UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS - UNICAMP FACULDADE ENGENHARIA QUÍMICA
ANA FLÁVIA PATTARO
Síntese, Caracterização e Processamento de Polímeros Biorreabsorvíveis
para uso na Engenharia de Tecidos (Tissue Engineering)
Campinas – SP 2016
Síntese, Caracterização e Processamento de Polímeros Biorreabsorvíveis
para uso na Engenharia de Tecidos (Tissue Engineering)
Tese apresentada à Faculdade de Engenharia Química como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Doutora em Engenharia Química.
Orientador: PROF. DR. RUBENS MACIEL FILHO
Co-Orientadora: DRA. MARIA INGRID ROCHA BARBOSA SCHIAVON
Este exemplar corresponde à versão final da tese defendida pela aluna Ana Flávia Pattaro e orientada pelo Prof. Dr. Rubens Maciel Filho.
Campinas – SP 2016
A Ata de Defesa com as respectivas assinaturas dos membros encontra-se no processo de vida acadêmica do aluno.
Dedico este trabalho aos meus pais Arlete e Augustinho.
Ao finalizar este projeto de doutorado o sentimento que inunda meu coração é de gratidão, pois este momento não se tornaria realidade sem a ajuda e incentivo de pessoas tão importantes em minha vida.
Primeiramente agradeço a Deus por me sustentar e capacitar em toda essa jornada. A vontade de Deus é boa, perfeita e agradável!
Aos meus pais, Arlete e Augustinho, que me incentivaram, ajudaram, ouviram e vivenciaram cada etapa deste projeto. Pai, você é o meu exemplo de como ser um profissional digno, honrado e eficiente. Mãe, você é a minha companheira, amiga e incentivadora. Amo muito vocês!
Sou grata ao meu orientador Prof. Dr. Rubens Maciel Filho que me acolheu desde meu mestrado, acreditou em minha capacidade para finalizar este doutorado e por todos seus ensinamentos.
Ingrid, minha co-orientadora, amiga, irmã, muito obrigada! Muitas coisas aconteceram nesse período e você chorou comigo, me cobrou na hora certa e sempre acreditou que seria possível finalizar esse projeto. Obrigada por ter sido minha companheira nos momentos bons e ruins.
Agradeço aos meus queridos amigos da salinha: Marcele, Anderson, Mariana, Aulus, Paulinha, mesmo distante vocês sempre estão disponíveis a me ajudar, seja com o que for e a hora que for! Vocês são muito especiais e sinto muita saudade das nossas conversas e “viagens” científicas, que além de serem enriquecedoras eram muito engraçadas. Marcele, Anderson e Mari, nunca me esquecerei do apoio que recebi de vocês!
André Jardini, Sr. Milton, Ana Amélia Rodrigues (LABIMO –FCM) e Ana Carolina Benatti, muito obrigada! Sem a ajuda de vocês não teria sido possível eletrofiar os polímeros e obter as análises biológicas.
Ao LOPCA – Laboratório de Otimização, Projeto e Controle Avançado e ao Biofabris – Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia em Biofabricação.
Agradeço de forma muito especial à BunTech – Tecnologia em Insumos, em especial ao meu gerente Dr. Fernando Santos e ao meu diretor Alexandre Lazari. Muito
terminaria este projeto sem este apoio e incentivo!
Aos meus colegas de trabalho do CPT- SP – BunTech, muito obrigada!
Ao Programa de Pós- Graduação e ao Departamento de Processos e Produtos da Faculdade de Engenharia Química da Unicamp, professores e funcionários.
À FAPESP – Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo, pelo apoio financeiro.
Minha gratidão a todos vocês que tornaram este sonho em realidade!
A busca por materiais que possam substituir funções totais ou parciais de um órgão ou tecido têm adquirido atenção e empenho do mundo científico nos últimos anos. A obtenção de biomateriais que possuam as características necessárias para as aplicações médicas e que não apresentem toxicidade é fundamental para o sucesso da Engenharia de Tecidos. Desta forma, este projeto foi elaborado buscando a síntese, caracterização e processamento de biomateriais para serem utilizados em Engenharia de Tecidos. O estudo envolve o processo de polimerização de Poli (L-Lactídeo) (PLLA) e do Poli (Glicolídeo) (PGA), assim como seus copolímeros PLGA. Também foram obtidas argilas bentoníticas organofilizadas para a produção de nanocompósitos de PLLA utilizando o processo de polimerização in situ. A cinética de polimerização por abertura de anel do PLLA foi estudada utilizando a técnica de DSC. Foram realizadas comparações da Energia de Ativação (Ea) utilizando três métodos isoconversionais: Ozawa – Flynn- Wall (OFW), Kissinger –Akahira-Sunose (KAS) e Vyazovkin. Os polímeros de PLLA e PGA produzidos com diferentes quantidades de catalisador, iniciador e tempo reacional foram caracterizados através das técnicas de FTIR, TGA, DSC, GPC e DRX. Os copolímeros PLGA, também foram caracterizados através de FTIR, TGA e DSC. O processo de organofilização realizado para as argilas bentoníticas ocorreu de forma satisfatória e foram utilizadas para a obtenção dos nanocompósitos. Um novo processo foi desenvolvido para a obtenção de nanocompósito de PLLA, que consistiu na polimerização por abertura de anel sem a inertização do meio reacional e a adição da argila ocorreu de forma lenta após a completa fusão do monômero. O resultado obtido deste novo processo foi a obtenção de um nanocompósito de PLLA com indícios de que foi totalmente esfoliado, além de apresentar as características de FTIR, TGA e DSC que confirmam que o polímero formado é o PLLA. O processamento do PLLA e do nanocompósito de PLLA foi realizado através da técnica de Eletrofiação. Foram realizadas análises morfológicas e biológicas das nanofibras obtidas de PLLA e de seu nanocompósito e os ensaios biológicos realizados indicam que os materiais não apresentam toxicidade para o meio de cultura estudado.
ABSTRACT
The search for materials that can replace total or partial functions of an organ or tissue have gained attention and commitment of the scientific world in recent years. Obtaining biomaterials with the necessary characteristics for medical applications and which show no toxicity is critical to the success of Tissue Engineering. Thus, this project has been prepared seeking the synthesis, characterization and processing of biomaterials for use in Tissue Engineering. The study involves the process of in situ polymerization of Poly (L-Lactide) (PLLA) and Poly (Glycolide) (PGA) and their copolymers PLGA. It was also obtained organoclay for the production of nanocomposites PLLA using the process of in situ polymerization. The kinetics of ring opening polymerization of PLLA was performed by using DSC technique. Comparisons of Activation Energy (Ea) were made by using three
isoconversinal methods: Ozawa – Flynn – Wall (OFW), Kissinger – Akahira – Sunose (KAS) and Vyazovkin. The PLLA and PGA polymers produced different amounts of catalyst, initiator and time reaction were characterized by FTIR, TGA, DSC, GPC and XRD techniques. The PLGA copolymers have also been characterized by FTIR, DSC and TGA. The organophilization process performed for bentonite clay occurred in a satisfactory manner and was used to obtain the nanocomposite. A new process has been developed for obtaining nanocomposite PLLA, which was the ring opening polymerization without blanketing the reaction medium and the addition of clay was slowly after complete melting of the monomer. The result of this new process produced a nanocomposite of PLLA with evidences that was completely exfoliated. The processing of the nanocomposite PLLA and pure PLLA was performed using the electrospinning techinique. Morphological and biological analyzes of the resulting nanofibers were made and the tests performed indicate that the pure and nanocomposite PLLA materials does not present toxicity to the medium of studied culture.
Figura 2.1: Esquema do processo de atuação da Engenharia de Tecidos...32
Figura 2.2: Imagens de scaffolds usados em Engenharia de Tecidos...36
Figura 2.3: Algumas aplicações de variados polímeros utilizados em Engenharia de Tecidos ...39
Figura 2.4: Dimensões moleculares do Poli (ácido glicólico) ...41
Figura 2.5: Estereoisômeros do ácido láctico e do lactídeo ...42
Figura 2.6: Esquema geral da polimerização do ácido glicólico por abertura de anel ...45
Figura 2.7: Mecanismo geral do crescimento de cadeia do PLA por abertura de anel ...45
Figura 2.8: Esquema geral das rotas de polimerização para o caso do PLA ...46
Figura 2.9: Estrutura do copolímero PLGA ...47
Figura 2.10.: Ilustração da intercalação das camadas de silicato na matriz polimérica por solução...49
Figura 2.11: Nanocompósito de PA-6 obtido utilizando o processo de polimerização in situ...50
Figura 2.12: Esquema ilustrativo do mecanismo de intercalação da argila organofílica na matriz polimérica no estado fundido...50
Figura 2.13: Representação dos três tipos de nanocompósitos que podem ser obtidos dependendo da interação entre a matriz polimérica e a nanocarga: (a) microcompósito de fases separadas, (b) nanocompósito intercalado e (c) nanocompósito esfoliado...52
Figura 2.14: Representação esquemática da estrutura dos Filossilicatos 2:1...53
avaliadas (5 0C/min, 10 0C/min e 20 0C/min)...62
Figura 3.2. Curvas de conversão em função da temperatura referente à reação de polimerização do L-Lactídeo considerando as três taxas de aquecimento (5 0C/min, 10 0C/min e 20 0C/min) obtidas pelo software STARE SW 11.00®...65
Figura 3.3. Obtenção da equação da reta para a faixa de conversão de (a) 0,2; (b) 0,3; (c) 0,4; (d) 0,5; (e) 0,6 e (f) 0,7 utilizando o método isoconversional de Ozawa-Flynn-Wall (OFW)...67
Figura 3.4. Obtenção da equação da reta para a faixa de conversão de (a) 0,2; (b) 0,3; (c) 0,4; (d) 0,5; (e) 0,6 e (f) 0,7 utilizando o método isoconversional de Kissinger-Akahira-Sunose (KAS)...70
Figura 3.5. Comparação dos valores encontrados para a Energia de Ativação utilizando os três métodos isoconversionais em função da taxa de conversão...75
Figura 4.1. Reator utilizado para as sínteses de PLLA e PGA...78
Figura 4.2. Estruturas de ressonância do complexo lactona/Sn+(Oct)...82
Figura 4.3. Mecanismo de reação da polimerização de lactonas pelo Sn(Oct)2 ...83
Figura 4.4. Mecanismo de reação da polimerização do lactídeo com Sn(Oct)2 proposto por Bendix ...84
Figura 4.5. Mecanismo de reação da polimerização do lactídeo com Sn(Oct)2 na presença de metanol...85
Figura 4.6. Representação das reações laterais de transesterificação intramolecular e intermolecular...86
Figura 4.7. Mecanismo reacional para a síntese do PGA...87
Figura 4.10. Espectro de FTIR do Glicolídeo utilizado na obtenção dos nove polímeros...89
Figura 4.11. Espectro de FTIR dos nove polímeros obtidos PGA conforme os parâmetros apresentados na Tabela 4.2. ...90
Figura 4.12. Análise termogravimétrica do monômero L-Lactídeo: (a) TG e (b) DTG...91
Figura 4.13. Análise termogravimétrica dos nove polímeros PLLA sintetizados: (a) TG e (b) DTG...91
Figura 4.14. Principais reações envolvidas degradação térmica do PLLA...92
Figura 4.15. Análise termogravimétrica do monômero Glicolídeo: (a) TG e (b) DTG...94
Figura 4.16. Análise termogravimétrica dos nove polímeros PGA produzidos: (a) TG e (b) DTG...94
Figura 4.17 Curvas de DSC obtidas para os nove polímeros PLLA sintetizados (segundo aquecimento)...96
Figura 4.18 Curvas de DSC obtidas para os nove polímeros PGA sintetizados (segundo aquecimento)...99
Figura 4.19 Difratograma de raios-x do monômero L-Lactídeo...101
Figura 4.20. Difratograma de raios-x do PLLA 9...101
Figura 4.21. Difratograma de raios-x do Glicolídeo...102
Figura 4.22. Difratograma de raios-x do PGA 9...103
Figura 4.23. Difratograma de raios-x do polímero retirado da literatura onde: (a) referente ao polímero amorfo e (b) referente ao polímero semicristalino...103
Figura 5.3. Análise termogravimétrica dos três copolímeros e dos polímeros puros PLLA 8
e PGA 8: (a) TG e (b) DTG...111
Figura 5.4. Curvas de DSC referente ao segundo aquecimento realizadas para os copolímeros sintetizados e para os polímeros puros PLLA 8 e PGA8...113
Figura 6.1. (a) Estrutura molecular do Ácido 12-aminododecanóico e (b) Estrutura molecular do Octadecilamina...118
Figura 6.2. DRX da Argila Bentonítica Argel CN 40 sódica natural...124
Figura 6.3. DRX da Argila Bentonítica Argel CN - 40 sódica e organicamente modificada...126
Figura 6.4. Argila Bentonítica Argel CN-40 (a) Curva TGA; (b) Curva da Derivada TGA...128
Figura 6.5. Argila Bentonítica Argel CN-40 organofilizada (a) TG; (b) DTG...128
Figura 6.6. Espectro de FTIR da argila bentonítica Argel CN-40 sódica natural...130
Figura 6.7. Espectros de FTIR das argilas bentoníticas organofilizadas...130
Figura 6.8. Espectros de FTIR para os nanocompósitos de PLLA/Argila sintetizados utilizando o processo de polimerização in situ com inertização do meio reacional...131
Figura 6.9. Espectro de FTIR para o nanocompósito de PLLA/Argila sintetizado utilizando o processo de polimerização in situ sem inertização do meio reacional...132
Figura 6.10. Espectros de FTIR para os nanocompósitos de PGA/Argila sintetizados utilizando o processo de polimerização in situ com inertização do meio reacional...132
Figura 6.11. Análise termogravimétrica dos três polímeros PLLA com inertização do meio reacional e adição de argila: (a) TG e (b) DTG...134
Figura 6.13. Análise termogravimétrica dos três polímeros PGA com inertização do meio reacional e adição de argilas: (a) TG e (b) DTG...136
Figura 6.14. Curvas de DSC referente ao segundo aquecimento realizadas para os
polímeros sintetizados: (a) NanoPLLA 1 com inertização meio reacional; (b)Nano PLLA 2 com inertização meio reacional; (c) NanoPLLA 3 com inertização meio reacional e (d) NanoPLLA 4 sem inertização meio reacional...139
Figura 6.15. Curvas de DSC referente ao segundo aquecimento realizadas para os
polímeros sintetizados: (a) NanoPGA 1 com inertização do meio reacional; (b) NanoPGA 2 com inertização do meio reacional e (c) NanoPGA 3 com inertização do meio reacional.141
Figura 6.16. Difratograma de raios-x do NanoPLLA 4 utilizando o processo de polimerização sem inertização e comparação com o obtido para a Argel CN-40
organofilizada com o Ácido 12-aminododecanóico...143
Figura 7.1. Sistema de eletrofiação utilizado para a obtenção de nanofibras...146
Figura 7.2. Feixe obtido durante a formação de nanofibras...146
Figura 7.3 Imagens obtidas por MEV das nanofibras do PLLA 8: (a) aproximação de 5000X; (b) aproximação de 10000X e (c) aproximação de 20000X ...151
Figura 7.4 Imagens obtidas por MEV para as nanofibras obtidas da manta de PLLA 8 recoberta com o NanoPLLA 4: (a) aproximação de 5000X; (b) aproximação de 10000X e (c) aproximação de 20000X ...152
Figura 7.5 Método colorimétrico para cultura de células fibroblasticas com PLLA 8,
controle negativo de toxicidade (CNT) e controle positivo de toxicidade (CPT)...153
Figura 7.6 Método de Eluição para a cultura de células fibroblasticas com PLLA 8, controle negativo de toxicidade (CNT) e controle positivo de toxicidade (CPT) para os tempos de 24 h, 48 he 72 h...154
controle negativo de toxicidade (CNT) e (g) (h) e (i) referente as nanofibras de PLLA 8 após 24 h, 48 h e 72 h de incubação...155
Figura 7.8 Método de Contato Direto para a cultura de células fibroblasticas com
nanofibras de PLLA 8: (a) e (b) são referentes ao controle corados com Azul de Toluidina e Xilidina Ponceu, respectivamente e, (c) e (d) são referente as células em contato com as nanofibras de PLLA 8 coradas com Azul de Toluidina e Xilidina Ponceu,
respectivamente...156
Figura 7.9 Teste de Difusão de Ágar para a cultura de células fibroblasticas com nanofibras de PLLA 8: (a) CPT (Látex), (b) CNT (Teflon) e (c) Células expostas as nanofibras de PLLA 8...157
Figura 7.10 Método Colorimétrico para cultura de células fibroblasticas com a manta de PLLA 8 recoberta de nanofibras de NanoPLLA 4, controle negativo de toxicidade (CNT) e controle positivo de toxicidade (CPT)...158
Tabela 2.1.Exemplos de polímeros sintéticos e naturais utilizados em Engenharia de
Tecidos...38
Tabela 2.2. Parâmetros da eletrofiação e os efeitos na morfologia das nanofibras ...59
Tabela 3.1.Valores de Temperatura referentes às conversões de 0,2 a 0,7 para cada taxa de aquecimento estudada...66
Tabela 3.2. Valores obtidos do coeficiente angular das retas, R2 e Energia de Ativação (Ea) referente às conversões de 0,2 a 0,7 utilizando o método isoconversional OFW...68
Tabela 3.3. Valores obtidos do coeficiente angular das retas, R2 e Energia de Ativação (Ea) referente às conversões de 0,2 a 0,7 utilizando o método isoconversional KAS...71
Tabela 3.4. Valores obtidos para a Energia de Ativação (Ea) referente às conversões de 0,2 a 0,7 utilizando o método isoconversional de Vyazovkin...74
Tabela 4.1. Parâmetros utilizados (quantidade de catalisador, iniciador e tempo) para as sínteses de PLLA...79
Tabela 4.2. Parâmetros utilizados (quantidade de catalisador, iniciador e tempo) para as sínteses de PGA...79
Tabela 4.3. Temperaturas obtidas de degradação térmica para o monômero L-Lactídeo e para os nove polímeros sintetizados...92
Tabela 4.4. Temperaturas obtidas da degradação térmica para o Glicolídeo e para os
polímeros PGA sintetizados...95
Tabela 4.5. Temperatura de transição vítrea (Tg), Temperatura de fusão (Tm), Temperatura
de cristalização a frio (Tcc), Temperatura de cristalização (Tc)e as respectivas entalpias do
Tabela 4.7. Valores obtidos de Mn, Mw e IP para os três polímeros PLLA analisados através de GPC...105
Tabela 5.1. Quantidade de reagentes utilizados na síntese dos copolímeros de PLGA...108
Tabela 5.2. Temperaturas obtidas de degradação térmica para os copolímeros
sintetizados...112
Tabela 5.3. Tg e Tm obtidas para os copolímeros sintetizados...114
Tabela 6.1. Características analíticas dos tipos de Argilas Bentoníticas...117
Tabela 6.2. Quantidade dos monômeros, catalisador, iniciador e argila utilizado nas sínteses dos nanocompósitos de PLLA...120
Tabela 6.3. Quantidade dos monômeros, catalisador, iniciador e argila utilizado nas sínteses dos nanocompósitos de PGA...121
Tabela 6.4. Quantidade dos monômeros, catalisador, iniciador e argila utilizado nas na síntese do nanocompósito de PLLA sem inertização do meio reacional...121
Tabela 6.5. Distâncias interplanares das argilas estudadas...127
Tabela 6.6. Temperaturas obtidas de degradação térmica para os polímeros PLLA com e sem inertização do meio reacional e adição de argila...137
Tabela 6.7. Temperaturas obtidas de degradação térmica os polímeros PGA com
inertização do meio reacional e adição de argila...137
Tabela 6.8. Tg, Tm e Tcc para os polímeros produzidos PLLA com adição de argila
utilizando os dois processos reacionais...140
Tabela 6.9. Tg e Tm obtidas para os três polímeros PGA com adição de argila e processo de
Símbolo Nomenclatura
PLA Poli (ácido láctico)
PLLA Poli (L-Lactídeo)
PGA Poli (Glicolídeo)
PLGA Poli (L-Lactídeo-co-Glicolídeo)
DSC Calorimetria Diferencial Exploratória
DRX Difração de raios X
GPC Cromatografia de Permeação em Gel
TGA Análise Termogravimétrica
MEV Microscopia Eletrônica de Varredura
FTIR Espectroscopia Vibracional de absorção no infravermelho com
transformada de Fourier
OFW Método isoconversional de Ozawa-Flynn-Wall
KAS Método isoconversional de Kissinger-Akahira-Sunose
Ea Energia de ativação
Eα Energia de ativação para uma determinada conversão
A Fator de frequência
β Taxa de aquecimento (0C/min)
R Constante geral dos gases
α Valores de conversão
Tm Temperatura de fusão
Tcc Temperatura de cristalização a frio
Xc Grau de cristalinidade
IP Índice de polidispersividade
Mn Massa molar média em número
Mw Massa molar em massa
Capítulo 1: Introdução...25
1.1 Objetivos...28
1.2 Organização do Trabalho...28
1.3 Principais Contribuições desta Pesquisa...29
Capítulo 2: Fundamentação Teórica...31
2.1 Engenharia de Tecidos...31
2.1.1 Scaffolds...34
2.2 Biomateriais...37
2.2.1 Poli (α – hidróxi ácidos)...40
2.2.2 Síntese dos Poli (α – hidróxi ácidos)...43
2.2.3 Copolimerização dos Poli (α – hidróxi ácidos)...46
2.3 Nanocompósitos Poliméricos...48
2.3.1 Preparação de Nanocompósitos Polímero/Argila...48
2.3.2 Tipos de Nanocompósitos...51
2.3.3 Nanocargas: Argilas...52
2.4 Cinética Química...55
2.5 Processo de Eletrofiação...57
2.6 Conclusões Parciais...59
Capítulo 3: Estudo de Parâmetros Cinéticos da Reação de Polimerização do Poli (L-Lactídeo)...61
3.1 Materiais...61
3.1.1 Reagentes...61
3.3.1 Método de Ozawa-Flynn-Wall (OFW)...64
3.3.2 Método de Kissinger-Akahira-Sunose (KAS)...69
3.3.3 Método de Vyazovkin...71
3.4 Conclusões Parciais...75
Capítulo 4: Síntese e Caracterização do Poli (L-Lactídeo) e Poli (Glicolídeo)...77
4.1 Materiais...77
4.1.1 Produção do Poli (L-Lactídeo) e Poli (Glicolídeo)...77
4.2Metodologia...77
4.2.1 Síntese de PLLA e PGA através de polimerização por abertura de anel ...77
4.2.2 Preparo das amostras para determinação de massa molar por Cromatografia de Permeação em Gel...79
4.2.3 Caracterização dos polímeros sintetizados PLLA e PGA...80
4.3 Resultados e Discussão...81
4.3.1 Espectroscopia Vibracional de absorção no Infravermelho com transformada de Fourier (FTIR)...87
4.3.2 Análise Termogravimétrica (TGA)...91
4.3.3 Calorimetria Exploratória Diferencial (DSC)...95
4.3.4 Difração de Raios –X (DRX)...101
4.3.5 Cromatografia de Permeação em Gel (GPC)...104
4.4 Conclusões Parciais...105
Capítulo 5: Síntese e Caracterização dos Copolímeros de Poli (L-Lactídeo –co-Glicolídeo)...107
5.2.1 Síntese de PGA por meio de polimerização por abertura de anel...107 5.2.2 Caracterização dos Copolímeros sintetizados...108 5.3 Resultados e Discussão...108 5.3.1 Espectroscopia Vibracional de Absorção no Infravermelho com transformada de Fourier (FTIR)...109 5.3.2 Análise Termogravimétrica (TGA) ...110 5.3.3 Calorimetria Exploratória Diferencial (DSC)...113 5.4 Conclusões Parciais...114
Capítulo 6: Síntese e Caracterização de Nanocompósitos de Poli (L-Lactídeo) e Poli (Glicolídeo)...116
6.1 Materiais...116 6.1.1 Argila Bentonítica...116 6.1.2 Agentes Organofilizantes...117 6.1.3 Ácido Clorídrico...118 6.1.4 Síntese dos Nanocompósitos de PLLA e PGA...118
6.2 Metodologia...119 6.2.1 Organofilização da Argila Bentonítica com a utilização do Ácido
12-aminododecanóico...119 6.2.2 Organofilização da Argila Bentonítica com a utilização do Octadecilamina...119 6.2.3 Síntese dos Nanocompósitos de PLLA e PGA por meio de polimerização por abertura de anel in situ com inertização...120
6.2.4 Síntese do Nanocompósito de PLLA por polimerização por abertura de anel in situ sem inertização...121 6.2.5 Caracterização da Argila Bentonítica e dos Nanocompósitos de PLLA e
6.3.2 Análise Termogravimétrica (TGA) das Argila Bentoníticas Sódicas e
Organofilizadas...127 6.3.3 Espectroscopia Vibracional de absorção no Infravermelho com transformada de Fourier (FTIR) das Argila Bentoníticas Sódicas e Organofilizadas...129 6.3.4 Espectroscopia Vibracional de absorção no Infravermelho com transformada de Fourier (FTIR) dos Nanocompósitos de PLLA e PGA...131 6.3.5 Análise Termogravimétrica (TGA) dos Nanocompósitos de PLLA e PGA...133 6.3.6 Calorimetria Exploratória Diferencial (DSC) dos Nanocompósitos de PLLA e
PGA...138 6.3.7 Difração de Raios – X (DRX)...142 6.4 Conclusões Parciais...143
Capítulo 7: Processamento (Eletrofiação) e Análises Biológicas...145
7.1 Materiais...145 7.1.1 Produção de Nanofibras de PLLA e de Nanocompósito de PLLA por
Eletrofiação...145 7.2 Metodologia...145 7.2.1 Produção de nanofibras de PLLA e de Nanocompósito de PLLA por
Eletrofiação...145 7.2.2 Análises Biológicas das Nanofibras de PLLA 8...147 7.2.3 Análises Biológicas das Nanofibras de NanoPLLA 4...149 7.2.4 Caracterização das Nanofibras de PLLA 8 e das Nanofibras do Nanocompósito NanoPLLA 4...150 7.3 Resultados e Discussão...150 7.3.1 Avaliação morfológica das Nanofibras obtidas...151 7.3.2 Análises Biológicas das nanofibras de Nano PLLA 8...153 7.3.3 Análises Biológicas das nanofibras de Nanocompósito NanoPLLA 4...158
8.1 Conclusão Geral...160 8.2 Sugestões para trabalhos futuros...162
Referências Bibliográficas...163 Apêndice I...176 Apêndice II...187 Apêndice III...189
Capítulo 1
Introdução
Capítulo 3
Nas próximas décadas, o custo social da saúde no Brasil deverá enfrentar um crescimento significativo e potencialmente perigoso para as contas públicas. A evolução do perfil demográfico e social aponta para o aumento progressivo da idade média da população humana, em particular da urbana. Existe, assim, cada vez mais, a necessidade de garantir a qualidade de vida, compatível com um custo e uma carga social aceitáveis. O número de habitantes de terceira idade triplicará nos próximos 50 anos e o número de pessoas em idade avançada será multiplicado por seis. Por outro lado, a população jovem, vivendo em aglomerações de alta densidade, está cada dia mais exposta a lesões traumáticas, incluindo aquelas causadas por acidentes de trânsito. Embora numericamente menos significativas, essas lesões têm um altíssimo custo social, gerando pessoas, ainda jovens, debilitadas ou permanentemente incapacitadas para uma vida normal e produtiva [1].
Para ajudar pessoas que sofrem com algumas limitações causadas por doenças ou acidentes, os recentes avanços na medicina moderna, aliados ao aumento da expectativa de vida, têm estimulado o desenvolvimento/aprimoramento de biomateriais e técnicas de biofabricação que auxiliem na melhoria da qualidade de vida destas pessoas.
Esta técnica, conhecida como Engenharia de Tecidos (Tissue Engineering), consiste na regeneração de órgãos e tecidos vivos. Como uma ciência multidisciplinar, a Engenharia de Tecidos integra a Ciência dos Materiais com Medicina Regenerativa, aplicando os princípios de Engenharia e Biologia em questões clínicas. A estratégia típica da Engenharia de Tecidos pode ser classificada em três componentes: scaffold (suportes, matrizes tridimensionais, arcabouços, estruturas, etc.), células e fatores biológicos. Muitas das técnicas da Engenharia de Tecidos utilizam scaffolds porosos tridimensionais cultivados com células. Geralmente, este cultivo tem início com a coleta de tecidos do próprio paciente, que são dissociados em células que,
posteriormente, são depositadas sobre os scaffolds (biológicos ou sintéticos) para então serem reinseridos no paciente [2,3,4].
Desta forma, os biomateriais são necessários em muito dos procedimentos cirúrgicos decorrentes da Engenharia de Tecidos e Medicina Regenerativa. A primeira etapa a ser levada em consideração para o emprego de biomateriais na Engenharia de Tecidos inicia-se com a seleção dos materiais, seguidos da avaliação de suas propriedades físicas, químicas, de biocompatibilidade e, finalmente, da construção dos scaffolds e/ou próteses para implantes.
Materiais sintéticos usados para aplicações biológicas (biomateriais) podem ser classificados como, metais, cerâmicos, polímeros e compósitos. Os materiais poliméricos e seus compósitos têm sido usados durante anos em aplicações como substituição de tecidos, suporte de tecidos e na liberação controlada de fármacos, proporcionando aceitação e destaque importante na Engenharia de Tecidos [5].
De acordo com seu comportamento e desempenho em tecidos vivos, os biomateriais poliméricos podem ser divididos em materiais bioestáveis, bioabsorvíveis, biodegradáveis, biorreabsorvíveis e parcialmente bioabsorvíveis [5].
Em muitos casos os biomateriais precisam ser implantados temporariamente, e nestes casos os materiais poliméricos bioabsorvíveis ou parcialmente bioabsorvíveis e biorreabsorvíveis são mais apropriados do que os materiais poliméricos bioestáveis [5].
Os materiais bioabsorvíveis e biorreabsorvíveis devem cumprir alguns critérios e requerimentos específicos relacionados a qualquer tipo de aplicação especial ou implantes: devem ser não mutagênicos, não antigênico, não carcinogênico, não tóxico, não teratogênico, antisséptico e ser biocompatível. Eles não podem causar morbidez e devem proporcionar rigidez e suportar a força mecânica adequada [5].
Os polímeros cirúrgicos biorreabsorvíveis mais importantes são os poliésteres alifáticos (polímeros e copolímeros) derivados dos α-hidróxi ácidos. Muitos deles são polímeros termoplásticos, parcialmente cristalinos, ou amorfos [4, 5].
Os representantes desta classe de poli(α-hidróxi ácidos) mais utilizados são, o poli(ácido glicólico) (PGA), poli(ácido lático) (PLA), poli(ε-caprolactona) (PCL), seus copolímeros e outros [5-15].
O poli (ácido láctico) (PLA), seus isômeros racêmicos: poli (L- ácido láctico) (PLLA), poli (D-ácido láctico) (PDLA) e poli (L-D-ácido láctico) (PDLLA), o poli (ácido glicólico)
(PGA), bem como seus copolímeros, compósitos e nanocompósitos, apresentam grande aceitação na Engenharia de Tecidos, devido à excelente biocompatibilidade destes polímeros [5-15].
Podem ser utilizados em diversas aplicações médicas, como em materiais de sutura e curativos; dispositivos para fixação ortopédica, como pinos e parafusos; liberação controlada de drogas; doenças cardiovasculares (stents); regeneração de ossos; reparo de lesões em cartilagens articulares; tecidos musculares; substituição ou regeneração da traquéia, entre outras [5-15].
Cada uma dessas aplicações necessita de materiais com propriedades físicas, químicas, biológicas, biomecânicas e de degradação específicas para promover uma terapia eficiente [16].
Melhorias nas propriedades mecânicas e estruturais de matrizes poliméricas são, geralmente, alcançadas com a incorporação de cargas à matriz. Além de aumentar a resistência mecânica dos polímeros, comumente observado em várias matrizes poliméricas como as Poliamidas (PAs), Polipropileno (PP), Polietileno (PE), entre outros, a utilização de argilas montmoriloníticas como carga tem despertado interesse devido suas propriedades medicinais. Modificação de argilas montmoriloníticas constitui um ponto chave para aplicação deste material em matrizes poliméricas, pois o uso do agente modificador (agente organofilizante, no caso de argilas organofílicas) adequado, pode alterar significativamente a extensão da intercalação do polímero entre o espaçamento interlamelar da argila, devido à interação entre o polímero e os grupos funcionais do agente modificador. Levando em consideração a aplicação na área médica, é necessário que o agente modificador mantenha/aumente a propriedade de biocompatibilidade do polímero, permitindo que o mesmo seja aplicado na Engenharia de Tecidos.
Considerando o supracitado, esta Tese tem como objetivo a síntese, caracterização e processamento de polímeros biorreabsorvíveis com a incorporação de argilas organofílicas, utilizando os dímeros do ácido láctico e glicólico para uso na Engenharia de Tecidos. Nesta pesquisa, foram estudados os polímeros PLLA, PGA, e seus derivados, desenvolvidos para desempenharem de forma satisfatória as funções e requisitos básicos para aplicação como biomaterial. Para tanto, diferentes rotas de sínteses e modificações nas estruturas dos polímeros foram avaliadas, como a incorporação de argilas organofílicas, como carga, buscando atender às necessidades de aplicações médicas. Após o entendimento de todo o processo envolvido nas sínteses dos polímeros foi possível desenvolver uma nova rota sintética para a obtenção de nanocompósitos de PLLA que atendessem aos requisitos do biomaterial.
1.1 Objetivos
Esta tese tem como objetivos principais a síntese, caracterização e análise das condições de processamento dos polímeros biorreabsorvíveis (PLLA e PGA), de seus copolímeros e nanocompósitos. Os objetivos específicos para o desenvolvimento do projeto são:
• Síntese de polímeros biorreabsorvíveis a partir dos dímeros derivados do ácido láctico e glicólico com obtenção de dados cinéticos para a polimerização do polímero puro;
• Avaliar o efeito da incorporação de partículas de argilas organofílicas nos
polímeros obtidos, visando à obtenção de nanocompósitos por meio da polimerização in situ;
• Avaliar a resposta biológica/biocompatível dos polímeros/nanocompósitos obtidos por meio da realização de ensaios in vitro e
• Estudar a viabilidade do processamento dos polímeros/nanocompósitos obtidos
utilizando o processo de eletrofiação para a obtenção de mantas de nanofibras para construção de dispositivos para a área médica.
1.2 Organização do Trabalho
Este trabalho está dividido em oito capítulos. No primeiro Capítulo é apresentada uma breve introdução sobre o tema abordado, os objetivos, a contribuição desta pesquisa e como o documento final esta organizado.
No Capítulo 2 é apresentada a fundamentação teórica com as principais definições dos tópicos necessários para o desenvolvimento do trabalho.
O Capítulo 3 apresenta os resultados obtidos para o estudo da cinética de polimerização por abertura de anel do PLLA utilizando diferentes métodos isoconversionais, através da técnica de Calorimetria Diferencial Exploratória (DSC).
O Capítulo 4 apresenta a metodologia, caracterização e os resultados obtidos para as sínteses do PLLA e PGA.
No Capítulo 5 são descritas as etapas envolvidas para a obtenção e caracterização dos copolímeros de PLGA em três proporções diferentes.
No Capítulo 6 são apresentadas as etapas de organofilização e caracterização das argilas bentoníticas e a obtenção de nanocompósitos de PLLA e PGA, utilizando a rota de síntese convencional, e a obtenção de nanocompósitos de PLLA utilizando a nova rota de síntese desenvolvida.
O Capítulo 7 descreve o processamento dos polímeros utilizando o processo de eletrofiação e os resultados obtidos das análises biológicas realizadas.
O Capítulo 8 apresenta as conclusões obtidas através das análises de todos os resultados apresentados e as sugestões para trabalhos futuros.
As referências bibliográficas utilizadas neste trabalho são apresentadas ao final desta tese.
1.3 Principais Contribuições desta Pesquisa
Em populações urbanas no Brasil, as lesões traumáticas são as primeiras causas tanto da internação hospitalar quanto da morte na segunda e terceira décadas da vida dos jovens [1]. Em 2014, o gasto do SUS com próteses ficou acima de R$ 1 bilhão, onde R$ 730 milhões foram gastos com equipamentos cardiovasculares e R$ 210 milhões em dispositivos ortopédicos [106]. Somente o procedimento de artroplastia total de quadril cimentada, em 2004, que tem grande aplicação na população idosa, gerou, no Brasil, um gasto de 17,8 milhões de reais com internações (correspondendo a 5551 internações) dos quais 8 milhões se referem aos gastos com as próteses. Paralelamente, foram gastos mais de 4,1 milhões de reais com internações para a realização de cirurgias de revisão de quadril (921 internações) no país. O número mundial de pacientes suscetíveis a receber uma terapia ortopédica associada com bioengenharia foi estimado, em 2003, em 11.750.000 com o valor de biomateriais usados em terapias de U$ 3.250.000,00 [1].
Sabe-se que no Brasil a produção de biomateriais é muito limitada e, em muitos casos, inexistente. O objetivo destes biomateriais é o de serem aplicados para corrigir/regenerar lesões de tecidos, causadas por diversas razões, influenciando de maneira positiva na qualidade de vida das pessoas que enfrentam problemas de saúde, permitindo que um paciente inativo, retorne às suas atividades sociais e econômicas, além de contribuir com a desoneração do sistema de saúde brasileiro.
Portanto, o desenvolvimento e entendimento da rota de síntese de biomateriais permite a obtenção de materiais com características específicas para cada área de aplicação. A obtenção de
polímeros puros, copolímeros e nanocompósitos são fundamentais para que os biomateriais alcancem diferentes propriedades e desempenho, sendo muito versáteis na aplicação em Engenharia de Tecidos. Nesta tese, através do ajuste de parâmetros reacionais, foi possível produzir polímeros de PLLA com tempos reacionais muito menores que os apresentados na literatura e o desenvolvimento de uma nova rota de síntese para a obtenção de nanocompósitos poliméricos de PLLA em um sistema aberto sem inertização do meio reacional, que consistem em avanços significativos para a produção com menor custo destes biomateriais. Destacam-se ainda como contribuições desta Tese, avaliar o efeito da incorporação de partículas de argilas organofílicas nos polímeros obtidos, visando à obtenção de nanocompósitos, a avaliação da resposta biológica/biocompatível dos polímeros/nanocompósitos e a viabilidade do processamento dos polímeros/nanocompósitos obtidos utilizando o processo de eletrofiação para a obtenção de mantas de nanofibras.
Capítulo 2
Fundamentação Teórica
2.1 Engenharia de Tecidos
Ferimentos, doenças e malformações congênitas sempre fizeram parte da experiência humana e seus tratamentos foram evoluindo com a experiência adquirida e com a introdução de métodos científicos observou-se uma nova compreensão do mundo natural. O desenrolar metódico dos conhecimentos da biologia foi acoplado com a compreensão científica de doenças e traumas permitindo o surgimento de novos procedimentos terapêuticos. Materiais artificiais ou próteses para substituição de membros, dentes e outros tecidos resultaram na restauração parcial da função perdida. Além disso, foi desenvolvido o conceito de utilização de um tecido como substituto para outro. No século 16, Tagliacozzi de Bologna, Itália, descreveu a substituição de um nariz por outro que foi construído a partir do antebraço. Com o entendimento científico do século 19 sobre germes, teorias das doenças e a introdução das técnicas de esterilização, a cirurgia moderna emergiu. O advento da anestesia na metade do século 19 permitiu uma rápida evolução de muitas técnicas cirúrgicas [17].
Atualmente, o campo de cirurgia reconstrutiva surgiu para melhorar a qualidade de vida das pessoas por meio da substituição das funções perdidas utilizando a reconstrução de estruturas do corpo. Técnicas modernas de transplante de tecidos e órgãos de um indivíduo para o outro têm sido revolucionária e salvado vidas, porém, embora seja um sucesso, possui alguns desafios. O maior problema é o acesso suficiente de tecidos e órgãos para todos os pacientes que necessitam deles. Além disso, existem problemas com o sistema imunológico que pode produzir rejeição crônica e conseqüente destruição do órgão, tecido ou parte implantada. Estas dificuldades produziram a necessidade de fornecer novas soluções para a obtenção destes tecidos. É neste contexto que nasceu a Engenharia de Tecidos [17].
A Engenharia de Tecidos é um campo interdisciplinar que surgiu das necessidades criadas por uma série de problemas inter-relacionados, incluindo escassez de doadores de órgãos, a morbidade do sítio doador e a insuficiência de dispositivos mecânicos. Estas soluções imperfeitas
continuam a impulsionar este campo relativamente novo, que aplica os princípios de engenharia com ciências da vida para o desenvolvimento de substitutos biológicos para a restauração, manutenção ou melhoria da função do tecido [3].
Em sua essência, um tecido vivo, novo e funcional é fabricado utilizando células vivas, que são normalmente associados com uma matriz ou scaffold que proporcionam o desenvolvimento do tecido. Novas fontes de células, incluindo muitos tipos de células-tronco, têm sido identificadas nos últimos anos, impulsionando um novo interesse neste campo. De fato, a emergência da biologia de células-tronco conduziu a uma nova expressão, Medicina Regenerativa. Scaffolds podem ser naturais, sintéticos, ou uma combinação de ambos. As células vivas podem migrar para dentro do implante após a implantação ou podem ser associados com a matriz em cultura celular antes da implantação [17].
A Figura 2.1 apresenta um esquema do processo de atuação da Engenharia de Tecidos.
Figura 2.1: Esquema do processo de atuação da Engenharia de Tecidos [18].
Scaffold de polímero
biodegradável
Cultura de tecido in vitro
Implante in vivo Novo Osso Cartilagem Fígado Intestino Uréter Osteoblastos Condrócitos Hepatócitos Enterócitos Células Uroteliais
A maioria das construções na Engenharia de Tecidos é composta de, pelo menos, dois componentes importantes: um grupo de células e um material em que elas possam crescer. Estes elementos desempenham um papel importante no desenvolvimento do tecido novo. O componente celular é necessário para a geração de novos tecidos por meio da produção extracelular da matriz e é responsável por sua longa duração e manutenção. O material do
scaffold proporciona estabilidade mecânica em curto prazo e fornece um modelo de organização
tridimensional para o desenvolvimento do tecido. A interação destes dois componentes, tais como a coordenação das taxas de degradação dos polímeros com a taxa de biossíntese celular e as características de inoculação celular do polímero, é crítica para o sucesso da construção na Engenharia de Tecidos [19].
Geralmente, a preparação dos produtos da Engenharia de Tecidos ocorre seguindo as seguintes etapas [2]:
• Seleção e processamento do suporte;
• Inoculação da população celular sobre o suporte;
• Crescimento do tecido prematuro;
• Crescimento do tecido maturado em sistema fisiológico (biorreator);
• Assimilação do produto.
Para a reconstrução de um órgão ou tecido é necessário selecionar o suporte em que ocorrerá o crescimento celular. A seleção deste suporte considera o tipo, local da lesão, como a sua extensão, e segue basicamente duas estratégias de aplicação quando preparado com polímeros biorreabsorvíveis, como é o caso dos poli(α-hidróxi ácidos) [2].
A primeira estratégia consiste no desenvolvimento do material de forma que ocorra o suporte físico e mecânico das células, desde a inoculação até o reimplante no organismo hospedeiro. A função do implante do conjunto polímero e células é proporcionar suporte para o crescimento celular e, adicionalmente, servir como substituto mecânico/estrutural do tecido original até a formação do novo tecido e sua biorreabsorção completa [2].
Na segunda estratégia, o implante ocorre com tecido maduro formado. O suporte polimérico é dimensionado com propriedades mecânicas e tempo de degradação adequado para a
inoculação das células até a sua inserção num biorreator, onde ocorrerá a formação do tecido maduro. Somente após a formação do tecido, o implante é inserido no organismo [2].
2.1.1. Scaffolds
Os scaffolds possuem diversas funções críticas para o sucesso da regeneração tecidual [3]:
• Servem como espaçadores para evitar crescimento do tecido na vizinhança do local afetado;
• Proporcionam uma estrutura de suporte temporário para o tecido que se deseja substituir;
• Substrato para o crescimento, proliferação, migração e diferenciação de células;
• Utilizado como um veículo de células, facilitando a sua retenção e distribuição na região em que o crescimento do novo tecido é desejado;
• Proporciona espaços para a vascularização, formação de novos tecidos e remodelação;
• Permite o transporte eficiente de nutrientes, fatores de crescimento, vasos sanguíneos e remoção de materiais;
Para assumir essas funções, os scaffolds precisam atender algumas exigências básicas. O principal requisito para qualquer tipo de scaffold é a biocompatibilidade. É necessário que ocorra uma resposta benéfica das células e ao mesmo tempo fornecer uma resposta imune adequada ao hospedeiro do tecido ou implante. Isto significa que as interações que ocorrem entre o scaffold, células e o hospedeiro do tecido devem ser favoráveis, sem que haja qualquer dano potencial devido à citotoxidade induzida, geração de resposta imune adversa, ou a ativação das vias de coagulação do sangue. Um grande número de fatores contribui para o tipo de tecido gerado pelo biomaterial, incluindo a forma e tamanho do implante, sua reatividade química, o mecanismo, taxa e subprodutos de degradação, localização do implante e a espécie hospedeira [3].
Scaffolds sintéticos servem como estruturas temporárias que são substituídas por tecidos e
que posteriormente precisam ser removidos gradualmente do local do implante [3]. Os materiais utilizados nos scaffolds sintéticos são definidos segundo o processo de degradação, porém estas definições ainda não são consenso no meio científico.
Uma das definições é referente ao termo biodegradável, que indica decomposição devido à degradação macromolecular causada por elementos biológicos, resultando em fragmentos ou em degradação de subprodutos que não são necessariamente eliminados do organismo; biorreabsorvível implica na eliminação completa de materiais estranhos e da degradação dos subprodutos via reabsorção dentro do corpo; ou seja, pelas vias naturais, como a filtração ou a metabolização [3].
Materiais bioabsorvíveis por outro lado, são aqueles que podem se dissolver em fluidos corpóreos sem qualquer clivagem da cadeia macromolecular ou diminuição de massa molar. Os produtos de degradação devem ser solúveis em água, compreendendo moléculas pequenas e devem ser metabólitos que ocorrem naturalmente no hospedeiro [2, 3, 5].
Outro critério importante, mas difícil de alcançar, é a realização da correspondência entre a taxa de degradação do scaffold e o crescimento do novo tecido. É essencial para o scaffold a transferência gradual da função de suporte de carga e de suporte de crescimento de um novo tecido, especialmente em aplicações musculoesqueléticas em que os suportes geralmente estão sujeitos a cargas mais elevadas quando comparadas com outras áreas. Geralmente, a taxa de biodegradação, biorreabsorção ou bioabsorção do scaffold deve coincidir com a taxa de regeneração de novos tecidos no local da colocação do implante para fornecer uma transição adequada da degradação do scaffold com o fortalecimento e desenvolvimento do tecido, sem comprometer a integridade do implante [3].
As propriedades mecânicas (resistência, módulo, tenacidade e ductilidade) e arquitetônicas de um scaffold são extremamente importantes, pois devem corresponder as do tecido hospedeiro, para que não ocorra comprometimento do scaffold antes da geração do novo tecido. O tamanho, a geometria, a interconectividade, ramificação e a química de superfícies dos poros e canais podem afetar diretamente a extensão e natureza da difusão dos nutrientes e o crescimento interno do tecido. Geralmente, o tecido vivo é observado no exterior das regiões do
scaffold enquanto a parte interior deixa de suportar o tecido viável devido à falta de difusão
adequada [3].
Um scaffold não pode ser completamente sólido. O tamanho dos poros deve ser, pelo menos, algumas vezes o tamanho das células que serão semeadas para proporcionar espaço suficiente para a entrada e saída de nutrientes e resíduos, respectivamente [3].
Além da porosidade e de sua interligação, a permeabilidade também é uma característica importante do material, pois é a medida da facilidade com a qual um fluido pode fluir através de uma estrutura. Desta forma, alta permeabilidade produz uma maior difusão no interior do
scaffold, facilitando a entrada de nutrientes e eliminação de produtos de degradação e resíduos
metabólicos [3].
A Figura 2.2 apresenta imagens exemplificando scaffolds usados na Engenharia de Tecidos.
Figura 2.2: Imagens de scaffolds usados na Engenharia de Tecidos [109, 20].
Como a formação de uma estrutura porosa constitui um objetivo central na fabricação de um scaffold, um grande número de técnicas foi desenvolvido para atingir este objetivo incluindo, separação de fases (separação de fases induzida, sem solvente, e separação de fases termicamente induzidas), evaporação de solvente com adição e lixiviação de sal, liofilização, entre outras. Devido à relativa facilidade no uso destas técnicas para a fabricação de scaffolds, elas ainda são comumente usadas. A limitação principal destas tecnologias é a falta de controle preciso das especificações dos scaffolds, tais como tamanho do poro, a forma, a distribuição e interconectividade, assim como a forma global do scaffold [20, 21, 22].
Outra técnica de fabricação utilizada é a técnica de fabricação de sólidos de forma livre (SFFT), ou Manufatura Aditiva. Esta técnica consiste na fabricação de scaffolds altamente reprodutíveis com uma rede de poros completamente interconectados. Usando dados digitais produzidos por softwares de imagens, tais como tomografia computadorizada ou ressonância magnética, é possível a obtenção do desenho apropriado do scaffold [20,21, 22].
Ao contrário das técnicas convencionais de usinagem que envolve a remoção de materiais, a Manufatura Aditiva emprega o conceito de fabricação em camadas, em que os objetos tridimensionais são fabricados camada por camada, construídos via processamento de folhas sólidas, líquidos ou pós [22]. Os métodos mais utilizados na fabricação de sólidos de forma livre são Modelagem de Deposição do Fundido (Fused Deposition Modeling), impressão 3D (3D
Printing), Sinterização Seletiva a Laser (Selective Laser Sintering) e Estereolitografia
(Stereolithography) [21].
Portanto, verifica-se que os pré-requisitos dos scaffolds de materiais poliméricos para aplicações na Engenharia de Tecidos são variados e altamente desafiadores, desde a escolha do material polimérico, arquitetura e escolha das técnicas de fabricação.
2.2 Biomateriais
Materiais sintéticos usados em aplicações biológicas (biomateriais) podem ser classificados como metais, cerâmicos, polímeros e compósitos [5].
Tradicionalmente polímeros sintéticos foram projetados e fabricados para possuírem estabilidade de longo prazo. A partir de 1970 os polímeros biodegradáveis com tempo de vida controlável receberam grande atenção como materiais biomédicos e produtos de consumo compatíveis com o ambiente [5, 27, 28].
Esta classe de biomateriais possui duas principais vantagens quando comparadas aos biomateriais não biodegradáveis. A primeira vantagem é de não provocarem reações de corpo estranho permanente, pois estes materiais são gradualmente absorvidos pelo organismo e não deixam vestígios de resíduos permanente nos locais onde foram realizados os implantes. A segunda vantagem, é que alguns tipos específicos de biomateriais são capazes de regenerar os tecidos por meio de sua interação com as células imunológicas [24].
Com base no comportamento dos biomateriais poliméricos em tecidos vivos, eles podem ser divididos em bioestável, bioabsorvíveis (biodegradáveis ou biorreabsorvíveis) e materiais parcialmente bioabsorvíveis, como citado anteriormente. Os polímeros bioestáveis são aqueles que são inertes, e causam resposta mínima ao tecido que o envolve, mantendo suas propriedades estáveis durante anos. Polietileno e polipropileno utilizado como endopróteses e suturas são exemplos deste tipo de polímero [5].
Em muitos casos os biomateriais são necessários durante um curto espaço de tempo e nestes casos, os materiais poliméricos bioabsorvíveis ou parcialmente bioabsorvíveis são mais apropriados que os materiais poliméricos bioestáveis. Desta forma, os materiais cirúrgicos bioabsorvíveis são adequados para fixação temporária interna quando o tecido foi traumatizado, já que o implante bioabsorvível preserva a estrutura do tecido em sua fase inicial de cura, como por exemplo, ossos, tendões ou pele. Como o implante se decompõe gradualmente, as tensões também são transferidas gradualmente para o tecido em cicatrização. O tempo necessário depende do tipo de matéria, massa molar e propriedades estruturais, assim como o local onde o implante está inserido [5].
Muitos polímeros sintéticos são considerados bioabsorvíveis ou biorreabsorvíveis em tecidos vivos. Os polímeros biorreabsorvíveis cirúrgicos mais importantes são os poliésteres alifáticos (polímeros, blendas e copolímeros) derivados dos α-hidróxi ácidos. A maioria deles são polímeros termoplásticos, parcialmente cristalinos ou totalmente amorfos [4,5].
Polímeros naturais, como o colágeno, que é degradado no organismo por meio de enzimas, também têm sido estudados e clinicamente usados [23].
A Tabela 2.1 apresenta alguns polímeros sintéticos e naturais usados na Engenharia de Tecidos e a Figura 2.3 apresenta algumas aplicações de diferentes polímeros utilizados como biomateriais.
Tabela 2.1: Exemplos de polímeros sintéticos e naturais utilizados na Engenharia de Tecidos [20]
Tipo Polímeros Sintético Poli(ácido glicólico) Poli(ácido láctico) Poli(etileno glicol) Natural Colágeno Ácido Hialurônico Alginato Agarose
Figura 2.3: Algumas aplicações de variados polímeros utilizados na Engenharia de Tecidos [57].
Como dito anteriormente, as propriedades mecânicas, geometria e o tempo de degradação em função das necessidades da aplicação são o que irá selecionar o tipo de material polimérico que deverá ser utilizado [31]. O polímero que será utilizado como biomaterial deverá apresentar as seguintes características idealmente [31]:
• Ser metabolizado pelo organismo após ter cumprido sua proposta de recuperação sem deixar traços;
• Ser facilmente processado na forma de um produto final;
• Ser facilmente esterilizável. 2.2.1 Poli(α –hidróxi ácidos)
Dentre os polímeros biorreabsorvíveis o poli (ácido láctico) e o poli (ácido glicólico) estão entre os poucos usados clinicamente. O interesse por estes tipos de polímeros vem do fato deles já terem aprovação para certo número de aplicações clínicas pelo U.S. Food and Drug
Administration (FDA), órgão responsável pela liberação de alimentos e drogas nos EUA [31].
O campo de aplicações destes polímeros é vasto e são empregados como dispositivos em implantes, materiais de sutura, próteses, materiais de reparação ortopédica, pinos intramedulares, e em liberação controlada de drogas [31].
Poli (ácido glicólico) (PGA) é um polímero biocompatível e conhecido desde 1954. Em 1962, o PGA foi desenvolvido como o primeiro fio de sutura absorvível sintético, chamado
Dexon®, pela American Cyanamide DuPont [29].
PGA é o mais simples dos poliésteres alifáticos do tipo –[-(CH2)z-CO-O-]n-,
possui temperatura de transição vítrea (Tg) entre 35-40º C e seu ponto de fusão varia entre
224-227ºC [29].
Devido à sua estrutura e estereoquímica simples podem apresentar diferentes graus de cristalinidade desde completamente amorfo a um máximo de 52% de cristalinidade. Devido a sua alta cristalinidade, PGA é insolúvel na maioria dos solventes orgânicos e, pelo mesmo motivo, apresenta a melhor propriedade mecânica entre todos os poliésteres biodegradáveis [29]. A Figura 2.4 apresenta as dimensões moleculares do PGA.
O PGA de sutura Dexon® possui cristalinidade em um intervalo de 46-52% e tende a perder suas características mecânicas por um período de 2-4 semanas após o implante [29].
O PGA pode ser obtido por processos iniciados com diferentes reagentes e gerar produtos com diferentes propriedades físico-químicas. De fato, para diferentes áreas de aplicação, os materiais básicos são de grande importância, juntamente com as tecnologias de formação de
implantes. Por exemplo, no campo ortopédico, propriedades mecânicas e de design (que estão intimamente relacionadas) são essenciais na obtenção do produto final [27, 29, 30].
Figura 2.4: Dimensões moleculares do Poli (ácido glicólico) [29].
O PGA pode ser polimerizado de forma direta ou indiretamente a partir do ácido glicólico. A policondensação direta produz um polímero de massa molar numérica média (Mn) menor que 10.000 devido à necessidade de um alto grau de desidratação (99,28%) e a ausência de impurezas monofuncionais. Para um PGA de massa molar maior que 10.000, é necessário que sua síntese ocorra a partir da polimerização por abertura de anel dos dímeros cíclicos do ácido glicólico [24, 27, 28, 29].
Por outro lado, o poli (ácido láctico) (PLA) tem como expectativa diversas aplicações desde sua utilização como plástico biodegradável, mas também como material para aplicações biomédicas, devido às suas excelentes propriedades mecânicas e por ser altamente hidrolisável no corpo humano [32, 33].
O PLA pode ser preparado por dois tipos principais de polimerização: condensação direta do ácido láctico e polimerização por abertura de anel do dímero cíclico lactídeo [33].
Tanto o ácido láctico como o dímero cíclico lactídeo apresentam carbonos quirais, sendo que o ácido láctico apresenta duas formas estereoisômeras, o L- e o D-ácido láctico. O lactídeo,
que é o diéster cíclico do ácido láctico, apresenta quatro isômeros diferentes: L-latideo, D-lactídeo, a mistura racêmica D, L-lactídeo e o lactídeo que é opticamente inativo. O meso-lactídeo com alta pureza é de difícil preparação e, portanto, é raramente citado na literatura. Os estereoisômeros do ácido láctico e lactídeo são mostrados na Figura 2.5 [34].
Figura 2.5: Estereoisômeros do ácido láctico e do lactídeo [34].
Os polímeros obtidos a partir do monômero lactídeo são também chamados de polilactídeo. O poli(ácido láctico) e o polilactídeo apresentam a mesma fórmula estrutural, porém os dois nomes distintos são normalmente utilizados para denotar o tipo de monômero utilizado na síntese [34].
A polimerização por abertura de anel leva à formação de polímeros de maior massa molar que aqueles formados por meio da policondensação do ácido láctico. Entretanto, a síntese a partir do lactídeo tem o inconveniente de apresentar alto custo de produção, pois o lactídeo é um produto caro [32, 33,34].
A massa molar é um dos parâmetros que determina as propriedades do polímero, entretanto, outro fator ainda mais importante é sua quiralidade. A presença de um átomo de carbono assimétrico gera estruturas particulares que apresentam características bastante diferentes dependendo do arranjo das unidades quiral que se distribuem na cadeia polimérica. Este arranjo depende do monômero de partida e da rota de síntese [33,34].
O ácido láctico pode ser precursor de materiais totalmente amorfos como também de materiais altamente cristalinos. O poli (L-ácido láctico), por exemplo, é um polímero
semicristalino com temperatura de fusão (Tm) em torno de 1800 C. O D- poli(ácido láctico)
apresenta as mesmas propriedades do L-poli(ácido láctico). O D,L-poli(ácido láctico) atático é um material amorfo com temperatura de transição vítrea entre 45 e 600 C. Já o D,L-poli(ácido láctico), que contém longos blocos de unidades D e L, pode apresentar propriedades similares àquelas dos polímeros opticamente puros [32].
O PLA mostra uma boa resistência mecânica, plasticidade térmica, processabilidade e pode sofrer rompimento de cadeia no corpo humano resultando em oligômeros e finalmente unidades monoméricas de ácido láctico, que são inteiramente reabsorvíveis como um intermediário natural no metabolismo, em particular o L-isômero é um metabólito biológico do corpo humano [32].
A cristalinidade dos polímeros também influencia seu uso, o PDLLA é amorfo, consequentemente, é usado nas aplicações de liberação controlada de drogas, que requerem a dispersão uniforme da espécie, enquanto que o PLA cristalino (37%) pode ser encontrado em dispositivos ortopédicos que requerem força e resistência mecânica elevada. A presença do meso e de D-lactideo introduz a irregularidade suficiente para limitar a cristalinidade. O PLA pode ser processado por injeção de molde, moldagem por sopro e por extrusão [32].
2.2.2 Síntese dos Poli (α –hidróxi ácidos)
O principal método de síntese do PGA e PLA para a obtenção de um polímero de baixa massa molar é a policondensação direta do ácido glicólico ou ácido láctico sintético. Esta metodologia consiste em um processo simples, porém não possui boa eficiência devido à produção de materiais de massa molar relativamente baixa (em torno de 10.000). O procedimento consiste no aquecimento do ácido glicólico ou ácido láctico a pressão atmosférica e temperatura em um intervalo de 175-1850 C até que não haja mais destilação da água. Em seguida a pressão é reduzida a 150 mmHg, mantendo a temperatura inalterada por cerca de duas horas e desta forma o PGA ou PLA de baixa massa molar é produzido [27, 29, 30].
Para a produção de PGA e PLA de alta massa molar diversas tecnologias têm sido desenvolvidas, porém o método preferido é o de polimerização do dímero cíclico por abertura de anel. A seguir são citados alguns métodos mais utilizados [27, 29, 30, 32, 33, 34]:
• Polimerização por condensação azeotrópica:
Nesta abordagem, o problema da remoção da água é superado através da manipulação do equilíbrio entre o monômero e o polímero em um solvente orgânico e desta forma o ácido glicólico ou ácido láctico é policondensado diretamente em um polímero de massa molar elevada;
• Oligomerização por acoplamento de cadeia:
A massa molar pode ser aumentada utilizando agentes de acoplamento de cadeia. Estes agentes reagem preferencialmente com os grupos hidroxila e carboxílico, levando a uma taxa de reação diferente;
• Reação Ácido-catalisada por monóxido de carbono e formaldeído:
Pode ser obtido pela reação de monóxido de carbono, formaldeído ou um de seus compostos relacionados como paraformaldeído ou trioxano na presença de um catalisador ácido;
• Reações catalisadas por enzimas:
O uso de enzimas para a síntese de polímeros in vitro tem sido uma das opções mais promissoras, porém estudos realizados até o momento indicam a obtenção de polímeros de baixa massa molar e;
• Polimerização por abertura de anéis a partir do dímero:
A primeira tentativa para se preparar os poli(α-hidróxi-ácidos) por abertura de anel foi realizada por Carothers em 1932 [107]. O processo de polimerização por abertura de anel do dímero cíclico pode seguir o processo de polimerização por fusão ou Bulk, polimerização por solução e polimerização por suspensão ou emulsão [27, 29, 30].
O mecanismo de polimerização por abertura de anel pode ser dividido em três classes de reação: catiônica, aniônica e coordenação-inserção. As duas primeiras são consideradas rotas alternativas, sendo que a última é mais utilizada industrialmente [27, 29, 30].
No método de coordenação-inserção, Sn(Oct)2 é usado como catalisador do sistema,
sendo que a temperatura mais usual da reação é de 1750 C e a polimerização dura entre 2 a 6 horas [27,29,30].
Este tipo de polimerização é uma reação de equilíbrio. As Figuras 2.6 e 2.7 apresentam as reações do poli(ácido glicólico) e do poli(ácido láctico), respectivamente.
Figura 2.6: Esquema geral da polimerização do ácido glicólico por abertura de anel [29].
Figura 2.7: Mecanismo geral do crescimento de cadeia do PLA por abertura de anel [33].
A Figura 2.8 apresenta um esquema geral das rotas de polimerização apresentadas para síntese do PLA.
Figura 2.8: Esquema geral das rotas de polimerização para o caso do PLA [32].
2.2.3 Copolimerização dos Poli(α –hidróxi ácidos)
Por definição, copolímero é um polímero que apresenta mais de um mero diferente na cadeia polimérica [95]. A porcentagem dos componentes, assim como o modo de distribuição dos diferentes meros dentro da cadeia polimérica são características importantes e que interferem nas propriedades finais [31, 95].
A realização da otimização das propriedades de um polímero como, por exemplo, o PLA, pode ser alcançado através de sua copolimerização com outros monômeros. Propriedades mecânicas, balanço hidrofílico/hidrofóbico e a velocidade de degradação podem ser modificados de forma a resultar em uma grande versatilidade dos materiais obtidos [31, 34].
Apesar do PLA e PGA apresentarem estrutura similar, as propriedades químicas, físicas e mecânicas são bem diferentes e este fato é devido à presença de um grupo metila no carbono alfa;
Despolimerização Condensação
Ácido Láctico
Condensação
Pré-polímero de baixa massa molar Mw = 1,000 -5,000 Lactídeo Polimerização por Abertura de Anel Condensação por desidratação azeotrópica
Pré-polímero de baixa massa molar Mw= 2,000-3,000
PLA de alta massa molar Mw> 100,00
Agentes de acoplamento de cadeia