UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
ALINE MARIA VASCONCELOS QUEIROZ
CARACTERIZAÇÃO DA PROPRIEDADE IMUNOESTIMULATÓRIA DE
Virus-like particles DE Triatoma virus E ANTÍGENOS RECOMBINANTES
QUIMÉRICOS DE Trypanosoma cruzi
NATAL - RN 2020
ALINE MARIA VASCONCELOS QUEIROZ
CARACTERIZAÇÃO DA PROPRIEDADE IMUNOESTIMULATÓRIA DE Virus-like particles DE Triatoma virus E ANTÍGENOS RECOMBINANTES
QUIMÉRICOS DE Trypanosoma cruzi
Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas da Universidade Federal do Rio Grande do Norte como requisito parcial para obtenção do título de Mestre em Ciências Farmacêuticas (Área de concentração: Bioanálises e Medicamentos).
Orientador: Prof. Dr. Marcelo Sousa Silva Coorientador: Prof. Dr. Diego M. Guérin Aguilar
NATAL - RN 2020
Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN Sistema de Bibliotecas - SISBI
Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Setorial do Centro Ciências da Saúde – CCS
Queiroz, Aline Maria Vasconcelos.
Caracterização da propriedade imunoestimulatória de Virus-like particles de Triatoma virus e antígenos recombinantes quiméricos de Trypanosoma cruzi / Aline
Maria Vasconcelos Queiroz. - 2020.
88f.: il.
Dissertação (Mestrado em Ciências Farmacêuticas) - Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Centro de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências
Farmacêuticas. Natal, RN, 2020.
Orientador: Prof. Dr. Marcelo Sousa Silva. Coorientador: Prof. Dr. Diego Marcelo Guérin Aguilar.
1. Trypanosoma cruzi - Dissertação. 2. Vacinas - Dissertação. 3. Virus-like particles (VLPs) - Dissertação. 4. Resposta imune humoral - Dissertação. 5. Triatoma virus - Dissertação. 6. Adjuvante - Dissertação. I. Silva, Marcelo Sousa. II. Aguilar, Diego Marcelo Guérin. III. Título.
RN/UF/BS-CCS CDU 616.937
Aline Maria Vasconcelos Queiroz
CARACTERIZAÇÃO DA PROPRIEDADE IMUNOESTIMULATÓRIA DE Virus-like particles DE Triatoma virus E ANTÍGENOS RECOMBINANTES QUIMÉRICOS DE Trypanosoma cruzi.
Banca Examinadora:
Prof. Dr. Marcelo de Sousa da Silva Presidente – UFRN
Dra. Paola Alejandra Fiorani Celedon Examinador Externo – IBMP/PR
Prof. Dr. Diego Marcelo Guérin Aguilar Coorientador – UPV/Espanha
Dra. Manoela Torres do Rêgo Examinador Interno – UFRN
Natal, 31 de março de 2020
NATAL - RN 2020
DEDICATÓRIA
Dedico este trabalho à minha avó materna Socorro e ao meu tio Carlos Augusto (Neno), fisicamente não mais presentes, foram peças-chave no início de tudo. Dedico também ao meu avô materno Luis Siqueira que não pôde acompanhar fisicamente muitas das minhas conquistas, mas sei que de algum modo sabe e está comigo.
Com gratidão, dedico este trabalho aos meus pais Isabel e José, meus irmãos Ana Carolina e Luis Felipe, meus avôs paternos Maria e Joaquim e a minha tia Cosma. Vocês são a minha maior fonte de apoio e amor incondicionais.
Minha afilhada Luz que está a caminho, dedico-lhe este trabalho pois como mulher atuante na pesquisa e sociedade, quero que você me tenha também como exemplo e saiba que você pode ser o que quiser!
Esta pesquisa é dedicada principalmente ao indivíduos em risco de infecção, os infectados e os pacientes chagásicos que sofreram e sofrem com a não solução definitiva contra a doença de Chagas.
AGRADECIMENTOS
O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES - Brasil) — Código de Financiamento 001, agradeço a concessão da bolsa de estudos que possibilitou a dedicação integral ao mestrado. Muito obrigada ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq - Brasil); à Fundação para a Ciência e Tecnologia, Portugal; à Fundação Biskaia, Espanha; à Universidade do País Basco, Espanha; e à rede internacional de investigação denominada RedVLP, financiada pelo o Programa Ibero-Americano de Ciência e Tecnologia para o Desenvolvimento (CYTED). As fontes de financiamento são e sempre serão importantes na logística e estímulo para este e qualquer outro trabalho.
Aos professores e pesquisadores envolvidos diretamente neste projeto: Prof. Dr. Marcelo Sousa Silva (orientador) e Prof. Dr. Diego Guérin (coorientador), agradeço a confiança, orientação e amizade. Prof. Dr. Fred Santos (Fiocruz - Bahia), envolvido no processo de produção das antígenos recombinantes quiméricos, agradeço a colaboração na qualificação e nesta versão final. Profa. Dra. Sandra Gabelli (Johns Hopkins University - USA), envolvida no processo de produção das VLPs-TrV, muitíssimo obrigada.
Agradeço ao Programa de Pós Graduação em Ciências Farmacêuticas da Universidade Federal do Rio Grande do Norte (PPgCF - UFRN), desde a secretaria e seu atendimento de excelência até os professores do curso de mestrado com tantos ensinamentos sobre a área acadêmica e a vida. Além disso, um agradecimento especial ao pessoal do biotério, aos laboratórios parceiros desta pesquisa e aos que fazem e fizeram parte do Laboratório de Imunoparasitologia. Obrigada a todos que pude contar não só para experimentos ou situações burocráticas.
Proponho-me a agradecer à espiritualidade amiga que está comigo até mesmo quando nem eu acredito, as coisas que acontecem em minha vida só me provam o quão abençoada sou e que evoluir é o melhor que posso fazer. Ao grupo GEON, meus irmãos que a espiritualidade uniu, nosso encontro foi um divisor de águas, obrigada por tanta paz e cuidado que há entre nós.
Nenhuma palavra será suficiente para agradecer aos meus pais, irmãos, avós paternos, tios e primos presentes. Vocês são o que tenho de mais valioso. Meu companheiro Guilherme, para além do lado amoroso, quero que saiba que mesmo mil anos, mil vidas, não são suficientes para agradecer tanto amor, apoio e cuidado. Você é, com certeza, uma das pessoas mais
importantes para mim. Obrigada por absolutamente tudo o que você e sua família fizeram e fazem, tenho certeza de que evoluímos todos juntos desde o nosso encontro.
Minhas maravilhosas amigas de infância, os amados darksides, minhas meninas do cursinho, as amizades da graduação e Mossoró, as mulheres incríveis da turma da Livinha e as pessoas queridas que me cativaram em Natal, meu coração é cheio de carinho e gratidão por ter vocês. A cada pessoa que passou por minha vida e contribuiu com apoio, um sorriso, um abraço, um conselho, um olhar de ternura, um momento de alegria e/ou uma mensagem de acalento: MUITO OBRIGADA!
“...o laboratório representa em nossa terra uma esperança. Dele esperamos esclarecidos os inúmeros problemas de patologia tropical, que por aí, prevalecem obscuros, zombando da sagacidade dos observadores e cujas incógnitas estão repletas das ilações as mais benéficas ao nosso bem-estar.”
(Carlos Chagas)
RESUMO
A infecção causada pelo protozoário Trypanosoma cruzi acomete os seres humanos ocasionando a doença de Chagas. Atualmente, as principais medidas disponíveis para esta doença são o tratamento medicamentoso e o controle vetorial. O desenvolvimento de vacinas acontece, principalmente, pelo o uso de antígenos do agente etiológico. As partículas semelhantes a vírus (do inglês virus-like particles ou VLPs) são estruturas análogas a cápsides virais compostas essencialmente por proteínas estruturais, não possuem material genético viral e são amplamente utilizadas em protocolos de vacinação por causa de suas propriedades imunoestimulatórias. Nesse contexto, o objetivo do atual trabalho foi utilizar estratégias em um modelo murino de imunização para caracterizar a capacidade imunoestimulatória de partículas semelhantes a vírus de Triatoma virus (VLPs-TrV), na presença e ausência do adjuvante hidróxido de alumínio. E paralelamente, observar o comportamento imunogênico de quatro proteínas recombinantes quiméricas de T. cruzi em forma de mix (mix-IBMP) associadas ou não as VLPs-TrV. Para isso, camundongos BALB/c (Mus musculus) foram imunizados uma ou duas vezes, a depender da estratégia, com amostras de soro colhidas 15, 30 e 45 dias após a imunização. O perfil de anticorpos específicos IgG total, IgG1, IgG2a, IgG2b e IgG3 foram determinados por teste imunoenzimático. Os dados obtidos demonstram a capacidade das VLPs-TrV sem a presença de alumínio de induzir preferencialmente os anticorpos do tipo IgG2b e IgG3, aliás, o uso do alumínio não interferiu no perfil de IgG total. Além disso, mix-IBMP tem melhor perfil de IgG total e subclasses IgG1 e IgG3 quando associado as VLPs-TrV, mesmo com a possível competição antigênica entre as VLPs e mix-IBMP. Em conclusão, os resultados encontrados contribuem para a possível utilização das VLPs-TrV como adjuvante em formulações vacinais em modelo murino, apesar de os mecanismos na indução da resposta imune polarizada para Th1 precisarem ser mais claramente entendidos. Ademais, avaliar a utilização das proteínas em novos protocolos in vivo como candidatos antigênicos torna-se interessante.
Palavras-chave: Virus-like particles (VLPs). Adjuvante. Vacinas. Resposta imune
ABSTRACT
The infection caused by the protozoan Trypanosoma cruzi affects humans and is called Chagas disease. Currently, the main measures available to reduce the incidence of this disease are drug treatment and vector control. The development of vaccines is mainly through the use of antigens of the etiologic agent. Virus-like particles (VLPs) are structures analogous to viral capsids composed essentially of structural proteins, they have no viral genetic material and are widely used in vaccination protocols because of their immunostimulatory properties. In this context, the objective of this study was to use strategies in a murine immunization model to characterize the immunostimulatory capacity of virus-like particles from Triatoma virus (VLPs-TrV), analyzed in the presence or absence of the aluminium hydroxide vaccine adjuvant. In parallel, observing the immunogenic behavior of four T. cruzi chimeric recombinant proteins in mix form (mix-IBMP) associated or not with the VLPs-TrV. For this, BALB/c mice (Mus musculus) were immunized once or twice, depending on the strategy, with serum samples collected 15, 30 and 45 days after the immunization. Subsequently, serum samples from animals immunized with VLPs-TrV were obtained at different times after immunizations. The total IgG, IgG1, IgG2a, IgG2b and IgG3 specific antibody profile was determined by enzyme immunoassay. The data obtained demonstrate the ability of VLPs-TrV, without the presence of aluminum, to preferably induce IgG2b and IgG3 type antibodies; in fact, the use of aluminum did not interfere with the total IgG profile. In addition, mix-IBMP has a better profile of total IgG and IgG1 and IgG3 subclasses when associated with VLPs-TrV, even with the possible antigenic competition between the VLPs-TrV and IBMP proteins. In conclusion, these results contribute to the possible use of VLPs-TrV as an adjuvant in vaccine formulations in a murine model, although the mechanisms in inducing the polarized cellular immune response to Th1 need to be more clearly understood. In addition, evaluating the use of proteins in new protocols in vivo as antigenic candidates is interesting.
Keywords: Virus-like particles (VLPs). Adjuvante. Vaccine. Humoral immune response.
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ACF Adjuvante completo de Freund AIF Adjuvante incompleto de Freund
ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária
APCs Células apresentadoras de antígeno (do inglês, Antigen
presenting cells)
BALB/c Linhagem de camundongos albinos
BZN Benznidazol
C1 Proteína da membrana plasmática C3 Proteína da membrana plasmática
c-di-AMP Segundo mensageiro usado na transdução de sinal em bactérias CpG DNA sintético curto, DNA bacteriano
DC Doença de Chagas
DNA Ácido desoxirribonucleico (do inglês, Deoxyribonucleic acid) DNDi Iniciativa medicamentos para doenças Negligenciadas (do
inglês, Drugs for neglected diseases initiative) DTap Vacina tríplice (difteria, tétano e coqueluche)
ELISA Ensaio de imunoabsorção enzimática (do inglês, Enzyme-linked
immunosorbent assay)
FDA Administração de comida e medicamentos (do inglês, Food and
drug administration)
FCH-FS-4 Anticorpo monoclonal
GP Glicoproteínas da superfície celular
Hib Vacina para Haemophilus influenzae tipo b
HPV Vírus do papiloma humano
IBMP Instituto de Biologia Molecular do Paraná
IFN-γ Interferon-gama
IgG Imunoglobulina G
IgM Imunoglobulina M
IL Interleucina
MAC Complexo de ataque à membrana (do inglês, Membrane attack
complex)
MASPs Proteínas de superfície associadas à mucina (do inglês,
Mucin-associated surface protein)
Mix-IBMP Proteínas recombinantes quiméricas IBMP em forma de mix Mix-IBMP + Alum Proteínas recombinantes quiméricas IBMP em forma de mix
associadas ao hidróxido de alumínio
Mix-IBMP + VLP Proteínas recombinantes quiméricas IBMP em forma de mix associadas às VLPs-TrV
NFX Nifurtimox
NK Células exterminadoras naturais (do inglês, Natural killer cell) ODN-CpG Oligodesoxinecleotódeos CpG
OMS Organização Mundial da Saúde
OPD o-phenylenediamine dihydrochloride
PAMP's Padrões Moleculares Associados a Patógenos (do inglês,
Pathogen associated molecular patterns)
PBS Tampão fosfato-salino (do inglês, phosphate buffered saline)
pET28a Plasmídeo
PRR’s Receptores de reconhecimento de padrões (do inglês, Pattern
recognition receptors)
RN Estado do Rio Grande do Norte RNA D0 D15 D30 D45 D60 D70
Ácido ribonucleico (do inglês, Ribonucleic acid) Dia 0, antes da imunização
Quinze (15) dias após imunização Trinta (30) dias após imunização
Quarenta e cinco (45) dias após imunização Sessenta (60) dias após imunização
Setenta (70) dias após imunização.
T CD4 Molécula (glicoproteína) expressada na superfície de células T (do inglês, CD4 T helper cells)
T CD8 Molécula (glicoproteína) expressada na superfície de células T (do inglês, CD8 T helper cells)
Tc24 Proteína recombinante de Trypanosoma cruzi TCR Receptores de células T (do inglês, T-cell receptor)
Tcr7 Anticorpo monoclonal
Tdap Vacina tríplice (difteria, tétano e tosse convulsa)
Th1 Resposta mediada por células T helper diferenciada para o tipo 1 (do inglês, T helper 1 cells)
Th2 Resposta mediada por células T helper diferenciada para o tipo 2 (do inglês, T helper 2 cells)
TLR Receptores do tipo Toll (do inglês, Toll-like receptor) TNF Fator de necrose tumoral (do inglês, Tumor necrosis fator)
TrV Triatoma virus
USA Estados Unidos da América — EUA (do inglês, United States of
America)
VLPs Particulas semelhantes a vírus (do inglês, Virus-like particles) VLP-A Particulas semelhantes a vírus associado ao hidróxido de
alumínio
VLPs-TrV ou VLP Particulas semelhantes a vírus de Triatoma virus
WHO Organização Mundial da Saúde (do inglês, World health
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Ciclo de vida do protozoário Trypanosoma cruzi na transmissão vetorial da doença de Chagas... 22
Figura 2 Modelo de geração e cristalização das partículas vazias de Triatoma
virus (TrV)... 31
Figura 3 Gel de SDS-poliacrilamida corado com Coomassie Brilliant Blue G-250 das proteínas IBMP... 33
Figura 4 Representação esquemática do processo de imunização primária e secundária em camundongos com as VLPs-TrV em associação ou de forma isolada... 38
Figura 5 Representação esquemática do processo de imunização primária em camundongos imunizados com o mix-IBMP em associação ou isolado... 41
Figura 6 Partículas semelhantes a vírus de Triatoma virus recombinantes produzidas pelo sistema de expressão baculovírus... 43
Figura 7 Perfil de anticorpos do tipo IgG total anti-VLPs-TrV após imunização primária com as VLPs-TrV em associação ou não com o hidróxido de alumínio... 44
Figura 8 Perfil das subclasses de anticorpos IgG1 e IgG2a anti-VLPs-TrV após imunização primária com as VLPs-TrV em associação ou não com o hidróxido de alumínio... 45
Figura 9 Perfil de anticorpos do tipo IgG total anti-VLPs-TrV após imunização secundária com as VLPs-TrV em associação ou não com o hidróxido de alumínio... 46
Figura 10 Perfil de anticorpos do tipo IgG total anti-VLPs-TrV após imunização
secundária com as VLPs-TrV em associação ou não com o hidróxido de alumínio... 48
Figura 11 Perfil da subclasse de anticorpo IgG3 anti-VLPs-TrV após
imunização secundária com as VLPs-TrV em associação ou não com o hidróxido de alumínio... 49
Figura 12 Perfil de anticorpos IgG total, IgG1, IgG2a, IgG2b e IgG3
anti-VLPs-TrV após 70 dias da imunização secundária com as VLPs-anti-VLPs-TrV em associação ou não com o hidróxido de alumínio... 49
Figura 13 Perfil de anticorpos do tipo IgG total anti-IBMP-8.1 após imunização
primária com o mix-IBMP associado às VLPs-TrVou ao hidróxido de alumínio... 51
Figura 14 Perfil de anticorpos do tipo IgG total anti-IBMP-8.2 após imunização
primária com o mix-IBMP associado às VLPs-TrVou ao hidróxido de alumínio... 51
Figura 15 Perfil de anticorpos do tipo IgG total anti-IBMP-8.3 após imunização
primária com o mix-IBMP associado às VLPs-TrVou ao hidróxido de alumínio... 52
Figura 16 Perfil de anticorpos do tipo IgG total anti-IBMP-8.4 após imunização
primária com o mix-IBMP associado às VLPs-TrVou ao hidróxido de alumínio... 52
Figura 17 Perfil de anticorpos do tipo IgG total anti-IBMP-8.1; 8.2; 8.3 e 8.4
após imunização primária com o mix-IBMP associado às VLPs-TrV... 54
Figura 18 Perfil de anticorpos do tipo IgG total anti-VLPs-TrV após imunização
primária com o mix-IBMP associado às VLPs-TrV... 55
Figura 19 Perfil da subclasse de anticorpo IgG1 anti-IBMP-8.1; 8.2; 8.3 e 8.4
após 30 dias da imunização primária com o mix-IBMP associado às VLPs-TrV ou ao hidróxido de alumínio... 56
Figura 20 Perfil da subclasse de anticorpo IgG3 anti-IBMP-8.1; 8.2; 8.3 e 8.4
após 30 dias da imunização primária com o mix-IBMP associado às VLPs-TrV ou ao hidróxido de alumínio... 57
Figura 21 Perfil de anticorpos do tipo IgG total anti-IBMP-8.1; 8.2; 8.3 e 8.4
após imunização primária somente com o mix-IBMP... 58
Figura 22 Perfil da subclasse de anticorpo IgG1 anti-IBMP-8.1; 8.2; 8.3 e 8.4
após 30 dias da imunização primária com o mix-IBMP e em associação com as VLPs-TrV... 59
Figura 23 Perfil da subclasse de anticorpo IgG3 anti-IBMP-8.1; 8.2; 8.3 e 8.4
após 30 dias da imunização primária com o mix-IBMP e em associação com as VLPs-TrV... 60
LISTA DE QUADROS
Quadro 1 Informações sobre a composição das proteínas recombinantes quiméricas de T. cruzi de denominadas IBMP-8.1, IBMP-8.2, IBMP-8.3 e IBMP-8.4... 33
Quadro 2 Estratégia de imunização primária e secundária em camundongos utilizando as VLPs-TrV em associação ou não com o hidróxido de alumínio em suspensão a 10% para posterior avaliação da resposta imune humoral... 37
Quadro 3 Estratégia de imunização primária em camundongos utilizando as proteínas recombinantes quiméricas em forma de mix (mix-IBMP) em associação ou isolado para posterior avaliação da resposta imune humoral... 40
Quadro 4 Estratégia de imunização primária em camundongos utilizando as proteínas recombinantes quiméricas em forma de mix (mix-IBMP) para posterior avaliação da resposta imune humoral... 40
17 SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO... 19 2 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA... 21 2.1 DOENÇA DE CHAGAS... 21 2.1.1 Agente etiológico... 23
2.1.2 Aspectos da resposta imune na doença de Chagas... 25
2.1.2.1 Resposta imune inata... 25
2.1.2.2 Resposta imune adaptativa ... 26
2.2 ANTÍGENOS EM ESTRATÉGIAS DE IMUNIZAÇÕES NA DOENÇA DE CHAGAS... 27
2.3 DESENVOLVIMENTO DE VACINAS ... 29
2.3.1 Virus-like particles — VLPs... 30
2.3.2 Vacinas de VLPs... 30
2.3.3 Partículas semelhantes a vírus de Triatoma virus (VLPs-TrV)... 31
2.4 PROTEÍNAS RECOMBINANTES QUIMÉRICAS... 32
3 OBJETIVOS... 35
3.1 OBJETIVO GERAL... 35
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS... 35
4 MATERIAIS E MÉTODOS... 36
4.1 OBTENÇÃO DAS PARTÍCULAS SEMELHANTES A VIRUS DE Triatoma virus (VLPs-TrV)... 36
4.2 ANIMAIS DE EXPERIMENTAÇÃO... 36
4.3 ESTRATÉGIA DE IMUNIZAÇÃO PRIMÁRIA E SECUNDÁRIA COM AS VLPs-TrV EM ASSOCIAÇÃO OU DE FORMA ISOLADA... 37
4.4 ESTRATÉGIA DE IMUNIZAÇÃO PRIMÁRIA COM AS PROTEÍNAS RECOMBINANTES QUIMÉRICAS DE Trypanosoma cruzi... 39
4.4.1 Caracterização da resposta imune humoral de camundongos imunizados com o mix-IBMP em associação ou isolado... 40
4.5 ANÁLISES ESTATÍSTICAS... 41
18 5.1 PARTÍCULAS SEMELHANTES A VÍRUS DE Triatoma virus (VLPs-TrV)
RECOMBINANTES... 43
5.2 CARACTERIZAÇÃO DA RESPOSTA IMUNE HUMORAL NA IMUNIZAÇÃO PRIMÁRIA COM AS VLPs-TrV... 44
5.3 CARACTERIZAÇÃO DA RESPOSTA IMUNE HUMORAL NA IMUNIZAÇÃO SECUNDÁRIA COM AS VLPs-TrV... 46
5.4 CARACTERIZAÇÃO DA RESPOSTA IMUNE HUMORAL NA IMUNIZAÇÃO PRIMÁRIA COM AS PROTEÍNAS RECOMBINANTES QUIMÉRICAS DE Trypanosoma cruzi EM FORMA DE MIX EM ASSOCIAÇÃO OU NÃO COM AS VLPs-TrV... 51
5.5 CARACTERIZAÇÃO DA RESPOSTA IMUNE HUMORAL NA IMUNIZAÇÃO PRIMÁRIA SOMENTE COM AS PROTEÍNAS RECOMBINANTES QUIMÉRICAS DE Trypanosoma cruzi EM FORMA DE MIX... 58
6 CONCLUSÕES... 62
7 PERSPECTIVAS... 63
8 FONTES DE FINANCIAMENTO... 64
REFERÊNCIAS... 65
APÊNDICE I – CAPÍTULO DE LIVRO PUBLICADO... 84
APÊNDICE II – ARTIGO ORIGINAL A SER SUBMETIDO... 85
APÊNDICE III – ARTIGO DE REVISÃO EM PRODUÇÃO... 86
APÊNDICE IV – RESUMO APRESENTADO ORALMENTE... 87
19
1 INTRODUÇÃO
As doenças tropicais negligenciadas são importantes problemas de saúde pública em países mais pobres, como os situados nas Américas (ORGANIZAÇÃO PANAMERICANA DA SAÚDE, 2014). Algumas são transmitidas por vetores e causadas por protozoários cinetoplastídeos os quais apresentam distribuições geográficas e epidemiológicas diferentes, um reflexo da complexidade biológica durante a interação parasito–hospedeiro–ambiente (VON ZUBEN, 1997). A doença de Chagas (DC), inserida na lista de doenças tropicais negligenciadas, é transmitida pelo inseto vetor conhecido no Brasil popularmente como barbeiro e tem como agente etiológico o protozoário Trypanosoma cruzi (CHAGAS, 1909).
Estima-se que 6 a 7 milhões de pessoas estejam infectadas, principalmente na América Latina, mas por conta do diagnóstico deficiente (< 10%) e subnotificações o número tende a ser maior (BEAUMIER et al., 2016; DNDI, 2019). A fase aguda da infecção é de difícil caracterização clínica, uma vez que geralmente é assintomática. O boletim epidemiológico apresentado em 2019 pelo Ministério da Saúde apontou entre 2012–2016 em todos os estados brasileiros 1.190 casos agudos, com a região Norte apontada com o maior número de casos (1.156), sendo a transmissão oral responsável por 869 casos, seguida da vetorial com 105 casos (BRASIL, 2019). A infecção por via oral traz como consequência um aumento da mortalidade observado comparada à infecção pelo vetor (SILVA-DOS-SANTOS et al., 2017).
A fase crônica é dividida entre assintomática, indeterminada com sorologia positiva sem sinais e sintomas, e sintomática (PÉREZ-MOLINA; MOLINA, 2018). A cronicidade na forma clínica cardíaca da doença afeta 30% dos indivíduos infectados. Estima-se que apenas 1% dos indivíduos com DC crônica recebam o tratamento, ocasionando uma média de 14.000 óbitos anualmente (WHO, 2019). No cenário brasileiro, dentre as doenças crônicas, a DC acomete cerca de 1,2 milhão de indivíduos e representa 11,4% da insuficiência cardíaca (WHO, 2015). As principais medidas disponíveis para reduzir a incidência de algumas doenças tropicais negligenciadas são os programas de tratamento medicamentoso e controle vetorial, os quais podem resultar na seleção de protozoários e vetores resistentes que, juntamente com o alto custo e baixa sustentabilidade dessas intervenções, reforça a necessidade de desenvolvimento de vacinas (GARCIA et al., 2011). No âmbito da DC, as estratégias de vacinas sugerem a utilização de antígenos das principais formas evolutivas de vida do parasito: tripomastigota, amastigota e epimastigota (RODRÍGUEZ-MORALES et al., 2015).
20 Nas formulações vacinais, a utilização de proteínas recombinantes quiméricas se torna interessante e viável. Os sistemas de expressão de proteínas, como por exemplo por baculovírus, são processos envolvidos na biotecnologia moderna que torna eficaz a construção de proteínas (AUCOIN et al., 2007), que no caso das quiméricas são constituídas por sequências de genes distintos de antígenos em uma única molécula, possibilitando o aumento de imunogenicidade oferecendo ao sistema imune uma variedade de epítopos (RODRÍGUEZ-MORALES et al., 2015). Estratégias utilizando moléculas quiméricas também têm mostrado eficácia para diagnóstico sorológico de doenças como, por exemplo, DC em humanos (SANTOS et al., 2016b; 2017a) e em cães (LEONY, 2019).
Ainda no que diz respeito ao uso de moléculas que possam aumentar a imunogenicidade nas vacinas, as partículas semelhantes a vírus, do inglês virus-like particles (VLPs), é uma tecnologia bastante utilizada (SARKAR et al., 2019). Atualmente discute-se não só vacinação profilática para evitar infecções agudas, mas também a terapêutica no controle da DC crônica. Para os indivíduos infectados em estágio indeterminado, a vacina terapêutica em associação ou não com os medicamentos disponíveis pode ter impacto significativo na prevenção de complicações cardíacas (BEAUMIER et al., 2016). Por conseguinte, torna-se necessário o desenvolvimento de estudos para a produção e validação de formulações vacinais para o controle da DC, a fim de contribuir em uma problemática que afeta populações a nível mundial. Nesse cenário, este estudo tem como objetivo principal avaliar a capacidade imunoestimulatória envolvendo a tecnologia VLP em associação ou não a um adjuvante convencional, hidróxido de alumínio. Paralelamente, avaliar a capacidade imunogênica de proteínas recombinantes quiméricas de Trypanosoma cruzi utilizadas em protocolos de imunização. Portanto, pretende-se caracterizar a imunogenicidade desses sistemas no que diz respeito ao tipo e a qualidade de anticorpos produzidos durante o processo de imunização estudado neste trabalho.
21
2 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA
2.1 DOENÇA DE CHAGAS
A doença de Chagas (DC), também conhecida como tripanossomíase americana, é uma zoonose causada pelo protozoário hemoflagelado denominado Trypanosoma cruzi, descrito por Carlos Ribeiro Justiniano das Chagas em 1909 (CHAGAS, 1909). Segundo a Organização Mundial da Saúde (OMS), esta doença acomete aproximadamente 6 a 7 milhões de indivíduos e é endêmica principalmente em 21 países da América Latina. Estima-se que 70 milhões de pessoas correm o risco de infecção nestas regiões com incidência anual de 30 mil novos casos e 14 mil óbitos em média. Contudo, sua disseminação para Europa, Estados Unidos e outros países aumentou consideravelmente por conta da imigração de pessoas infectadas que carreiam o parasito (WHO, 2017; DNDI, 2017).
Segundo o Boletim Epidemiológico do Ministério da Saúde no Brasil, em 2018 foram confirmados 380 casos de DC em fase aguda, sendo a região Norte do país apontada com a maior porcentagem (92,1%). Os casos estão localizados em 66 municípios do país, sendo o estado do Pará com maior número de registros (BRASIL, 2019b). Estima-se que haja de 1,0% a 2,4% da população afetada, essa notável variação é mais um desafio para enfrentar a respeito da DC, em que mais de 80% das pessoas não tem acesso ao diagnóstico (DIAS et al., 2016).
No Estado do Rio Grande do Norte (RN), estudos recentes demonstraram a presença domiciliar e peridomiciliar de vetores da doença infectados (BARBOSA-SILVA et al., 2016). O último inquérito realizado com moradores de áreas rurais revelou 6,5% de soroprevalência na mesorregião oeste, principalmente entre os municípios localizados na chapada do Apodi - Caraúbas, Apodi, Severiano Melo e Governador Dix Sept Rosado (BRITO et al., 2012). Esses dados refletem a existência e manutenção do ciclo do protozoário no RN.
A fase aguda da doença, geralmente assintomática, é responsável por cerca de 5% dos óbitos. Já a fase crônica pode apresentar-se assintomática (indeterminada) e sintomática, sendo esta última responsável por causar problemas cardíacos e/ou digestivos, os quais estão presentes em 30% a 40% dos portadores. Os portadores da fase crônica sintomática podem apresentar, devido ao parasitismo, características como crescimento exagerado do coração (cardiomegalia), do esôfago (megaesôfago) e do colón (megacolón), causando a perda de função dos orgãos e levando a morte (LARANJA et al., 1956; DIAS, 1989; STIMPERT; MONTGOMERY, 2010; PÉREZ-MOLINA; MOLINA, 2018).
22 Os fármacos tradicionais utilizados para o tratamento da doença são o Benznidazol (BZN) e o Nifurtimox (NFX), utilizados desde 1960. Entretanto, no Brasil somente o BZN possui registro ativo na ANVISA (Agência Nacional de Vigilância Sanitária). Ambos são eficazes durante a fase aguda da doença, contudo quando se trata da fase crônica o tratamento tem pouca eficiência, além de causar efeitos adversos nas duas fases, principalmente cutâneos (BZN) e gastrointestinais (NFX), com taxas de interrupção do tratamento variando de 15 a 20% (MOLINA et al., 2015; MORILLO et al., 2015; KRATZ et al., 2018).
A infecção pelo parasito T. cruzi tem como principal forma de transmissão a vetorial por meio das fezes do triatomíneo, como descrita na Figura 1. Outras formas de transmissão devem ser consideradas, como alimentos contaminados com as fezes de triatomíneos previamente infectados (transmissão oral), transfusão de sangue e doação de órgãos (CICORA et al., 2014; COURA, 2015).
Figura 1 – Ciclo de vida do protozoário Trypanosoma cruzi na transmissão vetorial da doença
de Chagas.
Legenda: Ao se alimentar do sangue por meio da picada (hematofagia) no hospedeiro vertebrado [1], o triatomíneo
infectado simultaneamente defeca e em suas fezes com urina está contido o parasito na forma tripomastigota metacíclica [2], este processo causa irritabilidade fazendo com que o hospedeiro vertebrado se coce gerando uma solução de continuidade, rompendo a membrana da pele ajudando o protozoário entrar na corrente sanguínea [3]. Ao entrar, o parasito reconhece e invade células nucleadas infectando-as [4]. Para garantir a sobrevivência diferencia-se em amastigota, forma intracelular mais resistente aos mecanismos de eliminação celular [5]. Após se multiplicar e romper a célula, causando a sua morte [6], a forma amastigota que não apresenta flagelo para se deslocar, diferencia-se em tripomastigota e atinge a corrente sanguínea [7], invadindo e infectando novas células/tecidos [8]. Outro triatomíneo ao se alimentar, por exemplo, de um ser humano infectado irá contrair a
23
forma tripomastigota presente no sangue periférico [9] que, ao entrar no estômago do inseto, pelas condições ambientais, diferencia-se para epimastigota [10] e ao alcançar o intestino grosso, mais uma vez volta para tripomastigota metacíclica [11], estabelecendo assim o ciclo de vida do protozoário T. cruzi. Fonte: Imagem feita pela autora utilizando o programa de web Biorender (www.biorender.com).
O protozoário T. cruzi é objeto de estudo de muitos parasitologistas e biologistas moleculares, principalmente pela sua facilidade em ser cultivado, além da possibilidade de desenvolvimento de modelos experimentais de infecção. No entanto, existem lacunas no conhecimento, especialmente no que diz respeito ao desenvolvimento de vacinas e novos fármacos, por conta de os medicamentos existentes apresentarem eficácia limitada (MÉDECINS SANS FRONTIÈRES, 2008). Várias linhas de investigação estão em desenvolvimento na tentativa de produzir vacinas contra a infecção causada por T. cruzi, baseados principalmente na descoberta de possíveis candidatos antigênicos do protozoário que possam melhorar a imunogenicidade nas estratégias (HAOLLA et al., 2009; DUMONTEIL et al., 2012; SERNA et al., 2014).
A complexidade genômica do parasito T. cruzi, na qual a sua variabilidade populacional é classificada em seis grupos independentes (TcI–TcVI) denominadas unidades discretas de tipagem (do inglês, Discrete Typing Units — DTUs) (ZINGALES et al., 2009; LEWIS et al., 2009), e as questões sociais tornando a DC uma doença tropical negligenciada são fatores que fazem com o que o diagnóstico e tratamento sejam limitados, tornando o desenvolvimento de uma vacina segura e eficaz um dos principais desafios a serem alcançados pela vacinologia moderna (SACKS, 2014).
2.1.1 Agente etiológico
Trypanosoma cruzi é transmitido naturalmente ao homem e outros animais por meio de
seu vetor, o triatomíneo (CHAGAS, 1909). Este protozoário, pertencente à ordem Kinetoplastida e à família Trypanosomatidae, é caracterizado pela presença de um flagelo e uma mitocôndria localizada em seu cinetoplasto que, por sua vez, possui um DNA específico (CHAGAS, 1909; MOREL et al., 1980; ADL et al., 2005). O parasito apresenta elevada variabilidade intraespecífica (MANOEL-CAETANO et al., 2007), o que possibilita ampla distribuição geográfica na América Continental e em diversidade de hospedeiros (JURBERG et al., 2014).
O ciclo de vida heteroxênico do protozoário T. cruzi compreende a infecção de hospedeiros invertebrados e vertebrados, em que suas formas evolutivas estão relacionadas às alterações morfológicas e fisiológicas. A diferenciação das formas de vida se dá pelo uso do
24 critério de localização do cinetoplasto. A replicação acontece por divisão binária em formas evolutivas epimastigotas que estão presentes no tubo digestivo do vetor e em formas amastigotas no interior das células de vertebrados. As formas não replicativas e infectantes para o hospedeiro vertebrado, as tripomastigotas metacíclicas, são encontradas nas fezes e urina do hospedeiro invertebrado e as formas tripomastigotas circulantes se localizam no sangue periférico de mamíferos (BEZERRA et al., 2014).
Os mecanismos envolvidos no início e na manutenção da infecção incluem invasão e evasão, que ocorrem por meio da interação de moléculas do parasito e células do sistema imune do hospedeiro. A invasão celular se estabelece por alguns mecanismos de interação com os lisossomos da célula hospedeira, processo que origina o vacúolo parasitário (ANDRADE; ANDREWS, 2004). Além do mecanismo mediado por lisossomos, observa-se a interação com células não-fagocíticas, por meio de um processo de fosforilação (WOOLSEY et al., 2003).
A internalização do parasito T. cruzi pelas células do hospedeiro é mediada por proteínas de superfície e pode ocorrer por mecanismos diferentes, incluindo fagocitose ou macropinocitose (BURLEIGH; ANDREWS, 1995). Estas proteínas estão amplamente distribuídas no corpo celular, flagelo e bolsa flagelar das diferentes formas evolutivas. O agente etiológico da DC é revestido por camada densa de glicoproteínas do tipo mucina que interagem com células de mamíferos e desempenham papel importante na proteção e estágio infeccioso (BUSCAGLIA et al., 2006). Da mesma forma, as proteínas trans-sialidases são fundamentais na viabilidade e propagação do parasito no hospedeiro estando ancoradas à membrana para introduzir ácido siálico no protozoário (AMAYA et al., 2004). Tais proteínas são conhecidas como fatores de virulência e estão envolvidas na invasão da célula hospedeira e sobrevivência intracelular (VALENZUELA et al., 2013). Já foram relacionadas proteínas purificadas do protozoário com proteção em modelo murino quando desafiadas com parasitos vivos.
Durante o seu ciclo de vida, o parasito expressa uma mistura complexa de isoformas de proteases cisteínicas denominadas cruzipaínas, representando a maior protease encontrada no parasito, presentes nas principais formas de desenvolvimento (GIORDANENGO et al., 2002). Outra importante família é constituída por proteínas de superfície associadas à mucina (do inglês, Mucin-Associated Surface Proteins — MASPs), nome dado pela proximidade com as mucinas de T. cruzi (BARTHOLOMEU et al., 2009). Além disso, o protozoário expõe em sua superfície várias outras proteínas, incluindo proteínas gp63, uma família de metaloproteases dependentes de zinco e localizadas na superfície celular capazes de degradar vários componentes da matriz extracelular (CUEVAS et al., 2003). Esses fatores de virulência podem
25 ser utilizados como antígenos em protocolos de imunizações em modelo murino (VALENZUELA et al., 2013).
2.1.2 Aspectos da resposta imune na doença de Chagas
Para elucidar os mecanismos de resposta, deve-se considerar o método natural de infecção por meio da transmissão pelo vetor. Ao penetrar na pele, o parasito migra e infecta diferentes tipos celulares e tecidos, preferencialmente macrófagos (PADILLA et al., 2009). No entanto, cerca de 20% a 30% de células não fagocíticas também são infectadas mediante mecanismos dependente do lisossomo e invaginação celular, sendo tais mecanismos revisados em 2016 por Cardoso e colaboradores.
2.1.2.1 Resposta imune inata
O sistema imune inato responde de diferentes formas ao processo infeccioso, inicialmente por meio da produção de espécies reativas de oxigênio e nitrogênio por diferentes células fagocíticas, como macrófagos e neutrófilos (KIERSZENBAUM et al., 1974; BURLEIGH; ANDREWS, 1995). Todavia, o parasito apresenta diferentes mecanismos de resistência ao dano oxidativo, sendo de preferência mediante uma rede de moléculas e enzimas que conferem resistência a este tipo de estresse (VENTURINI et al., 2000; PIACENZA et al., 2009; GUTIERREZ et al., 2009).
Além disso, o sistema imune irá atuar por intermédio do sistema complemento na tentativa de eliminação do parasito durante a formação do complexo de ataque a membrana (do inglês, Membrane attack complex — MAC), uma rede compartimentada em diferentes funções e produto final das três vias do sistema complemento: clássica, alternativa e das lectinas (KEMPER et al., 2014). Para o combate ao T. cruzi observa-se principalmente a via das lectinas como responsável por cerca de 70% da resposta durante a tentativa de eliminação (CESTARI et al., 2009). Enquanto a resposta pela via alternativa desencadeia principalmente processos de opsonização e formação do MAC (CESTARI; RAMIREZ, 2010). Não obstante, o protozoário apresenta vias de escape ao sistema complemento com a produção de proteínas que são capazes de evitar a formação do MAC, uma vez que diferentes moléculas e proteínas são liberadas pelo parasito evitando a formação dos complexos C1 e C3, componentes bases para desencadear este tipo de resposta (RAMÍREZ-TOLOZA; FERREIRA, 2017).
26 Outro importante ponto a se destacar é o método de reconhecimento de padrões moleculares associados a patógenos (do inglês, Pathogen Associated Molecular Patterns — PAMP’s) por meio de receptores de reconhecimento de padrões (do inglês, Pattern Recognition
Receptors — PRR’s), presentes principalmente em macrófagos e células dendríticas. Estes
receptores são responsáveis pelo reconhecimento do parasito e auxiliam na modulação da resposta imune inata e adaptativa. (GAZZINELLI et al., 2004; TAKEUCHI; AKIRA, 2010; KAWAI; AKIRA, 2010). Os receptores de células T (do inglês, T-Cell Receptor — TCR) são os mais eficientes e capazes de reconhecer microorganismo, apesar disso o parasito T. cruzi apresenta um sistema de mucinas e outras proteínas capazes de recombinar esses padrões de reconhecimento e induzir alterações nos receptores que favorecem um ambiente adequado para o seu desenvolvimento e sobrevivência (SERRANO et al., 1995; CAMARGO et al., 1997; RODRIGUES et al., 2012).
2.1.2.2 Resposta imune adaptativa
Além dos mecanismos desencadeados pela imunidade inata na tentativa de eliminar o parasito, o sistema imune desencadeia diferentes respostas mediante ativação de linfócitos T CD4 e T CD8+, linfócitos B, imunoglobulinas, interleucinas e quimiocinas. A resposta desencadeada pelo sistema imune adaptativo contra o parasito T. cruzi ocorre de forma tardia devido ao mecanismo de evasão à imunidade inata, a falta de reconhecimento pelas PPRs e a diferenciação intracelular para a forma amastigota, conferindo ao protozoário immunodominância, afetando principalmente a resposta por T CD8+ (DE AVALOS et al., 2002; TARLETON, 2007).
A principal resposta desencadeada pelo sistema imune ocorre principalmente por células Th1, ou seja, com a estimulação de células fagocíticas, auxiliadas por fator de necrose tumoral (do inglês, Tumor necrosis fator — TNF) e interferon gama (IFN-γ). A resposta é desencadeada de forma tardia, com T CD4+ estimulando a produção de citocinas contra o parasito. Como revisado por Zingales em 2019, diferentes interleucinas atuam na resposta do organismo (IL-1β, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7a, IL -8, IL-10, IL-13, IL-17) sendo responsáveis por estimular processos inflamatórios devido a invasão do parasito. Além disso, TNF e IFN-γ desencadeiam resposta e intensificam os danos oxidativos.
A resposta mediante produção de anticorpos é dificultada pelo parasito devido à grande quantidade de antígenos presentes em sua membrana, resultando em ativação policlonal
27 levando a hipergamaglobulinemia. Este evento é um fator importante para a sobrevivência do parasito, pois confere resposta humoral tardia (BERMEJO et al., 2011). Na fase aguda da infecção, devido a liberação de fatores de virulência que confundem o sistema imune, é observada grande variedade de imunoglobulinas em pequenas quantidades. Já na fase crônica, ocorre elevada expressão de IgG2a e baixa expressão das outras imunoglobulinas, dificultando a eliminação do protozoário (DOS SANTOS et al., 2009).
Devido a esses fatores, é necessária a produção de uma vacina eficiente para estimular o sistema imune tanto inato quanto adaptativo, pois, se as respostas tardias são evitadas, o organismo pode responder de forma rápida à infecção, possibilitando sua eliminação e assegurando a sobrevivência do hospedeiro vertebrado.
2.2 ANTÍGENOS EM ESTRATÉGIAS DE IMUNIZAÇÃO NA DOENÇA DE CHAGAS
Blanchard, em 1912, relatou que animais sobreviventes de uma infecção aguda por T.
cruzi demonstraram resistência a reinfecção. Com isso, estratégias de imunização começaram
a ser pesquisadas em estudos com formas atenuadas (PIZZI; PRAGER, 1952), mortas (ROMERO-DAVALOS, 1979) e antígenos preparados em uma câmara de pressão (INTROINI et al., 1998; BREGANÓ et al., 2003).
Antes dos anos 80, a estratégia de imunização era principalmente por intermédio das formas evolutivas atenuadas e/ou lisadas do parasito T. cruzi (YANOVSKY et al., 1969) e irradiadas (HANSON et al., 1976). Dos anos 80 em diante estudos com glicoproteínas de superfície do protozoário, entre elas a gp90 (SCOTT et al., 1985), a gp72 (COOPER et al., 1991), a gp57 e a gp51 (ARNHOLDT; SCHARFSTEIN, 1991) foram realizados. Além disso, encontra-se relatos do uso de anticorpos monoclonais FCH-FS-4 (BÚA et al., 1991) e Tcr7 (OUAISSI et al.,1992). Pesquisas utilizando as proteínas Tc24 (TAIBI et al., 1995) e cruzipaína (LADERACH et al., 1996) foram descritos, sendo a Tc24 com maior utilização atualmente (BARRY et al., 2016; SEID et al., 2016; GUNTER et al., 2017; VILLANUEVA-LIZAMA et al., 2018).
Nos anos 2000, estudos com vacina de DNA mudaram a história do desenvolvimento de vacinas através do uso da técnica de DNA recombinante. Porém, o sucesso da imunização com esta estratégia depende de fatores como natureza do antígeno, período de imunização e via de administração (RAINCZUK et al., 2003; MOREL et al., 2004). Uma vantagem na utilização das vacinas de DNA baseia-se no baixo risco de reversão da atenuação, além de poder ser
28 coadministrada com diversos epítopos (HAN et al., 1999; DOOLAN; HOFFMAN, 1997) a partir da utilização de plasmídeos virais. Além disso, imunizações com formas mortas ou atenuadas costumam precisar de reforço e induzem apenas redução significativa na parasitemia e no aumento da sobrevida (RODRÍGUEZ-MORALES et al., 2015), sendo então crucial uma estratégia que vise proteção à infecção ou o tratamento eficaz da doença quando já em fase crônica. Para isso, começou-se a pensar em antígenos purificados, recombinantes e vacinas de DNA e, com isso, o seu papel na indução da resposta imune.
Rodríguez-Morales e colaboradores (2015) relataram algumas estratégias nas quais pôde-se observar que os antígenos purificados podem não apresentar volume suficiente para o desenvolvimento dos ensaios, além disso o custo poderia tornar a vacina inviável. Ademais, o uso de vacinas de DNA quando comparadas ao de vacina convencional, tanto em termos econômicos quanto técnicos, apresenta maior vantagem devido à indução da resposta do tipo Th1, necessária para microrganismos intracelulares.
Ainda no estudo feito por Rodríguez-Morales e colaboradores (2015), consegue-se perceber o uso de antígenos envolvidos em várias formas evolutivas do parasito T. cruzi, assim como observam-se tentativas de imunizações com mais de um antígeno para contemplar todas as formas de vida e aumentar o repertório antigênico. Além disso, é importante compreender a utilização dos mesmos antígenos para estratégias tanto profiláticas quanto terapêuticas, como apontaram Resende e colaboradores em 2015, levando em consideração que vacinas profiláticas e terapêuticas podem prevenir a infecção e interferir na progressão da DC.
Quando se fala em vacinas, deve-se considerar os adjuvantes, substâncias utilizadas para potencializar a resposta imunológica ao antígeno. Ao se tratar de estratégias de imunizações experimentais para DC, alguns protocolos relatam a utilização de emulsões de água em óleo contendo a Mycobacterium tuberculosis inativada pelo calor, conhecida como adjuvante completo de Freund — ACF, já quando não tem a presença da bactéria a emulsão se intitula adjuvante incompleto de Freund — AIF (FLORES-GARCIA et al., 2011; EGUI et al., 2012; ARCE-FONSECA et al., 2018); hidróxido de alumínio — Al(OH)3(SERNA et al., 2014);
ISCOMATRIX® (BONTEMPI et al., 2015); ODN-CpG (BARRY et al., 2016; BIVONA et al., 2018) e c-di-AMP (ALBERTI et al., 2017; MATOS et al., 2017).
Vacinas contendo adjuvantes à base de alumínio começaram a ser utilizadas em 1932 e vêm sendo administradas com sucesso em humanos, levando a uma diminuição de mortalidade causada por doenças infecciosas. Algumas das vacinas para humanos utilizando adjuvantes à base de alumínio, licenciadas pela a administração de comida e medicamentos (do inglês, Food
29
and drug administration — FDA) dos EUA, são: Hepatite A, Hepatite B, DTap, Tdap, Hib,
Gardasil, Cervarix e Bexsero (TOM et al., 2018).
O alumínio é um metal encontrado em abundância no meio ambiente, além de estar presente nos alimentos e na água que frequentemente são ingeridos pelos seres humanos. Além disso, este metal permite ligar moléculas biologicamente ativas nas vacinas, juntamente com o fato de que adjuvantes à base de alumínio possuem baixo custo e elevada segurança. Tais vantagens garantem o uso generalizado desse sistema em adjuvantes, bem como o avanço para novos estudos (HE et al., 2015).
Adjuvantes à base de hidróxido de alumínio possuem a capacidade de estimular respostas imunes por um longo período devido a seu efeito depósito (KURODA et al., 2013; HE et al., 2015); formar partículas quando os antígenos são adsorvidos fazendo com que sejam capturados pelas células apresentadoras de antígeno (do inglês, Antigen presenting cells — APCs) por conta do efeito pró-fagocitário (HE et al., 2015); ativar e acelerar reações inflamatórias locais independente dos receptores Toll-like (do inglês, Toll-like receptor — TLR), ativando macrófagos para secretar fatores pró-inflamatórios IL-1beta e IL-18 (LI et al., 2007). O uso desses adjuvantes possui perfil de segurança há mais de seis décadas, contudo é importante considerar as reações como nódulos subcutâneos pruriginosos, hipersensibilidade (BAYLOR et al., 2002; BERGFORS; TROLLFORS; INEROT, 2003) e degeneração do neurônio motor (SHAW; PETRIK, 2009) já observadas.
2.3 DESENVOLVIMENTO DE VACINAS
A vacina é um método empregado há séculos em que almeja promover qualidade de vida ao ser humano, conferindo imunidade a determinadas doenças. Mediante imunização ativa é permitido ao sistema imune do indivíduo vacinado desenvolver mecanismos específicos capazes de combater a infecção de forma rápida e eficiente, evitando assim a sua disseminação. Porém, diversos fatores interferem diretamente na capacidade de atuação e eficácia de vacinas como o tipo de adjuvante, antígeno, método de aplicação e a resposta induzida (GUPTA; SIBER, 1995; AGUILAR; RODRIGUEZ, 2007; LARSON et al., 2014; ZHANG; ULERY, 2018).
30
2.3.1 Virus-like particles — VLPs
As partículas semelhantes a vírus (do inglês, virus-like particles — VLPs), são estruturas compostas por proteínas virais, organizadas, não apresentando material genético viral (CHROBOCZEK et al., 2014), contêm especialidades funcionais de um vírus, assegurando a entrada na célula por meio da penetração celular (PLUMMER; MANCHESTER, 2010).
Atualmente as VLPs são utilizadas para o desenvolvimento de vacinas contra o vírus sincicial respiratório (HUERTAS-DÍAZ et al., 2019), os 4 sorotipos da dengue — DENV (METZ et al., 2018) e a malária (PATTINSON et al., 2019). As VLPs podem ser produzidas em inúmeros sistemas de expressão diferentes, incluindo bactérias, insetos, leveduras ou células de mamíferos, refletindo em parte o amplo espectro hospedeiro dos vírus dos quais as VLPs são derivadas (PUMPENS, 2015). São partículas extensivamente utilizadas na produção de vacinas por apresentarem estabilidade e versatilidade, com capacidade de induzir ambas as respostas imunes: inata e adquirida (JENNINGS; BACHMANN, 2008). Além disso, apresentam funções como transporte de medicamentos, terapia gênica e tratamento de câncer, conferindo assim imunogenicidade, segurança e alternativa às vacinas atenuadas ou inativas (CHROBOCZEK et al., 2014; VICENTE et al., 2011; YAN et al., 2015).
2.3.2 Vacinas de VLPs
As vacinas envolvendo a tecnologia VLP são imunogênicas e fornecem uma plataforma alternativa para a produção de novos protocolos de imunização, visto que induzem resposta imunológica protetora e perfil de segurança comprovados. Apesar de não contar com o genoma viral (CHROBOCZEK et al., 2014), possuem propriedades imunoestimuladoras e auto adjuvantes dos vírus naturais, uma vez que são compostas de proteínas do capsídeo que podem iniciar uma resposta imune (GOMES et al., 2017).
A estrutura particulada da VLP é eficientemente reconhecida e absorvida por células apresentadoras de antígenos (KELLER et al., 2010), sendo considerada estrutura molecular para a exibição de antígenos. Desde o desenvolvimento das primeiras vacinas recombinantes aprovadas contra o vírus da hepatite B, a Engerix-B™ em 1986 e Sci-B-Vac, nos anos 2000 (ZUCKERMAN et al., 2001; KEATING; NOBLE, 2003), vacinas baseadas em VLPs surgiram no mercado, por exemplo contra o HPV, a Gardasil™ aprovada em 2006; a Cervarix™ em 2009 e a Gardasil™9 em 2014 (HARPER, et al., 2004; VILLA et al., 2005); contra a hepatite
31 E, a Hecolin1™ em 2011 (LI et al., 2005) e diversos estudos para Dengue (METZ et al., 2018), Zika (BOIGARD et al., 2017) e Chikungunya (METZ et al., 2013). Além disso, a primeira vacina licenciada contra malária, Mosquirix™, foi recentemente aprovada por reguladores europeus (MOORTHY; BALLOU, 2009; OLOTU et al., 2011; REGULES et al., 2011). Deste modo, as VLPs demonstram sucesso como uma plataforma de vacina confiável visto que recentemente foi publicado um trabalho com uma vacina de VLP contra o vírus influenza A que se encontra no ensaio clínico de Fase III (PILLET et al., 2019).
2.3.3 Partículas semelhantes a vírus de Triatoma virus (VLPs-TrV)
O Triatoma virus (TrV), pertencente à família Dicistroviridae e ao gênero Cripaviridae, é um vírus não envelopado de forma esférica com 30 nm de diâmetro que possui capacidade de infectar espécies dos vetores responsáveis pela transmissão do protozoário T. cruzi aos hospedeiros vertebrados (ROZAS-DENNIS et al., 2002). As VLPs recombinantes a partir do
Triatoma virus (VLPs-TrV) (Figura 2) foram produzidas e caracterizadas
(SÁNCHEZ-EUGENIA et al., 2015) após o estudo dos eventos associados à montagem do capsídeo do vírus (RODRIGUEZ-AGUIRRE et al., 2011) e descoberta da não infectividade em mamíferos (QUERIDO et al., 2013).
Figura 2 – Modelo de geração e cristalização das partículas vazias de Triatoma virus (TrV).
Legenda: TrV maduro (A), liberação do RNA — genoma viral (B) e capsídeo vazio (C). Fonte: Adaptado de
Sánchez-Eugenia e colaboradores, 2016.
A estratégia de utilização das VLPs-TrV, partículas vazias sem genoma viral, como candidato para o desenvolvimento de vacinas se torna viável, visto que há uma relevância na possibilidade de modificação de sua estrutura de forma independente, o que possivelmente
32 permite a inserção de diferentes antígenos (SÁNCHEZ-EUGENIA et al., 2015; RODRIGUEZ-AGUIRRE; GUÉRIN AGUILAR, 2015).
Yanshina (2017) avaliou a indução da imunidade humoral em modelo murino, utilizando como primeira dose 50 μg das VLPs-TrV acrescido dos adjuvantes ACF e AIF. Após 30, 60 e 90 dias observou-se a capacidade na indução de um perfil significativo de anticorpos IgG total, seis vezes mais reativos do que o controle negativo. Para entender se ao adicionar as VLPs-TrV com antígenos de T. cruzi haveria uma potencialização na indução de resposta humoral, desenvolveu-se uma nova estratégia de imunização. O ensaio mostrou que o resultado oriundo dos animais imunizados somente com os antígenos não demonstrou melhor perfil quando comparado ao controle, entretanto quando os antígenos foram associados com as VLPs-TrV apresentaram indução de anticorpos do tipo IgG total.
2.4 PROTEÍNAS RECOMBINANTES QUIMÉRICAS
A descoberta de regiões antigênicas de um determinado protozoário é um dos maiores desafios atualmente. A evidenciação de regiões envolvidas em formas evolutivas diferentes do parasito T. cruzi ou fases da infecção possibiliza a união dos candidatos a antígenos em uma única molécula recombinante quimérica com potencialização em aumentar o repertório antigênico nas estratégias de imunização (RODRÍGUEZ-MORALES et al., 2015).
Neste contexto, foi possível a produção de proteínas recombinantes quiméricas no Instituto de Biologia Molecular do Paraná — IBMP (SANTOS et al., 2016) denominadas IBMP-8.1, IBMP-8.2, IBMP-8.3 e IBMP-8.4 que possuem, respectivamente, peso molecular de 17, 36, 30 e 45 kDa (Figura 3) (SANTOS et al., 2016). Tais proteínas compreendem regiões imunodominantes de diferentes antígenos de T. cruzi (Quadro 1) descritas na literatura (SANTOS, 2016; SANTOS, et al., 2016a, 2016b, 2017b).
Inicialmente, as proteínas IBMP foram testadas em soros humanos (infectados e não infectados com T. cruzi) e avaliou-se a presença de anticorpos específicos anti-T. cruzi, utilizando Ensaio de imunoabsorção enzimática, do inglês Enzyme-Linked Immunosorbent
Assay — ELISA (SANTOS et al., 2016b). Além disso, foram avaliados parâmetros de
desempenho das IBMP no diagnóstico sorológico da DC na fase crônica — estudo de fase II, e os achados indicam a IBMP-8.4 com melhor desempenho para testes sorológicos em bancos de sangue e diagnóstico laboratorial (SANTOS et al., 2017a).
33
Figura 3 – Gel de SDS-poliacrilamida corado com Coomassie Brilliant Blue G-250 das
proteínas IBMP.
Legenda: 1,5 μg de cada proteína recombinante pura foram aplicadas por poço. MM: marcador de massa
molecular. IBMP-8.1 (17 kDa); IBMP-8.2 (36 kDa); IBMP-8.3 (30 kDa); IBMP-8.4 (45 kDa). Fonte: Extraído de SANTOS et al., 2016.
Quadro 1 – Informações sobre a composição das proteínas recombinantes quiméricas de T.
cruzi de denominadas IBMP-8.1, IBMP-8.2, IBMP-8.3 e IBMP-8.4.
IBMP SEGMENTOS DENOMINAÇÃO
8.1
SAPA; RPL19; Ag2/B13/CA-2.
Antígeno de fase aguda/Trans-sialidase; Proteína L19 de subunidade ribossomal 60S; Proteínas de superfície de
tripomastigota.
8.2
Ag1/H49/JL7/FRA; SAPA; Ag2/B13/CA-2.
Proteínas associadas ao citoesqueleto; Antígeno de fase aguda/Trans-sialidase; Proteínas de superfície de
tripomastigota.
8.3
Ag2/B13/CA-2; CRA/JL8/Ag30; TcD; RPL19.
Proteínas de superfície de tripomastigota; Antígenos repetitivos citoplasmático; Trans-sialidase; Proteína L19 de
subunidade ribossomal 60S. 8.4 SAPA; RPL19; Ag2/B13/CA-2; FRA; MAP; KMP-11.
Antígeno de fase aguda/Trans-sialidase; Proteína L19 de subunidade ribossomal 60S; Proteínas de superfície de tripomastigota; Proteína de antígeno repetitivo flagelar; Proteína associada ao microtúbulo; Proteína da membrana
do cinetoplasto.
Fonte: Extraído e modificado de Santos (2016).
O atual estudo está inserido na geração de uma plataforma tecnológica para o desenvolvimento de modelos experimentais para avaliação de novas vacinas contra a DC e
34 outras doenças negligenciadas. Sua proposta foi contribuir na continuação da caracterização imunoestimulatória das VLPs-TrV em associação ao hidróxido de alumínio, um dos adjuvantes aprovado pela ANVISA e utilizado em vacinas (ANVISA, 2015), e as proteínas IBMP.
Antígenos de T. cruzi são utilizados tanto para diagnóstico quanto para estratégias de imunizações, em vista disso propõem-se a utilização das proteínas IBMP como possíveis candidatos antigênicos. Diante dos desafios existentes para o controle da DC, a utilização destas proteínas contendo epítopos imunogênicos do agente etiológico e os dados anteriores em relação as VLPs-TrV, tornam possível a busca por novas estratégias.
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3 OBJETIVOS
3.1 OBJETIVO GERAL
Avaliar a capacidade das partículas semelhantes a vírus (do inglês, virus-like particles) de Triatoma virus (VLPs-TrV) e das proteínas recombinantes quiméricas de Trypanosoma cruzi em induzir a resposta imune humoral em modelo experimental in vivo.
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
a) Verificar a formação das VLPs-TrV através da microscopia eletrônica de varredura; b) Verificar a presença de endotoxinas nas VLPs-TrV;
c) Caracterizar a atividade imunoestimulatória das VLPs-TrV na indução de anticorpos específicos em camundongos imunizados;
d) Comparar a indução da resposta imune humoral das VLPs-TrV isoladas ou em associação com o hidróxido de alumínio como adjuvante;
e) Avaliar a resposta imune humoral em camundongos imunizados com as proteínas recombinantes quiméricas de T. cruzi na forma de mix em associação ou não com as VLPs-TrV.
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4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 OBTENÇÃO DAS PARTÍCULAS SEMELHANTES A VÍRUS DE Triatoma virus (VLPs-TrV)
As VLPs-TrV utilizadas para o modelo murino de imunização em camundongos estão no âmbito do consórcio internacional de investigação RedVLP, suportado pelo CYTED (http://redvlp.org) com pedido de proteção intelectual (PCT/EP2015/050054) (AGUIRRE; AGUILAR, 2015). Esta etapa trata-se de uma colaboração com o Prof. Dr. Diego Guérin da Universidade do País Basco - Espanha.
Em resumo, a produção e purificação a partir do sistema Bac-to-Bac™ (Invitrogen, USA) das partículas recombinantes foram por meio de dois vetores de baculovírus (BVs) usados para infectar células de insetos cultivadas em suspensão (SANCHEZ-EUGENIA et al., 2015). Após a produção das VLPs-TrV pelo sistema de baculovírus recombinantes, foi realizada micrografia eletrônica das VLPs-TrV recombinantes purificadas em coloração negativa. Além disso, um teste (in vitro) para detecção de endotoxinas de bactérias Gram-negativas foi realizado a partir do método de coágulo em gel (Gel-Clot) de maneira semi-quantitativa seguindo as instruções do fabricante (ToxinSensorTM Gel Clot Endotoxin Assay Kit; GenScript — L00351, USA), diferentes diluições da amostra (1:1 a 1:100000) foram testadas.
4.2 ANIMAIS DE EXPERIMENTAÇÃO
Camundongos BALB/c fêmeas (20 a 30 g), com 5 a 8 semanas de idade, foram alojados em uma sala com controle de luz (12–12 h de ciclo claro-escuro) a uma temperatura de 22 °C. Os animais foram fornecidos pelo Biotério do Centro de Ciências da Saúde da Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN), Brasil. Cada grupo foi composto por três animais (n = 3) na primeira e segunda estratégia de imunização e por cinco animais (n = 5) na terceira estratégia. Usando seringa e agulha (Omnican® 100, B. Braun, Germany), a via subcutânea foi a escolhida para administração das imunizações. Após as experiências, os animais foram sacrificados com uma overdose de Xilazina (Syntec, São Paulo, Brasil) e Quetamina (Vetnil, São Paulo, Brasil) por injeção intraperitoneal.
Todos os procedimentos experimentais foram submetidos e aprovados pela a Comissão de Ética no Uso de Animais da Universidade Federal do Rio Grande do Norte — CEUA -
37 UFRN, com protocolo 080/2017 e PARECER 068.080/2017 (12 de dezembro de 2017), encontrando-se de acordo com os preceitos da Lei n.º 11.794, de 8 de outubro de 2008 e com as normas editadas pelo Conselho Nacional de Controle da Experimentação Animais — CONCEA (Apêndice V).
4.3 ESTRATÉGIA DE IMUNIZAÇÃO PRIMÁRIA E SECUNDÁRIA COM AS VLPs-TrV EM ASSOCIAÇÃO OU DE FORMA ISOLADA
Para a caracterização da resposta imune humoral, o primeiro grupo recebeu 100 µg das VLPs-TrV [1,4 mg/ml] na imunização primária e na secundária 50 µg. O segundo grupo teve associação das VLPs-TrV (100 µg) com o hidróxido de alumínio — Al(OH)3 (Vetec Quimica
Fina, Rio de Janeiro, Brasil) em suspensão a 10% (Quadro 2).
Quadro 2 – Estratégia de imunização primária e secundária em camundongos utilizando as
VLPs-TrV em associação ou não com o hidróxido de alumínio em suspensão a 10% para posterior avaliação da resposta imune humoral.
GRUPOS DE IMUNIZAÇÃO 1ª IMUNIZAÇÃO POR ANIMAL
VLPs-TrV (VLP) 100 µg VLPs-TrV + Al(OH)3 suspensão a 10% (VLP-A) 100 µg
2ª IMUNIZAÇÃO POR ANIMAL
VLP 50 µg
VLP-A 50 µg
Legenda: cada animal recebeu 100 µl por via subcutânea. O diluente utilizado foi o PBS (tampão fosfato-salino,
do inglês phosphate buffered saline) para os dois grupos. Fonte: Autoria própria.
Antes de iniciar a estratégia (D0) foi colhido sangue para obtenção de soro pré-imune (controle negativo). Durante o processo de imunização, as amostras de sangue dos grupos imunizados foram colhidas 15 (D15), 30 (D30) e 45 (D45) dias após primeira imunização. Sessenta dias após a imunização primária (D60), os animais foram imunizados com a segunda dose e amostras de sangue também foram colhidas 15 (D15), 30 (D30) e 45 (D45). O ponto de eutanásia ocorreu setenta dias após imunização secundária (D70), de acordo com o esquema de imunização apresentado a seguir na Figura 4.
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Figura 4 – Representação esquemática do processo de imunização primária e secundária em
camundongos com as VLPs-TrV em associação ou de forma isolada.
Legenda: Amostras de sangue dos grupos imunizados foram colhidas 15 (D15), 30 (D30) e 45 (D45) dias após
primeira imunização (100 µg). Sessenta dias após a primeira imunização (D60), os animais foram imunizados com segunda dose das VLPs-TrV (50µg) e amostras de sangue dos grupos imunizados foram colhidas 15 (D15), 30 (D30), 45 (D45), posteriormente setenta dias após a segunda imunização (D70) os animais foram eutanasiados.
Fonte: Autoria própria.
Para todas as estratégias do estudo a metodologia desenvolvida por Querido e colaboradores (2013) foi adotada. Após realizada as colheitas de sangue, as amostras foram processadas para obtenção do soro (mantidas a 37° C durante 30 minutos, em seguida a 5° C durante 1 hora, subsequentemente centrifugadas a 5.000 rpm durante 10 minutos), fracionadas e armazenadas a -20°C até a utilização na análise da resposta imune humoral gerada após o esquema de imunização. O ensaio enzimático ELISA indireto foi o método de escolha para determinar os anticorpos específicos nos camundongos imunizados.
Resumidamente, microplacas de 96 poços (Nunc-Immuno MicroWell, USA) foram sensibilizadas com 50 ng/poço das VLPs-TrV em tampão bicarbonato 0,1 M pH 8,5 (overnight, 4 °C). O conteúdo da adsorção foi descartado e as microplacas foram lavadas três vezes com PBS (tampão fosfato-salino, do inglês phosphate buffered saline) e Tween20 a 0,05% (Promega, USA), após lavagem foram bloqueadas por uma hora à temperatura do ar artificial
