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(1)UNIVERSIDADE FEDERAL DE JUIZ DE FORA INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS. Michélia Antônia do Nascimento Gusmão. CARACTERIZAÇÃO IMUNOLÓGICA DA APIRASE DE BATATA E INDUÇÃO DE ANTICORPOS IgE POR EPITOPOS COMPARTILHADOS ENTRE AS SmATPDases DE Schistosoma mansoni E A APIRASE DE Solanum tuberosum. JUIZ DE FORA 2017.

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(3) MICHÉLIA ANTÔNIA DO NASCIMENTO GUSMÃO. CARACTERIZAÇÃO IMUNOLÓGICA DA APIRASE DE BATATA E INDUÇÃO DE ANTICORPOS IgE POR EPITOPOS COMPARTILHADOS ENTRE AS SmATPDases DE Schistosoma mansoni E A APIRASE DE Solanum tuberosum. Trabalho apresentado ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas como requisito parcial para obtenção do título de Doutor na área de Imunologia e Doenças Infecto-Parasitárias.. Orientadora: Prof.ª Drª. Priscila de Faria Pinto. JUIZ DE FORA 2017.

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(5) Michélia Antônia do Nascimento Gusmão. Caracterização imunológica da apirase de batata e Indução de anticorpos IgE por epitopos compartilhados entre as SmATPDases de Schistosoma mansoni e a apirase de batata Tese de doutorado submetida à banca examinadora do Curso de Pós-Graduação em Ciências Biológicas- Ênfase em Imunologia e DIP da Universidade Federal de Juiz de Fora, como parte dos requisitos parciais para obtenção do Título de Doutor em Ciências Biológicas (Imunologia). Banca Examinadora:. Prof.ª Drª. Priscila de Faria Pinto-UFJF (Orientadora). Prof. Dr. Marcos José Marques-UNIFAL (Membro Externo). Prof. Dr. Luiz Cosme Cotta Malaquias-UNIFAL (Membro Externo). Prof. Dr. Olavo dos Santos Pereira Júnior-UFJF (Membro Interno). Profª. Drª. Juciane Maria de Andrade Castro-UFJF (Membro Interno). Prof. Dr. Ivo Santana Caldas-UNIFAL (Suplente Externo). Profª. Drª. Eveline Gomes Vasconcelos-UFJF (Suplente Interno).

(6) AGRADECIMENTOS Agradeço a: Deus por abençoar o meu caminho, por ter me dado forças e persistência para seguir em frente e pela saúde que sempre tive para lutar por meus ideais. A todos os professores e técnicos da UFJF que contribuíram direta ou indiretamente para este trabalho. A Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal pela concessão da bolsa e apoio financeiro. A Drª Flávia Fernanda Búbula Couto pela doação dos plasmas e toda a equipe do Dr. Paulo Marcos Zech Coelho do Centro de Pesquisas René Rachou/CPQRR/Fiocruz/BH. A Drª Angela Maria Gollner pela ajuda na preparação das lâminas histológicas. Ao professor Dr. Gilson Costa Macedo do Laboratório de Imunologia da UFJF pela ajuda nos experimentos de dosagem de citocinas. Meu marido Ronaldo por sempre estar ao meu lado, me apoiando e ajudando a ser uma pessoa cada vez melhor, lutando junto comigo a cada dia para conquistarmos nossos sonhos e pela compreensão durante toda essa trajetória. Meus pais João e Cristina por terem lutado sempre com muito esforço para a minha criação e por terem me ensinado quais são os verdadeiros valores da vida. Meus irmãos Leandro e Lenildo pela amizade e companheirismo. Meus sogros Luís e Madalena pelo carinho, consideração, incentivo e a compreensão de minha ausência em vários momentos. A Eveline por ter me recebido no laboratório tão bem e com muita boa vontade, inicialmente me orientado tanto na parte experimental quanto na vida pessoal, dedicando sua sabedoria e tempo. Uma pessoa com a qual aprendi muito e admiro a dedicação ao trabalho. Peço desculpas pelas falhas cometidas durante esse período..

(7) A Priscila por ser uma orientadora companheira em todo esse período de trabalho e aprendizado, pela paciência em compartilhar comigo o seu conhecimento, pela amizade, consideração e por ser tão solícita com todos nós em qualquer situação. Por ter me acolhido como aluna com tanta dedicação e também peço desculpas pelas falhas cometidas. A Michelle, um ser humano incrível, por ter me ensinado tanto, desde a Iniciação Científica e em vários experimentos com tanta dedicação e boa vontade, pelas dicas, com quem eu aprendi muito, pela amizade, carinho e consideração. Aos companheiros de experimentos pela ajuda e aos amigos do laboratório pelos momentos bons e ruins que passamos juntos e pelo aprendizado diário: Nayara, Danielle, Priscila, Luana, Patrícia, Juliane,Lucas Araújo, Laís, Luis Felipe, Michelle, Gabriane, Leonardo, Wagner, Sólon. Agradeço a todos os amigos e colaboradores que participaram desta importante etapa da minha vida!.

(8) RESUMO. A esquistossomose é uma doença tropical negligenciada que acomete milhões de pessoas no mundo. A falta de vacina para essa doença helmíntica impulsiona a busca por moléculas antigênicas oriundas dos parasitos do gênero Schistosoma. Dentre as moléculas consideradas como promissoras, se encontra a ATP difosfohidrolase de Schistosoma mansoni. O parasito possui duas isoformas de desta enzima que são denominadas SmATPDases e são expressas em todos as fases do ciclo de vida deste helminto. A apirase de batata é uma proteína vegetal pertencente à mesma família de enzimas do parasito, compartilha epitopos com as isoformas de SmATPDases. Dessa forma, o objetivo deste trabalho foi realizar a caracterização imunológica da apirase de batata em modelo de infecção murina experimental com base nessa homologia protéica. A proteína vegetal foi inoculada em camundongos C57BL/6 que posteriormente foram infectados com cercárias de S. mansoni. A proteína vegetal induziu níveis significativos de anticorpos IgG e IgG1 após a imunização, os quais se mantiveram elevados na análise 60 dias após a infecção. A cultura de esplenócitos dos animais imunizados respondeu ao estímulo com a proteína vegetal, induzindo a produção de níveis significativos de IFN-γ, IL-10 e IL-5, mas não de IL-13. O processo de imunização não conferiu proteção, sendo incapaz de promover a redução da carga parasitária. O efeito imunomodulador da imunização foi observado através de uma redução da área afetada pela reação granulomatosa hepática nos animais imunizados.. Em relação à ligação de. anticorpos IgE, a apirase de batata mostrou reatividade significativa com estes anticorpos. presentes. em. amostras. do. plasma. de. pacientes. com. esquistossomose. Em ensaios de Western blotting, os anticorpos IgE foram capazes de reconhecer três proteínas presentes no homogeneizado de vermes adultos do helminto, com 91, 63 e 55 kDa. Foi possível inferir que todas as bandas reveladas correspondem a isoformas de SmAPTDases com distintos processamentos. pós-tradução,. tais. como. glicosilação. e. proteólise.. Comprovando esta reatividade, foi possível verificar que a imunização dos animais (C57BL/6) com a proteína vegetal foi capaz de induzir a produção significativa de anticorpos IgE detectáveis em técnicas de ELISA e Western.

(9) blotting. Como a apirase de batata possui identidade com a NTPDase 1 (CD39) de mamíferos sugerimos que os pacientes possuam anticorpos naturais contra NTPDases envolvidos na manutenção da homeostase do organismo. O conjunto de dados obtidos mostra que a apirase de batata possui um perfil imunoregulatório na esquistossomose, podendo contribuir para a redução da morbidade, induzindo a produção de anticorpos IgE, tidos como protetores na esquistossomose.. Palavras-chave: Apirase de batata, SmATPDase, IgE, Imunomodulação, regulação, Schistosoma mansoni..

(10) ABSTRACT. Schistosomiasis is a neglected tropical disease that affects millions of people around the world. The lack of vaccine for this helminth disease prompts a search for antigenic molecules from the parasites of the genus Schistosoma. Among the molecules considered promising are an ATP diphosphohydrolase from Schistosoma mansoni. The parasite has two enzyme isoforms which are termed SmATPDases and are expressed in all as life cycle phases of this helminth. The potato apyrase is a plant protein belonging to the same family of parasite enzymes, shared epitopes with SmATPDase isoforms. Thus, the objective of this work was to perform an immunological characterization of potato apyrase in a model of experimental murine infection based on this protein homology. Plant protein was inoculated into C57BL / 6 mice that were infected with S. mansoni cercariae. Plant protein induced significant levels of IgG and IgG1 antibodies after immunization, which remained high for analysis 60 days after infection. The solenocytes culture of the immunized animals responded to the stimulus with a plant protein, inducing a significant production of IFN-γ, IL-10 and IL-5, but not IL-13. The immunization process did not provide protection, being unable to promote a reduction of the parasitic load. The immunomodulatory effect of immunization was observed through a reduction of the area affected by the hepatic granulomatous reaction in the immunized animals. Concerning the binding of IgE antibodies, potato apyrase showed significant reactivity with these antibodies present in plasma samples from patients with schistosomiasis. In Western blotting assays, IgE antibodies were able to recognize three nonhomogenized languages of adult helminth worms at 91, 63 and 55 kDa. It was possible to infer that all the bands revealed correspond to SmAPTDase isoforms with various post-translational processing, such as glycosylation and proteolysis. (C57BL / 6) with a plant protein capable of inducing a significant production of IgE antibodies detected in ELISA and Western blotting techniques. As potato apyrase has an identity with a mammalian NTPDase 1 (CD39), we suggest that patients have an antibody against the NTPDases involved in maintaining the body's homeostasis. The obtained data show that the potato harvest has an immunoregulatory profile in schistosomiasis, and may contribute to the reduction.

(11) of morbidity, inducing a production of IgE antibodies, considered as protectors in schistosomiasis.. Key words: Potato apyrase, SmATPDase, IgE, immunomodulation, regulation, Schistosoma mansoni..

(12) LISTA DE FIGURAS. Figura 1 Ciclo biológico de Schistosoma mansoni.............................................19 Figura 2 Estados do Brasil com infecção por S. mansoni..................................21 Figura 3 Granuloma de S. mansoni na fase aguda............................................25 Figura 4 Opsonização do helminto por IgE e eosinófilos....................................32 Figura 5 Topografia da membrana mostrando as quatro famílias de enzimas...38 Figura 6 Representação das NTPDases de mamíferos.....................................39 Figura 7 Modulação da atividade de Treg pela via CD39/CD73........................40 Figura 8 Quantificação da produção de anticorpos IgG de camundongos imunizados com a apirase de batata.........................................................................................55 Figura 9 Quantificação da produção de anticorpos IgG de camundongos imunizados com a apirase de batata e infectados com S. mansoni..........................................56 Figura 10 Perfil de citocinas de camundongos imunizados com a apirase de batata e infectados com Schistosoma mansoni.................................................................58 Figura 11 Médias das áreas dos granulomas hepáticos de camundongos imunizados com a proteína vegetal (apirase de batata) e infectados com S. mansoni..............60 Figura 12 Fotomicrografias de lâminas de cortes hepáticos de camundongos C57BL/6 imunizados com apirase de batata e infectados com S. mansoni corados por hematoxilina-eosina.................................................................................................61 Figura 13 Célula gigante multinucleada do tipo Células de Langhans...................63 Figura 14 Fotomicrografias de lâminas de cortes hepáticos de camundongos C57BL/6 imunizados com apirase de batata e infectados com S. mansoni corados por tricrômica de gomori.................................................................................................................64 Figura 15 Reatividade entre anticorpos IgE de amostras de plasma de pacientes com esquistossomose e apirase de batata por ELISA............................................66 Figura 16 Reatividade de anticorpos IgE de amostras de plasma de camundongos C57BL/6 imunizados com a apirase de batata por ELISA.......................................67.

(13) 13. Figura 17. Reatividade da apirase de batata com anticorpos IgE do plasma de. pacientes e de camundongos com esquistossomose por Western blotting...............69 Figura 18 Reatividade de anticorpos IgE de plasmas de humanos com SmATPDases de S. mansoni.............................................................................................................71 Figura 19 Reatividade de anticorpos IgE, IgG e IgM do plasma de pacientes saudáveis e com esquistossomose com NTPDase de macrófagos...........................73.

(14) 14. LISTA DE TABELAS. Tabela 1. Área do granuloma hepático e vermes adultos de S. mansoni recuperados do grupo imunizado com apirase de batata, grupo que recebeu somente Adjuvante de Freund e grupo Controle. Todos os grupos foram infectados com cércárias de S. mansoni 15 dias após a segunda imunização e sacrificados após 55 dias de infecção......................................................................................................................60. Tabela 2. Análise semi-quantitativa do número de células gigantes multinucleadas localizadas nas áreas periféricas dos granulomas hepáticos dos camundongos C57BL/6 imunizados com a proteína vegetal (apirase de batata) e infectados com 50 cercárias de S. mansoni..............................................................................................63.

(15) 15. LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS v/v. Volume/volume. °C. graus Celsius. M. Molar. mL. Mililitro. mM. Milimolar. Pg/mL. Picogramas/mL. m/v. massa/volume. nm. Nanômetro. µg. Micrograma. µl. Microlitro. µM. Micromolar. ACRs. Apyrase Conserved Regions (Regiões Conservadas da Apirase). ADP. Adenosina difosfato. AMP. Adenosina monofosfato. ACF. Adjuvante Completo de Freund. AIF. Adjuvante Incompleto de Freund. WB. Western blotting. DO. Densidade Ótica. DP. Desvio Padrão. EP. Erro Padrão. ELISA. “Enzime-linked immunosorbent assay” (Ensaio imunoenzimático ligado a enzima). g. Força gravitacional. H2O2. Peróxido de hidrogênio. IgG. Imunoglobulina da classe G. kDa. Quilo Dalton. IgG1. Imunoglobulina da subclasse 1. NaHCO3. Bicarbonato de sódio. IgE. Imunoglobulina da classe E. OMS. Organização Mundial da Saúde. OPD. O-phenylenediamine dihydrochloride (Dihidrocloreto de o-fenilenodiamina).

(16) 16. PBS. Phosphate buffered saline (Tampão fosfato salino). pH. Potencial hidrogeniônico. pI. Ponto isoelétrico. sc. Subcutânea. SDS. Sodium dodecyl sulfate (Dodecil sulfato de sódio). SDS- Page. Eletroforese em gel de poliacrilamida na presença de dodecil sulfato de sódio. E-NTPDase. Ecto-Nucleosídeo Trifosfato Difosfohidrolase. E-NTP. Ectonucleotídeo pirofosfatase/fosfodiesterase. MOPS. Ácido 3-(N-morfolino) propanosulfônico. NDPase. Nucleosídeo difosfato hidrolase. NTPase. Nucleosídeo trifosfato hidrolase. NTPDase. Nucleosídeo Trifosfato Difosfohidrolase. Pi. Fosfato inorgânico. SWAP. Soluble Adult Worm Antigens (Antígeno Solúvel de Vermes adultos). Tris. Tris-hidroximethil-aminometano.

(17) 17. LISTA DE ANEXOS. A- Cartas de ética para pesquisa em humanos. B- Cartas de ética para pesquisa em animais..

(18) 18. SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO....................................................................................................................18 1.1. Schistosoma mansoni ......................................................................................... 20. 1.2 ESQUISTOSSOMOSE ............................................................................................... 21 1.3 O GRANULOMA NA ESQUISTOSSOMOSE ............................................................. 24 1.4 DIAGNÓSTICO .......................................................................................................... 27 1.5 TRATAMENTO E CONTROLE .................................................................................. 28 1.6 IMUNOLOGIA DA ESQUISTOSSOMOSE ................................................................. 30 1.6.1 O PERFIL DE CITOCINAS NA ESQUISTOSSOMOSE ....................................... 30 1.6.2 RESPOSTA HUMORAL NA ESQUISTOSSOMOSE ........................................... 33 1.6.3 ANTICORPOS NATURAIS ?.................................................................................35 1.7 A FAMÍLIA DAS NTPDases ...................................................................................... 39 2.OBJETIVOS ..................................................................................................................... 46 2.1 OBJETIVOS GERAIS ................................................................................................ 46 2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ...................................................................................... 46 3. MATERIAL E MÉTODOS ................................................................................................ 48 3.1 PURIFICAÇÃO DA APIRASE DE BATATA .............................................................. 48 3.2 IMUNIZAÇÃO DE CAMUNDONGOS C57BL6 COM A APIRASE DE BATATA, DESAFIO COM CERCÁRIAS E QUANTIFICAÇÃO DE ANTICORPOS POR ELISA ...... 48 3.3 AVALIAÇÃO DA CARGA PARASITÁRIA E ANÁLISE HISTOLÓGICA .................... 49 3.4 CULTURA DE ESPLENÓCITOS PARA ANÁLISE DE CITOCINAS ........................ 508 3.5 ANÁLISE MORFOMÉTRICA E CONTAGEM DE CÉLULAS ..................................... 50 3.6 OBTENÇÃO DE PLASMA DOS PACIENTES ........................................................... 51 3.7 ELISA DE PLASMAS HUMANOS ............................................................................. 50 3.8 PREPARAÇÃO DOS ANTÍGENOS SOLÚVEIS DO VERME ADULTO (SWAP) ....... 52 3.9 ATIVIDADE FOSFOHIDROLÍTICA, SEPARAÇÃO E REATIVIDADE DAS ISOFORMAS SmATPDases COM ANTICORPOS IgE ................................................... 53 3.10 IDENTIFICAÇÃO DAS PROTEÍNAS DA FAMÍLIA DAS NTPDASES POR “WESTERN BLOTTING”................................................................................................. 54 3.11 ANÁLISE ESTATÍSTICA ......................................................................................... 55 3.12 ASPECTOS ÉTICOS DA PESQUISA ...................................................................... 55 4. RESULTADOS ................................................................................................................ 56 4.1 QUANTIFICAÇÃO DOS NÍVEIS DE ANTICORPOS PRODUZIDOS PELA IMUNIZAÇÃO DE CAMUNDONGOS C57BL/6 COM APIRASE DE BATATA E POSTERIORMENTE INFECTADOS COM S. mansoni ................................................... 56 4.1.2 AVALIAÇÃO DO PERFIL DE CITOCINAS INDUZIDOS PELA IMUNIZAÇÃO DE CAMUNDONGOS C57BL/6 COM APIRASE DE BATATA E POSTERIORMENTE INFECTADOS COM S. mansoni ..................................................................................... 59.

(19) 19. 4.1.3 CONTAGEM DE VERMES RECUPERADOS APÓS INFECÇÃO COM S. mansoni E AVALIAÇÃO DO PERFIL IMUNOMODULATÓRIO DA APIRASE DE BATATA SOBRE GRANULOMAS DE S. mansoni ..................................................... 61 4.2 ANÁLISE DAS CÉLULAS GIGANTES MULTINUCLEADAS E DO PERFIL DE FIBRAS COLÁGENAS NOS GRANULOMAS HEPATICOS DE CAMUNDONGOS C57BL/6 IMUNIZADOS COM A APIRASE DE BATATA E POSTERIORMENTE INFECTADOS COM O PARASITO .................................................................................. 64 4.3 REATIVIDADE DA APIRASE DE BATATA COM ANTICORPOS IgE DOS PLASMAS DE PACIENTES COM ESQUISTOSSOMOSE POR ELISA ............................................ 67 4.3.1 INDUÇÃO DE ANTICORPOS IgE PELA APIRASE DE BATATA EM CAMUNDONGOS C57BL/6 ......................................................................................... 69 4.3.2 REATIVIDADE DA APIRASE DE BATATA COM ANTICORPOS IgE DOS PLASMAS DE CAMUNDONGOS IMUNIZADOS OU INFECTADOS COM S. mansoni E DE PACIENTES COM ESQUISTOSSOMOSE POR WESTERN BLOTTING ........... 70 4.3.3 IDENTIFICAÇÃO DAS SmATPDases DE S. mansoni POR ANTICORPOS IgE DO PLASMA DE PACIENTES COM ESQUISTOSSOMOSE POR WESTERN BLOTTING ................................................................................................................... 72 4.4 REATIVIDADE DE ANTICORPOS IgE DO PLASMA DE PACIENTES SAUDÁVEIS OU DOENTES COM NTPDase DE MACRÓFAGOS POR WESTERN BLOTTING ..... 74 5. DISCUSSÃO ................................................................................................................... 77 5.1 O PAPEL IMUNOMODULATÓRIO DA APIRASE DE BATATA NA ESQUISTOSSOMOSE MANSONI ................................................................................... 77 5.2 A APIRASE DE BATATA E A REATIVIDADE COM ANTICORPOS IgE .................. 84 6. CONCLUSÕES ............................................................................................................... 92 7. REFERÊNCIAS ............................................................................................................... 93.

(20) 20. 1 INTRODUÇÃO. 1.1 Schistosoma mansoni O gênero Schistosoma pertence ao filo Platyhelminthes, classe Trematoda e à família Schistosomatidae. Diferente de outros trematódeos, os parasitos desse gênero possuem sexos separados e parasitam os vasos sanguíneos de mamíferos, os quais são seus hospedeiros definitivos. O macho é menor (cerca de 1 cm) que a fêmea (aproximadamente 1,5 cm) e ambos possuem duas ventosas: uma oral, mais anterior, onde se encontra a abertura bucal; e a ventral ou acetábulo. A fêmea tem o tegumento liso e vive albergada no canal ginecóforo do macho que, diferente da fêmea, possui tubérculos em sua superfície e tem cor mais esbranquiçada que a mesma, a qual tende a ser mais escura devido à maior quantidade de sangue no ceco (GRYSEELS, 2006; CARVALHO, COELHO & LENZI, 2008). O parasito S. mansoni, responsável pela doença no Brasil (CHITSULO, 2000), possui ciclo de vida complexo (FIGURA 1) que envolve dois hospedeiros: o molusco do gênero Biomphalaria como hospedeiro intermediário e vertebrados como hospedeiros definitivos (ROSS, 2002; ROSS, 2007). A fêmea de S. mansoni produz centenas de ovos por dia (GRYSEELS, 2012), contudo, a maioria dos trabalhos aponta para números entre 150 e 300 ovos por dia (CARVALHO, COELHO & LENZI, 2008). Os ovos possuem uma larva ciliada, o miracídio, que secreta enzimas as quais auxiliam na migração dos ovos nos vasos sanguíneos até o lúmen intestinal. Nesta jornada, muitos ovos ficam presos nos tecidos, principalmente no fígado, mas cerca de um terço é excretado nas fezes. Em condições ideais, ao entrar em contato com a água, o miracídio eclode e penetra em moluscos do gênero Biomphalaria. Posteriormente, os miracídios se transformam, por reprodução assexuada, em esporocistos primários e posteriormente, em secundários, os quais sofrem profundas modificações anatômicas passando pelo processo de formação cercariana. Um único miracídio pode gerar cerca de 300 mil cercárias (CARVALHO, COELHO & LENZI, 2008; GRYSEELS, 2012). Em contato com o hospedeiro humano, as cercárias penetram através da pele, perdem a cauda e se transformam em esquistossômulos que migram para o coração, pulmões, fígado e veia porta (GRYSEELS, 2006). Na veia porta, ocorre o acasalamento e maturação dos vermes que migram para os vasos.

(21) 21. mesentéricos, onde ocorre a oviposição, iniciando o ciclo novamente (GRYSEELS, 2006).. Figura 1. Ciclo Biológico de Schistosoma mansoni. Adaptado de http://www.cdc.gov/parasites/schistosomiasis/biology.html. 1.2 ESQUISTOSSOMOSE Existem seis espécies de Schistosoma que podem infectar os humanos: S. mansoni, S. japonicum, S. mekongi, S. haematobium, S. intercalatum e S. malayensis. As infecções por S. mansoni, S. japonicum, S. mekongi e S. intercalatum estão associadas com a doença crônica do fígado e intestino, enquanto que infecções crônicas por S. haematobium podem levar à fibrose e calcificação do trato urinário (CARVALHO, COELHO & LENZI, 2008). A maioria das infecções por S. haematobium, S. mansoni e S. intercalatum é encontrada na África Subsaariana. A infecção por S. japonicum ocorre na China, Indonésia e Filipinas apesar de amplas e substanciais medidas de controle. S. mekongi é encontrado no Camboja e Laos e ao longo do Rio Mekong. No caso de S. malayensis, essa espécie ocorre na Ásia (LESHEM et al.,.

(22) 22. 2009) e o S. mansoni ocorre em algumas partes do Brasil, Suriname, Venezuela e Caribe (ROSS, 2002; http://www.cdc.gov/parasites/schistosomiasis/epi.html). A esquistossomose é uma das doenças tropicais negligenciadas, além disso, é considerada a mais importante das doenças helmínticas em termos de morbidade e mortalidade (JURBERG, 2015). Recentemente, um trabalho avaliou, por meio de uma revisão sistemática, os trabalhos publicados sobre a prevalência e intensidade da esquistossomose mansoni na América Latina e em países do Caribe de 1942-2014. Neste trabalho, foi observado que apenas o Brasil publicou estudos após 2001, mostrando “hot spots” de alta prevalência. Para que os programas de controle sejam direcionados no sentido de eliminação e/ou transmissão da doença a curto prazo, é necessária a atualização da situação epidemiológica da esquistossomose (ZONI, CATALÁ & AUTI, 2016). Em nosso país, a transmissão da doença ocorre em uma área endêmica que vai desde o Maranhão, até Espírito Santo e Minas Gerais (FIGURA 2). Cerca de 30 milhões de pessoas são expostas ao risco de contrair a esquistossomose, sendo a região Nordeste do país a área mais endêmica (LAMBERTUCCI, 2010; SOUZA et al., 2012; ROKNI, 2012; ZONI, CATALÁ & AUTI, 2016). Em Minas Gerais, 61% dos municípios tem relatado transmissão da infecção com mais de 10 milhões de pessoas vivendo em áreas endêmicas, entretanto a maioria dos estudos tem focado em áreas de alta endemicidade. Couto e cols. (2014) observaram que dentre as helmintíases encontradas, a esquistossomose foi a doença mais frequente, apesar de baixa prevalência, na Zona da Mata Mineira (Minas Gerais)..

(23) 23. Figura 2. Estados do Brasil com infecção por S. mansoni. Extraído de Rokni, 2012.. A esquistossomose pode se apresentar no homem sob uma forma aguda e duas formas crônicas. Uma forma crônica é a hepatointestinal, é leve, geralmente assintomática e atinge a maioria dos indivíduos de área endêmica. A outra, é classificada como forma hepatoesplênica, é rara e se manifesta geralmente com hepatoesplenomegalia e outros sinais de hipertensão portal. A doença é caracterizada, em sua forma aguda, pela presença de numerosos granulomas periovulares que se desenvolvem principalmente no fígado. Esses granulomas possuem muitos eosinófilos, periferia pouco delimitada e frequente necrose central. As manifestações clínicas são caracterizadas por prostração, febre e eosinofilia, que podem surgir alguns dias após a exposição cercariana ou após cerca de um mês, período coincidente com o início da eliminação dos ovos nas fezes, o que pode provocar dores abdominais e diarreia mucosanguinolenta (CARVALHO, COELHO & LENZI, 2008)..

(24) 24. A forma crônica habitual ou leve é a que se encontra na maioria das pessoas infectadas nas áreas endêmicas, as quais eliminam ovos viáveis nas fezes, mas assintomáticas ou com queixas vagas, inespecíficas. O intestino é geralmente pouco lesado nos casos de esquistossomose mansoni no Brasil, mas o fígado está sempre comprometido. Neste órgão são vistos granulomas periovulares isolados em várias fases de evolução para a cicatrização. Já a forma grave da esquistossomose é caracterizada morfologicamente pela fibrose hepática periportal. É uma lesão representada por expansão fibrosa dos espaços porta, acompanhada de lesões destrutivas e que podem conduzir à hipertensão portal (CARVALHO, COELHO & LENZI, 2008).. 1.3 O GRANULOMA NA ESQUISTOSSOMOSE O granuloma (FIGURA 3) na esquistossomose é uma reação inflamatória focal, caracterizada por células mononucleares fagocíticas e outros tipos celulares que estão de forma compacta e organizada em torno dos ovos do parasito (LENZI et al., 1998). Na fase aguda da doença, o tamanho do granuloma é determinado pelas células T, é sensível à IL-10 com poucos efeitos da resposta de anticorpos, já na fase crônica, a regulação do tamanho depende da resposta de anticorpos e das células T (LENZI et al., 1999). O granuloma de S. mansoni foi classificado em 2 estágios que se subdividem em outros estágios (LENZI et al., 1998): I) Estágio pré-granulomatoso: -Fracamente/inicialmente reativo (após 30 dias de infecção); -Exsudativo (após 35 dias após a infecção). II) Estágio granulomatoso: -Exsudativo-produtivo (de 40 a 70 dias após a infecção); -Produtivo (de 70 a 90 dias após a infecção); -Involutivo (inicia aos 90 dias após a infecção). No estágio pré-granulomatoso há o acúmulo gradual de células ao redor do ovo por meio da destruição focal das paredes vasculares envolvidas e do parênquima adjacente. O estágio granulomatoso tem início com o surgimento de histiócitos e células epitelióides que substituem a zona leucocitária. Posteriormente, o ovo se degenera e se desintegra, tornando-se mais proeminentes as fibras colágenas e o.

(25) 25. granuloma passa para a fase involutiva, tornando-se reduzidos em tamanho com hialuronizaçao das fibras colágenas. Os granulomas de S. mansoni são compostos principalmente de eosinófilos, linfócitos e macrófagos, com a proporção de células variando nos diferentes órgãos (CHEEVER et al., 2002). Dessas células que compõem o granuloma, cerca de 50% são eosinófilos, os quais secretam proteínas que podem romper e matar esquistossômulos (LINS et al., 2008). Além disso, algumas evidências tem mostrado um papel imunoregulatório dessas células na resposta imune inata e adaptativa, por exemplo, na apresentação de antígenos e regulação e polarização das células T (AKUTHOTA et al., 2008). A resposta granulomatosa é inicialmente orquestrada por células TCD4 + mas células TCD8+ , células B e macrófagos tem sido mostrados com um papel na regulação da formação do granuloma que é o principal responsável pela patologia na esquistossomose. Entretanto, é uma forma de proteção do hospedeiro, já que sem um granuloma intacto funcional ocorre, por exemplo, dano microvesicular nos hepatócitos. Isso pode ser observado em camundongos infectados por S. mansoni com células TCD4+ depletadas, os quais desenvolveram a doença na forma aguda fatal, com animais morrendo 4-6 semanas após a infecção, coincidindo com o período de deposiçao dos ovos no tecido (HAMS, AVIELLO & FALLON, 2013). Em relação aos macrófagos, os mesmos podem ser classificados em dois principais subgrupos: os classicamente ativados, que são induzidos por citocinas inflamatórias como IFN-Ɣ e IL-12, e os alternativamente ativados que são típicos de um ambiente marcado por citocinas como IL-4, IL-13 e IL-21. No granuloma, essas células podem ter um papel duplo: auxiliar no sequestro dos antígenos liberados pelo ovo no início da resposta inflamatória e mais tarde possuem um caráter antiinflamatório, na fase crônica, suprimindo indiretamente a função de outras células e diminuindo o volume do granuloma (WILSON et al., 2012). Durante a evolução do processo granulomatoso, os macrófagos tornam-se maduros, grandes e normalmente descritos como macrófagos epitelióides por sua semelhança à células epiteliais. Essas células epitelióides podem se fundir formando células gigantes multinucleadas (REISNER, 2015). Enquanto as células epitelióides são não fagocíticas mas secretórias, as células gigantes retém a sua capacidade fagocíticas e também produzem e secretam citocinas (HERNANDEZ-PANDO et al., 2000; BOROS & REVANKAR, 2010)..

(26) 26. Já foram descritos alguns estímulos para a formação de células gigantes multinucleadas, como algumas citocinas. Foi mostrado que a IL-4 é requerida para a formação dessas células, in vitro, in vivo e na esquistossomose. Além dessa citocina e de estímulos quimiotáticos, a IL-13 e o IFN- Ɣ também favorecem a fusão dos macrófagos (HELMING & GORDON, 2007). A fase produtiva do granuloma, segunda fase do estágio granulomatoso, corresponde ao início da formação de fibras e ocorre após a absorção e fagocitose dos restos celulares resultantes da necrose dos hepatócitos (LINS et al., 2008). A arquitetura tridimensional do granuloma mostra fibras de matriz extracelular arranjadas num padrão de malha, que ocorre no estágio granulomatoso exsudativo produtivo, e posteriormente, evolui para um arranjo final concêntrico e compacto no estágio produtivo (~70 dias de infecção). Esses dois arranjos de fibras correspondem a diferentes tipos de colágeno que aparecem na evolução do granuloma: colágeno tipo III, contendo fibras reticulares, que é posteriormente substituído por colágeno tipo I contendo fibras colágenas (LENZI et al., 1998)..

(27) 27. Figura 3. Granuloma de S. mansoni na fase aguda. Corte histológico de fígado de camundongos C57BL/6 após 55 dias de infecção com S. mansoni evidenciando a área do granuloma na fase aguda da doença. A seta azul mostra o tecido hepático sadio, a seta verde evidencia o ovo do parasito e a seta amarela mostra a reação inflamatória em torno do ovo que gera a reação granulomatosa (H&E, 100X). Arquivo Pessoal.. 1.4 DIAGNÓSTICO Os métodos de diagnóstico da esquistossomose podem ser agrupados em duas categorias: os diretos, que detectam o parasito ou suas partes, e os indiretos que identificam evidências indiretas do parasito. O diagnóstico da infecção por S. mansoni por meio de métodos parasitológicos se baseia na observação microscópica dos ovos do parasito nas fezes devido ao baixo custo operacional e sua praticidade em casos de infra-estrutura laboratorial precária (CARVALHO, COELHO & LENZI, 2008). O diagnóstico direto mais utilizado é o parasitológico de fezes, feito pelo método de Kato-Katz que é recomendado pela Organização Mundial de Saúde (OMS) por que associa o melhor custo-benefício à maior praticidade. Esse método permite a visualização e contagem dos ovos por grama de fezes. Entretanto, a detecção direta.

(28) 28. de ovos nas fezes não é possível em infecções pré-patentes e o diagnóstico é difícil naqueles pacientes com baixa taxa de eliminação de ovos, em áreas de baixa endemicidade e nos casos de avaliação pós-tratamento (FERRARI, 2003; CARVALHO, COELHO & LENZI, 2008; ZHAO, 2012). Novos métodos de diagnóstico têm sido propostos uma vez que os métodos clássicos de diagnóstico falham em detectar a infecção quando o número de ovos eliminados é baixo. Teixeira e colaboradores (2007) desenvolveram um método altamente sensível, o Helmintex, para identificar ovos de S. mansoni em maiores quantidades de fezes. Esse método envolve a separação de ovos por meio de beads paramagnéticos. Outro método desenvolvido por Jurberg (2008) consiste em um dispositivo de incubação para a detecção do miracídio. Esses métodos são muito sensíveis mas necessitam de fezes frescas, entretanto, a suspensão dos miracídios pode ser examinada por até 15 dias após fixação. Mais recentemente, foi descrita uma nova técnica diagnóstica baseada na sedimentação diferencial dos ovos quando sujeitos a um fluxo lento e contínuo de uma solução salina a 3%. Esse método é sensível, rápido e de fácil execução, mas pesquisas adicionais estão em andamento para utilizá-lo em grandes populações (COELHO et al., 2009). Existem uma variedade de métodos imunológicos para diagnóstico da esquistossomose, dentre eles, os mais utilizados são ELISA, COPT (Teste de precipitação Circumoval), IHAT (Teste de Hemaglutinação Indireta) e IFT (Teste de Imunofluorescência Indireta). Entretanto, alguns têm um valor limitado devido a reações cruzadas com outras helmintíases, não detectam a intensidade da infecção, não diferenciam infecções anteriores das recentes e podem permanecer positivos durante anos após a cura quimioterápica. Na forma aguda da esquistossomose, para complementar o exame clínico, a ultrassonografia abdominal pode ser útil na visualização de aumento inespecífico do fígado e do baço, além da presença de linfadenomegalia peripancreática e periportal (CARVALHO, COELHO & LENZI, 2008; GOMES, 2014).. 1.5 TRATAMENTO E CONTROLE Na busca por novos fármacos para a terapêutica da esquistossomose, deve-se considerar aquelas que poderão prevenir a infecção, as que irão agir nas formas jovens do verme; drogas supressoras que interrompam a postura das fêmeas, visto.

(29) 29. que o ovo é o principal agente patogênico, além de interromper a transmissão da doença; e drogas curativas que matam os vermes adultos (CARVALHO, COELHO & LENZI, 2008). O. praziquantel. é. a. farmacoterapia. chave. utilizada. para. tratar. a. esquistossomose pois é um fármaco efetivo que pode ser utilizado para todas as espécies de Schistosoma que infectam humanos (CHAN, 2013). Possui baixo custo e alta taxa de cura (ESMAT et al., 2009). Para tentar resolver o problema da baixa susceptibilidade dos estágios imaturos do parasito à droga, pode-se administrar uma segunda dose após 15 dias (CIOLI et al., 2014). Os efeitos colaterais são leves, não existindo evidências de que provoque lesões tóxicas graves no fígado ou outros órgãos (MINISTÉRIO DA SAÚDE,2009). Várias drogas com potencial anti-helmíntico têm como alvo os canais iônicos, dada a importância desses canais para a biologia do parasito. Estudos iniciais sobre a atuação do praziquantel em esquistossomos mostraram que além de causar modificações na superfície do verme adulto expondo vários antígenos do parasito ao sistema imune do hospedeiro, essa droga causa contração e paralisia muscular dos vermes adultos, acompanhada de rápida captação de cálcio do meio externo (ARAGON, 2009; CHAN et al., 2013; CIOLI et al., 2014). Atualmente, o controle da doença é principalmente baseado no tratamento de indivíduos infectados com o fármaco citado, entretanto o praziquantel não previne a reinfecção, além da possibilidade de resistência à droga (CARDOSO et al., 2006; GAZE et al., 2014). A melhor estratégia, a longo prazo, para controlar a esquistossomose, seria a imunização por meio de uma vacina (CARDOSO et al., 2006). Novos antígenos de Schistosoma têm sido descobertos graças aos avanços na biologia molecular do parasito, genoma, transcriptoma e proteoma do tegumento. Os principais alvos candidatos a vacina são produtos do sistema excretor e secretor, bem como moléculas da superfície do verme. Esses são moléculas que interagem diretamente com o sistema imune do hospedeiro (RICCIARDI & NDAO, 2015). De acordo com a Organização Mundial de Saúde (BETHONY et al., 2011), um possível candidato a vacina deve oferecer uma proteção acima de 40%. De acordo com estudos de imunização com cercárias irradiadas em modelos animais, esta estratégia pode oferecer uma taxa de 60 a 70% de proteção (RICCIARDI & NDAO, 2015)..

(30) 30. Um antígeno recombinante de Glutationa-S-transferase (GST), clonado de S. haematobium, foi o primeiro antígeno de Schistosoma a participar de ensaios clínicos. A vacina contendo esse antígeno é chamada Bilhvax, formulada com o adjuvante hidróxido de alumínio. Em estudos pré-clínicos, a mesma inibiu significativamente a fecundidade da fêmea e a viabilidade dos ovos (CAPRON et al., 2001). Um recente ensaio clínico de Fase 1 em homens Caucasianos saudáveis usando esse antígeno mostrou níveis elevados de anticorpos GST-neutralizantes, bem como níveis significativos de citocinas IL-5 e IL-13 detectados 21 dias após a segunda dose da vacina GST. Embora anticorpos IgE sejam conhecidos como protetores na esquistossomose, nenhum anticorpo dessa classe anti-GST foi gerado nesses indivíduos (RIVEAU et al., 2012). O segundo antígeno aplicado em ensaios clínicos, também promissor como candidato a vacina, foi o Sm14, uma proteína ligadora de ácidos graxos. Em camundongos, a proteína recombinante gerou níveis de proteção de 67% contra o desafio com S. mansoni. Em humanos, houve uma indução de anticorpos IgG e de células TCD4+ produtoras de IFN-gamma e IL-2 quando esse antígeno recombinante formulado com glicopiranosil lipídio A em uma emulsão óleo em água (rSm14/GLASE) foi administrado em 20 homens saudáveis de uma área não endêmica para esquistossomose em três doses com intervalo de 30 dias (SANTINI-OLIVEIRA et al., 2016). Além dos antígenos citados, existem outros promissores como candidatos a vacina, entretanto, estão em testes pré-clínicos mas tem potencial para entrarem em ensaios clínicos em um futuro próximo (RICCIARDI & NDAO, 2015).. 1.6 IMUNOLOGIA DA ESQUISTOSSOMOSE 1.6.1 O PERFIL DE CITOCINAS NA ESQUISTOSSOMOSE O sistema imune de hospedeiros infectados responde aos vários estágios do ciclo de Schistosoma, inicialmente à penetração da cercária, migração dos esquistossômulos, vermes adultos e aos ovos aprisionados no tecido. Todos esses estágios possuem vários antígenos que estimulam uma forte resposta imune humoral e celular (COLLEY et al., 2014)..

(31) 31. Durante os estágios iniciais da infecção em camundongos, nas primeiras 4-6 semanas, há uma resposta imune predominante do tipo Th1, dirigida principalmente aos antígenos dos esquistossômulos e vermes adultos imaturos. Essa resposta é caracterizada pelo aumento de TNF-α e IFN-γ. O IFN-γ contribui para a formação do granuloma e a ausência de receptores para esta citocina em animais foi responsável pela formação de granulomas de tamanho reduzido, que avançam mais rapidamente para a fase crônica, sugerindo um término prematuro da fase inflamatória (REZENDE et al., 1997). Por volta da sexta semana de infecção, quando se inicia a oviposição, esse perfil sofre uma mudança para uma resposta imune predominantemente do tipo Th2, com secreção de IL-4, IL-5, IL-10 e IL-13. A partir da ovoposição tem início a formação do granuloma esquistossomótico que é principalmente causada pelos ovos do parasito que ficam aprisionados nos órgãos do hospedeiro, como intestino e fígado. Esses ovos secretam antígenos como o ômega 1 e IPSE/alfa 1 os quais são liberados em maior abundância, sendo que o primeiro direciona as células dendríticas para uma resposta Th2 e IPSE/alfa 1 induz a liberação de IL-4 e IL-13 dos basófilos (PEARCE et al., 2002; BURKE et al., 2009; SCHRAMM, et al., 2010). A resposta Th2 e o pico de formação do granuloma ocorre entre 8 e 10 semanas após a infecção. Essa resposta Th2 começa a diminuir com a progressão para a fibrose crônica (BURKE et al., 2009; WYNN et al., 2015). A depleção dessa resposta, particularmente da IL-4, causa dano tecidual e morte do hospedeiro devido a uma forte resposta Th1 pró-inflamatória. Dessa forma, a resposta Th2 desempenha um papel protetor para o hospedeiro, regulando a intensidade da reação inflamatória granulomatosa causada pelos ovos do parasito (COLLEY et al., 2014). A citocina IL-4 é responsável por determinar o tamanho do granuloma induzindo a proliferação de linfócitos produtores de citocinas Th2, essa citocina também é importante para a produção de IL-5 e IL-13 pelas células associadas ao granuloma, aumentando o efeito da IL-13 sobre a fibrogênese (BURKE et al., 2009). A citocina IL13, associada à IL-4, induz a expressão de arginase em macrófagos, a qual usa Larginina como substrato para fazer L-ornitina que é convertida em prolina, aminoácido essencial para a produção de colágeno e desenvolvimento da fibrose (PEARCE et al., 2002). Adicionalmente, estas citocinas de perfil Th2, como IL-4 e IL-5, podem ser associadas com a resistência uma vez que as mesmas controlam a produção de IgE.

(32) 32. e eosinófilos, respectivamente, os quais foram relacionados com resistência à reinfecção (KHALIFE et al., 2000). Embora inicialmente ocorra uma resposta Th1 na esquistossomose, existem razões para suspeitar que a resposta aos vermes do parasito durante a infecção prepatente seja mais complexa uma vez que há eosinofilia e o aumento da eosinopoiese durante as primeiras semanas de infecção, resposta mediada tipicamente por IL-5, uma citocina Th2 (FRAGA et al., 2010). Os eosinófilos são as células mais abundantes nos granulomas induzidos por S. mansoni (REIMAN et al., 2006), produzem também citocinas Th2 como a IL-13 (BURKE et al., 2009). Além da IL-5, a sobrevivência dos eosinófilos nos tecidos pode ser aumentada por IL-3, GMCSF, IL-33 e IFN-γ (STONE et al., 2010). Entre 7 e 8 semanas de infecção, células Treg FOXP3+ e IL-10 são detectáveis, além de começar a proliferar células B CD5+ FasL+ esplênicas (LUNDY & LUKCASS, 2013). Nesse aspecto regulatório, tem sido descrita a presença de células Treg naturais e induzíveis. As primeiras têm uma expansão significativa após 4 semanas de infecção. Na infecção por Schistosoma essas células têm várias funções como a supressão da ativação de células dendríticas, orquestração da resposta Th2 e regulação da mesma no desenvolvimento do granuloma e fibrose (WILSON et al., 2009). Esse papel regulatório das células Treg ocorre por mecanismos dependentes de IL-10 e/ou TGF-β sendo que a citocina IL-10 possui um papel regulatório, facilitando a mudança do perfil Th1 para Th2 (MBOW et al., 2013). Na esquistossomose murina, tem sido mostrado que a IL-10 suprime a ativação de macrófagos e células dendríticas prevenindo o desenvolvimento da patologia severa devido a uma resposta excessiva Th1 ou Th2 e evita uma potencial inflamação deletéria no tecido (BURKE et al., 2009; DEWALS, 2010). Camundongos tratados com anticorpos monoclonais anti-IL-10R e anti-TGF-β tiveram aumento de mortalidade e da citocina IL-17, o que reforça a hipótese de que o balanço das células Th17 e Tregs pode ser crítico para o resultado clínico da doença em humanos (MBOW et al., 2013). Na presença de TGF-β e IL-6, as células Th se diferenciam em Th17, sugerindo assim uma relação recíproca entre Treg e Th17, uma vez que a manipulação dessa via gera elevação dos níveis de células Treg ou Th17, podendo promover um aumento da inflamação no tecido (OZDEMIR, 2009). As células Th17 não parecem estar envolvidas na patogênese da esquistossomose em camundongos com moderada patologia e têm sido associadas.

(33) 33. ao desenvolvimento de uma patologia severa em camundongos CBA/J com resposta polarizada Th1 que desenvolvem uma forte resposta inflamatória com altos níveis de IFN-γ (BURKE et al., 2009). Além das células Treg, estudos em camundongos têm mostrado que células B produtoras de IL-10 podem regular negativamente a resposta imune por meio de mecanismos dependentes de anticorpos e da produção de citocinas regulatórias (BOUAZIZ et al., 2012). Tem sido mostrado que as células B tem um papel regulatório na infecção por S. mansoni, uma vez que camundongos infectados com o parasito e deficientes em células B apresentaram uma redução da sobrevivência durante a fase crônica da infecção (MANGAN et al., 2004; LUNDY & LUKCAS, 2013). Além disso, foi mostrado que há intenso recrutamento de células B1CD5 + na cavidade peritoneal durante as primeiras 5 semanas de infecção. Assim, os estudos com essas células regulatórias mostram que tanto células Breg quanto Treg com propriedades antiinflamatórias contribuem para controlar ambas as respostas imunes, inata e adaptativa, principalmente em infecções crônicas (MAJLESSI et al.,2008).. 1.6.2 RESPOSTA HUMORAL NA ESQUISTOSSOMOSE O processo envolvido na resposta imune contra Schistosoma é complexo devido à variação antigênica durante o ciclo de vida e aos mecanismos pelos quais o parasito evade do sistema imune do hospedeiro (ZHANG et al., 2006). Na infecção por S. mansoni, a expressão de proteínas em todo o ciclo de vida do parasito e sua localização em tecidos específicos pode ser muito importante para determinar os níveis de exposição de uma proteína ao sistema imune e a resposta de anticorpos correspondentes (FARNELL et al., 2015). Durante a infecção natural por S. mansoni, após a ovoposição, a resposta imune muda de um perfil Th1 para Th2 ocorrendo um aumento nos níveis de IgE e do número de eosinófilos circulantes refletindo a produção de IL-4 e IL-5 que marcam a mudança para o perfil Th2 (ZHANG et al., 2006). Vários estudos em modelos experimentais sobre os mecanismos efetores dirigidos contra S. mansoni demonstraram que os anticorpos são citotóxicos para os esquistossômulos na presença de células efetoras, como eosinófilos, macrófagos e plaquetas. Na esquistossomose humana, IgG1, IgG3 e IgE têm sido apontados como.

(34) 34. os anticorpos diretamente envolvidos nos mecanismos efetores (KHALIFE et al., 2000). Em relação à IgE, há uma correlação positiva entre resistência à reinfecção e a resposta específica dessa imunoglobulina observada em vários estudos epidemiológicos. Os anticorpos dessa classe podem se ligar diretamente nos eosinófilos pela ligação aos receptores FcεRI que pode mediar a citotoxicidade dependente de eosinófilos específica contra esquistossômulos pela liberação da peroxidade eosinofílica (FIGURA 4) (ZHANG et al., 2006). Além do receptor FcεRI para IgE, os eosinófilos têm receptores para IgG (FcγRII/CD32) e IgA (FcαRI/CD89), dentre outros (STONE et al., 2010). Além dos eosinófilos, mastócitos e basófilos também possuem receptores FcεRI para IgE que ao se ligar de forma cruzada ao antígeno e ao receptor desencadeia a liberação de mediadores inflamatórios como histamina por mastócitos e citocinas IL-4 e IL-13 por basófilos (KNOL et al., 2006; STONE et al., 2010).. Figura 4. Opsonização do helminto por IgE e eosinófilos. Adaptado de Zhang e Mutapi, 2006)..

(35) 35. Em relação ao anticorpo IgG4, o mesmo tem sido associado ao aumento da susceptibilidade à reinfecção, uma vez que essa imunoglobulina inibe a citotoxicidade dependente de IgG1 e IgG3 e promove uma competição por antígenos com anticorpos IgE (KHALIFE et al., 2000). Em camundongos, complexos imunes de IgG podem mediar a liberação de mediadores pelos mastócitos via receptor FcγRIII assim como por meio do receptor Fc€RI (receptor de alta afinidade para IgE) em camundongos deficientes em IgE. Assim, quando anticorpos IgG específicos para o alergeno são administrados ou induzidos em modelo murino, poderá resultar em um resultado falso positivo. Quando alergenos são pré-incubados com IgG e IgE específicos, IgG também pode se ligar a esses antígenos e diminuir a subsequente ativação de mastócitos/basófilos com os alergenos pré-incubados (KNOL, 2006). Dessa forma, o lento desenvolvimento de imunidade adquirida pode ser devido ao bloqueio de receptores de IgE pelo excesso de anticorpos IgG4 anti-Schistosoma e possivelmente a outras imunoglobulinas nos primeiros anos da infecção (COLLEY et al., 2014). A concentração de IgE no plasma é a mais baixa de todas as imunoglobulinas, tem meia vida de ~2 dias, sendo sua expressão altamente controlada na ausência de doença. Ao longo da infância, na ausência de doença, os níveis dessa imunoglobulina aumentam e têm um pico aos 10-15 anos de idade e, posteriormente, diminuem durante a vida adulta, sendo seus níveis influenciados pela genética, raça, status imune e fatores ambientais (STONE et al., 2010). Além da idade, na esquistossomose, o perfil de anticorpos também é influenciado pela área, sexo e intensidade da infecção. Em relação aos anticorpos IgE, a maioria dos estudos que associam essa imunoglobulina à imunidade contra o parasito são epidemiológicos (FITZSIMONS, FALCONE & DUNNE, 2014). No estudo de Mutapi e colaboradores (1997), pessoas de área endêmicas com elevada taxa de infecção produziram mais IgE anti-SEA (antígenos solúveis de ovos) e a reatividade dos anticorpos IgE contra os antígenos de vermes adultos aumentou com a idade em ambas regiões, de alta e baixa intensidade de infecção. A regulação de IgE também depende da extensão e duração da exposição do indíviduo a determinadas proteínas allergen-like do parasito (PINOT DE MOIRA, 2013). Em S. mansoni existem algumas proteínas descritas que induzem anticorpos IgE como a IPSE/alpha 1 (SCHRAMM et al., 2007), proteína secretada pelos ovos do.

(36) 36. parasito e uma proteína de 22, 6 kDa (DUNNE et al.,1997) presente no tegumento dos vermes adultos. Além destas, existem outras do parasito que são apresentadas como proteínas allergen-like, ou seja, proteínas do helminto que contem estruturas similares aos principais alergenos ambientais conhecidos (FARNELL et al., 2015). A resposta de IgE para a proteína SmTAL2 (allergen-like) do tegumento de S. mansoni, expressa em todo o ciclo de vida do parasito, foi mais baixa nos pacientes residentes mais antigos de uma área endêmica do Quênia e significativamente maior em imigrantes recentes da mesma área (PINOT DE MOIRA, 2013). Helmintos e alergia induzem uma forte resposta Th2 com switching para a produção de IgE e acredita-se que esse perfil de resposta, juntamente com IgE, tenha evoluído para controlar parasitos extracelulares. Há um aumento nas evidências de que a forte resposta Th2 de indivíduos atópicos é suprimida por certas infecções helmínticas (FITZSIMMONS et al., 2009). Nesse sentido, tem sido discutida. a. “hipótese da higiene”, um conceito sugestivo de que a exposição a produtos microbianos nas fases iniciais da vida induz uma modulação imunológica de forma a diminuir processos inflamatórios no hospedeiro (SANTIAGO & NUTMAN, 2016). Dessa forma, essa hipótese propõe que a incidência de doenças alérgicas e autoimunes em países industrializados é consequência da melhoria nas condições sanitárias (KEARNEY et al., 2014). Algumas hipóteses são propostas para explicar a supressão da resposta Th2 de indíviduos atópicos infectados por helmintos: a produção de citocinas regulatórias como a IL-10 e TGF-β por helmintos como Schistosoma, a competição por IgE policlonal induzida pelo helminto e IgE específica para aeroalergenos pelos receptores presentes na superfície de mastócitos, inibição da síntese de IgE específica para aeroalergenos pelos altos níveis de IgE policlonal e altas concentrações de IgG4 (anticorpo bloqueador) que pode competir com IgE pela ligação ao alergeno (FIGUEIREDO, 2004; FLOHR et al., 2009;SANTIAGO & NUTMAN, 2016). Uma. minoria. de. antígenos. tem. propriedades. alergênicas,. algumas. propriedades funcionais dão às proteínas ambientais e alergenos alimentares maior possibilidade de sensibilizar indivíduos susceptíveis. Uma característica comum de um pequeno número de alergenos é a atividade proteolítica, a qual permite que possam ultrapassar barreiras mucosas. Muitos helmintos dependem da produção de proteases durante a migração nos tecidos e tem-se argumentado que essas proteases.

(37) 37. possam ter uma alergenicidade intrínseca, entretanto, nem sempre essas propriedades biológicas estão presentes nos alergenos (FITZSIMMONS et al., 2014).. 1.6.3 ANTICORPOS NATURAIS ? Anticorpos naturais são produzidos sem a necessidade de estímulo antigênico externo (LUTZ, 2008). Os títulos de anticorpos naturais IgM já aumentam no útero e são bem constantes durante toda a vida humana, o mesmo é válido para os IgG’s em crianças saudáveis (até 18 anos). Assim, os humanos, ao nascimento, já têm níveis substanciais de anticorpos IgM, ou seja, anticorpos naturais que estão preparados para contribuir com as defesas neonatas do hospedeiro contra ameaças do ambiente externo, diferente dos anticorpos IgG e IgA que vem do sistema imunológico materno (SILVERMAN, 2015). Diferente de IgM, os anticorpos naturais IgG’s tem os títulos aumentados a vários autoantígenos e em particular a proteínas do citoesqueleto, aumentando 2 a 3 vezes após injúria severa com trauma e permanecem altos por vários anos (LUTZ, 2007). Há uma concordância de que os anticorpos naturais em humanos e camundongos saudáveis são codificados por genes que não foram submetidos a uma mutação somática extensiva e maturação de afinidade, como é o caso das respostas de anticorpos dependentes de células T induzidas por antígenos em imunizações convencionais. E essa falta de maturação de afinidade poderia explicar o fato dos anticorpos naturais serem multireativos (COUTINHO, KAZATCHKINE & AVRAMEAS, 1995). Muitos anticorpos naturais IgM e IgG são contra constituintes intracelulares que atuam na homeostase (LUTZ, 2009). A homeostase dos tecidos em vertebrados requer a habilidade em limpar proteínas liberadas de células lisadas, eliminar proteínas plasmáticas não-funcionais e reconhecer e eliminar células senescentes e apoptóticas (LUTZ, 2007). Esses anticorpos são de baixo título, baixa afinidade para autoantígenos conservados ou antígenos não-próprios (JELEZAROVA et al., 2005). O desenvolvimento de imunoglobulinas com papéis homeostáticos teciduais requer mais a diferenciação entre o que é próprio exposto e oculto alterado do que o que é próprio e não próprio. Desse modo, as estratégias do sistema imunológico para tal, não foi “eliminar clones reativos próprios” e “ligação de alta afinidade” mas criar.

(38) 38. um sistema refinado e simples aproveitando a acessibilidade e a avidez. O reconhecimento de proteínas liberadas a partir de células lisadas ou que estão morrendo é análogo à “limpeza” do que é não-próprio, porque esses autoantígenos tornam-se acessíveis somente após a lise celular e não são normalmente expostos a anticorpos circulantes (LUTZ, 2007). Nesse sentido, de remoção dos resíduos, esses anticorpos naturais podem prevenir uma resposta imune adaptativa e doenças autoimunes (LUTZ et al., 2009). Tanto humanos quanto camundongos podem aumentar a produção de anticorpos naturais IgG. Essa regulação positiva de anticorpos naturais IgG está de acordo com seu papel em mediar a fagocitose via receptor do complemento e FcγR dos resíduos celulares (LUTZ, 2007). Uma característica marcante dos anticorpos naturais em camundongos é que essas imunoglobulinas podem ser encontradas nos animais germ- e antígeno-free (animais germ-free que recebem uma dieta ultrafiltrada) o que é sugerido pelo menos em parte, sua produção por autoantígenos (KEARNEY et al., 2015). Muitas das famílias de alergenos descritas, também estão presentes em humanos mas podem não ser alvo de uma resposta de IgE. Por meio de análises in silico de proteínas alimentares e suas respostas de IgE, foi proposto que proteínas com alta identidade na sequência com as homólogas de humanos (acima de 62%) foram raramente alergênicas. Por isso, acredita-se que a imunologia relacionada a IgE evoluiu para direcionar a resposta Th2 a grandes parasitos multicelulares que são mais estreitamente relacionados a nós do que patógenos bacterianos, fúngicos ou virais (FITZSIMMONS et al., 2014). Anticorpos para antígenos conservados em bactérias que comumente causam infecções em humanos tem o potencial de reagir com outros organismos, incluindo fungos e insetos associados com a alergia (KEARNEY et al., 2015). Historicamente, na primeira descrição de autorreatividade humana não foi possível identificar a natureza molecular da proteína endógena que gerava autoanticorpos IgE até o progresso nos métodos de biologia molecular. As reações contra antígenos próprios que compartilham homologia estrutural com alergenos ambientais podem ser explicadas pelo mimetismo molecular entre epítopos comuns para células B. Estruturas 3D de diversos alergenos tem sido elucidadas e no que diz respeito à reatividade cruzada a antígenos próprios, as estruturas mais interessantes.

(39) 39. são as que permitem a comparação de pares entre o ambiente e proteínas humanas correspondentes (ZELLER et al., 2008). A presença de autoanticorpos IgE tem sido descrita em algumas doenças autoimunes como no caso do Lúpus eritematoso sistêmico, onde esses autoanticorpos para antígenos nucleares como anti-dsDNA é mais comum em indivíduos com a doença ativa (DEMA et al., 2014). Embora a reatividade de autoantígenos mediada por anticorpos IgE tenha sido demonstrada in vitro e in vivo ainda não está claro “se” e “como” o reconhecimento imunológico de autoantígenos IgE-reativos podem contribuir para a patogênese da inflamação alérgica. Entretanto, tem aumentado as evidências derivadas de trabalhos estruturais comparando pares de homólogos ambientais e antígenos próprios e de trabalhos celulares indicando que a autoreatividade a antígenos próprios é devido ao mimetismo molecular entre epítopos de células B comuns no processo de sensibilização (ZELLER et al., 2008).. 1.7 A FAMÍLIA DAS NTPDases Enzimas localizadas na superfície celular que hidrolisam nucleotídeos extracelulares foram descritas antes da sinalização intercelular via nucleotídeos extracelulares, descoberta como principal meio de comunicação entre as células. Essas enzimas (FIGURA 5) são divididas em 4 grupos que incluem as Ectonucleosideo trifosfato difosfohidrolases (E-NTPDases), ecto-5-nucleotidases (eN), Ecto-nucleotideo pirofosfatase/fosfodiesterases (E-NPPs) e Fosfatases alcalinas (APs) (ZIMMERMANN et al., 2012)..

(40) 40. Figura 5. Topografia da membrana mostrando as quatro famílias de enzimas. As setas evidenciam os locais onde podem ser clivadas.Fonte: Extraído de Zimmerman et al., 2012.. As NTPDases são nucleotídeo-específicas e hidrolisam nucleosídeo di- e trifosfatados em nucleosídeo monofosfatados como produto final da hidrólise e sua atividade catalítica é dependente de íons divalentes como cálcio e magnésio (ZIMMERMANN et al., 2012). Todos os membros dessa família de proteínas apresentam em sua estrutura cinco regiões comuns, chamadas regiões conservadas de apirase (ACRs), as quais conferem a este grupo de enzimas uma identidade e estão envolvidas na atividade catalítica da enzima (HANDA & GUIDOTTI, 1996; VASCONCELOS et al. 1996). Além disso, essas enzimas diferem de outras fosfohidrolases por serem insensíveis a inibidores conhecidos de várias ATPases (Tipo P, F e V), fosfatases e adenilato quinases (HANDA & GUIDOTTI, 1996). Em relação à nomenclatura, essa família de proteínas não possui uma uniformemente aceita para todos os membros que a compõem, os quais são classificados pela ordem de descoberta e pelas propriedades catalíticas (ROBSON, 2006; VASCONCELOS et al., 2009). Os membros dessa família são nomeados como ATP difosfohidrolase ou NTPase em parasitos, NTPDases em mamíferos e apirases em plantas (VASCONCELOS et al., 2009). A primeira descrição da família ATP difosfohidrolase foi feita há mais de 20 anos baseada em estudos da apirase de batata (Solanum tuberosum) (HANDA &.

(41) 41. GUIDOTTI, 1996; VASCONCELOS, 1996). Em plantas, a apirase pode ser uma proteína citosólica, ligada à membrana ou ao núcleo. Devido à localização, essa proteína pode ter participação em vários processos, como resposta ao estímulo tático, germinação do pólen e biossíntese de amido (KETTLUN et al., 2005). O primeiro membro de NTPDase a ser clonado e sequenciado em mamíferos foi o antígeno de ativação celular de linfócitos, o CD39. Nesses organismos, existem oito isoformas descritas (FIGURA 6); quatro são enzimas tipicamente localizadas na superfície celular com um sítio catalítico para o meio extracelular (NTPDases 1, 2, 3 e 8); as isoformas 4 e 7 estão localizadas inteiramente no meio intracelular para o lúmen de organelas citoplasmáticas e as NTPDases 5 e 6 exibem localização intracelular e são secretadas (ROBSON et al., 2006; SANSOM et al., 2008).. Figura 6. Representação das NTPDases de mamíferos. Fonte: Adaptado de Sansom et al., 2008.. O CD39 é expresso em várias células como NK, monócitos, células dendríticas, em células B e subgrupos de células T ativadas como as células Treg (DWYER et al., 2007; KANTHI et al., 2014). Além do papel anti-inflamatório, CD39 tem sido associado à desagregação plaquetária por hidrolisar o ADP extracelular e regular o tamanho do trombo. Neutrófilos estimulados mobilizam CD39 na membrana celular e o ATP também é liberado em sua superfície sendo hidrolisado a AMP que é convertido a adenosina por outra ectoenzima CD73. A adenosina estimula os receptores purinérgicos promovendo a migração celular desempenhando diferentes funções em vários tecidos, como um efeito anti-inflamatório em células Treg. Além de células do hospedeiro, vários patógenos possuem enzimas-like CD39 que promovem o estabelecimento e propagação da infecção. Dessa forma, vários mecanismos.

(42) 42. regulatórios são usados para manter a homeostase imune, evitar a autoimunidade e moderar a inflamação induzida por patógenos e injúrias ambientais. Nesse sentido, as células Treg tem um papel central pois a via CD39/CD73 modula a atividade de Treg (FIGURA 7) (DWYER et al., 2007;ANTONIOLI et al., 2013).. Figura 7. Modulação da atividade de Treg pela via CD39/CD73. A ativação do TCR na célula Treg induz a atividade de CD39 que metaboliza o ATP sendo crucial para a atividade imunossupressora de Treg por que facilita a geração de adenosina, um componente essencial na atividade imunossupressora e anti-inflamatória nessas células T regulatórias. Extraído de ANTONIOLI et al., 2013.. Em relação às ATP difosfohidrolases, as mesmas já foram caracterizadas em diversos parasitos, como T. gondii (BERMUDES, 1994), T. cruzi (FIETTO, 2004), L. amazonensis (COIMBRA, 2002) e L. braziliensis (REZENDE-SOARES, 2010). Em Schistosoma mansoni, existem duas isoformas dessas proteínas descritas, a SmATPDase 1 e a SmATPDase 2 com massa molecular de aproximadamente 63 kDa, identificadas no tegumento do verme adulto (VASCONCELOS et al., 1993; VASCONCELOS et al., 1996) e em ovos do parasito (FARIA-PINTO et al., 2004)..