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UNIVERSIDADE DO SUL DE SANTA CATARINA MARCOS FLÁVIO GHIZONI

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AVALIAÇÃO DA REGENERAÇÃO NERVOSA EM EXTENSA LESÃO NEURAL ASSOCIADA AO USO OU NÃO DE HORMÔNIO ESTERÓIDE ANABOLIZANTE

Tubarão 2011

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MARCOS FLÁVIO GHIZONI

AVALIAÇÃO DA REGENERAÇÃO NERVOSA EM EXTENSA LESÃO NEURAL ASSOCIADA AO USO OU NÃO DE HORMÔNIO ESTERÓIDE ANABOLIZANTE

Dissertação apresentada ao Curso de Mestrado em Ciências da Saúde da Universidade do Sul de Santa Catarina, como requisito parcial à obtenção do título de Mestre em Ciências da Saúde

Orientador(a): Profa. Rosemeri Maurici da Silva, Dra.

Tubarão 2011

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MARCOS FLÁVIO GHIZONI

AVALIAÇÃO DA REGENERAÇÃO NERVOSA EM EXTENSA LESÃO NEURAL ASSOCIADA AO USO OU NÃO DE HORMÔNIO ESTERÓIDE ANABOLIZANTE

Esta dissertação foi julgada adequada à obtenção do título de Mestre em Ciências da Saúde e aprovada em sua forma final pelo Curso de Mestrado em Ciências da Saúde da Universidade do Sul de Santa Catarina

Tubarão, 17 de outubro de 2011.

______________________________________________ Professora e orientadora: Rosemeri Maurici da Silva, Dra.

Universidade do Sul de Santa Catarina

______________________________________________ Profa. Anna Paula Piovezan, Dra.

Universidade do Sul de Santa Catarina

______________________________________________ Prof. Adair Roberto Soares dos Santos, Dr.

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Aos meus pais Estevão e Ruth, exemplos de dignidade, compreensão, dedicação, honestidade e meus primeiros Educadores, o meu amor e respeito.

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AGRADECIMENTOS

À professora Rosemeri, minha orientadora pelo apoio sempre que necessário, que com sua perspicácia soube nos conduzir para frente quando o cansaço e desânimo nos tomava conta: muito obrigado!

Aos professores do mestrado pelo carinho e dedicação, sempre prontos para ajudar.

Às funcionárias do curso, sempre com boa vontade em atender as nossas solicitações, obrigado a Silvane e Franciéli.

À Raissa pela generosidade dos desenhos, sempre solicitados para ontem, muito obrigado!

Aos funcionários do anatômico, grupo do qual faço parte, meu muito obrigado pela ajuda e compreensão.

Agradeço a professora Ester e ao professor Rene, que sem eles seria muito difícil o trabalho no laboratório.

Agradeço ao Sr. Pedrinho, sempre com sua boa vontade em ajudar e transmitir o cuidado com os animais.

À professora Albertina pela dedicação e otimismo, razão da existência do laboratório de pesquisa em neurocirurgia.

À minha família pela compreensão e as horas de espera, muito obrigado!

Agradeço a DEUS pela existência e ao fato de ter colocado no meu caminho o amigo Dr. Jayme A. Bertelli.

Finalmente agradeço aqueles que foram injustos comigo porque me ensinaram a perdoar.

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“Talvez não tenhamos conseguido fazer o melhor. Mas lutamos para que o melhor fosse feito. Não somos o que deveríamos ser não somos o que iremos ser, mas graças a Deus não somos o que éramos”. (Martir Luther King)

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RESUMO

Em geral, busca-se nas pesquisas em neurociência das lesões do sistema nervoso periférico a recuperação funcional. Entretanto, ainda estão faltando testes para estudar a recuperação funcional, assim como modelo de lesão neural severa, que seja suficiente para avaliar com maior acurácia a ação de drogas sobre a regeneração. No presente estudo, utilizou-se enxertos longos do nervo mediano e flexores dos dedos como modelo experimental. Para tanto, selecionou-se três grupos de ratos fêmeas e sedentárias. O primeiro grupo recebeu decanoato de nandrolona 5mg/Kg IM semanal. Já o segundo, não recebeu medicação e o terceiro, sem enxerto, destinou-se ao controle. Após o enxerto do nervo mediano submeteu-se os ratos ao teste de grasping diariamente, até observar-se a flexão dos dedos. A força de preensão restou avaliada aos noventa e cento e oitenta dias por intermédio de novos testes de grasping. Testou-se a sensibilidade nociceptiva, na pata anterior esquerda, por meio de estímulo elétrico com eletrodo bipolar. Foram realizados, com noventa e cento e oitenta dias, estudos eletrofisiológicos e morfométricos do bíceps, flexor radial do carpo e flexor dos dedos. Ao término dos cento e oitenta dias, verificou-se que o decanoato de nandrolona acelerou a velocidade de regeneração neural, aumentou a força de preensão e melhorou a sensibilidade nociceptiva de maneira significante. Por sua vez, estudos eletrofisiológicos indicaram ação seletiva do mencionado esteróide em diferentes grupos musculares, em especial o bíceps com aumento da força contrátil e peso. Notou-se, também, aumento da massa corporal nos ratos do grupo nandrolona, a qual não se pode concluir que seja decorrente da ação do esteróide devido à falta de controle da ingestão de ração.

Palavras-chave: esteróide anabolizante androgênico, decanoato de nandrolona, nervo mediano, modelo de lesão, recuperação funcional.

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ABSTRACT

In general, we seek to neuroscience research in lesions of the peripheral nervous system functional recovery. However, are still lacking tests to study the functional recovery, as well as a model of severe nerve damage, which is sufficient to assess more accurately the action of drugs on regeneration. In the present study used grafts of the median nerve and finger flexors as the experimental model. For this , we selected three groups of female, sedentary rats. The first group received nandrolone decanoate 5mg/kg IM weekly. The second, no received medication and third, without graft, was intended to control. After the graft of the median nerve underwent rats to test grasping daily until observed fingers flexion. Grip strength remained assessed at 3 and 6 months by new tests for grasping. We tested the nociceptive sensitivity in the left paw, through electrical stimulation with bipolar electrodes. Were conducted , electrophysiological and morphometric studies of the biceps, flexor carpi radialis and flexor of the fingers. At the end of research, it was found that nandrolone decanoate has accelerated the speed of neural regeneration, increased grip strength and enhanced nociceptive sensitivity in a significant way. In turn, electrophysiological studies indicated selective action of the steroids mentioned in different muscle groups, especially the biceps with increased contractile force and weight. It was noted, also, increased body mass in the nandrolone group rats, which we can`t assume to be due to the action of the steroid because of lack of control of food intake.

Keywords: anabolic androgenic steroid, nandrolone decanoate, median nerve, paradigm of lesion, behavioral recovery.

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LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura 1 - Plexo braquial e suas origens nas raízes cervicais ... 14

Figura 2 - Sequela de paralisia completa do plexo braquial ... 14

Figura 3 - Exposição do nervo mediano em toda a extensão da pata do animal ... 22

Figura 4 - Isolado o nervo mediano para ser utilizado como enxerto ... 23

Figura 5 - Fragmento de 4 cm do nervo mediano que será enxertado na pata esquerda ... 23

Figura 6 - Sutura dos extremos, sendo realizado looping no subcutâneo para acomodar o nervo ... 24

Figura 7 - Fechamento por planos com mononylon 4-0 ... 24

Figura 8 – Flexão correta dos dedos da pata do rato (Grasping) ... 25

Figura 9 - O animal é mantido suspenso pela cauda perpendicular à grade e, tão logo agarre a grade, é tracionado firmemente até que solte, sendo registrado o peso negativo como a força de tração ... 26

Figura 10 – Caixa compartimentalizada com 10 ratos ... 27

Figura 11 – Estímulo aplicado no bordo radial da pata anterior esquerda ... 28

Figura 12 – Conjunto nervo mediano e enxerto isolados com látex ... 29

Figura 13 – Tendão flexor radial do carpo conectado ao transdutor ... 30

Figura 14 - Tendão flexor radial do carpo isolado e fixo com fio ao transdutor de força ... 30

Figura 15 - Sistema de registro da força contrátil muscular ... 31

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LISTA DE TABELAS

Tabela 1 – Recuperação motora avaliada pela força de preensão (Grasping) ... 33

Tabela 2 – Peso dos músculos flexores dos dedos e bíceps ... 35

Tabela 3 – Peso dos músculos, flexor radial do carpo ... 35

Tabela 4 – Força contrátil do flexor dos dedos e flexor radial ... 36

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SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO ... 13 1.1 JUSTIFICATIVA ... 18 2 OBJETIVOS ... 19 2.1 OBJETIVO GERAL ... 19 2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ... 19 3 ETAPAS METODOLÓGICAS ... 20 3.1 TIPO DE ESTUDO ... 20 3.2 SELEÇÃO DE ANIMAIS ... 20 3.3 PROCEDIMENTOS ... 21

3.3.1 Anestesia e preparo pré-operatório ... 21

3.3.2 Técnica operatória ... 21

3.3.3 Avaliação funcional ... 25

3.3.4 Recuperação motora ... 25

3.3.5 Recuperação sensorial ... 26

3.4 ESTUDOS ELETROFISIOLÓGICOS DA RECUPERAÇÃO MOTORA ... 28

3.4.1 Peso dos músculos ... 31

3.5 ANÁLISE ESTATÍSTICA ... 32

4 RESULTADOS ... 33

4.1 AVALIAÇÃO FUNCIONAL ... 33

4.1.1 Recuperação motora ... 33

4.1.2 Recuperação sensitiva ... 34

4.1.3 Peso dos músculos ... 34

4.1.4 Força contrátil ... 35

5 DISCUSSÃO ... 37

5.1 MODELO EXPERIMENTAL E A AVALIAÇÃO DA RECUPERAÇÃO FUNCIONAL37 5.2 AVALIAÇÃO ELETROFISIOLÓGICA ... 38

5.3 AVALIAÇÃO SENSORIAL ... 38

REFERÊNCIAS ... 40

APÊNDICE ... 44

APÊNDICE A – Protocolo de trabalho para coleta de dados ... 45

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1 INTRODUÇÃO

Define-se o plexo braquial como sendo a rede de nervos formada pela união das quatro últimas raízes cervicais e da primeira torácica, sendo que essa complexa malha nervosa, com suas divisões e uniões, estende-se do pescoço até a axila (Figura 1). Apesar do conhecimento atual sobre a anatomia e função dessa região do sistema nervoso periférico, o estado da arte sobre suas estruturas ainda não foi alcançado (BERTELLI; GHIZONI, 2005).

As lesões traumáticas do plexo braquial, desde a antiguidade, despertam interesse dos estudiosos por serem devastadoras, devido à paralisia com atrofia do membro afetado e perda da vitalidade cutânea, o que gera características mutilantes ao paciente lesionado (Figura 2).

Mesmo com a introdução do microscópio cirúrgico, a partir do ano de 1960, para o tratamento de lesões do sistema nervoso periférico, e o contínuo desenvolvimento de instrumental de microcirurgia, refinamento das técnicas de sutura e o uso de enxertos nervosos, a completa recuperação e normalização da função nervosa quase nunca ocorrem, e o resultado clínico com frequência é a restituição parcial da força do membro afetado (MCALLISTER et al., 1996). Isto gera um enorme contingente de jovens com limitação da capacidade laboral. Por exemplo, só em São Paulo, no ano de 1998, 119000 casos de lesões de nervos periféricos foram confirmados. A recuperação parcial ou a não-recuperação se traduzem em prejuízos para a sociedade, visto que essas lesões são mais frequentes no membro superior e em jovens do sexo masculino (SHIVANAND et al., 2010). As consequências podem ser desastrosas para a mão e função do membro superior, com grande probabilidade de perda da função laboral, e substancial impacto socioeconômico para o paciente e sociedade (JAQUET et al., 2001). A qualidade de vida do paciente pode ser ruim devido à possibilidade de a mão permanecer paralisada durante toda a vida, bem como a persistência da dor, disestesias, e intolerância ao frio (BERTELLI; GHIZONI, 2008).

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Figura 1 - Plexo braquial e suas origens nas raízes cervicais.

SSE = nervo supra escapular, MCN = nervo musculo cutâneo, AXN = nervo axilar, RN = nervo radial, MN = nervo mediano, UN = nervo ulnar, TD = nervo tóraco dorsal, MCFA = nervo cutâneo medial do antebraço, MCA = nervo cutâneo medial do braço.

Fonte: Capeler, 2009.

Figura 2 - Sequela de paralisia completa do plexo braquial. Fonte: Elaboração do autor, 2010.

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O pensamento de realizar um ato motor é transformado em impulso nervoso, que é transmitido aos músculos responsáveis pelo movimento imaginado. Num gesto amigável, por exemplo, distintos grupos musculares participam desse ato: um grupo eleva o braço, outro flexiona o cotovelo e, por fim, um terceiro grupo muscular realiza a extensão do punho e dedos. Do mesmo modo, o ato de perceber delicados relevos em uma moeda, o quente ou frio, e todas as diferentes modalidades de sensações são informações enviadas ao cérebro para a percepção consciente através do plexo braquial.

As lesões de nervos periféricos do antebraço e da mão são especiais, e podem resultar em perda funcional com impacto de importante consequência social (ROSBERG et al., 2005). A mão, cuja função sensório-motora dependente de adequada função de seus componentes no sistema nervoso central e periférico, é como uma extensão do cérebro, configurando-se em um pré-requisito para o desempenho funcional de cada pessoa no trabalho, na sociedade, e na vida familiar. A função sensorial altamente especializada da mão é fundamental, porque através da sensibilidade táctil, as mãos exploram e auxiliam a percepção do meio ambiente. Além disso, a mão é um símbolo de identidade, estando intimamente ligada a nossa personalidade. Os movimentos e gestos das mãos são importantes componentes da linguagem corporal, auxiliando a expressar os sentimentos, e na comunicação com outras pessoas. Ainda, o tato das mãos pode trazer conforto e consolo. Por estas razões, as lesões do plexo braquial que afetam a mão, especialmente aquelas consequentes de lesões neurais, facilmente causam desabilidade médica e social (LUNDBORG, 2005).

Atualmente, a incidência de lesões do sistema nervoso periférico tem aumentado, sobretudo entre jovens envolvidos em acidentes de motocicleta (FLORES, 2006). Essa realidade traz sérias consequências socioeconômicas, porque os pacientes que sofrem esse tipo de lesão ficam com sequelas graves que podem comprometer os movimentos da mão ou de todo o membro superior, associadas à dor persistente.

O estado atual do desenvolvimento de técnicas microcirúrgicas, material sintético e o conhecimento aprimorado das transferências nervosas, fazem com que a estratégia cirúrgica tenha alcançado o estado da arte para os dias atuais. Sendo assim, faz-se necessário direcionar as pesquisas para outros alvos, como por exemplo, o uso de drogas que promovam a regeneração nervosa. Embora centenas de trabalhos afirmem que esta ou aquela droga aumenta a regeneração nervosa (MAGNACHI, 2009), nenhuma destas drogas passou para o estágio de uso clínico. Este vazio entre o laboratório e a prática clínica pode ter origem no modelo experimental utilizado. Na maioria dos estudos, empregou-se um modelo de esmagamento do nervo. O esmagamento produz uma lesão do tipo axonotmesis (BRIDGE et

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al., 1994), que com ou sem tratamento, leva a uma recuperação funcional completa em ratos ou humanos. Desta maneira, este modelo é inadequado, por não testar a realidade na clínica.

Recentemente, foi desenvolvido um modelo de reinervação deficiente no rato, interpondo 40 mm de enxerto nervoso entre os cabos do nervo mediano no braço (BERTELLI et al., 2003). Aos seis meses, apenas 50% da força de preensão, e 30% da capacidade nociceptiva haviam sido restabelecidas. Aos 12 meses, os ratos recuperaram 65% da força de preensão, não havendo melhora na resposta nociceptiva. Isto contrasta com os achados em enxertos mais curtos, de 10 e 15 mm, em que os animais recuperam aproximadamente 75% da força de preensão normal no 6º mês, e quase 100% no 12º mês (BERTELLI et al., 2003).

Outro fato interessante é que os animais com enxertos de 40 mm começaram a flexionar os dedos 44 dias em média após a cirurgia, enquanto ratos com enxertos curtos iniciaram a recuperação 15 dias após a reparação nervosa. Dessa forma, este modelo de reinervação deficiente permite que se observe com maior clareza efeitos de drogas para acelerar e melhorar a recuperação após uma lesão nervosa.

Os esteróides anabolizantes androgênicos são derivados sintéticos da testosterona, obtidos através de mudanças na estrutura molecular desse hormônio, resultando em dois grupos que se diferenciam nos efeitos e uso: via oral ou intramuscular. Os esteróides sintéticos apresentam maior afinidade com os receptores androgênicos, absorção e eliminação mais lentas, maior resistência a ação da 5-alfa-redutase, diminuindo a aromatização (KUHN, 2002).

Atualmente tem sido sugerido que esteróides anabolizantes, como por exemplo, a nandrolona, possam atuar no sistema nervoso periférico, como moduladores de fenômenos moleculares que ocorrem na célula nervosa como resposta a lesão (ZHAO et al.,2008). Os esteróides neuroativos modulam a atividade mitogênica, proliferação e síntese da mielina periférica pelas células de Schwann, mecanismos estes relacionado com a regeneração nervosa periférica (DESARNAUD et al., 1998).

Apesar de vários experimentos publicados - Isaacs et al. (2011); Lynch, Schertzer, Ryall, (2008); Joumaa et al. (2002) e Taylor; Brooks; Ran (1999) - sobre os efeitos da nandrolona evitando a atrofia por desenervação ou imobilização, e melhorando a recuperação muscular após lesões externas ou internas, na maioria destes estudos, para testar a ação dos esteróides na regeneração neural, foi utilizada a lesão causada por crush do nervo ciático em ratos (BROWN; KHAN; JONES, 1999; SWALLOW, 1999; ISAACS et al., 2011).

Desta forma, foi hipotetizado que esteróides, em particular o decanoato de nandrolona, poderiam melhorar a recuperação motora num modelo de reinervação deficiente

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após reparação do nervo mediano em ratos. Os hormônios esteróides anabolizantes apresentam efeito neuroativo, em especial a nandrolona, por sua maior ação anabolizante, e em menor grau, o efeito androgênico. O decanoato de nandrolona mantém a atividade anabólica da testosterona, mas sua ação androgênica é marcadamente reduzida. O quociente anabólico/androgênico após duas semanas de tratamento, é cerca de 12 vezes aquele obtido com decanoato de testosterona. Administrado por via intramuscular, o fármaco é liberado lentamente do local da injeção para a corrente sanguínea, tendo uma meia vida de seis a oito dias.

Segundo Cardozo (2010), além da ação no sistema nervoso periférico, o decanoato de nandrolona age positivamente no metabolismo do cálcio, aumentando a massa óssea, podendo ser usado para tratar a osteoporose na mulher pós- menopausa, câncer de mama disseminado, estados de deficiência protéica após cirurgias de grande porte ou trauma, anemia, e falência renal crônica. Os efeitos secundários são mais comuns nas mulheres e estão relacionados à dose usada, sendo os mais frequentes o crescimento de pêlos na face, mudança da tonalidade da voz e hipertrofia do clitóris (LENEHAN, 2003).

O uso abusivo da medicação está relacionado ao desconhecimento da dose e período do uso, situações em que os efeitos colaterais são mais freqüentes, podendo comprometer o sistema cardiovascular, aumentar o risco de lesões músculo esqueléticas, acarretar virilização na mulher, ginecomastia e atrofia testicular no homem. As alterações psiquiátricas descritas com mais frequência, nas condições citadas previamente, são alterações do humor com episódios de agressividade, e estados maníacos. É discutível a síndrome de abstinência e adição, no entanto, existem evidências desta ocorrência. Como complicação local da injeção, é descrito a miopatia aguda com consequente dor e posterior atrofia muscular localizada (YESALIS, 2000).

Nesse experimento foi utilizado um modelo de lesão neural severo, que com o reparo cirúrgico a recuperação é deficitário, citado anteriormente, para testar os efeitos do decanoato de nandrolona. Foi decidido utilizar a nandrolona por ser uma droga de uso clínico, e cujos efeitos adversos são amplamente conhecidos. A droga foi administrada por via IM, e iniciada no sexto dia após a lesão, na tentativa de uma maior semelhança com a realidade clínica. Foram escolhidas ratos fêmeas jovens, para minimizar ambos os problemas, a senescência relacionada com estudos prolongados, e o hipogonadismo induzido pelos esteróides, como observado em estudo prévio (ISAACS et al., 2011).

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1.1 JUSTIFICATIVA

Traumatismos de nervos periféricos são frequentes e, apesar de não representarem uma ameaça à vida do paciente, suas consequências sobre a qualidade de vida e custos socioeconômicos são relevantes, o que justifica a busca por um maior entendimento na escolha da técnica mais adequada a ser utilizada para cada forma de lesão (BERTELLI; GHIZONI, 2004).

O meticuloso reparo cirúrgico não pode garantir a completa recuperação da função nervosa, porque o cirurgião não tem controle sobre os eventos biológicos que ocorrem no meio interno do nervo lesionado. A manipulação terapêutica da resposta ao dano lesional no nível molecular tem potencial para manter mais neurônios vivos, acelerar o crescimento axonal, maximizar a acurácia da reinervação do alvo, e modular a dor neuropática (HALL, 2005). O atual conhecimento de que neurônios do sistema nervoso central e do sistema nervoso periférico apresentam receptores dos esteróides androgênicos, viabiliza a hipótese de que essas drogas possam a atuar sobre a regeneração nervosa (SWALLOW et al., 1999; JONES, 1988). Além disso, é necessária uma maior compreensão acerca da evolução espontânea das lesões, em diferentes graus de extensão delimitada no segmento neural lesionado, sem ruptura anatômica completa.

Desta forma, os resultados da pesquisa aqui proposta podem esclarecer a possibilidade do uso de esteróide anabolizante para aumentar a regeneração nervosa, após a ressecção da lesão e enxerto e esclarecer a relação entre a recuperação funcional e o uso de esteróide anabolizante.

Além da contribuição científica, o aprimoramento da técnica e o estudo de possíveis fatores interferentes, esta pesquisa poderá auxiliar a encontrar a forma/técnica ideal que se transformará numa alternativa – a um número cada vez mais elevado de vítimas de lesão do plexo braquial – de buscar uma recuperação e, por consequência, de reinserção social e laboral. Por outro lado, além dos benefícios científicos e humanos, a possibilidade de recuperação do paciente significaria diminuição dos gastos com a previdência social, pois o número de pessoas inativas e dependentes do poder público decresceria invariavelmente.

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2 OBJETIVO

2.1 OBJETIVO GERAL

Avaliar a regeneração nervosa em modelos deficitários de lesão neural associando ou não o uso de hormônios anabolizantes androgênicos.

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

• Avaliar o papel dos esteroides anabolizantes como estratégia para melhorar o grau de recuperação funcional na pata anterior esquerda do rato, em modelos de lesões nervosas deficitárias.

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3 ETAPAS METODOLÓGICAS

3.1 TIPO DE ESTUDO

O estudo apresentou delineamento experimental, utilizando uma população composta por ratos Wistar.

3.2 SELEÇÃO DOS ANIMAIS

Foram utilizados, no modelo experimental, 60 ratos (Rattus norvegicus albinus) da linhagem Wistar, fêmeas, pesando em média 239 g (DP±21), aparentemente sadios, oriundos do Biotério Central da Universidade do Sul de Santa Catarina. Os animais foram alojados, individualmente, em caixas de polipropileno e alimentados com água e ração ad libitum.

Os animais foram randomizados por sorteio simples, em três grupos de 20 exemplares cada um, identificados por numeração individual nas gaiolas, e distribuídos conforme segue:

• Grupo Deca: animais que sofreram secção do nervo mediano no ponto médio do braço, sendo realizado enxerto no mesmo ato. Todos os animais desse grupo receberam injeção de decanoato de nandrolona 1,2 mg semanal por via intramuscular (IM) durante 6 meses. Esse protocolo de injeção resultou em uma dose semanal de 5 mg/Kg, iniciados seis dias após a cirurgia. Estudos prévios que examinaram o efeito da nandrolona na regeneração nervosa e muscular, administraram a medicação na faixa de 5 a 15 mg/Kg. (JOUMAA et al., 2002; ISAACS et al., 2011; CUNHA et al., 2006).

• Grupo Sem Deca: animais que sofreram secção do nervo mediano no ponto médio do braço, sendo realizado enxerto no mesmo ato, recebendo veículo oleoso 0,12 ml intramuscular, durante 6 meses.

• Grupo controle: animais que sofreram ressecção de um segmento de 15 mm do nervo ulnar na pata esquerda, deixando-se o nervo mediano intacto.

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Os animais foram mantidos em sala climatizada (22±2ºC) com ciclo claro/escuro de 12 em 12 h. Os procedimentos foram realizados de acordo com as leis governamentais de proteção de animais usados para propósito experimental.

O projeto de pesquisa foi submetido e aprovado pelo comitê de ética e pesquisa em animais de experimentação da Unisul - Anexo A (10.700.4.01.IV).

A pesquisa foi desenvolvida no Laboratório de Microcirurgia Experimental da UNISUL.

3.3 PROCEDIMENTOS

3.3.1 Anestesia e preparo pré-operatório

Sob anestesia profunda (Xylazina 10 mg/Kg, Ketamina 100 mg/Kg), os animais foram posicionados em decúbito dorsal horizontal, com as patas presas por fita adesiva, em uma prancha de fórmica (30x35 cm) para cirurgia de pequenos animais.

Foram tricotomizados com aparelho especial para essa finalidade, e feita antissepsia na face interna de ambas as patas anteriores, com solução de clorohexidine.

3.3.2 Técnica operatória

Foi realizada incisão da axila até a fossa cubital, com dissecação dos nervos mediano e ulnar.

No membro esquerdo foi removido um fragmento de 15 mm do nervo ulnar, enquanto que o nervo mediano foi seccionado no ponto médio do braço. Os extremos proximal e distal foram redirecionados para a região peitoral e fossa cubital respectivamente. O nervo mediano contralateral foi removido da região peitoral até o punho, e um enxerto de 40 mm foi criado (Figura 3, 4, 5). O extremo proximal do enxerto foi suturado ao coto proximal do nervo mediano receptor. O enxerto foi tunelizado sob o peitoral, e recuperado

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distalmente na fossa cubital, sendo suturado com o extremo distal do nervo mediano (Figura 6).

As suturas nervosas foram realizadas com mononylon 10-0.

No lado direito, 15 mm do nervo ulnar foi removido. Por esta razão a pata direita foi usada como controle negativo, isto é, desnervada. O grupo controle teve a pata direita desnervada por meio de remoção de um fragmento de 15 mm dos nervos mediano e ulnar. No lado contralateral foi removido um segmento de 15 mm do nervo ulnar, deixando-se o nervo mediano intacto. Isto foi feito para adequar a pata esquerda como controle dos animais operados, pois apesar da lesão do nervo mediano e ulnar, apenas o nervo mediano foi enxertado. A pata direita foi desnervada nos dois grupos para facilitar e aumentar a precisão da avaliação funcional.

Grupo Deca: Ressecção do nervo mediano e enxerto com a técnica descrita anteriormente, sendo administrado, por 6 meses, hormônio anabolizante esteróide androgênico, por via intramuscular.

Grupo Sem Deca: Ressecção do nervo mediano e enxerto com a técnica descrita anteriormente, sendo administrado veículo oleoso intramuscular.

Figura 3 - Exposição do nervo mediano em toda a extensão da pata do animal. Fonte: Elaboração do autor, 2011.

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Figura 4 - Isolado o nervo mediano para ser utilizado como enxerto. Fonte: Elaboração do autor, 2011.

Figura 5 - Fragmento de 4 cm do nervo mediano que será enxertado na pata esquerda. Fonte: Elaboração do autor, 2011.

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Figura 6 - Sutura dos extremos, sendo realizado looping no subcutâneo para acomodar o nervo. Fonte: Elaboração do autor, 2011.

Figura 7 - Fechamento por planos com mononylon 4-0. Fonte: Elaboração do autor, 2011.

Os animais permaneceram em respiração espontânea durante o tempo operatório e após sutura da pele em um plano foi usado neomicina tópica sobre a incisão (Figura 7).

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Como analgesia pós-operatória, foi usado 272mg de paracetamol diluído em 100 ml de água para cada 4 animais dia.

3.3.3 Avaliação funcional

Os animais foram avaliados diariamente pelo teste de preensão (BERTELLI; MIRA, 1995) até a detecção da recuperação da flexão dos dedos. Para essa avaliação os ratos eram seguros pela cauda e elevados em ângulo reto, de tal maneira que pudessem agarrar a grade da gaiola. A flexão dos dedos indicava o início da recuperação funcional (Figura 8).

Figura 8 – Flexão correta dos dedos da pata do rato (Grasping). Fonte: CAPELER, 2010.

3.3.4 Recuperação motora

A força de preensão foi medida aos 90 e 180 dias após a cirurgia. Uma grade medindo 8 cm x 14 cm (com fios de 1,5 cm de diâmetro) fixa em uma balança digital por meio de 4 hastes foi usada. A balança foi fixada na mesa do laboratório por meio de 4 ventosas. Os ratos segurados pela cauda foram mantidos em ângulo reto com a grade, e tão logo agarrassem, eram elevados firmemente até que soltassem a grade. Nesse momento era

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registrado o valor negativo na balança, e a força do grasping era anotada (Figura 9). O teste foi considerado correto quando os ratos agarravam a grade no seu centro com os quatro dedos, sem flexão do punho ou cotovelo.

Figura 9 - O animal é mantido suspenso pela cauda perpendicular à grade e, tão logo agarre a grade, é tracionado firmemente até que solte, sendo registrado o peso negativo como a força de tração.

Fonte: Capeler, 2010.

3.3.5 Recuperação sensorial

Uma caixa de acrílico transparente com 10 compartimentos isolados de 20 cm2 e assoalho formado por uma grade atraumática foram usados para avaliação sensorial. Os animais foram identificados e colocados um a um nos compartimentos. Antes dos testes sensoriais os animais permaneceram nos compartimentos por 1 hora para permitir a sua adaptação (Figura 10). Foi utilizado um estimulador elétrico com intensidade de corrente de 25 mA e voltagem variável de 1 a 39 V.

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Figura 10 – Caixa compartimentalizada com 10 ratos. Fonte: Elaboração do autor, 2011

Um estímulo, com duração de 5 segundos, foi aplicado por meio de um eletrodo rombo, bipolar, no bordo radial da face palmar da pata anterior esquerda dos ratos. A investigação do limiar nociceptivo era iniciada com o menor estímulo, aumentando-o gradualmente, até ser obtida a retirada da pata. Em situações em que o estímulo de máxima voltagem não provocava a retirada da pata, considerava-se a não recuperação sensorial.

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Figura 11 – Estímulo aplicado no bordo radial da pata anterior esquerda. Fonte: Elaboração do autor, 2011

3.4 ESTUDOS ELETROFISIOLÓGICOS DA RECUPERAÇÃO MOTORA

Aos 90 e 180 dias, sob anestesia profunda (xylazina 10 mg/Kg, ketamina 100 mg/Kg), os animais foram reoperados. Os ratos foram fixados na mesa por meio de fitas adesivas nas 4 patas, e a cabeça imobilizada. Através de uma incisão desde o primeiro mamilo até o punho, com desinserção parcial do peitoral, o nervo mediano foi exposto na axila. O nervo foi dissecado, e a sutura com o enxerto foi identificada. O nervo mediano foi seccionado proximalmente, e o conjunto nervo mediano e enxerto foram isolados das estruturas adjacentes com um pedaço de látex (Figura 12).

(29)

Figura 12 – Conjunto nervo mediano e enxerto isolados com látex. Fonte: Elaboração do autor, 2011.

A seguir, o tendão do flexor radial do carpo foi isolado e conectado por meio de um fio de mononylon 4-0 ao transdutor de força de um aparelho (Power Lab®).

A tensão entre o transdutor e tendão do flexor radial do carpo foi ajustada para obter a máxima força de contração. Foi aplicado um estímulo supra-máximo de 2 V ao extremo proximal do nervo mediano, e a força de contração produzida foi registrada em um computador (Figura 13 e 14).

(30)

Figura 13 – Tendão flexor radial do carpo conectado ao transdutor. Fonte: Elaboração do autor, 2011.

Figura 14 - Tendão flexor radial do carpo isolado e fixo com fio ao transdutor de força. Fonte: Elaboração do autor, 2011.

(31)

Figura 15 - Sistema de registro da força contrátil muscular. Fonte: Elaboração do autor, 2011.

Para o registro da força contrátil dos músculos bíceps, flexor superficial e profundo dos dedos foi dissecado o tendão dos respectivos músculos e conectados ao transdutor da maneira descrita acima (Figura 15)

Os ratos foram sacrificados com medicação própria por via intraperitoneal.

3.4.1 Peso dos músculos

Aos 90 e 180 dias, ao término da avaliação eletrofisiológica, os músculos bíceps, flexor radial do carpo, flexor superficial e profundo dos dedos da pata esquerda dos grupos Deca, Sem Deca e Controle foram removidos com técnica microcirúrgica (Figura 16), passados rapidamente em papel filtro e pesados em balança de precisão. O flexor radial do carpo da pata desnervada foi removido e pesado da maneira descrita acima.

(32)

Figura 16 – Flexor superficial e profundo dos dedos removidos. Fonte: Elaboração do autor, 2011.

3.5 ANALISE ESTATÍSTICA

A análise estatística foi realizada com InStat 3.0® (GraphPadSoftwares., CA,USA).

Os valores encontrados na avaliação funcional, eletrofisiológica e morfométrica, foram registrados como médias ± desvio padrão (DP). As médias foram comparadas pelo método Anova I com post-hoc Tukey-Kramertestformul para múltiplas comparações. Uma diferença de 5% foi considerada significativa.

A análise do dia da recuperação funcional foi realizada através do teste t de student.

(33)

4 RESULTADOS

Um rato que teve enxerto do grupo Deca, dois do grupo Sem Deca, e um dos animais controle morreram no período pós-operatório.

4.1 AVALIAÇÃO FUNCIONAL

4.1.1 Recuperação motora

A recuperação da flexão dos dedos foi em média de 51,1 (DP±7,4) e 40,4 (DP±5,1) dias, para o grupo Deca e Sem Deca respectivamente. Os ratos do grupo Deca recuperaram a flexão dos dedos 20,1% mais rápido (p<0,0001).

Aos 90 e 180 dias após a cirurgia foi observada uma significante diferença na força do grasping entre os grupos Deca e Sem Deca (p<0,05).

Aos 90 dias após a cirurgia, os ratos do grupo Deca recuperaram 42% da força do grasping normal, enquanto que os ratos do grupo Sem Deca recuperaram somente 11%.

Aos 180 dias após a cirurgia, o valor da média da força de recuperação do grasping no grupo Deca foi de 40% do normal, e para o grupo Sem Deca o valor foi de 33% (Tabela 1).

Tabela 1 – Recuperação motora avaliada pela força de preensão (Grasping). Pós-operatório

(dias)

Força de preensão (Grasping)

Grupo Deca Grupo Sem Deca Controle

90 85,0±26,1 22,5±13,3 203,7±78,2

180 96,5±17,4 80,4±15,9 241,4±37,2

p <0,05

Fonte: Elaboração do autor, 2011.

(34)

4.1.2 Recuperação sensitiva

Após 90 dias do enxerto nervoso não foram detectados em ambos os grupos (Deca e Sem Deca) limiares para nocicepção.

Aos 180 dias após a cirurgia, os ratos retiravam a pata do estímulo elétrico em média com limiares de 13,5 V(DP±8,6) e 23,5 V (DP±11,2), para os grupos Deca e Sem Deca respectivamente. As diferenças na recuperação foram estatisticamente significativas (p=0,01). Os controles retiravam a pata com estímulos de menor voltagem, em média de 1,5 V (DP±0,7) (p=0,001).

4.1.3 Peso dos músculos

O peso dos músculos estudados nos diferentes períodos de avaliação é demonstrado na Tabela 2.

Não houve diferença na recuperação do peso dos músculos flexores dos dedos nos ratos enxertados. Noventa dias após a cirurgia o peso muscular nos ratos enxertados era significativamente menor do que nos ratos controles, contudo, essa diferença desapareceu no final da avaliação.

O bíceps nos ratos enxertados era maior do que nos controles aos 90 e 180 dias após a cirurgia. As diferenças no peso do bíceps nos grupos Deca e Sem Deca, foram significativas (p=0,05) somente aos 180 dias após a cirurgia.

Em relação ao flexor radial do carpo, não houve diferença na recuperação do peso entre todos os grupos aos 90 ou 180 dias após a cirurgia. Não foram registradas diferenças significativas entre o peso do flexor radial da pata direita entre todos os grupos, aos 90 e 180 dias respectivamente (Tabela 3).

(35)

Tabela 2 – Peso dos músculos flexores dos dedos e bíceps.

Pós-operatório (dias)

Flexor dos dedos (mg)

Bíceps (mg)

Deca Sem Deca Controle Deca Sem Deca Controle

90 20±2 18±3 26±2 20±3 18±2 16±2

180 26±2 24±3 25±3 21±1 18±2 16±2

Fonte: Elaboração do autor, 2011. 90 = n:30, 180= n:30

Em relação ao flexor radial do carpo, não houve diferença na recuperação do peso entre todos os grupos aos 90 ou 180 dias após a cirurgia.

A nandrolona não teve efeito sobre a atrofia por desnervação aos 90 e 180 dias após a cirurgia, como demonstrado na Tabela 3.

Tabela 3 – Peso dos músculos flexor radial do carpo.

Pós-operatório (dias)

Flexor radial do carpo (pata esquerda mg)

Flexor radial do carpo (pata direita mg)

Deca Sem Deca Controle Deca Sem Deca Controle

90 10±1 8±1 10±1 5±1 4±1 4±1

180 11±1 10±1 10±2 5±1 3±1 5±2

P=0,08

Fonte: Elaboração do autor, 2011. 90 = n:30, 180 =n:30

4.1.4 Força contrátil

Após estímulo elétrico e registro da força muscular não foram observadas diferenças na recuperação da força do flexor dos dedos nos ratos enxertados e controles nos diferentes períodos de avaliação.

(36)

Diferenças significativas entre o grupo Deca e Sem Deca, na força do flexor radial do carpo, foram observadas somente aos 180 dias após a cirurgia.

A força muscular do bíceps foi significativamente aumentada no grupo Deca, aos 90 e 180 dias após a cirurgia, quando comparada aos animais Sem Deca e controles.

Os resultados do registro da força muscular seguindo estimulação elétrica são demonstrados nas Tabelas 4 e 5.

Tabela 4 – Força contrátil do flexor dos dedos e flexor radial.

Pós-operatório (dias)

Flexor dos dedos Força Contrátil (g)

Flexor radial do carpo Força Contrátil (g)

Deca Sem Deca Controle Deca Sem Deca Controle

90 18,8±6,6 15,4±2,9 16,4±4,2 20,4±8,7 14,2±4,1 13,9±1,9 180 19.1±3.2 16.0±2.2 17.8±1.8 20.6±3.8 14.8±1.9 16.1±2.1

Fonte:Elaboração do autor, 2011. 90 = n:30, 180 =n:30

Tabela 5 – Força contrátil do bíceps. Pós-operatório

(dias)

Flexor dos dedos Força Contrátil (g)

Deca Sem Deca Controle

90 34,1±7,6 18,0±4,1 13,4±2,5

180 25,2±5,7 16,8±4,1 15,6±1,4

P=0,01

Fonte: Elaboração do autor, 2011. 90 =n:30, 180 =n:30

(37)

5 DISCUSSÃO

5.1 MODELO EXPERIMENTAL E AVALIAÇÃO DA RECUPERAÇÃO FUNCIONAL

O nervo ciático e análise da impressão da caminhada é o modelo experimental mais usado para avaliação da recuperação funcional (VAREJÃO et al., 2001). Contudo, esse modelo apresenta algumas inconveniências, tais como um alto grau de autotomia e contraturas (WEBER et al., 1996), além da dificuldade em identificar acuradamente diferenças na regeneração, as quais, na opinião de alguns autores, tornam a continuidade do uso do método duvidosa (BRUSHART , 1988).

O nervo facial do rato têm sido usado com sucesso para investigação da regeneração e ação de drogas que possam acelerar a sua recuperação (ANGELOV et al.,1999; HADLOCK; HEATON; CHENEY,2005). Tem a vantagem de avaliação funcional através de movimentos das vibrissas e do reflexo de piscar, com a desvantagem de não ser possível estudar a regeneração sensorial e a interação sensitivo-motora.

O uso dos membros anteriores para estudo da regeneração é novo (BERTELLI et al., 2005), e tem a vantagem da ausência de mutilações e contraturas articulares. Esse modelo não permite somente avaliação comportamental motora, mas também a realização de testes sensoriais.

No presente estudo, o início da recuperação funcional foi determinado pela flexão dos dedos, sendo observado que o uso da nandrolona acelerou a regeneração neural de maneira evidente. Estudos prévios realizados por Brown; Khan; Jones (1999), demonstraram em modelos de lesão do nervo ciático por meio de um crush, que o uso de testosterona pode aumentar a velocidade de recuperação funcional. A diferença entre os resultados obtidos, provavelmente se deve ao modelo de lesão, e ao método de avaliação funcional.

Houve aumento significativo da força de preensão (grasping) nos ratos expostos a nandrolona, que se manteve durante o estudo. Em revisão bibliográfica realizada, não foi encontrado um experimento prévio no qual o grau de recuperação da força tenha sido quantificada através de testes funcionais. Foi encontrada maior acurácia nos testes comportamentais do que nos estudos eletrofisiológicos e histomorfométricos quando o foco da pesquisa é a recuperação funcional, o que está em acordo com trabalhos prévios, como o de Sarikcioglu L.; Demirel; Utuk (2009); Urbanchek et al. (1999). Outros relatos como o de

(38)

Swallow et al.,(1999), demonstraram a falta de correlação entre a recuperação anatômica e funcional.

5.2 AVALIAÇÃO ELETROFISIOLÓGICA

Estudos reportados por Isaacs et al. (2011), em modelos de lesão nervosa, encontraram aumento da força contrátil do gastrocnemius medial no grupo de ratos tratados com nandrolona.

Joumaa et al., (2002) relataram aumento da força contrátil do EDL quando comparado ao músculo sóleo em ratos tratados com nandrolona, indicando a maior ação sobre as fibras musculares de contração rápida.

Os testes eletrofisiológicos demonstraram que a força contrátil do flexor radial do carpo foi maior no grupo de ratos tratados com nandrolona, enquanto que os flexores superficial e profundo dos dedos não tiveram diferenças significativas entre os animais estudados. De acordo com experimentos prévios citados por Kadi et al., (2000), Yesalis et al. (2000), a ação dos esteróides anabolizantes androgênicos diferem entre grupos musculares, sendo maior nos músculos da cabeça, pescoço, cintura escapular e braços. Os achados do presente estudo estão em concordância com essa afirmação, sendo a força contrátil e peso do bíceps, significativamente maiores nos ratos tratados com nandrolona quando comparados com os do grupo não tratado e controle.

5.3 AVALIAÇÃO SENSORIAL

A escolha do estímulo elétrico para testar a sensibilidade nociceptiva está de acordo com os achados de Koning; Brakkee; Gispen (1986). Os ratos tratados com nandrolona recuperaram significativamente melhor a sensibilidade nociceptiva retirando a pata aos estímulos elétricos de menor voltagem comparados aos não tratados. Os animais controle apresentaram reação aos menores estímulos comparados a todos os grupos. Swallow et al. (1999), encontraram melhor recuperação da sensibilidade térmica nos ratos com uso de nandrolona, possivelmente devido ao modelo de lesão nervosa e o teste escolhido para

(39)

avaliação sensorial. Após o crush do nervo ciático, a sensibilidade térmica foi testada, com estímulo não localizado, submergindo a pata do rato em água a 52ºC, o que pode ter levado a resultados não confiáveis, devido à inervação cutânea da pata do rato demonstrado em estudos feito por Campos et al., (2008) e Greene (1963).

Ao término do experimento os ratos tratados com nandrolona aumentaram de peso significativamente, mas não se pode assumir que foi pelo efeito anabolizante ou aumento da ingestão de ração. Decramer (1997) demonstrou em publicação prévia, controlando a ingestão de ração em grupo de animais, a provável ação anabolizante da nandrolona no aumento de peso.

Este experimento demonstrou que o uso da nandrolona em ratos fêmeas sedentários, acelerou a recuperação funcional, aumentou a força de preensão e recuperação da sensibilidade nociceptiva o que explica o melhor desempenho dos ratos com nandrolona no teste do grasping devido a necessidade de uma função coordenada envolvendo impulso sensorial, resposta motora e integração cortical.

Como citado acima, o uso da nandrolona aumentou a força contrátil e causou hipertrofia em grupos musculares diferentes.

Os autores acreditam que estudos incluindo a curva efeito-dose da nandrolona seriam desejáveis. Além disso, a definição da pergunta de pesquisas subsequentes, como por exemplo: Qual a resposta mais útil?, é imperativa para a definição da metodologia a ser utilizada com relação a avaliação do desfecho. Por exemplo, se a natureza for a recuperação de função, os testes escolhidos deverão ser de avaliação funcional, contudo, se for o aumento de fibras, então os testes deverão ser eletrofisiológicos ou histomorfométricos.

(40)

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(44)
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APÊNDICE A – Protocolo de trabalho para coleta de dados

GRASPING (medido em gramas)

Deca Sem Deca Controle

90 dias 84 48 300 129 20 301 56 13 213 64 11 224 91 33 127 106 18 111 65 15 149

GRASPING (medido em gramas)

Deca Sem Deca Controle

180 dias 96 98 207 83 77 214 113 54 247 90 80 238 81 81 301 76 59 290 102 60 295 138 87 96 80 87 90 100 90

(46)

SENSIBILIDADE (medida em V)

Deca Sem Deca Controle

180 dias 10 10 1 10 39 1 10 30 2 10 30 2 10 25 1 10 15 2 10 30 1 15 20 2 10 30 1 15 30 39 0

FORÇA CONTRÁTIL FLEXOR RADIAL DO CARPO (medida em gramas) Deca Sem Deca Controle

90 dias 10,46 19,08 16,46 25,87 20,28 17,57 10,60 10,70 13,79 28,15 14,07 13,00 16,11 13,00 12,35 19,89 9,09 13,79 35,17 10,69 12,79 17,32 11,89

(47)

FORÇA CONTRÁTIL FLEXOR RADIAL DO CARPO (medida em gramas) Deca Sem Deca Controle

180 dias 15,43 11,98 14,49 15,17 16,15 14,56 18,70 13,29 19,49 26,01 13,28 15,05 21,25 14,29 16,94 25,85 15,55 22,09 15,68 23,86 13,06 16,47 18,35 20,16 14,61 21,28 17,18

FORÇA CONTRÁTIL FLEXOR DOS DEDOS (medido em gramas) Deca Sem Deca Controle

90 dias 16,24 15,43 14,90 20,54 18,73 18,10 15,37 17,29 11,54 19,22 18,30 10,66 24,06 12,46 13,95 11,05 14,45 15,21 31,30 11,33 22,80 12,68 18,10

(48)

FORÇA CONTRÁTIL FLEXOR DOS DEDOS (medido em gramas) Deca Sem Deca Controle

180 dias 17,36 16,58 17,38 20,74 13,95 20,30 16,06 12,93 15,41 13,53 17,88 18,79 18,59 14,18 17,14 18,10 16,56 22,80 23,55 15,52 22,89 15,37 16,29 19,20 21,46 14,52 21,57 19,82

PESO BÍCEPS (medidos em mg)

Deca Sem Deca Controle

90 dias 20 20 20 23 22 16 14 17 14 20 16 17 22 18 18 23 14 14 21 19 15 23

(49)

PESO BÍCEPS (medidos em mg)

Deca Sem Deca Controle

180 dias 23 17 16 20 22 19 21 19 18 21 21 16 20 16 21 24 21 22 17 22 21 21 15 22 16 20 19

PESO FLEXOR RADIAL DO CARPO (medidos em mg) Deca Sem Deca Controle

90 dias 10 8 12 11 8 10 9 8 8 11 8 11 11 8 10 10 7 11 11 9 12 12

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PESO FLEXOR RADIAL DO CARPO (medidos em mg)

Deca Sem Deca Controle

180 dias 13 10 14 13 12 9 13 10 8 11 11 10 9 10 9 10 10 10 10 10 8 10 12 12 11 12 9

PESO FLEXOR DOS DEDOS (medidos em mg)

Deca Sem Deca Controle

90 dias 19 20 26 20 20 23 16 18 24 20 22 27 23 17 26 22 13 30 22 21 28 23

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PESO FLEXOR DOS DEDOS (medidos em mg)

Deca Sem Deca Controle

180 dias 24 23 22 26 26 30 28 24 27 26 28 22 25 23 26 27 22 28 21 28 27 23 21 28 31 23 19

PESO CORPORAL DOS RATOS (medidos em gramas)

Deca Sem Deca Controle

180 dias 361 271 249 346 315 278 319 291 403 320 331 247 322 297 321 344 257 269 356 277 281 349 276 268 300 322 376 310 341 268

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Referências

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