1 UNIVERSIDADE REGIONAL DO NOROESTE DO ESTADO DO RIO GRANDE DO
SUL - UNIJUI
1º SEMESTRE DE 2017
TRABALHO DE CONCLUSÃO DE CURSO
GABRIELA MARTINS MELLITZ
A influencia dos métodos de extração na quantificação de fenóis totais na Casca de Schinus molle e Schinus terebinthifolius.
2 Gabriela Martins Mellitz
A influencia dos métodos de extração na quantificação de fenóis totais na Casca de Schinus molle e Schinus terebinthifolius.
Trabalho de conclusão de curso apresentado ao curso de graduação em Farmácia da Universidade Regional do Noroeste do Estado do Rio Grande do Sul como requisito parcial para obtenção do grau de Farmacêutico.
Orientador Dra. Ilaine Teresinha Seibel Gehrke.
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4 LISTA DE FIGURAS
Figura 1- Schinus molle, cujo nome popular é aroeira-salso, utilizada na medicina popular como tratamento para diversas patologias. ... 12 Figura 2 – Schinus terebinthifolius, conhecida com aroeira vermelha, encontrada comumente no Rio Grande do Sul, utilizada como cicatrizante ginecológico. ... 13 Figura 4 - Rendimento dos extratos obtidos por maceração e de refluxo... 17 Figura 3 - Resultado do teste de Shinoda em extrato hidroalcóolico das espécies de Schinus molle e
5 LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Teores médios de fenóis totais (mg EAG g-¹) nos extratos aquosos e hidroalcóolicos de
6 SUMÁRIO
APRESENTAÇÃO ... 7
INTRODUÇÃO ... 10
MATERIAIS E MÉTODOS ... 14
Material vegetal e Preparação dos Extratos ... 14
Preparo do Extrato Hidroalcóolico ... 14
Preparo do Extrato Aquoso ... 15
Determinações de Fenóis Totais ... 15
Teste de Shinoda (HCl concentrado e magnésio) para Detecção de Flavonoides ... 16
RESULTADOS E DISCUSSÃO... 16
Rendimento do Extrato Bruto ... 16
Identificação de Flavonoides pelo Teste de Shinoda ... 17
Quantificação de Fenóis Totais nos Extratos ... 18
CONCLUSÕES ... 20
7 APRESENTAÇÃO
O presente estudo foi formatado de acordo com as normas da Revista Brasileira de Farmácia, cujas normas encontram-se em anexo.
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Avaliação de Fenóis Totais e Caracterização de Flavonoides na Casca de
Schinus molle e Schinus terebinthifolius.
Gabriela Martins Mellitz², Ilaine Teresinha Seibel Gehrke³
¹ Trabalho de Conclusão de Curso - Farmácia - Universidade Regional do Noroeste do Estado do Rio Grande do Sul - UNIJUI.
² Aluna do Curso de Farmácia da UNIJUI.
³ Professora do Departamento de Ciências da Vida – DCVida da UNIJUI.
RESUMO
A família botânica Anacardiaceae é constituída por 80 gêneros e aproximadamente 600 espécies, dentro da família encontra-se o gênero Schinus L. que contem espécies arbóreas e arbustivas lenhosas, neste gênero deparam-se duas espécies Schinus molle L e Schinus terebinthifolius Raddi que são conhecidas por sua utilização na medicina popular, para tratar inflamações e até mesmo para repelir insetos, essas e outras propriedades das espécies são atribuídas pelos compostos fenólicos. O objetivo deste trabalho é quantificar fenóis totais e caracterizar flavonóides nas cascas das duas espécies. Foram utilizados dois métodos de extração ambos com diferentes solventes, os métodos de maceração com solução hidroalcóolica de solvente, e o método de refluxo tendo água como solvente. O extrato proveniente do método de refluxo apresentou maior rendimento. Foram identificados através do teste de Shinoda flavonóides do tipo flavonóis para a espécie S. terebinthifolius Raddi e flavonas para S. molle L. o extrato que mais apresentou teor de fenóis totais foi o hidroalcóolico da espécie S. molle L. com 4,57mgEAG / g de extrato, tanto o rendimento como a extração de fenóis totais, dependem tanto do solvente, como do
9 método aplicado, que pode ser baseado em mecanismos químicos diferentes. Além do rendimento, há grande variação na composição do extrato em função do sistema e do solvente utilizado.
PALAVRAS-CHAVES: Aroeira, Schinus, Folin-Ciocalteu, Flavonoides.
ABSTRACT
The family botanic anacardiaceae is composed for 80 genus and approximately 600 species, inside of family is found a genus Schinus L. that’s contains class arboreous and woody shrub, in that genus are found two species Schinus molle L and Schinus terebinthifolius Raddi that’s known for application in popular medicine to treat inflammations and insect repellent, these activities are attributed through the constitution phenolic. The objective of this work determine the quantity of constitution phenolic and flavonoids at bark of two species. Were used two method of extraction both different solvent, the method of maceration with hydroalcoholic solution, and the method of reflux with water solution. The extract with bigger efficiency was by de method of reflux. Was identified through the test of Shinoda flavonoids of the type flavonóis for Schinus trebinthifolius Raddi and flavonas for Schinus molle L. The extract that presented major content of constitution phenolic was extract with hydroalcoholic solution of Schinus molle L. with 4,57mgEAG / g of extract, both the yield and the extraction of total phenols depend on both the solvent and the applied method, which can be used in different chemical mechanisms. In addition to the yield, there is great variation in the composition of extract depending on the system and the solvent used..
10 INTRODUÇÃO
A utilização de plantas medicinais como recurso terapêutico é tão antiga quanto à civilização humana. O potencial antioxidante de espécies vegetais relacionado à presença de compostos fenólicos tem despertado o interesse de indústrias químicas e farmacêuticas (Eisenberg et al., 1998; Rice-Evans et al., 1996).
Os compostos fenólicos são comumente encontrados em plantas e apresentam além de sua atividade antioxidante, atividade antimicrobiana e anti-inflamatória (Kähkönen et al., 1999). A presença de substâncias fenólicas em S. terebinthifolius tem sido relacionada com a sua ação antimicrobiana e protetora da mucosa gástrica (Carlini, 2010). Na primeira edição da farmacopéia consta que a decocção da casca de Schinus terebinthifolius, é utilizada como anti-inflamatório e cicatrizante ginecológico (Bertoldi, 2006; Miranda 2013; Brasil, 2009; Salvi Junior, 2009).
Os principais compostos fenólicos encontrados em extratos etanólicos das folhas da Schinus terebinthifolius pertencem à classe dos flavonoides, sendo trans-catequina, quercitrina, afzelina os quais são amplamente empregados nas indústrias de alimentos, farmacêutica e cosmética devido às suas propriedades antimicrobianas, antioxidantes e anti-inflamatórias (Santana, 2012; Gehrke, 2012; Silva, L R; Oliveira, A A & Lima, R A, 2015; Alba G A & Bonilla R P 2009).
A espécie Schinus molle tem sido utilizada popularmente como repelente de insetos, analgésico em dores reumáticas e seus frutos, folhas e seiva apresentam potencial inibitório contra enzimas-chave relevantes à hipertensão arterial, além de possuir propriedades antiespasmódica, anti-reumática, emenagoga, antiinflamatória e cicatrizante (Ranilla et al., 2010; Piva, 2002).
O amplo emprego das espécies S. terebinthifolius e molle na medicina popular são motivo suficiente para buscar mais sobre o perfil químico das cascas sendo que estas são ricas em polifenóis, sendo estes essenciais para a prevenção de danos oxidativos e possível desenvolvimento de doenças crônicas, e estão diretamente relacionados com as atividades farmacológicas das espécies.
11 A família botânica Anacardiaceae é constituída por 80 gêneros e aproximadamente 600 espécies, as quais têm se mostrado promissoras na busca por substâncias bioativas (Correia et al., 2006). Nesta família se encontra o gênero Schinus L. o qual inclui espécies arbóreas ou arbustivas lenhosas nativas do continente americano. Dentre as espécies deste gênero que ocorrem no Rio Grande do Sul estão Schinus molle L. e Schinus terebinthifolius Raddi, estas são amplamente cultivadas sendo empregadas como ornamentais devido ao seu porte e beleza (Morgan & Overholt 2005).
Além de servir para ornamentação, estas plantas têm apresentado diversas propriedades medicinais. Estudos demonstram que espécies do gênero apresentam atividade antifúngica (Santos et al. 2010), antipirética, anti-inflamatória e analgésica (Erazo et al. 2000)..
Schinus molle L. é uma espécie arbórea, dióica, que ocorre de maneira natural no bioma Pampa. Esta espécie é usada na medicina tradicional do Sul do Brasil como agente de cicatrização, e apresenta efeito antidepressivo (Ferreira et al, 2016). Além disso, possui grande importância econômica, ecológica e ornamental, seu óleo essencial é utilizado como fonte de muitos compostos para a indústria farmacêutica (Lemos, R P M.; D’Oliveira, C B & Stefenon, V M, 2015), pois o mesmo apresenta propriedades antimicrobianas, antifúngicas, antiinflamatórias, antiespasmódicas, antipiréticas e cicatrizantes (Santos, 2007).
Três compostos com atividade anti-inflamatória foram isolados de frutos Schinus molle. Os compostos foram identificados como ácido 3-epi-isomasticadienolálico (1), ácido isomasticadienonalico (2) e chamaejasmin (3), sendo 1 e 2 triterpenos e 3 uma biflavona, (YUEQIN, 2003). Além da atividade anti-inflamatória foi testado por Ruffa et. al. (2002), a atividade citotóxica contra linhagem de células de carcinoma hepato celular humano, sendo o extrato metanóico de S. molle que apresentou potencial mais ativo dentre as espécies testadas.
12 Figura 1- Schinus molle, cujo nome popular é aroeira-salso, utilizada na medicina popular como tratamento para diversas patologias.
FONTE: Flores e Folhagens 2016.
As cascas, sementes e folhas de Schinus terebinthifolius têm sido utilizadas como matéria-prima para obtenção de fitoterápicos devido à diversidade de constituintes químicos presentes nesta espécie, tais como taninos e polifenóis. A decocção das cascas é utilizada na medicina popular especialmente pelas mulheres, em banhos de assento após o parto, como anti-inflamatório e cicatrizante, e para tratar de doenças do sistema urinário e do aparelho respiratório, bem como nos casos de hemoptise e hemorragia uterina (Braga, 1960; Lorenzi, 1992). A espécie S. terebinthifolius possui atividade antimicrobiana possivelmente, atribuída à presença de substâncias fenólicas (Bertoldi, 2006).
13 Figura 2 – Schinus terebinthifolius, conhecida com aroeira vermelha, encontrada comumente no Rio Grande do Sul, utilizada como cicatrizante ginecológico.
FONTE: NETO, 2012.
De acordo com Lima et al. (2006), a análise química do extrato etanólico da casca de S. terebinthifolius revelou a presença de fenóis, triterpenos e antraquinonas. Testes positivos para flavonas, xantonas, flavonoides, esteróides livres, antraquinonas e triterpenos foram observados quando os extratos foram preparados em hexano. Por outro lado, extratos etanólicos das folhas mostraram resultados positivos para fenóis, flavonas, flavonoides, xantonas, leucoantocianidinas, flavanonas e esteróides livres (Lima et al., 2006). No extrato etanólico de folhas de S. terebinthifolius permitiu o isolamento e identificação de cinco compostos ativos: galato de etilo, miricetrina, quercitrina, galato de metilo e miricetina. Estudos sugeriram que essas substâncias são responsáveis pela propriedade anti-radical livre observada em extratos de S. terebinthifolius (Ceruks et al., 2007).
No estudo de Queires, (2013) foi investigado em modelos animais, avaliar a atividade antiproliferativa de modelos de câncer, entre eles carcinoma da próstata DU145 insensível a andrógenos, onde o extrato aquoso de Schinus terebinthifolius foi mais eficaz do que o metanólico em termos de inibição e multiplicação celular em todas as linhagens testadas.
Diante do exposto e tendo em vista a necessidade de estudos sobre estes compostos naturais presentes na flora regional, o objetivo do trabalho foi avaliar o teor de fenois totais e
14 identificar a presença de flavonoides nos extratos das duas especies, frente a diferentes métodos de extração.
MATERIAIS E MÉTODOS
O estudo foi realizado no Laboratório de Pesquisa em Química da Unijui, o estudo é do tipo experimental qualitativo e quantitativo.
Material vegetal e Preparação dos Extratos
As cascas de Schinus molle e Schinus terebinthifolius foram coletadas em Ijuí (latitude 28º23'16" sul e longitude 53º54'53" oeste, 328 metros do nível do mar), RS, Brasil, no dia 13 de fevereiro de 2017 onde as temperaturas, mínima, média e máxima, encontravam-se em torno de 20, 24 e 33°C, respectivamente, a umidade relativa do ar próxima a 65%, insolação total diária de 12h e sem índices de precipitação (Instituto Nacional de Meteorologia, 2017). As coletas foram realizadas no período da manhã. O material vegetal tem sua exsicata depositada no Herbário Rogério Bueno (UNIJUÍ) para Schinus terebinhtifolius (registro 5.810) e Schinus molle (registro 6.379), deidamente identificadas por botânico.
As cascas frescas (450-500g) foram cominuídas cerca de 1 minuto na função pulsar em
liquidificador e submetidas à extração. O rendimento de extrato foi calculado pela fórmula:
Rendimento de extrato = (Massa do extrato/Massa da amostra total) x 100.
Preparo do Extrato Hidroalcóolico
O extrato hidroalcoólico foi preparado pelo método de maceração com álcool etílico a 96°(v/v), utilizando-se 200g das cascas frescas, moídas, e colocadas em 500 mL, metodologia adaptada de Maciel (2012).
15 O sistema foi agitado manualmente diariamente por 5 minutos durante sete dias, filtrado e a solução obtida teve o solvente eliminado em evaporador rotatório sob pressão reduzida com temperatura controlada (60°C) durante todo o processo.
Preparo do Extrato Aquoso
Para o preparo do extrato aquoso foi adaptada à metodologia de Campos (2011). O extrato aquoso foi preparado com 10g da amostra de cascas frescas moídas em 250 mL de água destilada. A amostra foi submetida à extração sob refluxo com temperatura de ebulição durante 2 horas. Os solventes foram eliminados em evaporador rotatório sob pressão reduzida com temperatura controlada (60°C) durante todo o processo. O extrato obtido foi filtrado em papel filtro e armazenado em vidro âmbar para posterior dosagem de fenóis totais (Brígida; Rosa, 2003).
Determinações de Fenóis Totais
O teor de FT nos extratos foi determinado pelo método de Folin-Ciocalteu com modificações (Sousa, 2007; Alves & Kubota, 2013). O extrato foi solubilizado a 1% (10 mg.mL-1) em metanol. Esta solução (0,5 mL) foi misturada e incubada com 250 µL do reagente de Folin Ciocalteu (2N), por cinco minutos, à temperatura ambiente e, por fim, adicionou-se 2 mL de solução de carbonato de sódio (7,5%). Após incubação à temperatura ambiente, no escuro, por 2 horas, a absorbância foi medida a 760 nm em cubeta de vidro, tendo como “branco” o metanol e todos os reagentes, menos o extrato. O teor de FT foi determinado por interpolação da absorbância das amostras contra uma curva de calibração construída com o padrão ácido gálico (0,005 a 0,040 mg.mL-1) e expressos como mg de EAG (equivalentes de acido gálico) por g de extrato. A equação da curva de calibração do ácido gálico foi y = 48,088x + 0,4597, onde x é a concentração de ácido gálico, e y é a absorbância a 760 nm e o coeficiente de correlação R = 0,9901. Todas as análises foram realizadas em triplicata.
16 Teste de Shinoda (HCl concentrado e magnésio) para Detecção de Flavonoides:
Para realizar o experimento foi pesado 40g do material sendo suspensos em 200 mL de etanol 92,8 °(v/v). Procedendo-se à decocção em banho-maria a 60ºC durante 15 min. Deixou-se esfriar e filtrou-se em papel filtro.
Para a realização do teste de Shinoda adicionou-se cerca de 5mL do extrato em um tubo de ensaio que continha 200mg de magnésio metálico. Acrescentou-se 1mL de ácido clorídrico. A leitura foi realizada visualmente.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Rendimento do Extrato Bruto
Os resultados de rendimento dos extratos aquosos do presente estudo obtidos pelo método de extração por refluxo apresentou maior rendimento confirmando, como mostra na figura 4, o que Simões et al. (2003) já havia relatado, que com o aumento da temperatura à planta amolece aumentando sua solubilidade, constituindo-se neste sentido em um método rápido de se obter a extração com um maior rendimento. Já os extratos hidroalcóolicos obtidos pelo o método de maceração dependem da permeabilidade do solvente na droga, da solubilidade a frio e há a saturação do solvente, esses fatores podem ter sido determinantes para o menor rendimento obtido (Hostettman, 2003).
17 Figura 3 - Rendimento dos extratos obtidos por maceração e de refluxo.
FONTE: Autor, 2017.
Identificação de Flavonoides pelo Teste de Shinoda
Este estudo revelou a presença de compostos fenólicos considerados constituintes químicos importantes como antioxidantes. Na reação de Shinoda ocorreu o desenvolvimento de cor vermelha, confirmando a presença de flavonóis para a espécie Schinus terebinthifolius, e para a espécie Schinus molle ocorreu o desenvolvimento de coloração laranja, confirmando a presença de flavonas (Fig. 3). A reação de Shinoda é considerada positiva para o grupo de flavonoides quando desenvolve coloração que varia de laranja (para a classe das flavonas), vermelho (para flavonóis) e violeta (para flavanonas), enquanto isoflavonas e chalconas não desenvolvem reação (Oliveira, F. De; Akisue, G. & Akisue, M K, 1998). O mecanismo desta reação ainda não foi completamente elucidado (Martínez, 2005). 0 5 10 15 20 25 30 35 S.molle S. terebinthifolius Aquoso em % Hidroalcoolico em %
18 Figura 4 - Resultado do teste de Shinoda em extrato hidroalcóolico das espécies de Schinus molle e terebinthifolius.
FONTE: Autor, 2017.
Neste estudo, demonstramos que o teste de Shinoda para a identificação de compostos polifenólicos nas cascas das espécies de Schinus molle e terebinthifolius corrobora, reforçando os dados obtidos pelos estudos de Jorge, L I F.; & Markmann, B E O (1996) e Colacite, (2015) os quais utilizaram o mesmo procedimento reação de Shinoda, para folhas e as cascas da Schinus terebinthifolius Raddi, tendo os testes apresentando reação positiva para flavonoides. Essa resposta também é suportada pelo estudo de Garcia de (2017), os quais além de identificarem flavonoides pelo teste de Shinoda que desenvolveu coloração vermelha identificaram pequenas quantidades de esteróides e triterpenóides na resina da casca de S. molle pelo teste de Liebermann-Burchard (reação verde escuro).
Quantificação de Fenóis Totais nos Extratos
Os extratos hidroalcóolicos apresentaram maior teor de fenóis totais, a espécie Schinus molle L apresentou 4,57 mg EAG g-¹ , enquanto a espécie Schinus terebinthifolius Raddi apresentou 4,49 mg EAG g-¹ . Os extratos aquosos apresentaram menor teor de fenóis totais onde na espécie Shinus molle L resultou em 3,9 mg EAG g-¹ , e na espécies Schinus terebinthifolius Raddi foram
19 quantificadas 4,1 mg EAG g-¹ . A quantificação de fenóis totais nos extratos esta descrita na tabela 1.
Tabela 1 – Teores médios de fenóis totais (mg EAG g-¹) nos extratos aquosos e hidroalcóolicos de Schinus molle e Schinus terebinthifolius.
Espécie Extrato Aquoso Extrato Hidroalcoolico.
Schinus molle L. 3,9 4,57
Schinus terebinthifolius
Raddi.
4,1 4,49
Foi observado que a água extrai com eficiência os compostos fenólicos devido à sua polaridade (Andreo & Jorge 2017), porém a decomposição térmica tem sido apontada como maior causadora da redução do conteúdo de polifenóis, pois estes podem reagir com outros componentes e impedir sua extração (Moure et al., 2001), o que condiz com o resultado do presente estudo, pois os extratos aquosos apresentaram maior rendimento confirmando a eficiência da água na extração e menor teor de fenóis totais devido ao aquecimento.
O extrato que foi obtido pelo método de maceração apresentou maior teor de fenóis totais, este resultado pode estar relacionado com o tempo de contato da casca com o solvente, pois o autor Yingngam et al. (2015) aponta que tempos reduzidos de extração não permitem a penetração eficiente do solvente no extrato, impedindo a extração dos compostos de interesse.
O que pode ter contribuído para os maiores teores de fenóis totais serem encontrados nos extratos obtidos por maceração esta correlacionado com a parte do material vegetal utilizado (Gribova et. al. 2008), pois na extração realizada em partes moles de plantas (flores e folhas), a fase
20 de inchaço, que afeta o rendimento das substâncias extraídas, ocorre rapidamente, acompanhado da liberação dos compostos de interesse. Contudo a utilização de partes mais fortes da planta, como casca e raiz, a fase de inchaço requer um tempo prolongado, pois ocorre lentamente, dificultando a transferência de massa das substâncias no tempo inicial.
Esses fatores estão diretamente relacionados com os dois resultados, o método de maceração se mostrou mais eficaz na extração dos compostos, pois houve um contato do material vegetal com o solvente por sete dias, onde durante este tempo ocorreu a transferência dos compostos da planta para o solvente. No extrato obtido por refluxo além do fator termossensibilidade há o fator tempo, que foi de duas horas, sendo considerado curto para a migração dos compostos para o solvente utilizado, sendo a casca a parte utilizada, já que esta necessita de um tempo maior para a fase de inchaço.
CONCLUSÕES
Os extratos das cascas das duas espécies em estudo apresentam compostos fenólicos do tipo flavonoides. Os resultados encontrados, tanto de rendimento de extração como na quantificação de fenóis totais, dependem tanto do solvente, como do método aplicado, que pode ser baseado em mecanismos químicos diferentes. Além do rendimento, há grande variação na composição do extrato em função do sistema e do solvente utilizado.
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