An official publication of the Brazilian Society of Periodontology ISSN-0103-9393
PREVALÊNCIA MICROBIANA E qUANTIFICAÇÃO DA
ARGINASE NA SAÚDE E DOENÇA PERIODONTAL
Microbial prevalence and arginase quantification in health and periodontal disease
Alexandre Lustosa Pereira1, Sheila Cavalca Cortelli2, Davi Romero Aquino2, Gilson César Nobre Franco2, Karina Cogo Miller2,
Edson Rodrigues3, Marinella Holzhausen4, José Roberto Cortelli2
1 MSc, Pesquisador Assistente – Departamento de Periodontia, Universidade de Taubaté, Taubaté, SP, Brasil 2 PhD, Professor Adjunto - Departamento de Periodontia, Universidade de Taubaté, Taubaté, SP, Brasil 3 PhD, Professor Adjunto - Departamento de Biologia, Universidade de Taubaté, Taubaté, SP, Brasil
4 PhD, Professor Adjunto – Divisão de Periodontia, Departamento de Estomatologia, Faculdade de Odontologia, Universidade de São Paulo, São Paulo, SP, Brasil
Recebimento: 03/05/11 - Correção: 09/06/11 - Aceite: 01/07/11
RESUMO
A arginase salivar está aumentada em processos inflamatórios e infecciosos da cavidade bucal. O objetivo do presente estudo foi avaliar a atividade de arginase salivar, correlacionando-a a parâmetros clínicos e microbiológicos em diferentes condições periodontais. Foram avaliados os seguintes parâmetros clínicos: índice de placa, índice de sangramento, profundidade de sondagem e nível de inserção clínica. Foi avaliada ainda a presença dos periodontopatógenos Campylobacter rectus, Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis, Tanerella forsythia, Treponema denticola e Prevotella intermedia por meio da reação em cadeia da polimerase (PCR). Finalmente, a presença salivar de arginase — por meio de espectrofotometria —também foi considerada. O tratamento estatístico dos dados foi realizado pelos testes Qui-quadrado e Kruskal-Wallis, adotando-se significância estatística quando p<0,05. Foram alocados no presente estudo 78 indivíduos assim caracterizados: 26 periodontalmente saudáveis (S), 26 com gengivite (G) e 26 com periodontite crônica (P). P. gingivalis, P. intermedia e T. denticola estavam mais prevalentes significativamente em P do que em G e S (p<0,05). A. actinomycetemcomitans foi significativamente mais prevalente (p<0,05) em P e G do que em S. C. rectus apresentou distribuição similar nos três grupos (p>0,05). Com relação aos níveis de atividade de arginase, os indivíduos portadores de periodontite crônica apresentaram maiores níveis (p<0,05) em comparação aos com gengivite ou periodontalmente saudáveis. A expressão da arginase salivar parece acompanhar a mudança dos sinais clínicos e a alteração do perfil microbiológico das diferentes condições periodontais.
UNITERMOS: Periodontite; Gengivite; Arginase; Bactéria. R Periodontia 2011; 21:74-80.
INTRODUÇÃO
A doença periodontal é uma das enfermidades mais comuns da cavidade bucal. Sua natureza é infecciosa, essencialmente provocada por micro-organismos específicos que induzem inicialmente a uma inflamação gengival (gengivite), caracterizada clinicamente pela presença de sangramento à sondagem e ausência de perda de inserção (Löe et al, 1965). A gengivite pode evoluir para uma periodontite dependendo da interação entre fatores microbianos e resposta do hospedeiro. A periodontite, por sua vez, caracteriza-se clinicamente por um aprofundamento patológico do sulco gengival, perda de inserção clínica e
destruição do osso alveolar de suporte. Esta progressão pode ocorrer de forma contínua ou por surtos episódicos de atividade (Jeffcoat & Reddy, 1991; Löe et al., 1986).
Recentemente, um dos grandes enfoques da periodontia têm sido os aspectos preventivos. A prevenção é buscada tanto na perspectiva clínica — tentando estabelecer métodos adequados de controle de biofilme, impedindo, assim, a progressão da doença — quanto na perspectiva diagnóstica, buscando ferramentas precoces e eficientes de determinação da condição periodontal. (Kirkwood et al., 2007). Podemos inferir, portanto, que o diagnóstico e o tratamento precoce da doença periodontal pode prevenir a destruição dos tecidos de suporte dos dentes, além de evitar
complicações sistêmicas do paciente como diabetes, infarto do miocárdio, acidente vascular cerebral, parto prematuro e outras (Ortiz et al., 2009; Tarannum & Faizuddin, 2007; Kiran et al., 2005; Offenbacher et al., 2009; Beck et al., 1996, Kinane & Bouchard, 2008; Grossi & Genco, 1998; Offenbacher et al., 1998).
Métodos clínicos (Löe et al., 1965; Papapanou & Lindhe, 2005; Ainamo & Bay, 1975) e laboratoriais (Armitage, 2004; Gheren et al., 2007) têm sido buscados para estabelecer o mais precocemente possível o diagnóstico das doenças periodontais, bem como o risco de determinados pacientes desenvolverem essas doenças, evitando-se, assim, suas sequelas. Estes métodos também podem ser utilizados no monitoramento de pacientes tratados, avaliando a eficiência de determinados tratamentos (Armitage, 2004; Gheren et al., 2007).
A arginase é uma enzima chave no ciclo da ureia que tem como função essencial eliminar a amônia, que é tóxica ao organismo. Ela atua sobre a arginina produzindo ureia e ornitina. Outra enzima, óxido nítrico sintetase, compete pelo mesmo substrato, a arginina, para produzir óxido nítrico.
São encontradas duas isoformas de arginase: arginase tipo I e arginase tipo II. A do tipo I é sintetizada exclusivamente no citosol de células hepáticas ou da glândula salivar submandibular sob condições normais e catalisa a última etapa da síntese da uréia. A do tipo II é expressa na matriz mitocondrial de tecidos do intestino delgado e rim (Mori, 2007).
A arginase desempenha um importante papel na resposta imune do organismo, bem como na cicatrização de tecidos. Jacobsen et al. (2007) demonstraram que ela é liberada a partir dos grânulos de neutrófilos ativados em áreas com infecção para modular a resposta imune e promover regeneração tecidual. King et al. (2004) demonstraram o papel da arginase como marcador da resposta alérgica respiratória além de evidenciar seu envolvimento em múltiplos aspectos de várias doenças.
Nos tecidos periodontais, a arginase é produzida por macrófagos ativados (Salimuddin et al., 1999), podendo essa produção ser estimulada pela presença de bactérias periodontopatogênicas (Uematsu et al., 2006; Sosroseno et al., 2006). Pode ser parte de um mecanismo natural de defesa não-específico contra bactérias patogênicas ou, alternativamente, pode contribuir para a destruição tecidual na periodontite — em quantidade excessiva — (Ugar-Çankal & Özmeriç, 2006). Desta forma, a arginase tem um importante papel na doença periodontal, pois o aumento de sua atividade causa uma diminuição na síntese de óxido nítrico (NO), o que diminui as propriedades antibacterianas
da saliva e torna os tecidos periodontais mais suscetíveis aos periodontopatógenos (Özmeriç et al., 2000).
Gheren et al. (2007) realizaram um estudo prospectivo em que avaliaram os níveis de arginase salivar em 18 pacientes-teste com periodontite (antes do tratamento e trinta dias depois) comparando-os a um grupo de 18 pacientes-controle saudáveis. O estudo concluiu que a arginase encontra-se em níveis mais elevados na saliva de indivíduos com periodontite em relação aos indivíduos saudáveis, e que o tratamento periodontal básico reduz significativamente os seus níveis salivares, assim como os níveis clínicos da doença.
Como evidenciado por Ramseier et al. (2009), a combinação da avaliação de biomarcadores salivares e periodontopatógenos aumentaria a possibilidade de uma correta categorização da doença periodontal e, portanto, um diagnóstico mais acurado.
Portanto, o objetivo do presente estudo do tipo transversal foi avaliar a prevalência de periodontopatógenos e a atividade de arginase salivar em indivíduos de diferentes condições clínicas periodontais.
MATERIAL E MÉTODOS
No presente estudo, foram incluídos 78 indivíduos, distribuídos em três grupos, a saber: 26 periodontalmente saudáveis (S); 26 portadores de gengivite (G) e 26 portadores de periodontite crônica (P). Para o estabelecimento do número de indivíduos a serem incluídos no presente estudo, foi realizado um calculo amostral adotado nível de significância estatística de 95% e power de 80%.
Para compor o grupo gengivite o indivíduo deveria apresentar todos os sítios com profundidade de sondagem menor do que 4 mm, ausência de perda de inserção clínica e presença de vermelhidão gengival associado a sangramento à sondagem em mais de 25% dos sítios (López et al., 2002).
Já no grupo periodontite, os indivíduos deveriam ter a presença de quatro ou mais dentes com um ou mais sítios com profundidade de sondagem maior ou igual a 4mm e perda de inserção clínica maior ou igual a 3mm em dentes não contíguos(López et al., 2002).
Finalmente, foram considerados saudáveis aqueles indivíduos que não apresentaram profundidade de sondagem e perda de inserção clínica maior ou igual a 4 mm e com índice gengival inferior a 25% .
Foram excluídos do estudo indivíduos que fizessem uso de antibióticos ou anti-inflamatórios (esteroides ou não) nos seis meses antecedentes ao início do estudo. Também ficaram de fora aqueles que apresentavam doenças sistêmicas que poderiam influenciar o comportamento da doença
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periodontal; fumantes ou ex-fumantes; e os que tivessem sido submetidos a tratamento periodontal seis meses antecedentes ao início do estudo.
Este estudo foi previamente aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade de Taubaté (Protocolo CEP/ UNITAU nº 386/08).
A profundidade de sondagem e o nível de inserção clínica foram medidos em seis sítios por dente (mésio-vestibular, médio-vestibular, disto-vestibular, mésio-lingual, médio-lingual e disto-lingual). Os índices de placa e gengival foram realizados segundo o critério de Ainamo & Bay (1975) e medidos em quatro sítios por dente (mésio-vestibular, médio-vestibular, disto-vestibular e lingual).
A análise microbiológica foi realizada por meio de reação em cadeia da polimerase (PCR) com primers específicos para Campylobacter rectus, Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Prevotella inter media, Porphyromonas gingivalis, Tanerella forsythia e Treponema denticola (quadro 1) segundo os critérios estabelecidos por Cortelli et al, 2008. Para tanto, amostras microbianas foram coletadas com cones de papel previamente esterilizados inseridos na base da bolsa/sulco periodontal. Nos indivíduos saudáveis e com gengivite, a coleta foi realizada na face mesio-vestibular dos primeiros molares superiores, um incisivo central superior e um incisivo central inferior; na ausência destes, a coleta foi realizada nos dentes imediatamente adjacentes. Para os portadores de periodontite crônica, foram coletadas amostras dos sítios com maior profundidade de sondagem — um de cada hemi-arco.
Após a remoção do biofilme supragengival com uma gaze, os sítios foram isolados com rolos de algodão estéreis e um sugador de saliva foi utilizado para diminuir o risco de contaminação salivar. Os dentes foram então secos com jato
de ar por dez segundos. Os cones foram introduzidos na base do sulco gengival / bolsa periodontal onde permaneceram durante 60 segundos (Cortelli et al., 2005) sendo em seguida, colocados em microtubos do tipo eppendorf. Estes microtubos ficaram armazenados em freezer a -80ºC até o processamento das amostras.
A coleta de saliva foi realizada de forma estimulada — sempre entre oito e 11h da manhã, em função do ciclo circadiano — solicitando-se ao indivíduo que mastigasse um pequeno pedaço de garrote estéril, sendo coletado 1 mL de saliva.O indivíduo não deveria ter ingerido nenhum líquido ou alimento sólido 1 hora antes da coleta. Após a coleta, as amostras foram centrifugadas a 4ºC em 10.000 rpm por dez minutos. Em seguida, o sobrenadante foi capturado e armazenado em freezer a -80ºC e, posteriormente, processado para análise bioquímica.
O teste de atividade da arginase foi realizado por meio de teste colorimétrico que mediu a L-ornitina formada pela hidrólise da L-arginina, de acordo com o protocolo estabelecido por Iyamu et al. (2008). A análise estatística foi realizada utilizando-se os softwares Bio Estat 5.0 e SPSS 13.0, sempre com nível de significância estatística de 95% (α=0,05). Foram utilizados os testes estatísticos Qui-quadrado e Kruskal-Wallis.
RESULTADOS
Foram incluídos no presente estudo 78 indivíduos, alocados em três grupos: 26 no grupo saudável (S); 26 no grupo gengivite (G); e 26 no grupo periodontite crônica (P). A caracterização da população estudada de acordo com o gênero e diagnóstico periodontal encontra-se expressa na tabela 2 e a distribuição dos parâmetros clínicos periodontais avaliados na tabela 3.
PrimErS ESPEcíficoS uSadoS Para a dEtEcção BactEriana Por Pcr
Bactéria Sequência de nucleotídeos 5´- 3´ Tamanho
C. rectus TTTCGGAGCGTAAACTCCTTTTCTTTCTGCAAGCAGACACTCTT 598 pb
A. actinomycetemcomitans AAACCCATCTCTGAGTTCTTCTTCATGCCAACTTGACGTTAAAT 550 pb
P. gingivalis AGGCAGCTTGCCATACTGCGACTGTTAGCAACTACCGATGT 404 pb
P. intermedia TTTGTTGGGGAGTAAAGCGGGTCAACATCTCTGTATCCTGCGT 575 pb
T. forsythia TGCTTCAGTGTCAGTTATACCTGCGTATGTAACCTGCCCGCA 641 pb
T. denticola TCAAAGAAGCATTCCCTCTTCTTCTTATAATACCGAATGTGCTCATTTACAT 316 pb tabela 1
diStriBuição da PoPulação EStudada dE acordo com o gênEro E diagnóStico PEriodontal Condição periodontal Total S G P Masculino 10 8 8 26 Feminino 16 18 18 52 Total (MI±DP) 26 (25,06±5,97) 26 (33,22±12,09) 26 (52,92±11,66) 78 (37,82±15,48) MI – Média de Idade em anos; DP – Desvio Padrão; S – Saudável; G – Gengivite; P – Periodontite
diStriBuição doS ParâmEtroS clínicoS avaliadoS dE acordo com o diagnóStico PEriodontal
Grupo IP (%) IG (%) PS (mm) NIC (mm)
Média±DP Média±DP Média±DP Média±DP
S ±22,1041,11 ±11,4119,13 ±0,391,05 ±0,460,79
G ±19,6871,26 ±22,9972,03 ±0,491,66 ±0,361,42
P ±17,3577,85 ±18,5375,04 ±0,473,03 ±1,012,37
S – Saudável; G – Gengivite; P – Periodontite; IP – Índice de Placa; IG – Índice Gengival; PS – Profundidade de sondagem; NIC – Nível de inserção clínica.
A comparação das frequências de cada espécie bacteriana entre os grupos evidenciou que C. rectus estava com distribuição similar nos três grupos (p>0,05). P. gingivalis, P. intermedia e T. denticola mostraram-se singificativamente mais prevalentes no grupo indivíduos com periodontite crônica em relação aos com Gengivite e periodontalmente saudáveis (p<0,05). A. actinomycetemcomitans apresentou-se mais prevalente nos grupos periodontite crônica e gengivite comparado aos Saudáveis (p<0,05). Já T. forsythia esteve mais prevalente no grupo periodontite crônica comparado a Gengivite e Saudáveis (p<0,05) (Figura 1).
Com relação aos níveis de atividade de arginase, os indivíduos portadores de periodontite crônica apresentaram maiores níveis (p<0,05) em comparação aos com gengivite ou periodontalmente saudáveis (Figura 2).
tabela 2
tabela 3
Figura 1 – Prevalência(%) de bactérias inter-grupos S – Saudável; G – Gengivite; P –
Periodontite; Cr – C. rectus; Aa – A. actinomycetemcomitans; Pg – P. gingivalis; Pi – P. intermedia; Tf – T. forsythia; Td – T. denticola; teste estatístico: Qui-quadrado
Figura 2 – Níveis de arginase salivar (mUI/mL) inter-grupo S – Controle; G – Gengivite; P –
Periodontite teste estatístico: Kruskal-Wallis
DISCUSSÃO
Conforme já descrito, a arginase está envolvida no mecanismo de várias doenças, especialmente com as de natureza inflamatória (Ugar-Çankal & Ozmeric, 2006). Quando avaliamos seus níveis em indivíduos com periodontite, observamos valores estatisticamente superiores aos observados em portadores de gengivite ou saudáveis.
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Observação semelhante também relatada por Ozmeric et al. em 2000. Estes autores, ao compararem a arginase salivar de indivíduos saudáveis com a de indivíduos com periodontite, verificaram que os níveis se apresentavam superiores nos portadores de periodontite. Uma possível explicação para este fato é que a arginase é, em parte, sintetizada por macrófagos ativados nos tecidos periodontais (Salimuddin et al., 1999), sendo que esta produção pode ser estimulada pela presença de bactérias periodontopatogênicas (Uematsu et al., 2006; Sosroseno, et al., 2006). Como observado no presente estudo, o grupo gengivite apresentou menor frequência de bactérias periodontopatogênicas e os macrófagos são células mais características da periodontite. Dessa forma, tal fenômeno pode ter determinado uma menor quantidade de arginase salivar e, consequentemente, uma diferença intergrupo.
Ao confrontarmos parâmetros microbianos e clínicos no presente estudo, observamos, no grupo saudável, a presença significativa de C. rectus (96,7%) que não diferiu significativamente dos grupos gengivite e periodontite crônica. Este achado está em concordância com os resultados de van Winkelhoff et al. (2002) e de Tavares et al. (2007). Hayashi et al. (2006) avaliaram, por meio de PCR, a distribuição de C. rectus e T. forsythia em vários sítios periodontais de crianças de quatro a seis anos de idade e constataram que C. rectus era um microrganismo mais prevalente, com 95% de probabilidade de detecção com coleta em apenas dois sítios periodontais; por outro lado, T. forsythia precisara de coletas em sete ou mais sítios para ser detectada com essa mesma possibilidade. Além disso, Könönen et al. (2007) avaliaram, por meio de PCR, a presença de alguns periodontopatógenos na saliva de indivíduos adultos e concluíram que espécies distintas apresentavam diferentes perfis de distribuição, dependendo de variáveis como idade, nível educacional e condição periodontal. Desta forma, podemos observar que fatores inerentes à distribuição microbiana podem justificar em parte os resultados encontrados no presente estudo.
Quanto à prevalência de microrganismos no grupo Gengivite, os resultados do presente estudo concordam com os de Tavares et al. (2007) em que foi observada uma alta prevalência de C. rectus (96,5%) e uma diferença estatisticamente significativa (p<0,05) de T. forsythia em relação ao grupo saudável. Esses dados sugerem que um aumento da prevalência de T. forsythia possivelmente implique numa transição de saúde para gengivite e, posteriormente, de gengivite para periodontite. Tanner et al. (2007) afirmaram que tal patógeno — comumente detectada em sítios com periodontite crônica avançada — pode ser encontrado em pacientes com periodontite incipiente que exibem atividade de doença, demonstrando a relação dessa bactéria com a
evolução da doença periodontal.
No grupo Periodontite crônica, evidenciou-se uma maior prevalência (p<0,05) para A. actinomycetemcomitans, P. gingivalis, P. intermedia, T. forsythia e T. denticola em relação ao grupo saudável. Tais evidências estão em concordância com outros estudos (Tanner et al., 2007; Cortelli et al., 2005; Brennan et al., 2007; Guan et al., 2008; Tanabe et al., 2008; Mineoka et al., 2008; Imbronito et al., 2008; Hamlet et al., 2008; Tavares et al., 2007). A baixa prevalência de A. actinomycetemcomitans deve-se ao fato deste micro-organismo estar mais especificamente envolvido na periodontite agressiva e este perfil de paciente não fez parte do presente estudo.
É interessante notar que C. rectus não apresentou diferenças intergrupo. Este dado está de acordo com os estudos de Van Winkelhoff et al. (2002), Tavares et al. (2007), Cortelli et al. (2005) e Cortelli et al. (2008). Miyamoto et al. (2009), que demonstraram que este microrganismo estava relacionado a pelo menos uma das bactérias do complexo vermelho (P. gingivalis, T. denticola e T. forsythia). É provável, portanto, que esse micro-organismo seja um precursor para outras bactérias periodontopatogênicas em pacientes com maior susceptibilidade à doença.
Riep et al. (2009)sugeriram em seu estudo que a associação de bactérias específicas com estado de saúde ou de doença periodontal requer futuras avaliações. Eles cogitaram que algumas bactérias frequentemente associadas a periodontite estariam mais associadas à evolução da doença periodontal, por meio do aumento da profundidade de sondagem, do que propriamente a um diagnóstico específico. Curiosamente, Ramseier et al. (2009) afirmaram que uma combinação entre a avaliação de biomarcadores salivares e periodontopatógenos aumentaria a possibilidade de uma correta categorização da doença periodontal. Dessa forma, demonstrou-se, por meio da associação de três parâmetros — clínicos, microbiológicos e salivares — um diagnóstico mais adequado dos indivíduos.
Portanto, pelo fato de a doença periodontal ser de natureza multifatorial, parece haver necessidade de se avaliar de maneira adequada os fatores envolvidos em sua patogênese. Isso não só traz uma clareza maior para o diagnóstico, como também permite uma melhor abordagem terapêutica e também uma melhor avaliação dos resultados da terapia, facilitando assim o monitoramento dos indivíduos tratados.
Com base nos resultados deste estudo transversal, podemos concluir que a expressão da arginase salivar parece acompanhar a mudança dos sinais clínicos e a alteração do perfil microbiológico das diferentes condições periodontais.
ABSTRACT
The salivary arginase is increased in inflammatory and infectious processes of the oral cavity. The aim of this study was to evaluate the salivary arginase activity, correlating it to clinical and microbiological parameters in different periodontal conditions. We evaluated the following parameters: plaque index, bleeding index, probing depth and clinical attachment level. It also assessed the presence of periodontopathogens Campylobacter rectus, Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis, Tanerella forsythia, Treponema denticola, and Prevotella intermedia by polymerase chain reaction (PCR). Finally, presence of salivary arginase - by spectrophotometry - was also considered. Statistical treatment of data was performed by chi-square
and Kruskal-Wallis, adopting statistical significance at p <0.05. Eighty-nine individuals were allocated in this study: 26 periodontally healthy (S), 26 with gingivitis (G) and 26 with chronic periodontitis (P). P. gingivalis, P. intermedia and T. denticola were significantly more prevalent in P-group than G- and S-group (p <0.05). A. actinomycetemcomitans was significantly more prevalent (p <0.05) in P- and G-group than in S-group. C. rectus showed a similar distribution in the three groups (p> 0.05). With respect to the levels of arginase activity, individuals with chronic periodontitis had higher levels (p <0.05) than those with gingivitis or periodontally healthy. Expression of the salivary arginase seems to follow the changes of clinical signs and microbiological profile in different periodontal conditions.
UNITERMS: Periodontitis; Gingivitis; Arginase; Bacteria.
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