTING
Animais naïve (machos e fêmeas) foram utilizados para a quantificação da proteína alfa-sinucleína. Devido ao exposto na introdução e baseado no trabalho de Anselmi (ANSELMI, 2016)
foram escolhidas as estruturas cerebrais do hipocampo, córtex pré-frontal e estriado para a realização do western blotting nas linhagens SHR e SLA16, com um número de 4 animais por linhagem e por sexo.
Os animais foram eutanasiados com 8 a 9 semanas de idade para a posterior quantificação. Os animais foram levados a
uma câmara de sedação saturada com isoflurano e
posteriormente eutanasiados por decapitação. O encéfalo foi removido cuidadosamente da calota craniana e as estruturas dissecadas a fresco e coletadas em microtubos previamente identificados. As amostras foram mantidas em freezer -80°C até o momento da extração celular. Os tecidos foram mantidos em
gelo e posteriormente preparados segundo o protocolo para a extração celular total.
Para a obtenção do extrato celular total de cada estrutura, os tecidos foram macerados com 150 μl de tampão de
lise (RIPA: Triton X-100 1%, SDS 0,1%, Deoxicolato de sódio 0,5%, NaCl 150 mM, Tris 50 mM) contendo coquetel inibidor de proteases (1%, Sigma, P8340, EUA) e as amostras foram incubadas em gelo por 30 min. O lisado foi centrifugado a 10.000
rpm durante 10 min a 4°C, o sobrenadante foi coletado e centrifugado novamente nas mesmas condições. O sobrenadante desta segunda centrifugação foi então utilizado nos experimentos.
A quantificação de proteínas foi realizada através do método BCA (Pierce, EUA). A leitura de absorbância (540 nm) foi
realizada em um leitor de placas Bio-Tek instruments (BIO-TEK)
e a concentração de proteínas foi normalizada para uma concentração final de 5,55 μg/μl. Foi adicionado o tampão de Laemmli e em seguida as amostras foram fervidas por 5 min.
As proteínas foram isoladas através de eletroforese em gel de poliacrilamida contendo dodecil sulfato de sódio
(SDS-PAGE) utilizando gel de separação com concentração de 12% e gel de entrada na concentração de 4%. A eletroforese foi realizada com corrente fixa de 15 mA/placa e voltagem máxima
de 150 V durante aproximadamente 2 h. Após a eletroforese, os géis foram submetidos ao processo de eletrotransferência usando um sistema semi-dry (1,2 mA/cm2; 1,5 h) para que as proteínas fossem transferidas para membranas de nitrocelulose. Para verificar a eficiência do processo de transferência, as
membranas foram coradas com Ponceau Stain (Bio-Rad).
As membranas foram bloqueadas com 3% de albumina sérica bovina em TBS (Tris 10 mM, NaCl 150 mM pH 7,5) por 1 h e após 3 lavagens de 5 min com TBS-Tween 0,1%, as
membranas foram incubadas overnight (4ºC), sob agitação constante, com os anticorpos específicos para as proteínas de
interesse (quadro 4).
Quadro 4: Proteínas-alvo e especificações dos anticorpos utilizados no Western blotting.
Proteína Empresa Código Clonali
dade Espécie PM (kDa) [ ] α-sinucleín a
ABCAM ab1903 Mono
clonal Camun-dongo 17 1:500 β-actina SCBT sc-47778 Mono clonal Camun-dongo 45 1:2000 IgG- camundo ngo GeHealth
care NIF825 - Ovelha -
1:1000 0 PM: Peso molecular, [ ]: concentração
Para a detecção dos complexos imunes, as membranas foram incubadas por 1 h com anticorpo secundário anti-IgG de camundongo (ligado à peroxidase) e reveladas por quimiluminescência, através do sistema LumiGLo® (Cell
Signaling). O imunoconteúdo das proteínas de interesse foi determinado pela razão entre a densidade óptica (D.O.) da alfa-sinucleína e a D.O. de β-actina. As bandas foram quantificadas
utilizando o software ImageJ (NIH, EUA) e os resultados
4.7. CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA (HPLC)
Foram escolhidas as estruturas cerebrais do hipocampo, córtex e estriado para a realização do HPLC. Foi realizada a determinação dos níveis cerebrais de monoaminas em machos e fêmeas (com idade entre 8 e 9 semanas) das duas linhagens,
através da cromatografia líquida de alta eficiência (do inglês, High performance liquid chromatography - HPLC) acoplada à detecção eletroquímica.
Os níveis teciduais de dopamina (DA), e seu metabólito, ácido 3,4-dihidroxifenilacético (DOPAC), foram determinados através de um sistema modular de HPLC da marca Waters, modelo Alliance e2695, constituído por uma bomba quaternária, desgaseificador, injetor automático refrigerado e um aquecedor
de coluna, acoplado a um detector eletroquímico amperométrico modelo Waters 2465 (Waters, Milford, MA, EUA). A célula analítica de fluxo é composta por um eletrodo de trabalho de carbono vítreo (GC-WE) com 2 mm de diâmetro, que é operado
em corrente contínua de +700 mV, versus um eletrodo de referência de Ag/AgCl in situ (ISAAC) e um eletrodo auxiliar de
aço inoxidável. Para a extração dos analitos, as estruturas
cerebrais foram homogeneizadas em uma solução de 0,1 M de ácido perclórico contendo 0,02% de metabissulfito de sódio e uma concentração conhecida de dihidroxibenzilamina (DHBA), como padrão interno. Após, as amostras foram submetidas a um banho de ultrassom de 40 kHZ por 20 min seguidas de
centrifugação a 14.000 RPMs durante 20 min, a 4°C. O sobrenadante foi transferido para microtubos do autoinjetor (4°C) e uma alíquota de 20 µL de cada amostra foi injetada no
cromatógrafo a cada 10 minutos. As amostras foram carreadas pela fase móvel composta por 60 mM de fosfato de sódio dibásico, 50 mM de ácido cítrico, 1,2 mM de 1-octanossulfonato de sódio, 0,5 mM de 1-heptanosulfonato de sódio, 2 mM de cloreto de sódio, 50 µM de ácido etilenodiamino tetra-acético
(EDTA) dissódico, 10% de acetonitrila e água ultrapura (Milli-Q, Millipore), pH = 4,2, filtrada através de uma membrana de acetato de celulose (0,45 µM, Millipore) e desgaseificada a vácuo em banho de ultrassom de 40 kHZ por 10 minutos. Utilizou-se um
fluxo gradiente (0 – 6 min = 0,20 ml/min; 6 – 10 min = 0,35 ml/min) através de uma pré-coluna (C18) com 20 mm de
comprimento e 2 mm de diâmetro interno (Alltech, Deerfield,
EUA) e coluna de fase reversa (C18) modelo Synergi Hydro-RP, 150 mm de comprimento e 2 mm de diâmetro interno, empacotada com 19 partículas de 4µM de diâmetro (Phenomenex, Torrance, EUA), ambas a temperatura de 30°C. O programa computacional Empower 2 ® (Waters Co.) foi utilizado
para controle, aquisição e processamento dos dados, os quais foram mensurados de acordo com as curvas de calibração de cada analito (10 – 1000 ng/ml) e expressos em ng de analito por
mg de tecido úmido.
4.8. ANÁLISES ESTATÍSTICAS
Os resultados de quantificação de alfa-sinucleína (5.5 Western blotting) e dopamina (5.7 HPLC) foram testados quanto à distribuição utilizando o teste de Shapiro-Wilk. Como todos os conjuntos de dados apresentaram distribuição normal foram utilizadas análises paramétricas. Os resultados do western blotting e de HPLC, seguiram o mesmo padrão, sendo analisados, individualmente, em concordância com a eletroforese; para análise do turnover de dopamina foi utilizada a
razão DOPAC/DA; foram comparados por testes-T de Student
não pareados entre as linhagens, separadamente por sexo e estrutura; animais que apresentaram resultados acima de dois desvios padrões da média foram considerados outliers e retirados das análises. Todos os resultados foram expressos como média mais ou menos o erro padrão da média (± e.p.m.).
Para a análise foi utilizado o software Statistica v.7 (StatSoft Inc., EUA). Os gráficos foram produzidos utilizando o programa GraphPad Prism v.7 (GraphPad, EUA) e representam a média de cada grupo ± o erro padrão da média. Nas análises estatísticas deste trabalho, os valores de p menores ou iguais a 0,05 foram considerados significativos.
5. RESULTADOS Parte I
5.1. CONSERVAÇÃO DA PROTEÍNA ALFA-SINUCLEÍNA ENTRE AS ESPÉCIES
Para analisar o nível de conservação da proteína
alfa-sinucleína entre diversas espécies, foi feita uma análise pelo programa BLAST do NCBI. Foram selecionados resultados de espécies diferentes (seguindo a árvore filogenética, figura 6) e
criado o quadro 5, para mostrar a identidade da sequência da proteína alfa-sinucleína destas espécies em relação à sequência do Rattus norvegicus.
F ig u ra 6 . Á rv o re f il o g e n é ti c a o b ti d a c o m r e s u lt a d o s d o BL AS T . Á rvo re f ilo g e n é tica co n st ru íd a co m o s d a d o s p ro ve n ie n te s d a a n á lise d e B L A S T . A á rvo re e st á d ivi d id a p o r e sp é cie s, o n d e a s b o lin h a s d a im a g e m m o st ra m re la çõ e s d e a n ce st ra lid a d e e n tr e a s e sp é cie s e o n d e e la s se d iv id e m ; já o s tr iâ n g u lo s e st ã o re p re se n ta n d o m a is d e u m o rg a n ism o o u a té m e sm o m ú ltip lo s o rg a n ism o s, co m u m a li g a çã o f ilo g e n é tica m a is p ró xim a m a s q u e n ã o f o ra m d e ta lh a d o s n a im a g e m e m q u e st ã o . Di fe re n te s e sp é cie s ilu st ra m o a lto g ra u d e co n se rvâ n cia d a p ro te ín a .
Quadro 5. Resultados do BLAST. Dados retirados com base nos resultados do BLAST e da árvore filogenética. Grau de identidade da proteína alfa-sinucleína de diferentes espécies em relação à mesma proteína da espécie Rattus norvegicus, nome da espécie, número de acesso pelo GenBank e porcentagem de identidade.
Espécie Número Acesso
GenBank Identidade Mus musculus NP_033247.1 99% Jaculus jaculus XP_004665471.1 96% Ictidomys tridecemlineatus XP_005337589.1 96% Homo sapiens NP_000336.1 95% Nannospalax galili XP_008842850.1 94% Crocodylus porosus XP_019408958.1 87% Alligator sinensis XP_006018179.1 87% Gavialis gangeticus XP_019382137.1 87% Tauraco erythrolophus XP_009977651.1 87% Charadrius vociferus XP_009886037.1 87% Falco peregrinus XP_005232578.1 87% Haliaeetus leucocephalus XP_010584461.1 86%
Struthio camelus australis XP_009672798.1 86%
5.2. ANÁLISE DO SEQUENCIAMENTO DA 3’UTR DO GENE SNCA QUE CODIFICA PARA A PROTEÍNA ALFA-SINUCLEÍNA.
A análise dos arquivos de sequenciamento mostrada na figura 7, foi realizada pelo software BioEdit v7.0.5. A sequências da 3’UTR das duas linhagens foram plotadas na mesma página e
alinhadas. O alinhamento destas sequências permitiu a análise de possíveis SNVs. Foi encontrado no alinhamento das sequências
senso, um SNV na base 96 onde os animais SHR (amostras 7, 9 e 11) possuem a base timina e os SLA16 (amostras 1, 3 e 5) possuem uma citosina (figura 7).
Figura 7. Alinhamento das sequências senso. Alinhamento das sequências 3’UTR, do gene Snca, das Linhagens SLA16 (representadas pelas linhas 1, 3 e 5) e SHR (representadas pelas linhas 7, 9 e 11). Na base 96 foi encontrado um SNV entre as duas linhagens, no qual a linhagem SLA16 tem uma citosina (C) e a linhagem SHR possui uma timina (T).
5.3. ANÁLISE COMPUTACIONAL DE miRNA COM LIGAÇÃO NA 3’UTR DO GENE SNCA.
Para este experimento foi utilizada uma ferramenta de bioinformática, o software miRDB, que permite a predição de possíveis alvos de miRNA. Foram encontrados 24 possíveis miRNA para a 3’UTR do gene da alfa-sinucleína em ratos. Porém, foram
escolhidos para este trabalho apenas os miRNA que tem um sítio de ligação próximo ao local (96bp) em que a variação descrita por sequenciamento foi encontrada. Resultando em quatro possíveis
miRNA, que estão dispostos no quadro 6 com dados do nome do miRNA, o target score (nível de confiança do algoritmo em prever o miRNA, com valores entre 50-100), sequência do miRNA e o seed location (pares de base ou região mais importante da ligação do miRNA com o RNAm alvo).
Q u a d ro 6 . Ca ra c te rí s ti c a s d o s q u a tr o m iRN As e n c o n tr a d o s n o m iRD B. No q u a d ro a b a ixo e st ã o a lg u n s d a d o s im p o rt a n te s co m o n o m e d o m iR NA e lo ca l d e li g a çã o ; De 1 -4 e st ã o r e p re se n ta d o s o s m iR NA q u e p o ssu e m o sí te o d e li g a çã o m a is p ró xim o a va ria çã o e n c o n tr a d a e n tr e a s lin h a g e n s S HR e S L A 1 6 ; T a rg e t S co re re p re se n ta o n íve l d e co n fia n ça d o a lg o ritm o e m p re ve r o m iR NA ( va lo re s e n tr e 5 0 -100) ; se q u ê n cia d o m iR N A g e ra d o p e la a n á lise in si lico ; se e d lo ca tio n p o d e se r d e fin id o co m o a r e g iã o m a is im p o rt a n te d a l ig a çã o d o m iR N A co m o RN A m a lvo . m iR N A (1 ) (2 ) (3 ) (4 ) N o m e d o m iR N A rn o -m iR -7a -5p rn o -l e t-7a -2 -3p rn o -l e t-7g -3p rn o -m iR -93 -3p T a rg e t S co re 92 72 72 56 S e q u ê n ci a m iR N A U G G A A G A C U A G U G A U U U U G U U G U C U G U A C A G C C U C C U A G C U U U C C C U G U A C A G G C C A C U G C C U U G C A C U G C U G A G C U A G C A C U U C C C G A S eed lo ca ti o n 120 101 101 128
Dos resultados obtidos no miRDB, foi selecionado o miRNA
que possui sua seed location mais próxima à base que apresentou a variação entre as linhagens, o rno-miR-93-3p (figura 8). Para demonstrar a ligação deste miRNA, no resultado da nossa sequência, foi realizado um alinhamento dos dados do miRNA com os dados do sequenciamento, levando em consideração a sequencia do DNA descrito e do RNAm (figura 9), a fim de mostrar
uma possível diferença de ligação devido a variação encontrada.
Figura 8. Análise de miRNA. Sequência 3’UTR do RNAm da proteína alfa-sinucleína de Rattus norvegicus fornecida pelo GeneBank. Em negrito está destacado o local de ligação do miRNA rno-miR-93-3p (pb 128-134).
Figura 9. Sequência 3’UTR e análise de miRNA. Sequência 3’UTR do gene da proteína alfa-sinucleína, do lado esquerdo representando a variação, encontradas nessa região, dos animais da linhagem LEW e SLA16 e do lado direito a variação dos animais da linhagem SHR. Em amarelo, a sequência de DNA, em azul a fita complementar de DNA (e molde para o RNAm), abaixo da fita molde, sequência de RNAm da proteína alfa-sinucleína de Rattus norvegicus. Em cinza, destacada a sequência do miRNA rno-miR-93-3p, o qual tem sua ligação mais importante (seed location) na parte destacado em rosa. Em verde e em vermelho representando as variações entre as linhagens e sua ligação (mais fraca ou mais forte, respectivamente) com o miRNA.
Parte II
5.4. QUANTIFICAÇÃO DA PROTEÍNA ALFA-SINUCLEÍNA NO HIPOCAMPO, CÓRTEX PRÉ-FRONTAL E ESTRIADO DE ANIMAIS NAÏVE DAS DUAS LINHAGENS.
Os resultados da expressão de alfa-sinucleína estão
apresentados de acordo com a estrutura analisada. A expressão de alfa-sinucleína, normalizada pela expressão de β-actina, no
hipocampo (figura 10), não apresentou diferença entre as
linhagens em machos [T(6)=1,150; p=0,29] ou fêmeas [T(6)= -0,125; p=0,90].
