TÍTULO: AVALIAÇÃO IN VITRO DA EFICÁCIA BACTERICIDA DE VENENOS DE COBRAS FRENTE A PATÓGENOS DA CÁRIE
TÍTULO:
CATEGORIA: EM ANDAMENTO CATEGORIA:
ÁREA: CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E SAÚDE ÁREA:
SUBÁREA: Biomedicina SUBÁREA:
INSTITUIÇÃO(ÕES): UNIVERSIDADE DE FRANCA - UNIFRAN INSTITUIÇÃO(ÕES):
AUTOR(ES): JOÃO MATIAS DE SOUZA AUTOR(ES):
ORIENTADOR(ES): CARLOS HENRIQUE GOMES MARTINS ORIENTADOR(ES):
COLABORADOR(ES): ANDREIMAR MARTINS SOARES, MARIA ANITA LEMOS VASCONCELOS AMBRÓSIO
RESUMO
Os venenos de cobras são constituídos de uma mistura complexa de substâncias bioativas, abrangendo amplo potencial de atividades biológicas e farmacológicas. Um grande problema de saúde pública é a cárie dentária, pois é uma doença silenciosa e causada por diferentes fatores. Streptococcus mutans é o agente etiológico primário da cárie dentária, devido ao alto potencial cariogênico e favorece a colonização de outros microrganismos. O presente estudo teve por objetivo a avalição in vitro do potencial antibacteriano dos venenos de cobras de espécies Bothrops spp. frente aos agentes etiológicos da cárie dentária. Os agentes da cárie utilizados neste estudo foram Streptococcus mutans (ATCC 25175); S. mitis (ATCC 49456); S. sobrinus (ATCC 33478); S. sanguinis (ATCC 10556); S. salivarius (ATCC 25975); Enterococcus faecalis (ATCC 4082) e Lactobacillus casei (ATCC 11578). Os venenos de cobras Bothrops jararaca; B. diporus (Paraguai) e B. marajoensis foram coletados do Serpentário Proteínas Bioativas LTDA, na cidade de Batatais (SP/Brasil). Para a avaliação da atividade antibacteriana foram utilizados os métodos de diluição em caldo visando à determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM) e Concentração Bactericida Mínima (CBM), em concentrações de 0,195 a 400 μg/mL, baseado no protocolo do Clinical and Laboratory Standadars Institute (CLSI), empregando resazurina como revelador do crescimento bacteriano. Os resultados obtidos para as bactérias na CIM variaram entre 6,25 e >400 μg/mL com resultados promissores para os venenos B. jararaca; B. diporus (Paraguai) e B. marajoensis frente S. mutans e S. sanguinis, cuja CIM foi de 6,25 a 100 μg/mL. Para S. mitis, S. sobrinus e S. salivarius a CIM foi de 200 a 400 μg/mL. Para demais bactérias o resultado foi inativo, ou seja, CIM superior a 400 μg/mL. A CBM apresentou efeito bactericida para todas as bactérias avaliadas, com exceção para E. faecalis e L. casei. Portanto, podemos concluir que os venenos de cobras Bothrops spp. apresenta potencial atividade bactericida promissora frente às principais bactérias da cárie.
INTRODUÇÃO
A resistência bacteriana o fracasso dos antibióticos em eliminar certos patógenos torna-se uma necessidade urgente em pesquisa de produtos naturais para desenvolvimento de novos antibacterianos (Brahma et al., 2015). Nos últimos anos, vem aumentando o interesse na investigação e descoberta de produtos naturais, entre eles os venenos de diferentes espécies de animais peçonhentos, tais como cobras, escorpiões e anfíbios, destacando principalmente as proteínas e peptídeos desses animais, demostrando assim amplo potencial terapêutico frente às bactérias patogênicas (Gomes et al., 2010; McCleary, Kini; 2013).
Os venenos de cobras são constituídos de uma mistura complexa de proteínas ativas e peptídeos, em aproximadamente 90% do peso seco do veneno, incluindo fosfolipases A2, serinoproteases, hialuronidases, L-aminoácido oxidase, fatores de crescimentos, acetilcolinesterases, ativadores de proteína C, dentre outros (Dorley, Kini; 2009, Perumal Samy et al., 2007; Porto et al., 2007).
Entretanto, além desses compostos, podem-se encontrar alguns compostos orgânicos de baixo peso molecular, tais como carboidratos, serotonina, histamina, citrato e íons inorgânicos, como por exemplo cálcio, ferro, magnésio, cobre e potássio (Fox, Serrano; 2008; Georgieva et al., 2008; Ramos, Selistre-de-Araujo; 2006). Embora os venenos possuem efeitos tóxicos, podem ter grande potencial para a produção de novos medicamentos e algumas aplicações biotecnológicas, tais como analgésicos, antimicrobiano, anti-hipertensivo, antiviral e antiparasitário (Yingxia et al., 2012; Santamaría et al., 2005; Samy et al., 2008; Lee et al., 2011; Lameu et al., 2010; Deolindo et al., 2010; Paiva et al., 2011; Bregge-Silva et al., 2012).
A cavidade bucal abriga o microbioma mais diversificado do corpo humano, pois hospeda aproximadamente 700 espécies de microrganismos já identificados, tais como bactérias, fungos, vírus e protozoários (Wade, 2013). A cárie dentária é um grave problema de saúde pública, doença silenciosa causada por diversos fatores, tais como dieta, formação de biofilme dental, suscetibilidade do hospedeiro e microrganismos cariogênicos. No entanto, acomete independente da faixa etária e resulta na destruição dos dentes, podendo levar a perda total se não for tratada rapidamente (Pitts et al., 2011; Hooley et al., 2012).
Estudos demonstram que as principais bactérias associados no desenvolvimento da cárie dentária é o Streptococcus mutans e Lactobacillus spp. No entanto, o S. mutans é considerado por diferentes autores como a bactéria iniciadora da cárie dentária, demonstrando amplo potencial cariogênico e atuando como porta de entrada para posterior colonização de outros microrganismos,
tais como S. salivarius; S. sanguinis; S. mitis e Enterococcus sp (Jurela et al., 2013; Maret et al., 2013; Sanpei et al., 2010; Struzycka, 2014).
OBJETIVO
O presente estudo teve por objetivo a avalição in vitro do potencial antibacteriano dos venenos de cobras de espécies Bothrops spp. frente aos agentes etiológicos da cárie dentária.
METODOLOGIA
Os venenos de cobras Bothrops jararaca; B. diporus (Paraguai) e B. marajoensis foram coletados do Serpentário Proteínas Bioativas LTDA, na cidade de Batatais (SP/Brasil), armazenados sobre refrigeração (2 a 8º C). Os venenos foram cedidos gentilmente pelo Prof. Dr. Andreimar Martins Soares, pesquisador-chefe do Centro de Estudos de Biomoléculas Aplicadas à Saúde (CEBio), Fundação Oswaldo Cruz, FIOCRUZ Rondônia e Departamento de Medicina da Universidade Federal de Rondônia (UNIR), Porto Velho-RO.
A Concentração Inibitória Mínima (CIM) é definida como a menor concentração capaz de inibir o crescimento bacteriano. Foi utilizado o método de determinação da CIM por microdiluição em microplaca segundo a metodologia preconizada pelo “Clinical and Laboratory Standards Institute” (CSLI, 2012), com adaptações, empregando a resazurina como revelador de crescimento bacteriano.
A Concentração Bactericida Mínima (CBM) é definida como a menor concentração na qual não houve crescimento bacteriano (Duarte et al., 2003). Esta técnica permite verificar se as amostras avaliadas na CIM atuaram com efeito bactericida (ausência de crescimento bacteriano) ou efeito bacteriostático (inibição do crescimento bacteriano).
DESENVOLVIMENTO
Para a realização da Concentração Inibitória Mínima (CIM), os venenos de cobras foram pesados em 1 mg e solubilizados em 125 microlitros (µL) de dimetilsulfóxido (DMSO) e posteriormente acrescentados 500 µL de caldo Brain Heart Infusion (BHI). A concentração final de DMSO não foi superior a 5% e a solução nesta porcentagem foi utilizada como controle negativo.
Com o auxílio de uma alça de inoculação esterilizada, os microrganismos cariogênicos foram transferidos para um tubo contendo 3 mL de solução salina (estéril) até obter turvação equivalente ao tubo 0,5 da escala de McFarland, que corresponde a aproximadamente a 1,5x108 UFC/mL, e em seguida foi retirado 500 µL desta turvação para um outro tubo contendo 4,5 mL de solução salina e depois 2.000 µL deste tubo foi transferido para um terceiro tubo contendo 10 mL de caldo BHI. Em uma microplaca esterilizada de 96 orifícios foram depositados um total de 50 µL de caldo BHI, 50 µL de solução estoque e posteriormente acrescentado 30 µL do caldo BHI e 20 µL suspensão bacteriana, a fim de se obter uma concentração de 0,195 a 400 µg/mL, em diluição seriada permitindo determinar a concentração necessária para inibir o crescimento bacteriano a ser avaliado. Nos demais orifícios foi feito o controle da cultura, pelo qual deve apresentar crescimento bacteriano devido à ausência do agente antimicrobiano, controle de esterilidade do caldo, controle esterilidade das amostras e controle do DMSO. A Clorexidina foi o controle positivo. As placas foram incubadas em incubadora de CO2 a10% a 37ºC, com exceção para S. salivarius e E. faecalis que foram incubadas em condição aeróbica por 24 horas a 37° C. Após o período de incubação foi adicionado em cada poço 30 µL de resazurina (Sigma) na concentração de 0,02% preparado em solução aquosa. As placas foram incubadas novamente por 30 minutos, sendo então observada a alteração da cor azul (ausência de crescimento bacteriano) e a cor rosa (presença de crescimento bacteriano). Os experimentos foram realizados em triplicata.
Para a realização da Concentração Bactericida Mínima (CBM) antes da adição da resazurina na CIM, foi retirado uma alíquota (10 µL) de cada poço da microplaca e transferido para uma nova placa de Petri contendo meio de cultura ágar BHI. A incubação dessas placas foi realizada em incubadora de CO2 a10% a 37ºC, com exceção para S. salivarius e E. faecalis, que foram incubadas em condição aeróbia por 24 horas a 37° C. Após o período de incubação o resultado foi avaliado pela ausência ou crescimento de colônias de cada alíquota inoculada. Os experimentos foram realizados em triplicata.
Após o período de incubação, as culturas foram inspecionadas visualmente e os resultados foram interpretados da seguinte maneira: Quando os resultados da CIM e CBM foram iguais indica que os venenos apresentaram efeito bactericida, enquanto que o valor da CBM obtido for acima da CBM, indica que os venenos apresentaram efeito bacteriostático.
RESULTADOS PRELIMINARES
No presente estudo foi avaliado os extratos brutos dos venenos de cobras de espécies Bothrops spp. frente agentes etiológicos da cárie dentária, utilizando os ensaios de Concentração Inibitória Mínima (CIM) e Concentração Bactericida Mínima (CBM).
Os resultados da CIM e CBM dos venenos variaram de 6,25 a >400 μg/mL frente agentes etiológicos da cárie dentária, encontrando resultados promissores para os venenos B. jararaca; B. diporus (Paraguai) e B. marajoensis frente S. mutans e S. sanguinis com a CIM variando entre 6,25 a 100 μg/mL. S. mitis, S. sobrinus e S. salivarius a CIM foi de 200 a 400 μg/mL. Para demais bactérias o resultado foi considerado inativo, ou seja, CIM superior a 400 μg/mL. A CIM e CBM da Clorexidina usada como controle positivo variou de 0,92 a 7,37 μg/mL frente agentes etiológicos da cárie dentária, conforme demonstrado na Tabela 1. Nos consideramos valores da CIM superior a 400 μg/mL, pois corresponde à ausência de atividade antibacteriana e maior concentração testada neste estudo. Em relação aos ensaios antibacterianos de extratos de fontes naturais, alguns autores (RIOS; RECIO, 2005) estabeleceram critérios de valor da CIM para determinação do seu potencial antibacteriano. Esses autores sugeriram que os valores da CIM inferior ou igual 100 μg/mL são considerados promissores nas pesquisas de novos agentes antimicrobiano, parâmetro utilizado no presente estudo para determinar se os venenos de cobras de espécies Bothrops spp. foram promissores ou não.
Tabela 1. Concentração Inibitória Mínima (CIM) e Concentração Bactericida Mínima (CBM) dos extratos brutos dos venenos de cobras de espécies Bothrops spp. frente agentes etiológicos da cárie dentária. Bactérias B. jararaca μg/mL B. diporus (Paraguai) μg/mL B. marajoensis μg/mL Clorexidina μg/mL
CIM / CBM CIM / CBM CIM / CBM CIM / CBM S. mutans (ATCC 25175) 100 / 100 25 / 50 100 / 100 0,92 / 0,92 S. mitis (ATCC 49456) 400 / 400 400 / 400 400 / 400 3,68 / 3,68 S. sobrinus (ATCC 33478) 400 / 400 400 / 400 400 / 400 0,92 / 0,92 S. sanguinis (ATCC 10556) 25 / 25 6,25 / 6,25 50 / 50 3,68 / 3,68 S. salivarius (ATCC 25975) 400 / 400 400 / >400 400 / >400 0,92 / 0,92 E. faecalis (ATCC 4082) >400 / >400 >400 / >400 >400 / >400 7,37 / 7,37 L. casei (11578) >400 / >400 >400 / >400 >400 / >400 3,68 / 3,68 FONTES CONSULTADAS
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