Universidade Federal do Rio Grande do Norte Centro de Ciências da Saúde
Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas
Susceptibilidade do Triatoma brasiliensis (Hemiptera:
Reduviidae, Triatominae) à infecção por isolados do
Trypanosoma cruzi (Kinetoplastida, Trypanosomatidae) do
Estado do Rio Grande do Norte
.
Raniery de Oliveira Santana
Natal, RN
Agosto/2017
I
Raniery de Oliveira Santana
Susceptibilidade do Triatoma brasiliensis (Hemiptera:
Reduviidae, Triatominae) à infecção por isolados do
Trypanosoma cruzi (Kinetoplastida, Trypanosomatidae) do
Estado do Rio Grande do Nort
e.
Orientadora: Profª. Dra. Antonia Cláudia Jácome da Câmara
Natal, RN
AGOSTO/2017
Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas da Universidade Federal do Rio Grande do Norte,como requisito parcial à obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas.
II
Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN Sistema de Bibliotecas - SISBI
Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Setorial do Centro Ciências da Saúde - CCS
Santana, Raniery de Oliveira.
Susceptibilidade do Triatoma brasiliensis (Hemiptera: Reduviidae Triatominae) à infecção por isolados do Trypanosoma cruzi (Kinetoplastida, Trypanosomatidae) do Estado do Rio Grande do Norte / Raniery de Oliveira Santana. - Natal, 2017.
56f.: il.
Dissertação (Mestrado)-Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas, Centro de Ciências da Saúde, Universidade Federal do Rio Grande do Norte.
Orientador: Profa. Dra. Antônia Claúdia Jácome da Câmara.
1. Susceptibilidade - Dissertação. 2. Infecção Mista -
Dissertação. 3. T. brasiliensis - Dissertação. I. Câmara, Antônia Claúdia Jácome da. II. Título.
IV
INSTITUIÇÕES ENVOLVIDAS
Projeto de Pesquisa em desenvolvimento no “Laboratório de Biologia de Parasitos e Doença de Chagas”, Departamento de Análises Clínicas e Toxicológicas, Faculdade de Farmácia 2º Andar, Rua Gal. Gustavo Cordeiro de Farias, s/n, Petrópolis 59012-570 Natal, RN, Telefone: 84 3342-9827
Laboratório de Biologia do Trypanosoma cruzi e doença de Chagas, Departamento de Parasitologia, Av. Antonio Carlos, 6627, Bloco L4, Sala 179, Campus Pampulha, 31270-901, Belo Horizonte, MG, Telefone: 31 3409-2847.
APOIO FINANCEIRO
Edital MCT/CNPq Universal No 472251/2010-4
Programa de Incentivo a Parasitologia Básica Proc. Nº 23038.005288/2011-48
Chamada MCTI/CNPq/MS-SCTIE-Decit 40/2012 Pesquisa em Doenças Negligenciadas N° 404056/2012-1
V
DEDICATÓRIA
Dedico esta dissertação aos meus pais e minha irmã, nos quais me deram todo o apoio, carinho, amor, educação e formação para que pudesse
alcançar todos os meus objetivo de vida. Amo vocês
VI AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus, que nos proporciona a dádiva da vida e do conhecimento, responsável por todos os passos da minha vida;
Aos meus pais, Marileide Oliveira Santana e Nerivan Santana, que proporcionaram a educação, o apoio em todos os quesitos necessários até o presente momento, a formação do meu caráter, educação e todo o carinho e amor que me oferecem, e quem sem vocês nada seria possível de acontecer;
A minha irmã, Milleny de Oliveira Santana, que sempre esteve presente nos momentos de descontração e horas vagas durante a longa jornada acadêmica, compartilhamento alegria e diversão;
A minha namorada, Vanessa Paloma, pelo amor, apoio, carinho, conversas e paciência durante a jornada da pós-graduação e pelos momentos de alegria nas horas vagas;
Aos meus primos, João Manoel e Erick Richardson, por estarem sempre presentes nos momentos de descontração, pelas conversas, apoio, risadas e incentivo desde graduação até hoje;
As minhas tias, Iris de Souza e Maria Auxiliadora, pela assistência e carinho diários;
Ao meu grande amigo, Elton Sullyvan, que esteve presente durante toda a minha jornada acadêmica, incentivando e auxiliando quando foi necessário;
Aos meus amigos da graduação, pelos momentos de descontração;
A Profª. Dr. Antônia Cláudia Jácome da Câmara, pela orientação, aprendizado, paciência e apoio, acreditando no meu trabalho, e sendo a principal responsável pelo meu amor pelo estudo de Parasitologia e Doença de chagas, fica o meu grande agradecimento.
Ao Profº. Dr. Ricardo Andreazze, pelo incentivo, auxílio e apoio durante a graduação até o presente momento;
Aos professores da graduação em ciências biológicas, pela minha iniação acadêmica, aprendizado e desenvolvimento;
Aos professores da pós-graduação;
A Andressa Noronha, por ajudar em todo o desenvolvimento do trabalho, com coletas, experimentos, escrita, idéias e incentivo para a conclusão da presente dissertação. Além disso, pelo grande carinho, amizade, auxílio e momentos de descontração proporcionados;
VII Aos meu amigos e colegas de laboratório, Raphael, Stphanny, Vicente Toscano, pelos bons momentos em trabalho e desenvolvimento;
Ao meu amigo, Pedro Ramon, pela convivência diária em laboratório, sempre presente nos experimentos do trabalho. E fora do laboratório, nos momentos difíceis e felizes durante os dois anos de mestrado, se tornando parte da minha família;
Ao meu amigo, Nathan Honorato, ajudando em todas as etapas do trabalho, desde dos experimentos até a escrita, pelos momentos de descontração, apoio e boas conversas concedidas;
Aos técnicos de laboratório, Da Luz e David, que sempre deixou o laboratório em ótimo estado para trabalho, pelas conversas e conselhos dados;
A Universidade Federal do Rio Grande do Norte; A Capes, pelo apoio financeiro;
Ao programa de pós-graduação de Ciências Farmacêuticas (PPGCF), no qual fui acolhido;
A Fábia e Aureliana, da secretaria de pós-graduação do PPGCF, pela assistência A banca de qualificação, por ter aceito o convite e pelas sugestões dadas;
VIII LISTA DE FIGURAS
Figura 1
Infecção artificial em Triatoma brasiliensis no laboratório de biologia dos parasitos e de Doença de Chagas. Fonte: Acervo Próprio
26
Figura 2 Gel em poliacrilamida a 6% representativo da PCR do kDNA do
IX
LISTA DE TABELAS E GRÁFICOS
Tabela 1
Características e referências dos isolados do Trypanosoma cruzi
utilizados nas infecções experimentais 24
Tabela 2 Características das amostras de referência do Trypanosoma
cruzi e dos marcadores genéticos 29
Tabela 3
Caracterização genética da massa úmida do Trypanosoma cruzi re-isolado na infecção por infecção direta no Triatoma brasiliensis
38
Tabela 4
Caracterização genética do Trypanosoma cruzi no conteúdo intestinal por infecção indireta no Triatoma brasiliensis em infecções simples e mista
39
Tabela 5
Percentual de amostras do Trypanosoma cruzi caracterizadas geneticamente a partir de infecção indireta no T. brasiliensis em infecções simples e mistas
40
Gráfico 1 Curva de Parasitemia dos isolados Pl1.10.14 (TcIII),
RN79(TcII) e 3188(TcI) 32
Gráfico 2
Positividade dos insetos com infecção simples examinados em exame direto, xenocultura e PCR do kDNA do Trypanosoma cruzi
35
Gráfico 3
Positividade dos insetos com infecção mista examinados em exame direto, xenocultura e PCR do kDNA do Trypanosoma cruzi
X
Gráfico 4 Percentual de detecção das técnicas de exame direto, infecção e
XI
LISTA DE ABREVIATURAS
D.A.I - Dias Após Infecção
DNA - Ácido – Desoxirribonucléico dNTP - Deoxinucleotídeos trifosfato
DTU´s – Discrete Typing Units (Unidades Distintas de Tipagem) EDTA - Ácido Etilenodiamino Tetracético
KCl - Cloreto de Potássio kDNA - DNA do cinetoplasto LIT – Liver Infusion Tryptose MgCl2 - Cloreto de magnésio
mL – Mililitro µL – Microlitro mM – Milimolar
NaOH - Hidróxido de sódio ng – Nanograma
pb - Pares de bases
PBS – Phosphate Buffered Saline (Tampão Fosfato Salino)
PCR - Polymerase Chain Reaction - Reação em Cadeia da Polimerase pH - Potencial hidrogeniônico
rpm - Rotação por minuto TcI - Trypanosoma cruziI TcII - Trypanosoma cruziII TcIII - Trypanosoma cruzi III TcIV - Trypanosoma cruziIV TcV - Trypanosoma cruziV
XII
TcVI - Trypanosoma cruziVI v/v - Volume por volume U – Unidade
XIII SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO E REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ... 16
1.1 Epidemiologia da Doença de Chagas ... 16
1.2 Ciclos epidemiológico da infecção pelo vetor ... 17
1.2 Triatomíneos encontrados no Nordeste e Rio Grande do Norte ... 17
1.3 Genotipagem do Trypanosoma cruzi ... 20
2 OBJETIVOS ... 22
2.1 Objetivo Geral ... 22
2.2 Objetivos específicos ... 22
3 METODOLOGIA ... 23
3.1 Delineamento experimental ... 23
3.2 Colônias de Triatoma brasiliensis ... 24
3.3 Isolados do Trypanosoma cruzi usados nas infecções experimentais ... 24
3.4 Infecção experimental do T. cruzi em T. brasiliensis ... 25
3.5 Curva de Parasitemia ... 25
3.6 Infecção ...Erro! Indicador não definido. 3.6.1 Infecção Direta ... 25
3.6.2 Infecção Indireta ... 26
3.7 Cultura acelular e obtenção da massa úmida do T. cruzi ... 27
3.8 Extração do DNA da massa úmida dos Parasitos ... 27
3.9 Extração de DNA do conteúdo intestinal ... 28
3.10 Amplificação dos minicírculos do kDNA por PCR (PCR kDNA) ... 28
3.11 Caracterização genética do T. cruzi ... 29
3.11.1 Amplificação da subunidade II do gene mitocondrial citocromo oxidase (COII) 30 3.11.2 Amplificação do domínio divergente D7 do gene 24Sα (rDNA) ... 30
3.12 Amplificação do gene da região intergenica (SL-IR) do T. cruzi ... 30
XIV
4 RESULTADOS ... 32
4.1 Infecção experimental em camundongos com os isolados TcI, TcII e TcIII ... 32
4.2 Infecção experimental em T. brasiliensis ... 32
4.2.1 Infecção direta ... 32
4.2.2 Infecção indireta ... 33
4.3 Percentual de detecção do T. cruzi por infecção direta e indireta ... 36
4.4 Caracterização molecular por diferentes marcadores genéticos ... 37
4.5 Caracterização genética do T. cruzi no conteúdo intestinal por infecção indireta no T. brasiliensis em infecções simples e mista ... 38
5 DISCUSSÃO ... 40
6 CONCLUSÕES ... 45
XV
RESUMO
A suscetibilidade do Triatoma brasiliensis a infecção por DTUs I, II e III do Trypanosoma cruzi encontradas no Estado do Rio Grande do Norte foi avaliada experimentalmente. Ninfas de T. brasiliensis foram alimentadas por infecção direta e indireta com os isolados 3188 (TcI), RN79/RN25 (TcII) e Pl1.10.14 (TcIII) em infecções simples ou mistas. O conteúdo intestinal foi avaliado por exame direto, xenocultura e Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) do kDNA. Em seguida, a caracterização dos isolados foi realizada com os marcadores: Gene mitocondrial citocromo Oxidase subunidade II (CO II), gene 24Sα do DNA ribosomal (rDNA) e espaçador Intergênico (SL-IR). Na infecção direta, a positividade das técnicas foi de 30,0%(15/50) no exame direto, 18,0% (9/50) em xenocultura e 88,0% (44/50) na PCR do kDNA. Enquanto na infecção indireta, a positividade no exame direto foi de 5,4%(3/56) e na xenocultura de 25,0% (14/56) e PCR de 41,1% (23/56). Ao comparar as duas técnicas, a infecção direta resultou em percentual de positividade de infecção superior aa infecção indireta. A PCR do kDNA identificou o T. cruzi nas infecções experimentais no T. brasiliensis tanto em infecção direta como indireta com os percentuais de positividade superiores aos verificados nos exames direta e xenocultura. Na caracterização molecular do T. cruzi nos re-isolados foi observado o mesmo perfil do isolado antes e após a infecção simples. Nas infecções mistas foi observado a presença dos dois isolados ou somente um. Os dados evidenciaram a susceptibilidade do T. brasiliensis as DTU´s I, II III, com elevados índices de infecção simples e mistas reforçando a importância do T. brasiliensis na epidemiologia da infecção pelo T. cruzi no Rio Grande do Norte.
Palavras-chave: Susceptibilidade, Infecção direta, Infecção indireta, Triatoma
XVI
ABSTRACT
The susceptibility of Triatoma brasiliensis to infection by Trypanosoma cruzi DTUs I, II and III found in the State of Rio Grande do Norte was evaluated experimentally. Nymphs were fed using direct and indirect xenodiagnosis with the isolates 3188 (TcI), RN79/RN2 (TcII) and Pl1.10.14 (TcIII) in simple or mixed infections. The intestinal contents were evaluated by direct exam, xenoculture and kDNA polymerase chain reaction (PCR). Then, the characterization of isolates was used the cytochrome oxidade subunit 2 gene (COII), 24Sα ribosomal DNA gene (rDNA) and the spliced-leader intergenic region of the mini-exon gene (SL-IR) as markers. In the direct xenodiagnosis, the direct exam presented 30.0%(15/50) of positivity, the xenoculture 18.0%(9/50) and the kDNA PCR 88.0% (44/50). Meanwhile, the indirect xenodiagnosis showed 5.4%(3/56) of positivity to the direct exam, 25.0%(14/56) to xenodiagnosis and 41.1%(23/56) to kDNA PCR. Comparing the techniques, the direct xenodiagnosis showed better results than the indirect procedure. The PCR identified the T. cruzi in both types of infection, with higher positivity than direct exam and xenoculture. With respect the molecular characterization, the re-isolates showed the same profile before and after the simple infections. In the mixed infections were verified two or only one isolate. The data demonstrated the susceptibility of T. brasiliensis to DTUs I, II and III, with high rates in simple and mixed infections reinforcing the importance of T. brasiliensis to the epidemiology of T. cruzi infection in Rio Grande do Norte.
Keywords: Susceptibility, Direct infection , Indirect Infection, Triatoma brasiliensis, Trypanosoma cruzi
16
1 INTRODUÇÃO E REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
1.1 Epidemiologia da Doença de Chagas
A doença de Chagas é doença tropical, endêmica, negligenciada restrita à países da América Central e do Sul, associada principalmente à presença do inseto vetor da subfamília Triatominae (MONCAYO & SILVEIRA, 2009). De acordo com a Organização Mundial de Saúde (OMS), na América Latina existem aproximadamente 5,7 milhões de pessoas infectadas com o Trypanosoma cruzi espalhadas em 21 países e média de 29 mil novos casos. No Brasil são estimados 1,15 milhões de indivíduos chagásicos e 25 milhões de pessoa moram em área de risco de infecção (WHO, 2015).
No Brasil foram realizados três inquéritos soroepidemiológicos nacionais da doença de Chagas. No primeiro, entre 1975 e 1980, a população rural brasileira apresentou 4,22% de infectados, a região Nordeste apresentou 3,05% e o Rio Grande do Norte 1,78% (CAMARGO, 1984). O segundo, foi com crianças e adolescentes de 7-14 anos, tendo prevalência estimada de 0,14% para o Brasil, e no Nordeste 0,20% nos anos de 1989-1997 (SILVEIRA & VINHAES, 1998). O último, com dados recentes de 2001-2008, examinou 1750 crianças de faixa etária até cinco anos, em 65 municípios do RN e uma única criança infectada foi identificada no município de Várzea (LUQUETTI et al., 2011). Ainda existe um quarto inquérito, sendo esse restrito a moradores da zona rural na mesorregião Oeste do Rio Grande do Norte que estimou a soroprevalência em 6,5% e 14.151 indivíduos infectados (BRITO et al., 2012).
No contexto epidemiológico da doença de Chagas, a região Nordeste apresenta importância acentuada, tendo sido a segunda em número de infectados e de índices de infestação de triatomíneos no primeiro inquérito nacional de prevalência e distribuição dos vetores (CASTRO-FILHO & SILVEIRA, 1979). No segundo inquérito, em 1996, esta região apresentou o número mais elevado de triatomíneos capturados, que correspondeu a 69,2% do total de insetos e, as espécies Triatoma brasiliensis e Triatoma pseudomaculata foram as mais frequentes no ambiente domiciliar, representando 43,12% e 37,47%, respectivamente (SILVEIRA & VINHAES, 1998). Nessa região, o controle dos triatomíneos domiciliados apresenta problemas no presente e futuro, por ser o centro de dispersão e de maior concentração de T. brasiliensis, atualmente a espécie mais preocupante e mais difícil de controlar em todo o país (FORATTINI, 1980; ALENCAR, 1987; DIAS et al., 2000; SILVEIRA & VINHAES, 1998). Além das espécies T.
17
brasiliensis e T. pseudomaculata, o Panstrongylus megistus também apresenta importância à saúde pública (DIAS et al., 2000).
1.2 Ciclos epidemiológico da infecção pelo vetor
A infecção chagásica é uma enzootia silvestre amplamente distribuída na América Latina, transmitida na natureza entre triatomíneos e animais, que passou a ser uma antropozoonose a partir de modificações antrópicas realizadas no ambiente natural (CHAGAS, 1909; COURA, 1988). O processo destrutivo desse ambiente desencadeou a dispersão dos triatomíneos, expandindo o ciclo de transmissão do parasito (FORATTINI, 1980) e, incluindo o homem e os animais domésticos no ciclo epidemiológico da doença de Chagas. Assim, o fluxo de interação que predomina é unidirecional no sentido silvestre-doméstico, com poucas situações de retorno (BARRETTO et al, 1979).
Do ponto de vista ecológico, a doença de Chagas é típica de ambientes rurais, onde o inseto vetor interage com animais dos ambientes silvestre, peridomiciliar e domiciliar, transmitindo o T. cruzi (OLIVEIRA-LIMA et al., 2000). No ciclo de transmissão do ambiente silvestre, a circulação do parasito envolve a interação entre hospedeiros invertebrados (triatomíneos) e vertebrados (marsupiais, carnívoros, roedores, primatas, mamíferos silvestres dentre outros animais), em ecótopos naturais do continente americano (DIAS et al, 2000).
A transmissão do parasito nos ambientes peridomiciliar e domiciliar são resultantes da interação entre o homem e o vetor, como consequência de modificações sociais e ecológicas provocadas pelo próprio homem, permitindo assim a colonização de ecótopos artificiais pelos triatomíneos (DIAS, 1992). A adaptação dos triatomíneos ao domicílio é o fator determinante para o estabelecimento da infecção humana. A transmissão no peridomicílio envolve animais domésticos que atuam como reservatórios e triatomíneos silvestres atraídos às residências pela luz em busca de alimento. O peridomicílio está limitado a cem metros das habitações humanas e até onde pode ser encontrado os anexos (tijolos, pedaços de madeira, cercas, telhas e criadouros de animais domésticos) servindo de refúgio na parte do dia para os insetos (OLIVEIRA-LIMA et al, 2000).
1.3 Triatomíneos encontrados no Nordeste e Rio Grande do Norte
A subfamília Triatominae, pertence à ordem Hemiptera, família Reduviidae, estes são todos caracterizados pela hematofagia em mamíferos, aves, répteis e anfíbios. A subfamília triatominae é atualmente composta por 140 espécies, porém, apenas algumas estão adaptadas às moradias humanas, apresentando importância epidemiológica
18
(CARANHA et al., 2006). O grupo está dividido em 19 gêneros, sendo três, os potenciais vetores do parasito: Triatoma, com 67 espécies descritas, Rhodnius, com 16 espécies e o Panstrongylus que apresenta 13 espécies (DIOTAIUTI et al., 2000). A maioria é endêmica do continente americano, de grande importância para o Brasil, pois, o clima neotropical da região se mostra como meio natural desses insetos. Estes insetos são obrigatoriamente hematófagos durante toda a vida, possuem o hábito noturno, e uma característica crucial para infecção que é defecar durante ou logo após se alimentarem. Nesses dejetos pode estar presente a forma tripomastigota metacíclica, forma infectante do parasito ao hospedeiro vertebrado (TARTAROTTI et al, 2004).
As espécies mais importantes relacionadas à transmissão do parasito ao homem no Brasil, são T. brasiliensis, Triatoma infestans, Triatoma pseudomaculata, Rhodnius prolixus e P. megistus (JURBERG et al., 2017). Na região Nordeste predominam as espécies autóctones T. brasiliensis e T. pseudomaculata, ambas capazes de colonizar o peridomicílio (SILVEIRA & VINHAES, 1998). Nos estados do Ceará, da Paraíba e do Rio Grande do Norte, essas espécies estão associadas aos municípios não litorâneos, demonstrando a afinidade das mesmas pelo bioma caatinga e cerrado (LUCENA & COSTA, 1954; 1965; CASTRO-FILHO & SILVEIRA, 1979; CÂMARA et al., 2010).
T. brasiliensis e T. pseudomaculata são espécies nativas do semiárido com ampla distribuição territorial e apesar de terem sido reduzidas, ainda se mantêm dispersas com populações colonizando o intradomicílio (FORATTINI, 1980; ALENCAR, 1987; CARCAVALLO et al., 1999; DIAS et al., 2000; SILVEIRA, 2000; GALVÃO et al., 2003). Estas são as principais vetoras do T. cruzi no Nordeste, capturados em ambientes peridomiciliar e domiciliar que reinvadem a partir dos ecótopos naturais (DIAS, 1988) e são encontrados em todos os estados desta região (CASTRO-FILHO & SILVEIRA, 1979; SILVEIRA & VINHAES, 1998; DIAS et al., 2000; COSTA et al., 2003; SILVEIRA, 2011).
Estudos pioneiros realizados nesta região apontaram T. brasiliensis e T. pseudomaculata como os mais frequentes nos ambientes silvestre, peridomiciliar e domiciliar nos estados da Paraíba (LUCENA & COSTA, 1954), Ceará (ALENCAR, 1965), Piauí (COURA et al., 1996) e no Rio Grande do Norte (LUCENA, 1959; CASTRO-FILHO & SILVEIRA, 1979; DIAS et al., 2000). No estado da Paraíba, Lucena & Costa (1954) chamaram a atenção para a predominância do T. brasiliensis e T. pseudomaculata no sertão, com índices de infecção pelo T. cruzi de 17,1% e 2,8%, respectivamente, porém com baixa infestação domiciliar. No caatinga do estado do Piaui,
19
Coura et al., 1996 observaram que 5,5% dos T. brasiliensis capturados no domicilio e peridomicílio estavam infectados com o parasito. No estado do Ceará foi registrada como espécie predominante, com 15,4% de infecção pelo T. cruzi em 2.837 exemplares capturados (ALENCAR, 1965). Sarquis et al. (2004) também detectaram elevados índices de infecção em T. pseudomaculata (18%), R. nasutus (27,2%) e T. brasiliensis (15,3%) capturados em vários ambientes no município de Jaguaruana. Diotaiuti et al. (2000) avaliaram o processo de domiciliação e reinfestação do T. brasiliensis em 227 unidades domiciliares e encontraram 48% de casas infestadas. Após o tratamento com inseticidas peritróides os resultados foram satisfatórios no controle das populações domésticas, porém com rápida reinfestação dos ecótopos peridomiciliares, atribuindo a abundância desta espécie no ambiente silvestre.
Em vários estados do Nordeste mostraram que o T. brasiliensis e o T. pseudomaculata continuam sendo as espécies mais capturadas, com diferentes perfis ecoepidemiológicos (LUQUETTI et al., 2011). Várias espécies de triatomíneos foram capturadas em 138 municípios de Pernambuco, sendo o T. pseudomaculata, T. brasiliensis e Panstrongylus lutzi as espécies mais frequentes no estado. A infecção natural pelo T. cruzi foi detectada em 17,8% de P. lutzi, 8,0% de T. pseudomacutata e 6,5% de T. brasiliensis (SILVA et al., 2012). No Piauí, o T. brasiliensis foi o mais frequente, com 65% dos 22.896 triatomíneos capturados e 28% do T. pseudomaculata (GURGEL-CONÇALVES et al., 2010). No Ceará, em localidades rurais do município de Morada Nova foram capturados 730 insetos em todos os ambientes, sendo aproximadamente 90% de T. brasiliensis, além de T. pseudomaculata e R. nasutus. Os índices de infecção natural do T. brasiliensis e R. nasutus foram 11,6% e 2,8% respectivamente, e nenhum espécime do T. pseudomaculata infectado (SARQUIS et al., 2012).
No Estado do Rio Grande do Norte, a fauna triatomínica é bastante variada, tendo sido encontradas as seguintes espécies: P. megistus, P. lutzi, Rhodnius nasutus, T. brasiliensis, T. pseudomaculata e Triatoma petrochiae (CASTRO-FILHO & SILVEIRA, 1979; SILVEIRA & VINHAES, 1998; DIAS et al., 2000; SILVEIRA, 2011). Especificamente no semiárido, foram examinados mais de 800 espécimes de triatomíneos distribuídos entre T. brasiliensis, T. pseudomaculata, P. lutzi e R. nasutus. Nos municípios de Apodi, Caraúbas, Governador Dix-Sept Rosado, Lucrécia, Mossoró, Severiano Melo, São Miguel, Caicó e Serra Negra do Norte a infecção natural pelo T. cruzi foi 78,1% em P. lutzi e 24,5% em T. brasiliensis (CÂMARA et al., 2010;
20
BARBOSA-SILVA et al., 2016) demonstrando o papel importante que essas espécies endêmicas têm desempenhado nos ciclos de transmissão do T. cruzi.
1.4 Genotipagem do Trypanosoma cruzi
Desde os trabalhos de Chagas (1909), há variabilidade do parasito em relação das características morfológicas, biológicas e comportamentais do T. cruzi. Os primeiros relatos sobre diferenciações morfológicas mostraram que existe formas tripomastigotas delgadas, largas ou muito largas (BRENER & CHIARI, 1963), além do tropismo de algumas cepas por determinados tecidos, células fagocitárias e células musculares (BRENER, 1965). As populações do T. cruzi de fase aguda nos pacientes chagásicos apresentam maior complexidade genética quando comparada com as populações de fase crônica, o que evidencia uma especificidade para a invasão tecidual. A variabilidade pode ser resultante da interação parasita-hospedeiro (TIBAYRENC & AYALA, 1999).
Um tropismo preferencial de populações do T. cruzi por determinados tecidos ou órgãos do hospedeiro tem sido evidenciado experimentalmente com cepas isoladas no México (GALLIARD, 1965) e Recôncavo Baiano (ANDRADE, 1999). O parasitismo tecidual induzido pelas cepas Y, Berenice e ABC (isoladas de seres humanos) e pela cepa CL (isolada de triatomíneo naturalmente infectado) também foi avaliado e observada uma localização preferencial dos parasitos por macrófagos ou por células musculares, classificando-as em reticulotrópicas ou macrofagotrópicas e miotrópicas (MELO & BRENER, 1978).
Macedo & Pena (1998) descreveram a hipótese do modelo histotrópico clonal. Esses autores sugeriram que a formação de populações multiclonais em pacientes procedentes de áreas endêmicas se deve à infecção por múltiplos contatos com diferentes triatomíneos e estes podem se alimentar de sangue de diferentes indivíduos infectados. Isso propiciaria a formação de populações multiclonais em hospedeiros e vetores, levando ocasionalmente ao isolamento dessas populações em meio de cultura no laboratório. Ainda nesse modelo, os isolados do parasito interagem dentro do grupo, que pode mudar drasticamente em diferentes ambientes, especialmente na passagem da população multiclonal do vetor para o homem. O esperado seria a eliminação de alguns clones pela inabilidade para competir e propagar no ambiente humano ou por ação dos mecanismos de defesa do hospedeiro ou vetor, diminuindo a complexidade populacional. De acordo com essa teoria, as populações do parasito encontradas no início da infecção, (fase aguda) poderiam ser ainda mais complexas. Os dados de Andrade (1999) e Vago et al. (2000) corroboram com essa hipótese, pois demonstraram que os clones presentes no
21
tecido cardíaco de pacientes são diferentes daqueles existentes no esôfago, ou seja, distintos genótipos do T. cruz apresentam distribuição preferencial para os tecidos, sugerindo que a variabilidade genética do parasito é um dos fatores determinantes para a forma clínica da doença.
As cepas do T. cruzi podem ser classificadas de acordo com o perfil fenotípico de algumas isoenzimas, chamadas de zimodemas em Z1, Z2 e Z3. Sendo os Z1 e Z3 predominantemente encontrados em ambientes silvestres, enquanto Z2 localizado em ambientes peridomiciliares (MILES et al. 1981). Em 1999, uma nova divisão do T. cruzi foi sugerida. O grupo T. cruzi I, seriam as cepas com zimodema Z1, rRNA2 e de ambiente silvestre. E T. cruzi II as cepas e clones com zimodema Z2, rRNA 1 e de ambiente doméstico (ANONYMOUS, 1999). Nos trabalhos seguintes, T. cruzi II mostrou maior complexidade adquirindo subdivisão em cinco grupos denominados de unidades distintas de tipagem (DTU) IIa, IIb, IIc, IId e IIe. A linhagem 1 foi renomeada de DTU I (BARNABÉ et al. 2000; BRISSE, et al. 2000, 001). Esta divisão do parasito foi reforçada em reunião satélite com um novo consenso reconhecido para que a nomenclatura das cepas do parasito fosse adaptada usando equivalência de diferentes metodologias estudadas e subdividida em seis DTUs, TcI-TcVI (ZINGALES et al., 2009).
Todas as DTU´s foram encontradas na América do Sul, com distribuição dividida em ecótopos domésticos e artificiais. As DTU´s TcI, TcIII, TcIV foram encontrados no ambiente silvestre, enfatizando que TcI tem prevalência silvestre na região sul do continente. Enquanto TcI, TcII, TcV e TcVI foram encontrados em ecótopos domiciliares abrangendo o nordeste e sul brasileiro, Paraguai, Argentina, Bolívia e Chile, com TcI aparecendo em ecótopos doméstico na região norte (ZINGALES et al., 2012). No Brasil, as DTU´s mais frequentes foram TcI, TcII e TcIII, porém, também pode ser encontrado TcIV em ecótopos silvestres ao norte do país e TcVI em domicílios no Sul.
Araujo et al (2014) demonstraram em infecção experimental utilizando R. prolixus e isolados de TcI e TcII a susceptibilidade destes isolados. E que, O CA45/TcI estava mais adaptado ao triatomíneo que JCA3/TcII indicado pela maior quantidade de tripomastigotas metaciclicos na ampola retal quando utilizaram infecções simples ou mistas.
No semiárido do Rio Grande do Norte foi demonstrada uma grande diversidade natural na população do T. cruzi envolvendo TcI, TcII e TcIII em humanos e TcI, TcII e TcIII em T. brasiliensis e P. lutzi, sugerindo a introdução de DTUs silvestres no ambiente domiciliar com implicações clínicas desconhecidas (MARCILI et al., 2009; CÂMARA et
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al., 2010, 2013). TcIII foi identificado em 18,7% (3/16) de pacientes de diferentes municípios, bem como em P. lutzi, Galea spixii (Preá) e Euphractus sexcinctus (Peba), indicando a conexão entre os ciclos silvestre e domésticos nesta região semiárida brasileira. TcI e TcII também foram detectados, em 37,5% (6/16) e 43,8% (7/16) dos pacientes, respectivamente (MARTINS et al., 2015).
Ao observar os dados do atual cenário da Doença de Chagas para a região e sabendo que, em áreas endêmicas existe infecção por múltiplos contatos entre triatomíneos e reservatórios, e que, estes podem ainda apresentar interações e seleções de populações de parasitos em meio de cultura e em hospedeiros, demonstar a susceptibilidade das populações do T. cruzi ao T. brasilienis com as populações I, II e III e as implicações de infecções mistas neste inseto na manutenção dos ciclos domiciliar e silvestre da infecção é de suma importância.
2 OBJETIVOS 2.1 Objetivo Geral
Avaliar a susceptibilidade do T. brasiliensis a infecção pelo T. cruzi de diferentes DTUs (TcI, TcII e TcIII) encontradas nos ciclos silvestre e domiciliar no Estado do Rio Grande do Norte.
2.2 Objetivos específicos
Determinar a susceptibilidade/infecção experimental de TcI-TcIII ao T. brasiliensis;
Determinar a susceptibilidade/infecção experimental do T. brasiliensis a infecções mistas;
Comparar as técnicas de infecção direta e indireta em T. brasiliensis;
Verificar diferenças entre as DTUs parental e re-isolamento em infecção direta e indireta por infecções simples e mista.
23 3 METODOLOGIA 3.1 Delineamento experimental EXAME DIRETO XENOCULTURA CONTEÚDO INTESTINAL + GUANIDINA PCR do kDNA TCI, TCII E TCIII
INFECÇÕES SIMPLES E MISTA
INFECÇÃO INDIRETA INFECÇÃO DIRETA Triatoma brasiliensis (10-15 / DTU) MARCADORES GENÉTICOS:
Gene Mitocondrial Citocromo Oxidase subunidade II (CO II) Gene 24Sα do DNA ribosomal (rDNA)
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3.2 Colônias de Triatoma brasiliensis
As colônias de T. brasilienses procedentes do insetário do Laboratório de Biologia dos Parasitos e de Doença de Chagas/DACT/CCS/UFRN foram mantidas em frascos de vidro/plástico sobre a proteção de duas telas, uma de filó e outra de tecido, prendido por cordões elásticos com temperatura controlada entre 25-27Cº. Os insetos da colônia foram originados de ovos de triatomíneos coletados em campo. A alimentação dos insetos foi realizada a cada 15 dias com camundongos albinos swiss também não infectados, sedados com cetamina (60 a 80mg/Kg- 5%) + xilazina (8 a 15mg/Kg – 2%) e colocados sobre os potes de vidro/plástico cobertos com filó durante 30min.
3.3 Isolados do Trypanosoma cruzi usados nas infecções experimentais
Os isolados 3188, RN79, RN25 e Pl1.10.14 foram caracterizados geneticamente por Martins et al 2015. Estes foram isolados de humanos na fase crônica da infecção e de Panstrongylus lutzi (Tabela 1). As amostras estavam criopreservadas em nitrogênio líquido no LABIOPAR/DACT/CCS. Após o descongelamento, os isolados foram cultivados em meio LIT - Liver Infusion Triptose – (CAMARGO, 1964) com repiques a cada 10 dias até o momento da infecção.
Tabela 1 – Características e referências dos isolados do T. cruzi utilizados nas infecções experimentais
Isolados do
T.cruzi
Hospedeiro Forma clínica
Município DTUs* Referencias
3188 Humano Digestiva Assú TcI Martins et al 2015 RN79 Humano Cardíaca SNN TcII Martins et al 2015 RN25 Humano Digestiva SNN TcII Martins et al 2015 Pl 01.10.14 P. lutzi - SNN TcIII Dados não
publicados SNN: Serra Negra do Norte; *: D’AVILA et al., 2012
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3.4 Infecção experimental do T. cruzi em T. brasiliensis
A infecção experimental do parasito em triatomíneos realizada durante alimentação em camundongos – “infecção direta ou indireta”. Na infecção direta, foram utilizados três camundongos albinos swiss, machos, para cada grupo, pesando 18-20g. em seguida, os animais foram infectados com suspensão de 4x104tripomastigotas sanguíneos (TrS)/animal ou 0,3 mL de parasitos em cultura suplementado com 40% de hemoglobina de coelho com os isolados descritos no item 3.3 por via intraperitoneal (i.p.), sendo três animais para cada isolado. Em infecção indireta foi feito de acordo com o protocolo de Romanã (1947).
3.5 Curva de Parasitemia
A curva de parasitemia foi avaliada para selecionar o dia com maior quantidade de parasitos e fazer a infecção direta. Grupos com cinco animais foram infectados com 3,0 a 5,0X103 tripomastigotas sanguíneos (TrS) dos isolados 3188, RN79 e Pl1.10.14. A parasitemia sanguínea foi examinada a partir do 5º dia da infecção e em dias alternados, durante 30 dias em microscópio óptico no aumento de 400x. A contagem dos parasitos para determinação do inóculo e na curva de parasitemia foi utilizada a técnica Pizzi (1960) modificada por Brener (1962) que consiste em examinar entre lâmina e lamínula (22 X 22 mm) 5
L de sangue retirado da cauda do camundongo. O número de campos microscópicos da lamínula foi previamente determinado com objetiva de 40X e ocular de 10X. Os parasitos foram contados em 50 campos e o número encontrado multiplicado por um fator de correção correspondente a 72.3.6 Infecção
3.6.1 Infecção Direta
O infecção foi descrito por Brumpt (1913) e revisado e modificado posteriormente por Dias (1940). As ninfas foram alimentadas com o sangue dos camundongos infectados por aproximadamente trinta minutos. Nesta metodologia foi utilizadas cinco ninfas de T. brasilienses entre o 3º e 4º estádio para cada animal. O conteúdo intestinal das ninfas foi retirado após 30 dias em 500µl de PBS (Phosphate Buffered Saline), e uma aliquota foi examinada pelo método direta para observação dos parasitos móveis. Em seguida, a xenocultura foi realizada com aproximadamente 300µl do conteúdo, adicionado ao meio de cultura LIT+NNN (Neal, Novy, Nicolle) para o desenvolvimento das formas epimastigotas e formação da massa úmida, e outra 200µl foi adicionado em guanidina+EDTA 8,0pH V/V para a extração do DNA usado nas PCRs. Os isolados
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usados na infecção direta foram com infecções simples com 3188 (TcI), RN79 (TcII) e Pl1.10.14 (TcIII) e infecção mista entre RN79 e Pl1.10.14.
3.6.2 Infecção Indireta
Para alimentação dos triatomíneos foi utilizado um dispositivo adaptado do trabalho de ROMAÑA (1947), constituído de uma fonte de aquecimento e um aparelho de vidro composta de duas câmaras: uma interna, em forma de funil foi encaixada uma membrana de látex, distendida presa ao fundo. A outra câmara externa, que serviu para aquecer a primeira com fluxo contínuo de água a 37°C de um banho-maria com o auxílio de uma minibomba de aquário (Figura 1). O sangue colhido foi transferido para o dispositivo na câmara interna. Em seguida, o frasco com triatomíneos foi colocado em contato com o dispositivo para alimentação por 30 minutos. Após trinta dias, os insetos foram examinados e sua infecção foi avaliada conforme o item anterior. Para o infecção artificial, foi utilizado os isolados 3188 (TcI), RN25 (TcII) e Pl1.10.14 (TcIII). O isolado RN79 não se adequou ao infecção artificial, sendo substituída pelo RN25 que também foi caracterizado por TcII.
Figura 1: Infecção Indireta em Triatoma brasiliensis no Laboratório de Biologia dos Parasitos e de Doença de Chagas. A: Visão superior aparelho de vídeo com os insetos
A B B
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dentro do frasco; B: Visão inferior dos insetos se alimentando do sangue com cultura de T. cruzi em membrana de latéx (preservativo masculino; C: Aparelhagem completa, com banho maria à esquerda com os tubos de elástico por onde a água circula entre o compartimento de vidro e baho maria. Fonte: Acervo Próprio
3.7 Cultura acelular e obtenção da massa úmida do T. cruzi
O re-isolamento dos parasitos de triatomíneos foi realizado por xenocultura. As culturas foram mantidas em fase logarítmica até a concentração de 1×108epimastigotas/mL. As massas úmidas dos parasitos foram lavadas em tampão Krebs-Ringer-Tris pH 7,3, centrifugadas a 2000×g durante 20 min a 4 °C, em seguida, armazenada a -20°C até à extração do DNA e caracterização genética.
3.8 Extração do DNA da massa úmida dos Parasitos
A extração do DNA foi realizada de acordo com a metodologia descrita por Macedo et al. (1992). A massa úmida de parasitos foi re-suspendida em 1mL de tampão de lise (NaCl 80mM/EDTA 45mM, pH 8,0/ SDS 1%) contendo 0,1mg/mL de proteinase K (Promega, USA) e incubado a 37°C durante 12h. Em seguida o DNA foi desproteinizado com fenol (v/v) e precipitado durante 5 minutos na centrifugação de 5.000×g (Microcentrífuga Eppendorf modelo 5418, Hamburg, Germany) a temperatura ambiente por 10 minutos. A fase aquosa foi recuperada e submetida à extração com igual volume (v/v) de uma solução preparada com fenol, clorofórmio e álcool isoamílico na proporção de 25:24:1 e de outra solução contendo clorofórmio e álcool isoamílico (24:1) seguido de agitação e centrifugação nas mesmas condições anteriores. A precipitação ocorreu com dois volumes de etanol absoluto, incubado a -70°C por 2h ou a -20ºC overnight. Após a centrifugação e volatilização do etanol, o precipitado obtido foi tratado com 1mL de tampão da ribonuclease (NaCl 80mM/ EDTA 5mM, pH 8,0, 10U/μĿ de ribonuclease - Promega, USA) e incubado a 37ºC por 2h. Em seguida, nova extração e precipitação do DNA foram realizadas de acordo com o protocolo descrito anteriormente (MACEDO et al., 1992). E o DNA foi diluído em tampão Low TE (10mM Trs-HCl e 0,1mM EDTA pH 8,0) e estocado a -20°C. As amostras de DNA foram quantificadas em NanodropTM 2000 (ThermoFisher Scientific - Waltham, Massachusetts,EUA) sendo o grau de pureza das amostras determinado pela relação das absorbâncias a 260/280nm. E a concentração final de cada amostra de DNA foi ajustada para ~3ηg/μĿ, e estocadas a 4ºC até o momento do uso.
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3.9 Extração de DNA do conteúdo intestinal
A extração do DNA foi realizada de acordo com metodologia proposta por Gomes et al., 1998. Ao tubo com a amostra foi adicionado 200μL de fenol UltraPure pH 7,49 – 7,79 (Invitrogen, Califórnia, USA). Em seguida, a mistura foi homogeneizada lentamente durante 2min e centrifugada a 6.000rpm. O sobrenadante foi removido e descartado. Ao precipitado foram adicionados 100μL de fenol UltraPure e 100μL de clorofórmio. A mistura foi homogeneizada lentamente durante 2min e centrifugada a 6.000rpm por 5min. O sobrenadante foi removido para outro microtubo e, ao sedimento foi adicionado 200μL de água Milli-Q estéril e centrifugado nas mesmas condições anteriores com transferência do sobrenadante para o microtubo anterior. Na próxima etapa foram adicionados 320μL de clorofórmio ao sobrenadante, centrifugado por 5min a 6.000rpm, seguida da precipitação do DNA em banho de gelo durante 15min em presença de 100mM de acetato de sódio, 40μg de glicogênio (Invitrogen, Califórnia, USA) e dois volumes de etanol absoluto. Após a centrifugação a 13.000rpm por 15min, o sobrenadante foi recolhido, volatilizado o etanol e o DNA foi ressuspendido em 20μL de água Milli-Q e armazenado a 4ºC até o momento de uso. O DNA extraído do conteúdo intestinal foi utilizado para identificação dos minicírculos do kDNA e para caracterização genética do T. cruzi.
3.10 Amplificação dos minicírculos do kDNA por PCR (PCR kDNA)
As sequências da região constante dos minicírculos do kDNA constituíram o alvo da reação, amplificando o fragmento de 330pb (pares de base) com os iniciadores: 121
(5’-AAATAATGTACGGG(G/T)GAGATGCATGA-3’) e 122
(5’-GGTTCGATTGGGGTTGGTGTAATATA-3’) (DEGRAVE et al., 1988). As reações de PCR kDNA foram realizadas de acordo com metodologia proposta por Gomes et al 1998. As reações foram executadas em duplicata, em um volume final de 20µL contendo Tris-HCl 10mM (pH 9.0), água Milli-Q, KCl 75mM, MgCl2 3,5mM, 0,2mM de cada
deoxinucleotídeo (Invitrogen, Califórnia, USA), 1U de Taq Platinum DNA polimerase (Invitrogen, Califórnia, USA), 25pmoles de cada iniciador da reação e 2µL do DNA. Amplificação foi executada com o auxílio de termocicladores (Mastercycler gradient-Eppendorf, Hamburg, Germany e MultiGene™ Mini Compact Thermal Cycler, New York, United States) responsável pela regulação dos ciclos de temperatura. Inicialmente à 95ºC (5min), 35 ciclos de desnaturação a 95ºC (1min), anelamento a 65ºC (1min), extensão a 72ºC (1min) e extensão final por 10min. Em todas as etapas de extração do DNA e mistura da reação da PCR foram monitoradas com controles positivos e
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negativos. Como controles positivos da reação de PCR foram utilizados 2µL de DNA de cultura acelular de T. cruzi da cepa SM73 (3ng/µL), enquanto o controle negativo foi obtido do conteúdo intestinal de triatomíneos não infectados em tubo separado com a mesma mistura da reação. Para evitar contaminações, cada etapa da reação foi realizada em ambientes separados, utilizando reagentes e equipamentos destinados exclusivamente para cada uma delas.
3.11 Caracterização genética do T. cruzi
A caracterização molecular foi realizada de acordo com protocolo proposto por D'avila et al 2009. Os marcadores utilizados foram: Gene do mitocondrial citocromo oxidase subunidade II(COII), o domínio divergente D7 do gene 24Sα (rDNA) e gene da região intergênica (SL-IR). Os controles utilizados na caracterização foram as cepas e clones dos parasitos descritos na Tabela 2.
Tabela 2: Características moleculares e referências dos controles do Trypanosoma cruzi
aSouto and Zingales (1993); bFreitas et al. (2006); bD’Ávila et al. (2009); cBurgos et al. (2007); pb: pares
de bases; DTU: discrete typing units.
Controles Marcadores genéticos DTU do T. cruzi Referência 24Sα rDNAa (pb) COIIb (haplotipo/pb) SL-IRacc (pb)
Col1.7G2 110 A/30, 81, 264 150 TcI Federici et al. (1964)
JG 125 C/81, 212 150 TcII Lages-Silva et al.
(2001)
RN19 110 B/81, 294 200 TcIII Câmara et al.
(2010)
AM64 125 B/81, 294 200 TcIV Monteiro et al.
(2010)
3253 110 + 125 B/81, 294 150 TcV Lages-Silva et al.
(dados não publicados)
CL-Brener 125 B/81, 294 150 TcVI Zingales et al.
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3.11.1 Amplificação da subunidade II do gene mitocondrial citocromo oxidase (COII)
A amplificação do gene mitocondrial citocromo oxidase subunidade II do T. cruzi foi utilizado metodologia descrita por Freitas et al. (2006). Na PCR usou 9ng do DNA ou 3μL do DNA do conteúdo intestinal com volume final de reação de 20μL, adicionados 0,25μM dos iniciadores TcMit-21 e TcMit10; 1,5mM MgCl2; 2,5 U de Taq Platinum DNA polimerase; 2,0μL tampão 10x (Invitrogen, Califórnia, USA) 50mM; 10nM Tris-HCl e 0,25μ de cada DNTP. Os iniciadores foram: Tcmit-10: 5’-CCATATATTGTTGCATTATT-3’, Tcmit-21: 5’-TTGTAATAGGAGTCATGTTT-3’. As condições da PCR foram de 30 ciclos: 30 segundos de desnaturação a 94ºC, anelamento a 48ºC por 2 minutos e extensão de 72ºC durante 2 minutos. Após a amplificação e visualização da banda de 375pb, os produtos foram digeridos com a enzima de restrição AluI (16h) e os fragmentos gerados analisados em gel de poliacrilamida a 6% (SANTOS et al., 1993). Os fragmentos amplificados foram comparados com o DNA de cepas usadas por FREITAS (2006), observando os pares de base alinhados entre 31 e 294. Os isolados foram classificados de acordo com os haplótipos A (30+81+264pb), haplótipo B (~82+212pb) ou haplótipo C (81+294pb) conforme observado na tabela 2.
3.11.2 Amplificação do domínio divergente D7 do gene 24Sα (rDNA)
A PCR do gene rDNA 24Sα foi realizada de acordo com SOUTO & ZINGALES, 1993. O volume final de 12,5μL contendo 2μL de DNA total (~3ɳg/μĿ), 10mM Tris-HCl pH 9,0, 50mM KCl, 0,1 % Triton X-100 (Buffer B, Promega, USA), 3,5mM MgCl2 (Promega), 0,625U Taq DNA Polimerase (Promega), 200μM de cada dNTP, 0,25μM de cada iniciador: D71: 5’-AAGGTGCGTCGACAGTGT GG-3’, D72: 5’-TTTTCAGAATGGCCGAACAGT-3’. Os ciclos de amplificação consistiram da desnaturação inicial a 94°C por 1 min, 30 ciclos contendo desnaturação (94°C, 30s), anelamento (60°C, 30s) e extensão (72°C, 30s) e extensão final a 72º por 10min. Os produtos de amplificações foram revelados por eletroforese em géis de poliacrilamida a 6% corados pela prata (SANTOS et al. 1993) para a visualização de fragmentos de 110pb, 117/119 e 125 (Tabela 2).
3.12 Amplificação do gene da região intergenica (SL-IR) do T. cruzi
A amplificação do gene da região intergênica foi utilizada para diferenciar os isolados TcIII e TcIV das demais DTUs, descrita por Burgos et al (2007). As amostras do
31
T. cruzi foram submetidas a PCR contendo solução de 1U de Taq Polimerase; 20mM Tris-HCl pH 8,4; 50mM KCl; 3mM MgCl; 3μM dos iniciadores TcIII: 5’- CTCCCCAGTGTGGCCTGGG-3’ e UTCC: 5’-CGTACCAATATAGTACAGAAACTG -3’; 250mM de cada dNTP;1,0μL de DNA total e volume final de 15μL. Os ciclos de amplificação da PCR consistiram de uma etapa inicial de desnaturação em 94ºC por 1 minutos, anelamento em 68ªC durante 1 minutos, extensão dos iniciadores em 72ºC por 1 minuto e desnaturação a 94ºC por 1 minutos. A cada três ciclos, a temperatura de anelamento foi reduzindo para 66, 64, 62 e 60ºC. Na última temperatura o número de ciclos foi aumentado para 35, seguido de extensão final de 72ºC por 10 minutos. Os produtos de amplificações foram revelados por eletroforese em géis de poliacrilamida a 6% corados pela prata (SANTOS et al. 1993) para a visualização de fragmentos de ~150-157pb e 200pb conforme descrito na Tabela 2.
3.13 Detecção dos produtos da PCR
Com a técnica de eletroforese, os produtos amplificados pela PCR foram visualizados em géis de poliacrilamida a 6%, revelados pela prata (SANTOS et al., 1993) as bandas amplificadas foram monitoradas pela utilização do marcador de peso molecular de 100pb (Steap Ladder, Promega, Madison, USA). Os géis foram fixados com solução de etanol a 10% e ácido acético a 0,5% com agitação constante durante cinco minutos. Em seguida foram corados com o nitrato de prata a 0,2% em agitação por dez minutos e lavados em água destilada duas vezes seguidas. A revelação foi com a solução de NaOH 0,75M e formaldeído 0,1M sob agitação até o surgimento das bandas. Por fim, os géis foram transferidos para solução fixadora e fotografados.
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4 RESULTADOS
4.1 Infecção experimental em camundongos com os isolados TcI, TcII e TcIII A infecção experimental foi avaliada para conhecer o melhor momento para alimentação dos insetos. A parasitemia dos camundongos infectados com os isolados RN79 e Pl1.10.14 foram patentes a partir do 5º dia após a infecção (DAI). No Pl.1.10.14 (TcIII) foi possível observar picos no 6º, 10º e 13º DAI. Na RN79 (TcII), o pico de parasitemia foi mais tardio, entre o 10º e 11º DAI. Enquanto o isolado 3188 (TcI) não apresentou parasitemia patente na infecção experimental (Gráfico 1). A infecção do T. brasiliensis foi realizada quando os animais infectados estavam no 6º, 8º e 10º DAI com Pl1.10.14, 3188 e RN79, respectivamente em infecção simples. A infecção mista foi realizada com os isolados RN79 e Pl1.10.14, sendo o primeiro infecção no 8º DAI com a PL1.10.14 e após 15 dias, outro infecção com a RN79, no 11º DAI.
Gráfico 1: Curva de Parasitemia das cepas Pl1.10.14 (TcIII), RN79(TcII) e 3188(TcI)
4.2 Infecção experimental em T. brasiliensis
4.2.1 Infecção direta
Os insetos infectados com as formas tripomastigotas sanguíneos (TrS) foram examinados 30 dias após a infecção direta realizado com os isolados 3188(TcI), RN79(TcII) e Pl1.10.14(TcIII) em infecções simples e mista com RN79/Pl1.10.14. O percentual de positividade total e da PCR do kDNA foram semelhantes. No isolado 3188
0 200 400 600 800 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 MÉ DIA DE P A R A SIT O S E M 5µ L DE S A N G UE
DIAS APÓS INFECÇÃO
33
a positividade foi de 86,6%(13/15) e 66,6%(11/15) para os isolados RN79 e Pl1.10.15. Como por exemplo, no isolado RN79, em exame direto, 33,3% (5/15) dos insetos foram encontradas formas móveis do parasito, enquanto nos triatomíneos infectados com 3188 todos foram negativos. Os insetos infectados com a Pl1.10.14 e RN79 foram positivos tanto exame direto quanto na xenocultura em valores inferiores a PCR (Gráfico 2-A).
Na infecção mista entre Pl1.10.14 e RN79 com TrS, o percentual de positividade total e da PCR do kDNA foi de 90,0%(9/10) sendo superior a positividade destes quando em infecção simples. No exame direto, a positividade foi de 60,0%(6/10) em infecção mista enquanto que em infecções simples, a maior positividade neste mesmo exame foi 33,3% (Gráfico 2-A, gráfico 3-A). A xenocultura foi positiva em 20,0%(2/10) dos insetos infectados. A figura 2, mostra um gel em poliacrilamida a 6,0% representativo da amplificação da banda de 330pb do kDNA realizada no conteúdo intestinal de cinco insetos infectados com PL1.10.14/RN79. Todas as amostras positivas no exame direto e/ou hemocultura foram positivas na PCR.
4.2.2 Infecção indireta
Na infecção indireta, os experimentos foram realizados adicionando os parasitos crescidos em meio LIT com insetos alimentados na infecção indireta (Gráfico 2-B). Em infecção simples, como na infecção direta o isolado 3188 apresentou o maior percentual de positividade total com 60,0%(6/10), seguido por RN25 com 50,0%(5/10) e Pl1.10.14 com 40,0%(4/10). Na PCR, o fragmento do kDNA estava presente no isolado 3188 em 60,0%(6/10) dos insetos. Enquanto que, nos insetos infectados com RN25 e Pl1.10.14, a positividade foi de 20,0%(2/10). Na xenocultura 40,0%(4/10) dos insetos infectados com RN25 estavam com formas móveis do parasito, e em 3188 e Pl1.10.14 foi de 30,0%(3/10). Em nenhuma das cepas foi observado o parasito no exame direto (Gráfico 2-B).
O Grafico 3-B mostra os resultados com infecções mistas entre 3188, RN25 e Pl1.10.14. O percentual de positividade total e da PCR do kDNA da infecção mista de 3188/Pl1.10.14 foi de 100,0%(6/6), enquanto em 3188/RN25 foi de 40,0%(4/10). Os insetos infectados com RN25/PL1.10.14 apresentaram resultados semelhantes a infecção tripla com 3188/RN25/Pl1.10.14 com 40,0%(4/10) de positividade. Na xenocultura, a maior positividade foi com 3188/RN25, seguidos por infecções com RN25/Pl1.10.14 e 3188/Pl1.10.14 de 30,0%(3/10) e 16,6%(1/6) respectivamente. Na infecção tripla não foi encontrado parasito nas xenocultura.
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No exame direto, os insetos infectados com 3188/RN25 e 3188/Pl1.10.14 não foram observadas formas móveis dos parasitos, enquanto em RN25/Pl1.10.14 foi evidenciado 20,0%(2/10) e em infecção tripla 1,0%(1/10).
Figura 2: Gel em poliacrilamida a 6% representativo da PCR do kDNA do conteúdo intestinal de insetos infectados com PL1.10.14/RN79 na infecção indireta
PM: Peso Molecular; 1,2,4,5,6: Fragmento de 330 pb do kDNA do T. cruzi do conteúdo intestinal de triatomíneos com PL1.10.14/RN79 (infecção mista); 3: Controle Negativo; 7: CL Brener; 8: Branco.
PM 1 2 3 4 5 6 7 8
300 400
35 Gráfico 2: Positividade dos insetos com infecção simples examinados em exame direto, xenocultura e PCR do kDNA do T. cruzi alimentados em infecção direta e indireta
A: Insetos infectados por infecção direta; B: Insetos infectados por infecção indireta.
A
A
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A: Insetos infectados por infecção direta; B: Insetos infectados por infecção indireta. Gráfico 3: Positividade dos insetos com infecção mista examinados em exame direto, xenocultura e PCR do kDNA do T. cruzi alimentados em infecção direta e indireta
4.3 Percentual de detecção do T. cruzi por infecção direta e indireta
Para a técnica de infecção direta foram utilizadas 50 ninfas de T. brasiliensis, com os isolados 3188, RN79 e Pl1.10.14 submetidos as técnicas de exame direto, xenocultura e PCR do kDNA. A positividade das técnicas foram de 30,0%(15/50) no exame direto, 18,0%(9/50) em xenocultura e 88,0%(44/50) na PCR do kDNA.
Na infecção indireta foram avaliados 56 insetos infectados com 3188, RN25 e Pl1.10.14. A positividade no exame direto foi de 5,4%(3/56) e na xenocultura a 25,0%(14/56). Como na infecção direta, a PCR do kDNA apresentou os melhores resultados entre as técnicas de detecção com 41,1%(23/56) (Gráfico 4).
A
B
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Gráfico 4: Percentual de detecção das técnicas de exame direto, infecção e PCR kDNA em infecção direta e indireta na infecção direta e indireta
4.4 Caracterização molecular por diferentes marcadores genéticos
Na caracterização molecular do T. cruzi nos re-isolados obtidos após a infecção direta mostrou o mesmo perfil do isolado antes e após a infecção simples. Deste modo, infecção com 3188 (TcI) foi evidenciado bandas de 110pb no rDNA, 150pb no SL-IR e haplótipo A no COII. Em RN25 (TcII) foi observado bandas de 125pb no 24Sα rDNA e de 150pb no SL-IR e haplótipo C, classificando o re-isolado como TcII. Na Pl1.10.14 (TcIII) foi visualizado bandas de 110pb e 200pb para 24Sα rDNA e SL-IR respectivamente, e haplótipo B, caracterizando como TcIII (Tabela 4)
Em infecções mistas foi encontrado perfis mistos e simples. Em 3188/RN25 os re-isolados na xenocultura evidenciaram dois perfis, com TcII e em infecção mista (TcI/TcII). Em xenoculturas com 3188/Pl1.10.14 foi encontrado tanto o perfil de TcIII como o de TcI/TcIII. Nas infecções com três isolados foi evidenciado três perfis diferentes, TcI/TcII/TcII, com infecção tripla, TcII e TcIII (Tabela 4).
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Tabela 4: Caracterização genética da massa úmida do T. cruzi re-isolado na infecção por infecção direta no T. brasiliensis
Isolados DTU 24sα rDNA
(pb) SL-IR (pb) COII (pb) DTU re-isolado* 3188 TcI 110 150 A TcI RN25 TcII 125 150 C TcII Pl1.10.14 TcIII 110 200 B TcIII 1_3188/RN25 TcI/TcII 125 150 C TcII 2_3188/RN25 TcI/TcII 110 150 C TcI/TcII 1_3188/Pl1.10.14 TcI/TcIII 110 200 B TcIII 2_3188/Pl1.10.14 TcI/TcIII 110 200 A TcI/TcIII 3188/RN25/Pl1.10.14 TcI/TcII/TcIII 110+125 150 C+B TcI/TcII/TcIII 3188/RN25/Pl1.10.14 TcI/TcII/TcIII 125 150 C TcII 3188/RN25/Pl1.10.14 TcI/TcII 110 200 B TcIII Pb: Pares de bases; *: D’ÁVILA et al.,2012.
4.5 Caracterização genética do T. cruzi no conteúdo intestinal por infecção indireta no T. brasiliensis em infecções simples e mista
Ao observar a porcentagem de positividade dos isolados TcI, TcII e TcIII, todos os isolados apresentaram 100% de positividade em sua caracterização. Em infecções mistas, como foi encontrado mais de um perfil nas amostras de xenocultura. Nas culturas com 3188/RN25 33,3% das amostras tinham o perfil de TcII enquanto 66,6% apresentaram perfil de TcI/TcII. EM 3188/Pl1.10.14 foi encontrado 50,0% para TcIII e TcI/TcIII. Nas infecções triplas, 12,0% de TcII, 25,0% de TcIII e 63,0% de TcI/TcII/TcII (tabela 5).
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Tabela 5: Percentual de amostras do Trypanosoma cruzi caracterizadas geneticamente a partir de infecção indireta no T. brasiliensis em infecções simples e mistas
%
Amostra do T. cruzi DTU´s TcI TcII TcIII TcI/TcII TcI/TcIII TcII/TcIII TcI/TcII/TcIII
3188 TcI 100,0 - - - -
RN25 TcII - 100,0 - - - - -
Pl.1.10.14 TcIII - - 100 - - - -
3188/RN25 TcI/ TcII 0,0 33,3 - 66,0 - - -
3188/Pl1.101.4 TcI/ TcIII 0,0 - 50,0 - 50,0 - -
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5 DISCUSSÃO
Estudos recentes no semiárido do RN demonstraram a presença de T. brasiliensis, Triatoma pseudomaculata, P. lutzi e Rhodnius nasutus com elevados percentuais de infecção pelo T. cruzi. Estes insetos foram encontrados em ambientes domiciliares e silvestre na zona rural dos municípios de Mossoró, Governador Dix Sept Rosado, Apodi, Caraúbas, Lucrécia, Severiano Melo, São Miguel, Serra Negra do Norte e Caicó (CÂMARA et al., 2010; BARBOSA DA SILVA et al., 2016). Trabalhos do mesmo grupo mostraram elevada soroprevalencia nesta área e estudos de genotipagem identificaram o T. cruzi como TcI, TcII e TcIII em humanos, animais silvestres e triatomíneos. As amostras isoladas de T. brasiliensis foram identificadas como DTU II e III, em humanos TcI, TcII e TcIII e animais silvestres TcIII (CAMARA et al., 2010; BRITO et al., 2012; MARTINS et al., 2016). Assim, este trabalho demonstrou que o T. brasiliensis foi susceptível a todas as DTUs encontradas até o momento no RN.
Inicialmente, o comportamento biológico das cepas do T. cruzi em animais experimentais foram observados por parasitemia diária em infecções em camundongos para avaliar o melhor momento da infecção dos triatomíneos. A analise das curvas de parasitemia permitiu agrupar os isolados em biodemas II e III como descrito por ANDRADE et al., 1985. No biodema II, os picos de parasitemia devem ser irregulares entre os 12º e 20º D.A.I. enquanto que, o biodema III apresenta picos de parasitemia tardios ou ausentes entre os 20º e 30º D.A.I. e baixa taxa de mortalidade tardia (ANDRADE, 1974; ANDRADE et al., 1985). O Pl1.10.14 (TcIII) e RN79 (TcII) foram associadas ao biodema do tipo II e baixa virulência. O isolado 3188 não apresentou parasitemia patente e ausência de mortalidade, sugestivo de perfil de biodema III. Em Minas Gerais, Devera et al. (2002) também encontraram a sobreposição dos biodemas II e III ao avaliar cepas de pacientes da área. Assim, a infecção do T. brasiliensis foi realizada quando os animais infectados estavam no 6º ao 10º D.A.I. em infecção simples. A infecção mista foi realizada com os isolados RN79 e Pl1.10.14, sendo a primeiro infecção no 8º D.A.I. com a PL1.10.14 e após 15 dias com a RN79.
A PCR kDNA identificou o T. cruzi nas infecções experimentais no T. brasiliensis tanto em infecção direta como indireta com os percentuais de positividade superiores aos verificados nos exames direta e xenocultura. Resultados semelhantes foram verificados por Russomando et al., 1996, Braz et al., 2007, Zulantay et al., 2011. Em estudo comparando a PCR e o exame direto na detecção do T. cruzi nas fezes do T. infestans na
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Bolívia, Pizarro et al. (2007) obtiveram positividade de 81,1% e 55,5%, respectivamente. A PCR também revelou positividade elevada (84%) em comparação ao exame direto (26%) nas fezes do T. infestans oriundos de áreas endêmicas do Paraguai (RUSSOMANDO et al., 1996). Esta reação também foi eficiente para detectar o DNA do parasito em amostras de insetos mortos, no qual muitas vezes a microscopia mostra-se inadequada (DORN et al., 1999). Barbosa da Silva et al 2016 também relataram percentual de infecção natural em triatomíneos dos quais a PCR detectou 24,5% dos T. brasiliensis capturados no RN enquanto o exame direto e xenocultura estavam positivos em 1,5% e 0,4% respectivamente. Assim, ao comparar com métodos como o exame direto e da xenocultura, a PCR do kDNA foi o mais adequado para diagnóstico de positividade dos triatomíneos.
A infecção direta tem sido utilizado no diagnóstico parasitológico do T. cruzi e para possibilitar o isolamento do parasito (BRONFEN et al., 1989). Entretanto, fatores negativos no infecção como: a entrada proibida de triatomíneos em hospitais, reação alérgica a saliva dos insetos e por ser uma técnica invasiva, estimulou investigações sobre a infecção indireta descrito por Freitas et al., 1955. Ao comparar as duas técnicas de infecção com as DTU´s I, II e III, a infecção direta resultou em percentual de positividade de infecção superior aa infecção indireta, nas técnicas de PCR do kDNA, xenocultura e exame direto. Em pacientes na fase crônica, a infecção indireta foi considerado melhor ou igual aa infecção direta (FREITAS et al., 1955; SANTOS et al.,1995; PINEDA et al., 1998). Pineda et al., 1998, descreveram a xenopositividade de 28,0% pelo método direta e 35,0% pelo indireta em pacientes na fase crônica de Brasília/DF. No trabalho de Santos et al., 1995, a positividade no método artificial foi estatisticamente igual à do método natural, com aproximadamente 29,0%. Castro et al., 1983, mostram que a no infecção a infecção foi maior com subsequentes exames, assim a positividade de 22,8% foi elevada para 54,0% após a terceira repetição, concluindo que essa diferença de resultados está possivelmente associada às fases da infecção, método de detecção e o modelo utilizado. Além disso, as consecutivas alimentações na infecção mista da infecção direta podem ter favorecido a maior positividade do método, tendo em conta que, a quantidade de sangue ingerido pelo inseto e a repetição do infecção, aumentam a positividade do exame direto e PCR.
Com relação a susceptibilidade de cada isolado, 3188 (TcI) apresentou percentual de positividade elevada tanto em infecção direta como no indireta. A literatura relata a DTU I como a mais dispersa, sendo encontrada em todos triatomíneos associados aos
