ATIVIDADE INIBITÓRIA DE TRIPSINA EM PRODUTOS DERIVADOS DE SOJA (Glycine max) CONSUMIDOS NO BRASIL 1

ATIVIDADE INIBITÓRIA DE TRIPSINA EM

PRODUTOS DERIVADOS DE SOJA (Glycine max)

CONSUMIDOS NO BRASIL

Maria Inés GENOVESE

, Franco M. LAJOLO

RESUMO

O trabalho teve como objetivos determinar a atividade inibitória de tripsina em produtos

comerciais de soja consumidos pela população, tais como bebidas à base de extrato de soja, e fómulas não-lácteas à base de proteína isolada de soja, para os intolerantes ao leite. Os resultados mostraram que, excetuando-se os produtos à base de extrato de soja, os demais apresentam valores baixos de

atividade inibitória de tripsina, em torno de 5% do valor encontrado para a farinha desengordurada. Além disso, através de eletroforese em gel de poliacrilamida com revelação para inibidores de tripsina, demonstrou-se que em alguns casos a

inibição observada através do método colorimétrico de KAKADE, SIMONS & LIENER [8] se deve provavelmente à inibição não específica provocada por outros componentes da amostra.

Palavras-chave: soja, produtos comerciais,

SUMMARY

TRYPSIN INHIBITORY ACTIVITY OF SOY (Glycine max) PRODUCTS CONSUMED IN BRAZIL. The objective of this work was to determine trypsin inhibitory activity of soy

products consumed by the general population, such as soy extract based beverages, and by special

groups, such as new-born infant formulas, destined to milk sensitive children. Results showed that, excepting those products containing soy extracts, the other soy based products studied had a very low trypsin inhibitory activity, approximately 5% of the amount existing in defatted soy meal. Moreover, by means of polyacrylamide gel electrophoresis

followed by trypsin inhibitor activity staining, it was demonstrated that in some cases the inhibition observed, using the colorimetric method of

KAKADE, SIMONS & LIENER [8], was due to non-specific inhibition caused by other components present in the samples.

Keywords: soy, commercial products, trypsin

inhibitors.

1 — INTRODUÇÃO

Os inibidores de proteases presentes na soja provocam inibição do crescimento e hipertrofia e hiperplasia pancreáticas. A inibição da proteólise intestinal resulta em aumento de secreção das enzimas digestivas tripsina, quimotripsina e elastase, as quais são

eliminadas nas fezes, representando uma perda endógena

importante de aminoácidos sulfurados [10]. O fato das proteínas de leguminosas serem deficientes nestes aminoácidos aumenta o impacto nutricional dos inibidores. No entanto, efeitos fisiológicos positivos, tais como supressão de carcinogênese, também foram associados à presença de produtos de soja na dieta, sendo os inibidores de proteases do tipo Bowman -Birk os principais

implicados [9]. O consumo de pratos à base de soja pela população brasileira não é significativo se comparado ao do feijão. Por outro lado, a funcionalidade de suas proteínas faz com que seus

derivados sejam utilizados como ingredientes em diversos produtos, tais como molhos, sopas e produtos cárneos

industrializados. Indivíduos com dietas diferenciadas, tais como os vegetarianos e os indivíduos intolerantes à lactose e/ou alérgicos às proteínas do leite, consomem quantidade significativa de

derivados de soja. Em geral, os produtos comerciais de soja

recebem tratamento térmico de forma a apresentarem menos de 20 % da atividade inibitória de tripsina da soja crua [10]. Dessa

forma, torna-se necessário quantificar as atividades residuais nesses produtos, de modo a permitir uma avaliação dos efeitos fisiológicos que poderiam estar sendo exercidos. Para isso é necessário também que a técnica utilizada tenha sensibilidade suficiente para a determinação de teores residuais.

2 — OBJETIVOS

Este trabalho teve como objetivos determinar a atividade inibitória de tripsina de produtos derivados de soja consumidos pela

população em geral, tais como bebidas à base de extrato de soja, e a de produtos para fins especiais, tais como os substitutos de leite de vaca à base de proteína isolada de soja, destinados a pessoas com intolerância à lactose e/ou alérgicas às proteínas do leite.

Objetivou-se também avaliar a confiabilidade da metodologia para baixos teores.

3 — MATERIAIS E MÉTODOS

As amostras de produtos à base de soja analisadas foram

adquiridas no comércio local e são relacionadas a seguir: Bebidas à base de extrato de soja - Mupy sabor maracujá (Agro Nippo Prod. Alim. Ltda.); Tonyu (Yakult S/A Ind. e Com.); Bebida contendo proteína isolada de soja Boom sabor morango (Bretzke Alimentos Ltda.); Leite em pó integral com proteínas da soja

Bônus (Nestlé Industrial e Comercial Ltda.); Proteína de soja

texturizada Mais Vida (Yoki Alimentos S/A); Fórmulas não lácteas à base de proteína isolada de soja (isentas de lactose)

Nursoy (Laboratórios Wyeth-Whitehall Ltda.); Prosobee e Sobee

(Bristol-Myers Squibb Brasil S/A); Isomil (Abbott Laboratórios do Brasil Ltda.); Alsoy (Nestlé Ind. e Com. Ltda.); Suplemento

alimentar Ensure sabor baunilha (Abbott Laboratórios do Brasil Ltda.). A farinha desengordurada e o isolado protéico de soja foram preparados de acordo com Genovese & Lajolo [5], a partir de soja adquirida no comércio local. Todos os reagentes utilizados foram de grau analítico. Tripsina, EC 3.4.21.4 (T-8253, 12.700 unidades/mg proteína), N-acetil-DL-fenilalanina-β-naftilester (A 7512) e BAPA (Nα-benzoil-DL-arginina-p-nitroanilida, B-4875) foram obtidos da Sigma Chemical Co.

3.2 – Métodos

3.2.1 - Extração dos inibidores de tripsina

A extração dos inibidores de tripsina foi feita agitando-se, durante 3 horas à temperatura ambiente, um grama da amostra em 50 ml de hidróxido de sódio 0,01 N, como recomendado por KAKADE

et al. [7]. A suspensão foi então centrifugada (30.000 g/30 min, 4

ºC) e o sobrenadante utilizado para revelação dos inibidores por eletroforese e determinação da atividade inibitória de tripsina. O sobrenadante teve seu teor protéico determinado pelo método de Lowry et al. [11], usando-se albumina de soro bovino como padrão.

A eletroforese em condições nativas foi realizada de acordo com o método de DAVIS [3], em gel de poliacrilamida.

3.2.3 - Revelação dos inibidores de tripsina

A revelação dos inibidores de tripsina nos géis de eletroforese foi feita de acordo com Uriel & Berges [14]. Após a corrida, a placa foi incubada com solução de tripsina (5 mg/100 ml de tampão fosfato 0,05 M, pH 7,4), durante 20 minutos. A seguir, esta foi lavada três vezes com água destilada. Adicionou-se à placa

solução contendo 4,7 mg de N-acetil-DL-fenilalanina-β-naftilester dissolvidos em 2 ml de dimetilformamida, misturados, na hora do uso, a 18 ml de tampão fosfato 0,05 M pH 7,4 contendo 20 mg de

o-dianisidina-tetrazotizada. Após 30 min a placa foi lavada com

água destilada e escaneada com densitômetro GS 700 da Bio-Rad (Molecular Analyst Software).

3.2.4 - Atividade inibitória de tripsina

A atividade inibitória de tripsina foi determinada de acordo com KAKADE, SIMONS & LIENER [8], com algumas modificações, usando-se benzoil-DL-arginina-p-nitroanilida (BAPA) como

substrato: 0,2 a 1,0 ml dos extratos protéicos foram pipetados, em triplicata, e o volume final ajustado para 1,0 ml com tampão Tris 50 mM, pH 8,2, contendo CaCl₂ 20 mM. A cada tubo,

previamente acondicionado em banho-maria a 37 oC, adicionaram-se 1,0 ml da solução de tripsina (0,05 mg/ml de HCl 0,001 N) e, após 5 min., 7,0 ml de BAPA (0,3 mg/ml de tampão Tris 50 mM, pH 8,2, contendo CaCl₂ 20 mM), previamente aquecido a 37 oC. A reação foi interrompida após 10 min pela adição de 1,0 ml de ácido acético 30 % e a absorbância lida a 410 nm, contra os brancos aos quais adicionou-se o ácido acético antes do BAPA. Uma unidade de tripsina (UT) foi definida arbitrariamente como o aumento de 0,01 unidades de absorbância a 410 nm por 10 ml do meio de reação. Os resultados foram expressos como unidades inibitórias de tripsina (UIT) por g de proteína, sendo uma unidade inibitória responsável pela inibição de uma unidade de tripsina.

3.2.5 - Determinação do conteúdo protéico

As amostras tiveram o conteúdo protéico determinado através do método de Kjeldahl [1].

4 — RESULTADOS E DISCUSSÃO

Os resultados mostram que os produtos comerciais contendo proteína isolada de soja (pó para bebida "Boom" e leite "Bônus") apresentam baixa atividade inibitória de tripsina, o que parece estar de acordo com o reduzido conteúdo de inibidores do isolado protéico (Tabela 1). O pó para bebida "Boom" e o leite em pó "Bônus" apresentaram, respectivamente, 4,0 e 2,1 % da atividade inibitória (UIT/g proteína) da farinha desengordurada, e o isolado protéico de soja 5,0 %. Esse resultado era esperado já que no processo de obtenção dos isolados protéicos de soja os inibidores se concentram na fração solúvel que é descartada, após

precipitação ácida das proteínas do extrato bruto [6].

TABELA 1. Atividade inibitória de tripsina de produtos contendo derivados de soja.

Nome Comercial UIT/g

amostra

UIT/g proteína

Bebida contendo proteína isolada de soja

BOOM (pó) 494 ± 15 3.190 ± 99

Bebidas à base de extrato de soja

TONYU 152 ± 3 14.426 ± 275

MUPY 217 ± 9 23.556 ±

1.011

Leite em pó contendo proteína de soja

Produtos de soja FARINHA DESENGORDURADA 41.034 ± 854 78.911 ± 1.641 ISOLADO PROTÉICO 3.638 ± 360 3.955 ± 391 PROTEÍNA TEXTURIZADA(Mais Vida) 1.685 ± 137 3.240 ± 263

UIT. Unidades inibitórias de tripsina.

Por outro lado, as bebidas à base de extrato de soja apresentaram uma atividade inibitória de tripsina bastante elevada, o que poderia ser devido ao alto conteúdo de inibidores nos extratos brutos e ao tratamento térmico insuficiente para sua inativação. A bebida "Mupy" apresentou cerca de 30 % da atividade inibitória de tripsina (UIT/g proteína) da farinha desengordurada de soja, e a bebida "Tonyu" valor equivalente a 18,3 % (Tabela 1). Já a

proteína texturizada de soja, produto bastante utilizado nas dietas vegetarianas como substituto da carne, apresentou apenas 4,1 % da atividade inibitória da farinha, similar ao observado para o isolado. Esse produto é obtido através da extrusão termoplástica da farinha desengordurada, processo que utiliza altas temperaturas e

pressões, e que resulta portanto em uma redução significativa da atividade inibitória de tripsina.

Os resultados obtidos tanto para a farinha desengordurada como para o isolado protéico e a proteína texturizada de soja estão de acordo com os encontrados na literatura [10].

As atividades inibitórias de tripsina das fórmulas não-lácteas à base de proteína isolada de soja são apresentadas na Tabela 2. Como se pode observar, todos os produtos analisados

apresentaram valores baixos de atividade inibitória de tripsina, entre 2,5 e 6,2 % do valor encontrado para a farinha

atividade inibitória de tripsina do isolado protéico de soja (Tabela

1).

TABELA 2. Atividade inibitória de tripsina de fórmulas não-lácteas à base de proteína isolada de soja.

Nome Comercial UIT/g amostra UIT/g proteína

NURSOY 564 ± 28 4.027 ± 197

PROSOBEE 696 ± 42 4.462 ± 268

ISOMIL 542 ± 16 3.954 ± 119

SOBEE 684 ± 20 4.887 ± 146

ALSOY 277 ± 26 1.979 ± 185

UIT. Unidades inibitórias de tripsina.

Os extratos obtidos a partir desses produtos foram submetidos a eletroforese em condições não-dissociantes e revelação para inibidores de tripsina (Figura 1). Nesta técnica, após a corrida eletroforética, o gel de poliacrilamida é imerso em solução de tripsina, o que faz com que esta se adsorva ao gel. A seguir, adiciona-se um substrato sintético para a tripsina. Este substrato, ao ser hidrolisado pela tripsina, forma um composto colorido. Nas regiões correspondentes às bandas do inibidor de tripsina isto não ocorre, e as bandas se mostram translúcidas contra um fundo rosa. O método apresenta grande sensibilidade e foi escolhido para checar se os valores residuais de atividade inibitória encontrados através do método espectrofotométrico seriam de fato devidos à presença de inibidores ativos.

FIGURA 1. Eletroforese em gel de poliacrilamida dos extratos de produtos de soja comerciais, revelada para

inibidores de tripsina. Fórmulas não lácteas à base de proteína isolada de soja: 1. Nursoy (235 µg), 2. Prosobee (243 µg), 3. Alsoy (254 µg); Bebidas à base de derivados de soja: 4. Boom (360 µg), 5. Tonyu (127 µg), 6. Mupy (17,3 µg); 7. Leite em pó "Bônus" (302 µg), 8. Farinha desengordurada de soja (8

µg), 9. Proteína texturizada de soja "Mais vida" (78 µg), 10. Isolado protéico de soja (126 µg). Obs: Os números entre parênteses representam a quantidade total de proteína aplicada.

Os resultados mostram que, mesmo quando aplicadas quantidades elevadas de proteína no gel de eletroforese, não se observa

inibição de tripsina para as fórmulas não-lácteas à base de proteína isolada de soja. A "Alsoy", que através do método colorimétrico apresentou a menor atividade inibitória de tripsina entre as

fórmulas testadas (Tabela 2), foi a única que apresentou leve inibição de tripsina no gel (Fig. 1). Já os extratos obtidos a partir do isolado protéico e da proteína texturizada de soja, cuja

atividade inibitória de tripsina (UIT/g proteína) foi similar à das fórmulas não-lácteas, mostraram uma nítida inibição da tripsina no gel, mesmo para quantidades bem menores de proteína aplicada (Fig. 1). Em relação ao extrato obtido a partir da farinha

desengordurada de soja, a aplicação de quantidades de proteína equivalentes a 8 mg (ou menores) provocaram forte inibição da tripsina, o que está de acordo com a alta atividade inibitória desse

produto. A bebida em pó "Boom" e o leite em pó "Bônus" também demonstraram clara inibição da tripsina no gel de eletroforese, porém apenas para a aplicação de quantidades elevadas de proteína (Fig. 1). Esse resultado parece estar de acordo com a baixa atividade inibitória encontrada através do método

colorimétrico. Entre as bebidas à base de extrato de soja, uma forte inibição de tripsina foi observada tanto para o "Mupy" como para o "Tonyu", embora a quantidade de proteína aplicada tenha sido significativamente menor para o "Mupy". A diferença entre a atividade inibitória desses dois produtos encontrada através do método colorimétrico não foi tão acentuada, indicando que no caso do "Tonyu" estaria havendo inibição da tripsina por outros

componentes não-protéicos, provavelmente compostos fenólicos presentes no suco de maçã. Isso explicaria porque no gel, onde a inibição observada é devida apenas aos inibidores protéicos, a inibição não foi tão acentuada quanto a do "Mupy".

Esses resultados mostram uma inadequação do método

colorimétrico para valores baixos de inibição de tripsina. Essa observação já foi feita por SMITH et al. [13], que atribuíram o fato a uma maior disponibilidade de outras proteínas à ação da tripsina, resultado da utilização de extratos menos diluídos. Essas proteínas competiriam com o substrato sintético (BAPA) e

levariam a falsos valores de inibição. Segundo os autores, mesmo a caseína apresenta certa atividade inibitória de tripsina através do método colorimétrico, e além disso, ácidos graxos presentes

também podem inibir a tripsina. BELITZ & WEDER [2] ressaltam que o fitato presente na maioria dos produtos à base de soja

poderia complexar o cálcio presente no tampão utilizado no método. O cálcio é um cofator da tripsina, e a sua complexação diminuiria a atividade desta, simulando a ação dos inibidores. FERNÁNDEZ et al. [4] também demonstraram a interferência de compostos polifenólicos na determinação da atividade inibitória de tripsina de feijões.

utilização de um outro método que comprove realmente a presença de inibidores ativos, especialmente face a teores muito pequenos de atividade. ROOZEN & DE GROOT [12] sugeriram a

cromatografia de afinidade (tripsina-Sepharose 4B) para a purificação dos inibidores, porém ressaltaram a ocorrência de modificações destes inibidores pela ação da tripsina na coluna, com consequente perda de atividade. Neste trabalho, nós

demonstramos a utilidade da eletroforese em gel de poliacrilamida com revelação para inibidores de tripsina, como forma de

diferenciar inibidores protéicos de não-protéicos, e inibição

específica de não-específica causada por outras proteínas presentes nos extratos. O método é rápido, sensível e permite a análise de dez ou mais amostras simultaneamente, o que o torna interessante para aplicação no controle de qualidade das indústrias.

De acordo com nossos resultados, os únicos produtos com

atividade inibitória de tripsina significativa seriam aqueles à base de extrato de soja, especialmente a bebida "Mupy". A ingestão de uma embalagem deste produto (200 ml) representaria a ingestão de cerca de 43.000 unidades inibitórias de tripsina. A tripsina utilizada nas determinações apresentou 971,4 ± 39,2 unidades de tripsina por mg, determinada através do método colorimétrico. Dessa forma, os inibidores contidos em uma embalagem de "Mupy" seriam capazes de inibir 44,3 mg de tripsina. Segundo revisão feita por BELITZ & WEDER [2] a ingestão diária de inibidores de tripsina provenientes de diversas fontes na dieta (leite, carne, ovos, vegetais, etc.) inibiria, num cálculo

aproximado, cerca de 300 mg de tripsina bovina ou 186 mg de tripsina humana. Frente a estes valores, a atividade contida em uma embalagem de "Mupy" parece bastante elevada. No entanto, considerando-se que o homem produz em média 1,5 g tripsina/dia [2], isso representaria apenas cerca de 3 % do total. Para aumentar a exatidão deste cálculo seria necessário determinar a atividade específica da preparação de tripsina utilizada nas determinações. Todavia, mesmo que esta fosse 50 % maior, os valores de inibição

continuariam irrelevantes do ponto de vista de prejuízo nutricional.

Além disso, como essas atividades resultam tanto do inibidor do tipo Kunitz como do Bowman-Birk, e são determinadas contra a tripsina bovina, certas precauções devem ser tomadas quando se tenta extrapolar esses valores para prever seu efeito fisiológico. Os inibidores do tipo Kunitz são facilmente inativados pelo suco

gástrico humano, enquanto os Bowman-Birk permanecem estáveis [10].

5 — CONCLUSÕES

Este trabalho nos permite concluir que os produtos comerciais de soja apresentam, em geral, baixa atividade inibitória de tripsina, com exceção feita àqueles à base de extrato de soja, porém cujo significado antinutricional é inexistente. Em se tratando de valores baixos de atividade, o método colorimétrico de KAKADE,

SIMONS & LIENER [8] deve ser utilizado em conjunto com outra técnica que permita diferenciar inibição específica de

não-específica. A eletroforese em gel de poliacrilamida, com revelação para inibidores de tripsina, mostra-se confiável, rápida e sensível para esta finalidade.

6 — REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

[1] A.O.A.C. Association of Official Analytical Chemists.

Official methods of analysis, 15 ed. Washington, 1990.

[2] BELITZ, H-D. & WEDER, J.K.P. Protein inhibitors of

hydrolases in plants foodstuffs. Food Rev. Int., 6: 151-211, 1990. [3] DAVIS, B. J. Disc electrophoresis II: Method and application to human serum proteins. Ann. N. Y. Sci., 121: 404-427, 1964. [4] FERNÁNDEZ, R.; ELIAS, L.G.; BRAHAM, J.E.;

BRESSANI, R. Trypsin inhibitors and hemagglutinins in beans (Phaseolus vulgaris) and their relationship with the content of tannins and associated polyphenols. J. Agric. Food Chem., 30: 734-739, 1982.

[5] GENOVESE, M.I.& LAJOLO, F.M. Physicochemical properties of isolated soy proteins from normal, broken or damaged seeds. J. Food Sci., 57: 1378-1381, 1411, 1992.

[6] HONIG, D.H.; RACKIS, J.J; WOLF, W.J. Effects of pH and salt on yields, trypsin inhibitor content, and mineral levels of soybean protein isolates and wheys. J. Agric. Food Chem., 35: 967-971, 1987.

[7] KAKADE, M.L.; RACKIS, J.J.; McGHEE, J.E.; PUSKI, G. Determination of trypsin inhibitor activity of soy products: a collaborative analysis of an improved procedure. Cereal Chem.,

51: 376-382, 1974.

[8] KAKADE, M. L.; SIMONS, N.; LIENER, I. E. An evaluation of natural vs. synthetic substrates for measuring the anti tryptic activity of soybean samples. Cereal Chem., 46: 518-526, 1969. [9] KENNEDY, A. R. The evidence for soybean products as cancer preventive agents. J. Nutrition, 125: 733S-743S, 1995. [10] LIENER, I.E. Implications of antinutritional components in soybean foods. Crit. Rev. Food Sci. Nutr. , 34: 31-67, 1994. [11] LOWRY, U. H.; ROSEBROUGH, N. J.; FARR, A. L.; RANDALL, R. J. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem., 193: 265-275, 1951.

[12] ROOZEN, J.P. & DE GROOT, J. Electrophoresis and assay of trypsin inhibitors in different stages of tempe production. J.

Food Biochem., 9: 37-48, 1985.

[13] SMITH, C.; VAN MEGEN, W.; TWAALFHOVEN, L.; HITCHCOCK, C. The determination of trypsin inhibitor levels in foodstuffs. J. Sci. Food Agric., 31: 341-350, 1980.

[14] URIEL, J. & BERGES, J. Characterization of natural inhibitors of trypsin and chymotrypsin by electrophoresis in acrylamide-agarose gels. Nature, 218: 578-580, 1968.

7 — AGRADECIMENTOS

Os autores agradecem a aluna de Iniciação Científica (CNPq) Andrea Petry Hasegawa pelo auxílio técnico, e à FAPESP.

1 _{Recebido para publicação 06/04/98. Aceito para publicação 08/09/98.} 2 _{Prof. Doutor Ciência dos Alimentos Depto. de ALimentos e Nutrição}

Experimental - Fac. Ciências Farmacêuticas. USP. Conj. Químicas, Bloco 14. Av. Lineu Prestes, 580. CEP 05508-900. São Paulo - SP.

3 _{Prof. Titular Ciência dos Alimentos}