¹Graduando em Biomedicina pelo Centro Universitário Toledo (2017)
²Graduada em Farmácia Bioquímica pela Universidade de São Francisco (1990), Mestre em Microbiologia pela Universidade Guarulhos, Doutora em Imunologia ICB/USP; Docente UniToledo.
³Graduada em Farmácia Bioquímica pela FCFRP-USP (1993), Mestre em Farmacologia pela FMRP-USP (1996), Doutora em Farmacologia FMRP-USP (2001).
EFEITOS DO ESTRESSE OXIDATIVO NO ENDOTÉLIO VASCULAR
EFFECTS OF OXIDATIVE STRESS ON VASCULAR ENDOTHELIUM
FERREIRA, Bruno Henrique da Silva Homem¹ - UNITOLEDO VALENTE-FERREIRA, Rita de Cássia²- UNITOLEDO ANTONIALI, Cristina³ - UNESP
RESUMO: As doenças cardiovasculares têm se tornado um grande mal do século XXI, sendo
que apenas em 2015, foram responsáveis por 15 milhões de mortes em todo o mundo. Uma vez que esses números tendem a crescer cada vez mais, devido ao estilo de vida adotado atualmente, cujo doenças como hipertensão e aterosclerose tem se tornado cada vez mais comuns. As doenças cardiovasculares apresentam uma fisiopatologia comum: o dano às células endoteliais dos vasos sanguíneos responsáveis pelo controle do tônus muscular, controle da resposta inflamatória, agregação plaquetária, coagulação sanguínea e entre outros. Nesse trabalho, foi avaliado a capacidade de compostos (apocinina, ácido protocatecuico e ácido elágico) de modular contrações vasculares e de proteger contra o dano endotelial.
Palavras-chave: Estresse Oxidativo, Endotélio Vascular, Doenças Vasculares.
ABSTRACT: Cardiovascular diseases have become a great evil of the century, and only in
2015 were responsible for 15 million deaths worldwide. Since these numbers are likely to grow steadily due to lifestyle currently adopted, whose diseases such as hypertension and atherosclerosis has become increasingly common. Cardiovascular diseases are a common pathophysiology: the damage to the endothelial cells of blood vessels responsible for the control of muscle tone, control of inflammatory response, platelet aggregation, blood coagulation and others. In this study, we evaluated the ability of compounds (apocynin, protocatechuic acid and ellagic acid) to modulate vascular contractions and protection against endothelial damage.
1. INTRODUÇÃO
O endotélio vascular, camada que reveste o lúmen dos vasos sanguíneos, ocupa uma posição estratégica e atua como regulador do controle vasomotor, mecanismos pró e antitrombóticos, crescimento vascular entre outros. Nesse trabalho será considerado apenas o seu papel na produção do fator relaxante derivado de endotélio (EDRF) que foi descrito em 1980 por Furchgott e Zawadzki que ao analisarem aortas de coelho descobriram que a acetilcolina (ACh), quando administrada em anéis de aorta na presença de endotélio, era capaz de promover a vasodilatação.
Essa vasodilatação ocorre devido à ligação de ACh, ao receptor muscarínico da célula endotelial, estimulando a produção de óxido nítrico (NO), pela oxido nítrico síntase endotelial (eNOS). O NO, por sua vez, é o ativador endógeno da guanilato ciclase solúvel (sGC), enzima que transforma a guanosina trifosfato (GTP) no segundo mensageiro guanosina monofosfato cíclica (GMPc) responsável pela vasodilatação (FURCHGOTT e ZAWADZKI, 1980).
O controle vasomotor ocorre em tempo real e está sujeito a interferentes como as espécies reativas de oxigênio (ERO), metabólitos do metabolismo celular e que apresentam funções endógenas como a geração de adenosina trifosfato (ATP), fertilização de óvulos, ativação de genes e defesa contra microrganismos invasores, que em excesso causam danos nas biomoléculas celulares (lipídeos, proteínas, carboidratos e ácidos nucléicos) e em excesso no tecido vascular diminuem a meia-vida do NO, destruindoa bicamada lipídica do endotélio e aumentando a agregação plaquetária (FERREIRA & MATSUBARA, 1997).
Dessa forma, organismos aeróbicos apresentam um sistema de controle de ERO, chamado de sistema antioxidante, sendo ele o responsável por eliminar o excesso de produção e reparar lesões causadas por ERO. O estresse oxidativo ocorre quando a geração de ERO é maior que a capacidade do organismo de controlar e eliminar esse excesso, causando diversas alterações na homeostase e sendo um fator chave em inúmeras patologias como a hipertensão, diabetes e até mesmo o desenvolvimento de câncer (BARBOSA et al., 2010; WILLIAMS et al., 2007).
1.1 OXIDO NÍTRICO
O óxido nítrico é uma molécula gasosa, que possui inúmeras funções no sistema cardiovascular (fator relaxante derivado do endotélio, inibidor da agregação plaquetária, proliferação vascular) e é produzida pela enzima óxido nítrico sintase (NOS) a qual apresenta três isoformas: a nNOS (óxido nítrico sintase neuronal), iNOS (óxido nítrico sintase induzida)
e eNOS (óxido nítrico sintase endotelial) sendo essa última a responsável pela preservação da fisiologia vascular (LIU & HUANG, 2008; POTJE et. al., 2014).
1.2 ESPÉCIES REATIVAS DE OXIGÊNIO – ERO
As ERO, não possuíam funções conhecidas e até 1970, eram descritas como metabólitos prejudiciais ao organismo. Desde então, foram descobertas diferentes funções fisiológicas para as ERO, devido à descoberta de enzimas dedicadas exclusivamente à sua formação.
As NAD(P)H Oxidase, representam uma família de enzimas (NOX1, NOX2, NOX3, NOX4, NOX5 DUOX1 e DUOX2) cujo único propósito é gerar ERO e foi identificada em fagócitos como a enzima responsável pelo “respiratory burst”, essencial para a função de defesa contra microrganismos exercida por essas células (SELEMIDIS, 2008). O principal mecanismo responsável pela disfunção endotelial é a produção excessiva de ERO (GUZIK & HARRISON, 2006).
2.2 SISTEMA ANTIOXIDANTE
Organismos aeróbicos apresentam um sistema de controle de ERO, denominado sistema antioxidante. Ele é o responsável por eliminar o excesso e reparar lesões causadas por ERO. O estresse oxidativo ocorre, quando a geração de ERO é maior do que a capacidade do organismo de controlar e eliminar esse excesso (FERREIRA & MATSUBARA, 1997; BARBOSA et al., 2010; WILLIAMS et al., 2007).
O sistema antioxidante é dividido em duas partes: a primeira delas é detoxificadora do agente antes que ele cause lesão (glutationa reduzida (GSH), superóxido-dismutase (SOD), catalase, glutationa-peroxidase (GSH-Px) e vitamina E) e a segunda é a função reparadora da lesão ocorrida (ácido ascórbico, pela glutationa-redutase (GSH-Rd) e pela GSH-Px, entre outros) (FERREIRA & MATSUBARA, 1997).
O dano ao endotélio o torna disfuncional, diminuindo ou até mesmo inibindo suas funções essenciais para a preservação da fisiologia vascular. Ao avaliarmos os compostos capazes de combater ou inibir o dano endotelial proveniente de estresse oxidativo, podemos compreender melhor esse fenômeno principalmente em decorrência da preocupação quanto aos crescentes números de casos de hipertensão e outras doenças cardiovasculares.
O objetivo desse trabalho foi avaliar o perfil da apocinina, um composto, que já foi descrito como antioxidante e também como inibidor da NAD(P)H oxidase, do ácido protocatecuico (antioxidante) e do ácido elágico (inibidor da NAD(P)H oxidase). Nesse trabalho foram avaliadas as suas capacidades antioxidantes, capacidade da modulação à reatividade vascular e peroxidação lipídica.
3. MATERIAIS E MÉTODOS
Foi avaliado o perfil de três compostos (Apocinina, Ácido Elágico e Ácido Protocatecuico), quanto a suas capacidades antioxidantes e de inibição da NAD(P)H oxidase. Os protocolos experimentais deste trabalho foram submetidos e aprovados pelo Comitê de Ética no Uso de Animais da Faculdade de Odontologia de Araçatuba, da Universidade Estadual Paulista, sendo aprovadas as metodologias a serem conduzidas seguindo o Guide to the Care and Use of Experimental Animals (Canadian Council On Animal Care, 1993) nº00130-2016.
3.1. Animais
Para esse estudo, foram utilizados ratos Wistar fornecidos pelo Biotério Central da Faculdade de Odontologia de Araçatuba (FOA UNESP). Esses animais foram mantidos em condições controladas de temperatura (22-24°C) com ciclo de luz (12h/luz e 12h/escuro) e receberam ração padrão e água ad libitum, até os três meses de idade, quando foram utilizados para os experimentos.
3.2. Materiais
3.2.1. Apocinina
A apocinina foi isolada primeiramente das raízes da planta Apocynum cannabinum em 1883. Em 1971, foi identificada nas raízes da planta Picrorhiza kurroa, nativa das montanhas do Himalaia e muito utilizada na medicina popular do sul asiático. É uma acetofenona, da classe dos metóxi-catecóis, com peso molecular de 166,17 g/mol, leve odor de baunilha, ponto de fusão de 115 ºC, baixa toxicidade (LD50: 9 g/kg) e facilmente solúvel em água quente, álcool, benzeno, clorofórmio e éter (STEFANSKA & PAWLICZAK, 2008; YU et al., 2008).
Existem efeitos comprovados da apocinina na melhora da lesão pulmonar, na isquemia e reperfusão hepática, na prevenção de choques hemorrágicos causados por lesões em órgãos em diferentes modelos experimentais e do desenvolvimento da hipertensão arterial induzida
por dexametasona em ratos Sprague-Dawley, ratos 2-rins-1-clipe, ratos DOCA-salt, ratos tratados com frutose, ratos e camundongos com hipertensão induzida por angiotensina II (BESWICK et al., 2001; HU et al., 2006; COSTA et al., 2009; UNGER & PATIL, 2009; EL-SAWALHI & AHMED, 2014; MÁRTINEZ-REVELLES et al., 2013).
3.2.2. Ácido protocatecuico
O ácido protocatecuico é um composto fenólico, encontrado naturalmente em diferentes espécies de plantas utilizadas na medicina popular, principalmente extraído das flores da Hibiscus sabdariffa. É um pó cristalino, de cor acinzentada, odor levemente fenólico, com pontos de fusão aos 221°C e ebulição aos 410°C, peso molecular de 154 g/mol e moderadamente solúvel em água. Apresenta LD50 800 mg/Kg, i.p. e devido à baixa absorção oral, é atóxico e relativamente seguro para administração oral. Diversos trabalhos na literatura têm relatado a ação antioxidante e ações farmacológicas do ácido protocatecuico como antibactericida, antitumoral, anti-hiperlipidêmico, anti-inflamatório, hipoglicemiante, anti-ulcerativo, anti-envelhecimento, analgésico, antiviral, antifibrótico, anti-aterosclerótico, neuroprotetor e com atividade cardíaca (KAKKAR & BAIS, 2014; KHAN et al., 2015).
3.2.3. Ácido elágico
O ácido elágico é um composto fenólico natural encontrado em uma variedade de frutas e nozes, na forma de taninos hidrossolúveis, importante componente estrutural da parede celular e membrana celular de vegetais (SOONG & BARLOW, 2004; VATTEM & SHETTY, 2005). Além de ser potente antioxidante in vitro e in vivo, já foram descritas várias atividades farmacológicas do ácido elágico, tais como: inflamatório, antitrombótico, anti-hiperlipidêmico, hipotensor, hipoglicemiante, vasodilatador, anti-aterogênico, antimutagênico contra diferentes tipos de câncer – mama, próstata, pele, cólon, esofágico e osteosarcoma –, nefro e hepatoprotetor. Também, já foram relatados estudos que mostraram que o tratamento com ácido elágico, aumenta a expressão e a atividade da eNOS em células endoteliais de artérias humanas (HASSOUN et al., 1997; SEERAM et al., 2005; DEVIPRIYA et al., 2007; YILMAZ & USTA, 2013; AYHANCI et al., 2015; SALIMI et al., 2015). Yllmaz e Usta (2013) sugeriram um futuro potencial do ácido elágico como produto natural no tratamento da hipertensão.
A fenilefrina é um agonista α1-seletivo, capaz de ativar os receptores β, que provoca acentuada vasoconstrição arterial durante a infusão intravenosa (GOODMAN & GILMAN, 2012). A fenilefrina foi responsável por contrair os vasos vasculares para avaliação dos outros compostos.
4. EXPERIMENTOS
4.1. Preparação dos anéis aórticos para reatividade vascular
Aos três meses de idade, os animais foram anestesiados por inalação com halotano e mortos por decapitação. A aorta torácica foi isolada e dissecada dos tecidos adjacentes em solução de Krebs Henseleit modificada, pH 7,4, 4 °C e seccionada em anéis de 4 mm, mantendo o endotélio preservado. Os anéis foram posicionados em dois ganchos de aço inoxidável, conectados a um transdutor de tensão isométrica (Letica Scientific Instruments, Barcelona, Espanha) mantidos em câmara para órgãos isolados com 10 mL de solução de Krebs-Henseleit modificada 37ºC, pH 7,4 e suprimento gasoso de 95% O2 e 5% CO2.
Os anéis permaneceram em repouso por 60 minutos para estabilização, sob tensão basal constante de 2,0 gramas. Após, os anéis passaram por um teste de viabilidade, antes de prosseguirmos com os protocolos experimentais. Os anéis foram estimulados com solução de alta concentração de cloreto de potássio (KCl 120 mmol/L) por 15 minutos. Foram considerados viáveis os anéis que atingirem contração superior a 1,5 g. A integridade do endotélio foi confirmada pelo relaxamento induzido pela acetilcolina 1 μmol/L após contração com fenilefrina 0,1 μmol/L. Os anéis que atingiram 70% do relaxamento induzido pela acetilcolina, serão considerados como anéis de aortas com endotélio intacto.
4.2. Análise da contração induzida pela fenilefrina em aortas incubadas com
apocinina, ácido protocatecuico e ácido elágico.
Após estabilização da tensão basal as preparações foram então incubadas por 30 minutos com apocinina, ácido protocatecuico ou ácido elágico, na concentração de 100 μmol/L. Após o tempo de incubação, os anéis foram estimulados com concentrações crescentes e cumulativas de fenilefrina (0,1 nmol/L – 10 μmol/L) para obtenção das curvas concentração-efeito para fenilefrina. As curvas obtidas na presença de apocinina, ácido protocatecuico ou ácido elágico foram comparadas.
4.3. Determinação da capacidade antioxidante total da apocinina, do ácido
A capacidade antioxidante dos compostos em estudo foi determinada pelo método FRAP (Ferric Reducing Antioxidant Power Assay), descrito por Benzie e Strain (1996). Este método é baseado na capacidade de redução do complexo férrico tripiridiltriazina (Fe3+-TPTZ) para Fe2+ por agentes redutores, em meio ácido.
4.4. Determinação da peroxidação lipídica de aorta de ratos, incubadas com
apocinina, ácido protocatecuico e ácido elágico.
A determinação da peroxidação lipídica dos compostos em estudo foi determinada pelo método TBARS (Thiobarbituric acid and reactive substances). Aos três meses de idade, os animais foram anestesiados por inalação com halotano e mortos por decapitação. A aorta torácica foi isolada e dissecada dos tecidos adjacentes e seccionada em anéis de 4 mm, mantendo o endotélio preservado.
Cada um dos anéis foi mantido, separadamente, e incubado com apocinina, ácido protocatecuico ou ácido elágico, na concentração de 0,1 μmol/L, por 30 minutos em um béquer contendo 10 mL de solução de Krebs-Henseleit modificada 37ºC, pH 7,4, suprimento gasoso de 95% O2 e 5% CO2. Passado o tempo de incubação, os anéis foram congelados em nitrogênio líquido, e mantidos a -80° C até o dia do experimento.
No dia do experimento, os anéis foram macerados individualmente com inibidor de protease e centrifugados por 10 minutos a 4°C a 1.6 G. Foram retirados 25uL de sobrenadante, adicionado 25uL de SDS e 1mL de reativo de cor. As amostras foram então mantidas em banho seco à 100°C por uma hora. Após 1 hora, as amostras foram levadas a geladeira por dez minutos e pipetadas em placa de 96 poços.
As leituras foram realizadas por leitora de placa no comprimento de onda de 550 nm, e o resultado final foi normalizado pela quantidade de proteínas dosada pelo método de Lowry (LOWRY, 1951).
5. ANÁLISE ESTATÍSTICA
Para os experimentos de reatividade vascular, foram analisados, a partir de curvas concentração-efeito, os parâmetros farmacológicos de eficácia (Emax, efeito máximo) e potência (pD2 = –log EC50) dos diferentes compostos. Os valores de EC50 (concentração que produz 50 % da resposta máxima) foram determinados pelo método de regressão não linear dos mínimos quadrados, utilizando-se o programa GraphPad Prism 3.0 (GraphPad Software Corporation, La Jolla, EUA). Todos os resultados foram expressos como a média ± erro padrão da média (EPM).
Os experimentos para determinação de capacidade antioxidante foram expressos como a média ± EPM e comparados entre os grupos. Nos resultados dos experimentos feitos para determinação de peroxidação lipídica foram expressos como a média ± EPM e foram comparados entre os grupos. Os gráficos, a análise estatística e a comparação entre os resultados foram feitas utilizando o mesmo software GraphPad Prism 3.0. A comparação entre os resultados foi realizada pela análise de variância (ANOVA) ou Test t de Student, sendo adotado nível de 5% (p<0,05) para as diferenças significativas.
6. RESULTADOS
6.1. Análise da contração induzida pela fenilefrina em aortas incubadas e não
incubadas.
A fenilefrina promoveu contração dose-dependente em anéis de aorta não incubados (controle) ou incubados de ratos Wistar. Os resultados mostram que apocinina, assim como o ácido elágico e ácido protocatecuico reduzem a contração induzida pela fenilefrina em aortas de ratos Wistar (Figura 1 A e B). No entanto, a incubação com ácido protocatecuico não alterou a eficácia (Emax: 2,4 ± 0,2), mas reduziu a potência da fenilefrina (pD2:6,9 ± 0,1) (Figura 1A). O ácido elágico promoveu redução do efeito máximo (Emax: 2,1 ± 0,4) e da potência (pD2: 7,0 ± 0,3) da fenilefrina, quando comparados aos valores de Emax e pD2 obtidos nas curvas controle (2,8 ± 0,2; 7,3 ± 0,1, respectivamente) (Figura 1B). A apocinina também reduziu os valores de Emax (2,1 ± 0,3) e pD2 (6,9 ± 0,1) da fenilefrina.
Figura 1. Efeito contrátil da fenilefrina (0,1 nmol/L – 100 μmol/L) em anéis de aorta de ratos Wistar incubados
por 30 minutos com apocinina (APO, triângulo), ácido protocatecuico (APC, círculo), ácido elágico (AE, losango) ou não incubados (controle, quadrado). Valores representam a média ± erro padrão da média, n = 4-6. *p<0,05 entre valores de pD2 da curva controle versus outras curvas, &p<0,05 entre valores de Emax da curva
controle versus outras curvas.
-11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3 -1 0 1 2 3 Controle APO AE & *
Fenilefrina (Log mol/L)
C o n tr ação ( g ) B -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3 -1 0 1 2 3 Controle APO APC * & A
Fenilefrina (Log mol/L)
Co n tr a ç ã o ( g )
O efeito da apocinina e do ácido elágico estão sobrepostas demonstrando que ambas foram capazes de modular a eficácia e o efeito máximo da contração induzida por fenilefrina. Os resultados observados neste estudo com a apocinina corroboram com resultados já descritos na literatura (TROIANO et. al, 2016; PERASSA et al., 2016) que demonstram que seu efeito no aumento da modulação do endotélio e da atividade da eNOS sobre a contração vascular estimulada por fenilefrina em ratos Wistar.
O ácido protocatecuico deslocou as curvas concentração-efeito à fenilefrina em aortas de ratos Wistar. Considerando que o ácido protocatecuico é um excelente composto fenólico antioxidante que apresenta maior capacidade em eliminar radicais livres quando comparado a apocinina (PETRONIO et al., 2013), nossos resultados sugerem que a ação antioxidante do ácido protocatecuico seria suficiente para reduzir a biodisponibilidade de ERO em aortas de Wistar, e aumentar a biodisponibilidade de NO.
6.2. Determinação da capacidade antioxidante total da apocinina, do ácido
protocatecuico e do ácido elágico.
A capacidade antioxidante foi avaliada e comparada para as concentrações de 0,1 nmol/L-1 mmol/L dos três compostos pelo método FRAP. Não foi observada capacidade antioxidante nas concentrações de 0,1 nmol/L – 10 μmol/L. Já nas concentrações de 0,1 mmol/L e 1 mmol/L observamos capacidade antioxidante para os três compostos. No entanto, o ácido protocatecuico apresentou capacidade antioxidante nas concentrações de 0,1 mmol/L (0,40 ± 0,006) e 1mmol/L (3,85 ± 0,002) maior que dos outros compostos (Figura 2). A apocinina apresentou capacidade antioxidante menor que do ácido protocatecuico e semelhante ao do ácido elágico nas concentrações de 0,1 mmol/L (Apocinina: 0,24 ± 0,002; Ácido elágico: 0,19 ± 0,007) e 1 mmol/L (Apocinina: 1,17 ± 0,05; Ácido elágico: 1,42 ± 0,05) (Figura 2).
-11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3 -2 0 APO APC AE 1 2 3 4 * * Log (mol/L) FRA P (m m o l/ L F e S O4 )
Figura 2. Capacidade antioxidante, em mmol/L de FeSO4, da apocinina APO, quadrado), ácido
protocatecuico (APC, triângulo) e ácido elágico (AE, círculo) avaliada pelo método FRAP, nas concentrações de 0,1 nmol/L – 1 mmol/L. p<0,05 APO versus outros compostos.
6.3. Determinação da peroxidação lipídica de aorta de ratos, incubadas com
apocinina, ácido protocatecuico e ácido elágico.
O efeito dos diferentes compostos sobre o dano oxidativo em aortas de ratos Wistar. Foi avaliado, pelo método do TBARS como pode ser observado nos gráficos (Figura 3), a apocinina e o ácido protocatecuico promoveram redução do dano oxidativo em aortas de ratos Wistar (Figura 3). Entretanto, este efeito não foi observado em aortas incubadas com o ácido elágico.
Controle APO APC AE
25 50 75 100
*
T
B
A
R
S
(
n
m
o
l/m
g
p
rot
eí
na
)
**
Figura 3. Concentração de substâncias reativas ao ácido 2-thiobarbiturico (TBARS, em nmol/mg proteína) em
aortas de ratos Wistar, pré incubadas com apocinina (APO, 0,1 μmol/L), ácido protocatecuico (APC, 0,1 μmol/L) e ácido elágico (AE, 0,1 μmol/L) por 30 minutos. As barras representam a media ± EPM dos experimentos realizados. *p< 0.05; **p< 0.01 (teste t de Student, controle versus outros grupos).
7. CONSIDERAÇÕES FINAIS
Nesse estudo foi avaliado o perfil da apocinina em comparação com o ácido protocatecuico e o ácido elágico. Foi observado que os três compostos apresentam capacidade antioxidante, sendo o ácido protocatecuico com maior capacidade antioxidante e também o que mais reduziu o dano oxidativo avaliado pelo método TBARS, seguido pela apocinina que apresentou menor capacidade antioxidante e consequentemente menor redução do dano oxidativo.
Na reatividade vascular, a apocinina e o ácido elágico apresentaram os melhores resultados, pois foram capazes de reduzir a eficácia e o efeito máximo da contração vascular em relação aos controles.
Com base nesses resultados, é sugerido que a apocinina foi o melhor composto testado até então, pois atuou tanto na eliminação de ERO, quanto na inibição da sua geração.
8. REFERÊNCIAS
AYHANCI, A. et al. Protective effects of ellagic acid in D-galactosamine-induced kidney damage in rats. Cytotechnology. P.1-8, 2015.
BABIOR, B. M. NADPH oxidase. Curr. Opin. Immunol., v. 16, p. 41-47, 2004.
BAHIA, Luciana et al. O endotélio na síndrome metabólica. Arq Bras Endocrinol Metab, São Paulo , v. 50, n. 2, p. 291-303, Apr. 2006.
BARBOSA, K. B. F., et al. Estresse oxidativo: conceito, implicações e fatores modulatórios. Ver. Nutr., Campinas. v. 23, p. 629-643, Ago. 2010.
BENZIE, I. F.; STRAIN. The ferric reducing ability of plasma (FRAP) as a measure of “antioxidant power”: the FRAP assay. Anal. Biochem., v. 239, n. 1, p. 70–76, 1996.
BESWICK, R. A. et al. NADH/NADPH oxidase and enhanced superoxide production in the mineralocorticoid hypertensive rat. Hypertension, v. 38, n. 5, p. 1107-1111, Nov. 2001.
Brunton, L.L. Goodman & Gilman: As Bases Farmacológicas da Terapêutica. 12ª ed. Rio de Janeiro: McGraw-Hill, 2012
CANADIAN COUNCIL ON ANIMAL CARE. Guide to the Care and Use of Experimental Animals. v. 1, 1993. COSTA, C. A. et al. Antioxidant treatment with tempol and apocynin prevents endothelial dysfunction and development of endovascular hypertension. Am. J. Hypertens., v. 22, n. 12, p. 1242-1249, Dec. 2009.
DEVIPRIYA, N. et al. Dose-response effect of ellagic acid and circulatory antioxidants and lipids during alcohol-induced toxicity in experimental rats. Fundam. Clin. Pharmacol. v.21, p.621-630, 2007
DRUMMOND, G. R. et al. Combating oxidative stress in vascular disease: NADPH oxidases as therapeutic targets. Nature Rev., v. 10, p. 453-471, Jun. 2011.
EL-SAWALHI, M. M.; AHMED, L.A. Exploring the protective role of apocynin, a specific NADPH oxidase inhibitor, in cisplatin-induced cardiotoxity in rats. Chemico-Biological Interactions. v.207, p.58-66, 2014. FERREIRA, A.L.A., MATSUBARA, L.S. Radicais livres: conceitos, doenças relacionadas, sistema de defesa e estresse oxidativo. Rev Ass Med Brasil. v. 43, p. 61-68, 1997.
FURCHGOTT, R. F.; VANHOUTTE, P. M. Endothelium-derived relaxing and contracting factors. The FASEB Journal. V. 3, Jul. 1989.
GEISZT, M. NADPH oxidases: new kids on the block. Cardiovasc. Res., v. 71, n. 2, p. 289-299, Jul. 2006. GUZIK, T. J.; HARRISON, D. G. Vascular NADPH oxidases as drug targets for novel antioxidant strategies. Drug. Discov. Today, v.11, n. 11/12, Jun. 2006.
HASSOUN, E.A. et al. Modulation of TCDD-induced fetotoxicity and oxidative stress in embriyonic and placental tissues of C57BL/6J mice by vitamin E succinate and ellagic acid. Toxicology. v.127, p.27-37, 1997. HU, L. et al. Apocynin but not L-arginine prevents and reverses dexamethasone-induced hypertension in the rat. Am. J. Hypertens., v. 19, n. 4, p. 413-418, Apr. 2006.
KAKKAR, S.; BAIS, S. A Review on Protocatechuic Acid and Its Pharmacological Potential. ISRN Pharmacol. Mar. 2014.
KHAN, A.K. et al. PHARMACOLOGICAL ACTIVITIES OF PROTOCATECHUIC ACID. Acta Polinae Pharmaceutica Drug Res. v.72, n.4, p.643-650, 2015.
LEE, W.J. et al. Ellagic acid inhibits oxidized LDL-mediated LOX-1 expression, ROS generation, and inflammation in human endothelial cells. J. Vasc. Surgery. v.52, n.5, p.1290-1300, Nov. 2010.
LOWRY, O.H. et al. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem. v.193, p. 265-275, 1951.
MARTIN, E. et al. Soluble Guanylyl Cyclase: The Nitric Oxide Receptor. METHODS IN ENZYMOLOGY, v. 396, p. 478-492, 2005.
MARTÍNEZ-REVELLES, S. et al. Reciprocal relationship between reactive oxygen species and cyclooxygenase-2 and vascular dysfunction in hypertension. Antioxid. Redox Signal, v. 18, n. 1, p. 51-65, Jan. 2013.
PERASSA, L. A., et al. Apocynin reduces blood pressure and restores the proper function of vascular endothelium in SHR, v. 87. p. 38-48, December, 2016.
Petronio MS, et al. Apocynin: chemical and biophysical properties of a NADPH oxidase inhibitor. Molecules. 2013;18:2821–2839.
PINHO, R. A., et al . Doença arterial coronariana, exercício físico e estresse oxidativo. Arq. Bras. Cardiol., São Paulo , v. 94, n. 4, p. 549-555, Abr. 2010.
ROSS R, GLOMASER JA. Atherosclerosis and arterial smooth muscle cell: proliferation of smooth muscle is a key event in the genesis of the lesions of atherosclerosis. Science. 1973; 180: 1332-9.
SALIMI A. et al. Ellagic acid, a polyphenolic compound, selectively induces ROS-mediated apoptosis in cancerous B-lymphocytes of CLL patients by directly targeting mitochondria. Redox Biol. v.6, p.461-471, 2015. SEERAM, N.P. et al. In vitro antiproliferative, apoptotic and antioxidant activies of punicalagin, ellagic acid and a total pomegranate tannin extract arenenhanced in combination with other polyphenols as found in pomegranate juice. J. Nutr. Biochem. v.16, p.360-367, 2005.
SELEMIDIS, S. et al. NADPH oxidases in the vasculature: molecular features, roles in disease and pharmacological inhibition. Pharmacol. Ther., v. 120, n. 3, p. 254-291, Dec. 2008.
SOONG, Y.Y.; BARLOW, P.J. Antioxidant activity and phenolic content of selected fruit seeds. Food Chem. v.88, p.411–417, 2004.
STEFANSKA, J.; PAWLICZAK, R. Apocynin: molecular aptitudes. Mediators Inflamm., v. 2008, p. 106507, 2008.
TROIANO, J.A. et al. Decreased reactive oxygen species production and NOX1, NOX2, NOX4 expressions contribute to hyporeactivity to phenylephrine in aortas of pregnant SHR. Life Sci. v.144, p.178-184, 2016. UNGER, B. S.; PATIL, B. M. Apocynin improves endothelial function and prevents the development of hypertension in fructose fed rat. Indian J. Pharmacol., v. 41, n. 5, p. 208-212, Oct. 2009.
VATTEM, D.A.; SHETTY, K. BIOLOGICAL FUNCTIONALITY OF ELLAGIC ACID: A REVIEW. J. Food Biochem. v. 29. n.3, p. 234-266. Jun. 2005.
WILLIANS, H. C.; GRIENDLING, K. K. NADPH oxidase inhibitors: new antihypertensive agents? J. Cardiovasc. Pharmacol., v. 50, n. 1, p. 9-16, Jul. 2007.
WORLD HEALTH ORGANIZATION. The top 10 causes of death. , 2015. Disponível em: < http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs310/en/>. Acesso em: 24 de Novembro, 2017
YILMAZ, B.; USTA, C. Ellagic Acid-Induced Endothelium-Dependent and Endothelium-Independent Vasorelaxation in Rat Thoracic Aortic Rings and the Underlying Mechanism. Phytother. Res. v.27, n.2, p. 285-289, Feb. 2013.
YU, J. et al. The role of methoxyphenol apocynin, a vascular NADPH oxidase inhibitor, as a chemopreventative agent in the potential treatment of cardiovascular diseases. Curr. Vasc. Pharmacol. v.6, p.204-217, 2008.
