RELATÓRIO FINAL REVISÃO 1

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Ensaio de Proficiência em Microbiologia de Alimentos 10ª Rodada –

Enumeração de Coliformes Termotolerantes em Matriz Ovo

RELATÓRIO FINAL – REVISÃO 1

ORGANIZAÇÃO E COORDENAÇÃO

Fundação Oswaldo Cruz - Fiocruz

Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde - INCQS Avenida Brasil, 4365 - Manguinhos

Rio de Janeiro - RJ – Brasil - Cx. Postal 926 - CEP: 21040-900

COMISSÃO ORGANIZADORA DA RODADA

- COMISSÃO DO PROGRAMA DE ENSAIO DE PROFICIÊNCIA

Armi Wanderley da Nóbrega – Coordenador Geral

Marcus Henrique Campino de la Cruz – Coordenador Técnico

Maria Helena Wohlers Morelli Cardoso – Coordenadora da Qualidade

- COMITÊ TÉCNICO

Carla de Oliveira Rosas Marcelo Luiz Lima Brandão Silvia Maria Lopes Bricio Valéria de Mello Medeiros

Autorizada a emissão – Marcus Henrique C. de la Cruz (Coordenador Técnico)

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SUMÁRIO

1. Introdução ... 3

2. Objetivos ... 4

3. Produção dos Itens de Ensaio ... 4

3.1. Escolha da Matriz ... 4

3.2. Preparo do Item de Ensaio ... 4

3.3. Faixa de Concentração Esperada ... 4

3.4. Homogeneidade e Estabilidade dos Itens de Ensaio ... 5

3.6. Envio dos Itens de Ensaio ... 5

4. Análise dos Resultados ... 5

4.1. Resultados das Medições dos Laboratórios ... 5

4.2. Estabelecimento dos Valores Designados (x*_{) e suas incertezas (u} x*) ... 6

4.3. Análise Estatística ... 6

4.3.1. Avaliação da Estabilidade dos Itens de Ensaio ... 6

4.3.2. Avaliação da Homogeneidade dos Itens de Ensaio ... 6

4.3.3. Desvio Padrão para Avaliação de Proficiência ... 6

4.3.4. Índice z ... 7

5. Resultados da Avaliação da Homogeneidade e Estabilidade dos Itens de Ensaio ... 7

5.1. Avaliação da Homogeneidade ... 7

5.2. Avaliação da Estabilidade ... 8

6. Atribuição dos Valores Designados ... 10

7. Avaliação do Desempenho dos Laboratórios Participantes ... 11

7.1. Laboratórios Participantes ... 11

7.2. Resultados dos Laboratórios Participantes ... 11

7.3. Cálculo do Índice z ... 15

7. Conclusões e Comentários... 19

8. Confidencialidade ... 19

9. Modificações em Relação a Versão Anterior...19

10. Referências Bibliográficas ... 20

11. Laboratórios Participantes ... 21

Anexo A – Homogeneidade Segundo o Protocolo Harmonizado ... 22

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1. Introdução

Ensaio de proficiência (EP) é o uso de comparações interlaboratoriais com o objetivo de avaliar a habilidade de um laboratório em realizar um determinado ensaio ou medição de modo competente e demonstrar a confiabilidade dos resultados gerados. Em um contexto geral, o ensaio de proficiência propicia aos laboratórios participantes: avaliação do desempenho e monitoração contínua; evidência de obtenção de resultados confiáveis; identificação de problemas relacionados com a sistemática de ensaios; possibilidade de tomada de ações corretivas e/ou preventivas; avaliação da eficiência de controles internos; determinação das características de desempenho e validação de métodos e tecnologias; padronização das atividades frente ao mercado e reconhecimento de resultados de ensaios, em nível nacional e internacional.

Com a crescente demanda por provas regulares e independentes de competência pelos organismos reguladores e clientes, o ensaio de proficiência é relevante para todos os laboratórios que testam a qualidade de produtos. Além do baixo número de provedores de ensaios de proficiência na área de alimentos, os custos cobrados para a participação nestes ensaios principalmente de provedores internacionais, são normalmente muito elevados, o que inviabiliza, em muitos casos, a participação de um laboratório em um número maior de ensaios.

A qualidade microbiológica dos alimentos é uma das grandes preocupações da saúde pública em todo o mundo. O controle da qualidade dos alimentos e as análises laboratoriais em casos de surtos de toxinfecções alimentares ocorridos no território brasileiro são de responsabilidade da rede de Laboratórios Centrais de Saúde Pública (LACEN). Logo, a qualidade e confiabilidade dos ensaios realizados para o controle microbiológico dos alimentos, nestes laboratórios são de suma importância para garantir que os produtos analisados sejam avaliados corretamente e não venham a causar danos à saúde do consumidor. Assim, a realização de programas de ensaio de proficiência no Brasil, na área de microbiologia de alimentos é fundamental para o aumento da confiabilidade dos resultados das medições aqui realizadas, trazendo maior confiabilidade aos resultados emitidos, facilitando o comércio internacional e prevenindo barreiras técnicas.

Visando a promoção da saúde e em apoio a maior competitividade da indústria nacional, o INCQS promoveu o Ensaio de Proficiência em Microbiologia de Alimentos 10ª Rodada – Enumeração de Coliformes Termotolerantes em Matriz Ovo, seguindo as diretrizes da ABNT ISO/IEC 17043

,

apresentando neste relatório os resultados da avaliação de desempenho dos laboratórios participantes.

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2. Objetivos

O objetivo deste Ensaio de Proficiência é fornecer aos laboratórios participantes uma ferramenta efetiva para verificar sua competência nos ensaios de enumeração de coliformes termotolerantes em matriz ovo, utilizando metodologia analítica utilizada na rotina. Este EP também poderá contribuir para:

 Promover o aumento da confiança nos resultados das medições dos laboratórios participantes;  Avaliar o desempenho de laboratórios para o ensaio proposto; e

 Propiciar subsídios aos laboratórios para a identificação e solução de problemas.

3. Produção dos Itens de Ensaio

Os procedimentos de preparo dos itens de ensaio e as análises foram realizados no Setor de Alimentos do Departamento de Microbiologia (DM) do INCQS/Fiocruz, seguindo os requisitos da norma ABNT ISO/IEC 17025 na quantificação deste micro-organismo.

3.1. Escolha da Matriz

Dentre os surtos de doenças transmitidas por alimentos (DTA) registrados pelo Ministério da Saúde no período de 2000 a 2011, os ovos e produtos a base de ovos são os alimentos mais envolvidos, sendo responsáveis por uma média de 76 surtos por ano. No Brasil a RDC nº12/2001, que estabelece os padrões microbiológicos para alimentos, prevê para a avaliação da qualidade de gema desidratada a quantificação de Coliformes Termotolerantes.

3.2. Preparo do Item de Ensaio

Foi utilizado como matriz uma solução de emulsão de gema de ovo 50% (Difco) livre de contaminação. A cultura bacteriana foi preparada com uma cepa de Escherichia coli da “Coleção de Micro-organismos de pesquisa do INCQS/FIOCRUZ”, identificada como EC 03.

Duas suspensões bacterianas com concentrações de células distintas foram utilizadas para o preparo de dois diferentes lotes de itens de ensaio, que foram disponibilizados juntos,

na mesma rodada do EP. Cada um dos dois lotes foi preparado a partir da homogeneização da solução de gema de ovo, com uma das suspensão de células em uma concentração adequada ao preparo do lote. Após a homogeneização, volumes de 1mL foram distribuídos em frascos de vidro estéreis. Posteriormente, os frascos foram congelados em ultrafreezer a aproximadamente -70 ºC e submetidos a um ciclo de liofilização de 24 horas.

3.3. Faixa de Concentração Esperada

Os itens de ensaio apresentaram concentrações aproximadas de 3,5 x 103_UFC.mL-1_{(3,5 log} 10

UFC.mL-1_{) no primeiro lote produzido e 2,5 x 10}2_UFC.mL-1_{(2,4 log}

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3.4. Homogeneidade e Estabilidade dos Itens de Ensaio

Foram separados aleatoriamente vinte itens de ensaio de cada lote representativos do conjunto preparado para o teste de homogeneidade. Após a reconstituição e homogeneização do liófilo, foram preparadas diluições decimais analisadas sob condições de repetitividade.

Foram realizados estudos de estabilidade de curta duração (transporte) e de longa duração (armazenamento e referência). Para os estudos de longa duração foi feito o controle de estoque a -70 ºC (temperatura de referência) e a -20 ºC (temperatura de armazenamento durante o EP). Os testes da estabilidade a -70 ºC e -20 ºC foram iniciados após o preparo do lote e abrangeram o tempo disponibilizado aos laboratórios participantes do EP para a análise do item de ensaio. A estabilidade de curta duração, que verificou a influência da temperatura nas condições de transporte, foi estudada por 4 dias, em diferentes temperaturas: 4 ºC, 30 ºC e 35 ºC, utilizando-se o modelo Isócrono (Lamberty, Schimmel e Pauwels, 1997).

Os testes estatísticos foram feitos segundo o Protocolo Harmonizado (Homogeneidade) e a ISO GUIDE 35 (Estabilidade); os resultados obtidos nos testes estão apresentados nos itens 5.1 e

5.2 deste relatório.

3.6. Envio dos Itens de Ensaio

Para cada laboratório inscrito no Ensaio de Proficiência em Microbiologia de Alimentos 10ª Rodada – Enumeração de Coliformes Termotolerantes em Matriz Ovo foram enviados dois itens de ensaio contendo, cada um, 1 mL de solução de ovo liofilizado, sendo um frasco de cada concentração.

Os frascos foram armazenados em ultrafreezer a aproximadamente -70 ºC até o momento em que foram enviados aos laboratórios participantes. O envio aos laboratórios foi por via aérea, em uma caixa de isopor contendo gelo seco e devidamente lacrada.

Os itens de ensaio foram distribuídos aos participantes em frascos rotulados com as seguintes informações: nome do programa, item a ser ensaiado, código da amostra e rodada.

4. Análise dos Resultados

4.1. Resultados das Medições dos Laboratórios

Os laboratórios receberam dois itens de ensaio contendo amostra de ovo liofilizado e foram orientados a proceder como nas análises rotineiras realizadas no laboratório, a expressar os resultados analíticos em NMP.mL-1_{ou UFC.mL}-1_{e informar a metodologia e os meios de cultura}

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4.2. Estabelecimento dos Valores Designados (x*_{) e suas incertezas (u} x*)

As técnicas de estatística robusta são utilizadas para minimizar a influência de resultados extremos sobre estimativas de média e desvio-padrão. Assim, a Coordenação deste Ensaio de Proficiência adotou como valores designados para a concentração de cada lote, aqueles oriundos do cálculo da estatística robusta apresentado no item 5.6 da norma lSO 13528, norma específica de métodos estatísticos para uso em EP por comparações interlaboratoriais. O procedimento adotado no cálculo do valor designado e de sua incerteza é descrito no Anexo B. Seguindo os critérios desta norma, os valores designados foram obtidos pela média robusta dos resultados emitidos por todos os laboratórios participantes.

4.3. Análise Estatística

Neste tópico estão descritas as análises estatísticas utilizadas para a avaliação da homogeneidade e da estabilidade das amostras, para a obtenção dos valores designados e suas incertezas, do desvio padrão utilizado na avaliação dos laboratórios (desvio padrão robusto), bem como para a avaliação do desempenho dos laboratórios participantes.

4.3.1. Avaliação da Estabilidade dos Itens de Ensaio

Esses testes foram empregados para se avaliar a estabilidade da concentração de

Escherichia coli

na matriz em função do tempo (longa duração) e do tempo-temperatura (curta duração). Assim, foram estimadas as variâncias dos valores utilizados na regressão linear, observando-se se os valores de contagem apresentavam alguma tendência, através da ferramenta estatística de análise de variância (ANOVA). A concentração de

Escherichia coli

foi considerada estável quando a inclinação da reta (ou a não linearidade) não foi significativa e o gráfico da concentração em função do tempo não apresentou tendências.

4.3.2. Avaliação da Homogeneidade dos Itens de Ensaio

O Protocolo Harmonizado foi seguido na avaliação da homogeneidade dos itens de ensaio. Um resumo do procedimento estabelecido neste documento para avaliação da homogeneidade dos itens de ensaio é apresentado no Anexo A.

4.3.3. Desvio Padrão para Avaliação de Proficiência

Nesta rodada de EP o desvio padrão para avaliação de proficiência dos laboratórios participantes foi calculado como recomendado no item 6.6 da norma ISO 13528, isto é, a partir do desvio padrão robusto calculado a partir dos resultados dos participantes (e do INCQS), usando o algoritmo A do anexo C desta norma. O procedimento adotado no cálculo do Desvio Padrão Robusto é descrito no Anexo B.

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4.3.4. Índice z

Para a qualificação dos resultados dos laboratórios, o índice z (z-score, medida da distância relativa do resultado da medição do laboratório em relação ao valor designado do ensaio de proficiência) foi calculado de acordo com a Equação 1.

* *

s

x

z



i



(1)

Onde xi representa o valor do laboratório participante, x* representa o valor designado

(média robusta) e s*_{o desvio padrão de robusto.}

A interpretação do valor do índice z está descrita abaixo: z  2 - Resultado satisfatório

2 < z < 3 - Resultado questionável z ≥ 3 - Resultado insatisfatório

5. Resultados da Avaliação da Homogeneidade e Estabilidade dos Itens de Ensaio 5.1. Avaliação da Homogeneidade

Para o teste de homogeneidade foram separados, aleatoriamente, 20 itens de ensaio de cada lote. Para cada item de ensaio foram realizadas duas análises completas produzindo dois resultados (A e B), como mostrado na Tabela 1.

Tabela 1: Dados gerados no teste de homogeneidade, em UFC.mL-1_.

Item de Ensaio

Lote de Maior Concentração Lote de Menor Concentração Contagem (UFC.mL-1_{) Log10 UFC.mL}-1_{Contagem (UFC.mL}-1_{) Log}_{10 UFC.mL}-1

A B A B A B A B 1 3300 3400 3,52 3,53 120 145 2,08 2,16 2 2050 1700 3,31 3,23 80 85 1,90 1,93 3 2850 2850 3,45 3,45 135 145 2,13 2,16 4 2100 2900 3,32 3,46 60 20 1,78 1,30 5 3000 2800 3,48 3,45 70 80 1,85 1,90 6 1850 2450 3,27 3,39 120 110 2,08 2,04 7 3350 3400 3,53 3,53 75 80 1,88 1,90 8 2200 2200 3,34 3,34 165 150 2,22 2,18 9 3550 2950 3,55 3,47 135 150 2,13 2,18 10 1800 2350 3,26 3,37 20 25 1,30 1,40 11 2850 1750 3,45 3,24 190 190 2,28 2,28 12 2400 2300 3,38 3,36 210 190 2,32 2,28 13 1500 1700 3,18 3,23 105 80 2,02 1,90 14 1650 2300 3,22 3,36 175 180 2,24 2,26 15 2200 1800 3,34 3,26 60 95 1,78 1,98 16 1350 1450 3,13 3,16 125 115 2,10 2,06 17 1500 1800 3,18 3,26 105 150 2,02 2,18 18 2050 2350 3,31 3,37 95 80 1,98 1,90 19 2250 1300 3,35 3,11 205 165 2,31 2,22 20 1700 1500 3,23 3,18 105 105 2,02 2,02

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A Tabela 2 apresenta os resultados da análise estatística do estudo de homogeneidade dos diferentes lotes.

Tabela 2: Sumário das análises estatísticas, em log10 UFC.mL-1.

Lotes Média



_p 2

all



2

an

s

_sam2 c Resultado

Maior Concentração 3,34 0,25 0,00563 0,00523 0,01014 0,01190 Homogêneo

Menor Concentração 2,02 0,25 0,00563 0,00876 0,05368 0,01390 Não Homogêneo

Desta forma, o lote de maior concentração foi considerado homogêneo. Em relação a não homogeneidade do lote de menor concentração, procedemos da mesma forma preconizada pela norma ISO 13528, onde está previsto que, caso o critério estabelecido na avaliação de homogeneidade não seja atendido, no desvio padrão para a avaliação de proficiência seja incluído a variação existente entre as amostras como descrito na Equação 2:

𝜎 = √(𝑠∗₎2_{+ (𝑠}

𝑠𝑎𝑚)2 (2)

Onde s* é o desvio padrão para avaliação de proficiência e  é o desvio padrão efetivamente utilizado para avaliação de proficiência.

Esta inclusão permite que possíveis variações na homogeneidade entre os itens de ensaio com relação aos valores, não influenciem diretamente na avaliação de desempenho do laboratório participante do EP.

5.2. Avaliação da Estabilidade

No decorrer do EP, foram avaliadas as flutuações temporais na concentração de Escherichia coli nas temperaturas de referência (-70 o_{C) e de armazenamento (-20}_{C) durante o EP (}_{Tabelas 3,}

4, 5 e 6). A influência da temperatura nas condições de transporte também foi estudada por 4 dias (Tabelas 7 e 8). Estas avaliações foram realizadas utilizando-se a análise de resíduos da regressão linear.

Tabela 3: Estudo de estabilidade: Temperatura de referência (-70 o_{C) – Maior Concentração.}

Dias Item 1 (UFC.mL

-1₎ _{Item 2 (UFC.mL}-1₎

Log das Médias (Log10 UFC.mL-1₎ Replicata A Replicata B Replicata A Replicata B

0 2450 1850 4150 3950 3,47 21 2400 2600 4100 2500 3,45 24 2600 4100 4200 4600 3,58 34 3800 2900 3200 2900 3,50 49 6100 6700 4400 3500 3,70 62 3000 3700 2900 2900 3,49 76 3900 3700 3500 3500 3,56 105 1800 400 1600 2000 3,09 132 4350 4200 3850 3500 3,60 211 1750 1800 3000 3600 3,38

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Tabela 4: Estudo de estabilidade: Temperatura de referência (-70 o_{C) – Menor Concentração.}

-1₎ _{Item 2 (UFC.mL}-1₎

Log das Médias (Log10 UFC.mL-1₎ Replicata A Replicata B Replicata A Replicata B

0 210 190 180 170 2,27 11 155 190 170 230 2,27 25 125 160 135 115 2,12 42 120 145 60 90 1,99 53 110 140 85 160 2,08 67 140 175 175 255 2,26 81 205 240 190 95 2,24 109 225 235 95 100 2,18 139 305 265 160 210 2,36 221 125 110 90 115 2,04

Tabela 5: Estudo de estabilidade: Temperatura de armazenamento (-20 o_C) _{– Maior}

Concentração.

-1₎ _{Item 2 (UFC.mL}-1₎

Log das Médias (Log10 UFC.mL-1₎ Replicata A Replicata A Replicata A Replicata B

0 3350 3400 3750 3800 3,55 21 4450 4050 3050 2900 3,55 28 4400 3750 2700 2550 3,51 43 2200 3500 3500 2800 3,47 55 3750 4250 3250 3050 3,55 71 2750 3200 2100 2600 3,42 93 3800 3950 2700 2950 3,52 157 3100 2750 3650 4350 3,53

Tabela 6: Estudo de estabilidade: Temperatura de armazenamento (-20 o_C) _{– Menor}

Concentração.

-1₎ _{Item 2 (UFC.mL}-1₎

Log das Médias (Log10 UFC.mL-1₎ Replicata A Replicata A Replicata A Replicata B

0 230 205 155 95 2,21 14 190 170 205 205 2,28 31 210 150 140 190 2,23 42 115 180 205 370 2,30 56 350 245 190 200 2,38 70 270 310 175 200 2,37 98 195 190 150 200 2,26 128 200 170 225 205 2,30 210 140 155 85 90 2,06

Tabela 7: Análise de Regressão - Diferentes estudos de estabilidade para o lote de maior concentração, em Log10 UFC.mL-1.dias-1.

Escherichia coli

Coeficiente Angular Erro padrão Intervalo de confiança Resultado Inferior Superior Referência -0,00076 0,00087 -0,00277 0,00126 Estável Armazenamento -0,00013 0,00038 -0,00106 0,00081 Estável Transporte 4o_C _-0,08992 _0,02669 _-0,14484 _0,02501 _Estável Transporte 30o_C _-0,02235 _0,04286 _-0,15876 _0,11407 _Estável

Transporte 35o_C _-0,08208 _0,03741 _-0,20113 _0,03698 _{Não Estável}*

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Tabela 8: Análise de Regressão - Diferentes estudos de estabilidade para o lote de menor concentração, em Log10 UFC.mL-1.dias-1.

Escherichia coli

Coeficiente _Angular _padrãoErro Intervalo de confiança_Inferior _Superior Resultado

Referência -0,00027 0,00061 -0,00169 0,00115 Estável

Armazenamento -0,00076 0,00048 -0,00188 0,00037 Estável

* apesar de terem “passado” na avaliação estatística, apresentaram tendência.

Os resultados obtidos no tratamento estatístico dos dados gerados nos estudos de estabilidade de transporte, armazenamento e de transporte à 4 0_{C, este para a maior concentração,}

evidenciaram que o valor do intervalo de confiança para o coeficiente angular abrange o valor zero (0). Conclui-se, portanto, que os itens de ensaio mostraram-se suficientemente estáveis nestas condições. As outras temperaturas do estudo de estabilidade de transporte apresentaram tendências e, por conta disto, os itens de ensaio foram considerados “não estáveis” a estas temperaturas.

6. Atribuição dos Valores Designados

Apesar de existirem duas técnicas para a enumeração de coliformes termotolerantes, contagem por plaqueamento direto e Número Mais Provável (NMP), a grande maioria dos laboratórios participantes optou por esta última. Assim somente serão apresentados os valores designados

calculados a partir da técnica do NMP.

Os valores designados relativos à concentração de Escherichia coli empregados neste EP foram calculados segundo procedimento estatístico descrito no item 4.3.5; o respectivo desvio padrão para avaliação de proficiência foi obtido pelo algoritmo A do anexo C da norma ISO 13528, conforme o item 4.3.3.

O valor designado, o seu respectivo desvio padrão e a incertezas do valor designado dos 2 lotes, bem como os laboratórios que contribuíram para este cálculo, estão apresentados na Tabela 9.

Tabela 9: Valor designado (x*_{), desvio padrão (s}*_{), incertezas do valor designado (Log}

10 UFC.mL-1). Lote x* s* s*(%) uc k U Laboratórios Maior Concentração 3,59 0,53 14,74 0,14 2,13 0,31 10/027, 10/029, 10/042, 10/062, 10/074, 10/080, 10/085, 10/091, 10/105, 10/145, 10/155, 10/157, 10/166, 10/183, 10/199, 10/214, 10/227, 10/249, 10/250, 10/256 e 10/278 Menor Concentração 2,182 0,336 15,40 0,088 2,12 0,186 10/027, 10/042, 10/062, 10/074, 10/075, 10/080, 10/085, 10/091, 10/105, 10/145, 10/155, 10/157, 10/166, 10/183, 10/199, 10/214, 10/217, 10/227, 10/249, 10/250, 10/256, 10/278 e 10/280

As incertezas combinadas do valor designado dos dois lotes foram menores que 0,3s*

. Assim, estas PODEM ser negligenciadas nas avaliações.

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Somando ao valor do desvio padrão robusto para o lote de menor concentração (s*) ao desvio padrão da variação amostral (ssam) como indicado na equação (2), teremos como desvio padrão

para avalição do EP, o valor de 0,408, que será o valor utilizado na avaliação dos resultados dos laboratórios.

7. Avaliação do Desempenho dos Laboratórios Participantes 7.1. Laboratórios Participantes

Vinte e quatro laboratórios se inscreveram no Ensaio de Proficiência em Microbiologia de Alimentos 10ª Rodada – Enumeração de Coliformes Termotolerantes em Matriz Ovo, e todos enviaram os resultados.

Dos laboratórios participantes, dois (8,3 %) são acreditados na norma ISO/IEC 17025 e outros dois (8,3 %) estão em processo de acreditação neste ensaio.

Os Laboratórios Centrais de Saúde Pública (LACENs) responderam por 75,0% da participação (18 laboratórios). Somados as Vigilâncias Sanitárias Municipais este percentual atinge a marca de 87,5% (21 laboratórios). Três laboratórios privados completam a lista de participantes.

7.2. Resultados dos Laboratórios Participantes

Os dados reportados pelos laboratórios participantes do EP foram tratados de acordo com os procedimentos descritos na ISO/IEC 17043. A Tabela 10 apresenta os resultados dos laboratórios para as análises dos dois itens de ensaio enviados, a técnica e a metodologia empregada.

O gráfico da dispersão dos resultados dos laboratórios participantes para cada concentração encontram-se nas Figuras 1 e 2. Neste gráfico a linha central representa o valor designado e as linhas pontilhadas o intervalo da incerteza expandida (U) do valor designado.

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Tabela 10: Resultados por análise (UFC.g-1_{) e Metodologia Empregada}

Código dos Laboratórios Maior Concentração Menor Concentração Técnica Metodologias(1)

Item Resultado Item Resultado

MIB 10/027 48 750 18 15 NMP APHA 4th _Edition

MIB 10/029 19 39000 30 < 3 NMP Outros(2)

MIB 10/029 19 1600 30 70 Contagem Não identificado

MIB 10/042 11 11000 10 460 NMP Outros(2)

MIB 10/062 31 4600 34 43 NMP Não identificado

MIB 10/074 28 210 13 23 NMP MMAMAA

MIB 10/075 20 > 11000 23 150 NMP APHA 4th _Edition

MIB 10/155 35 4600 25 150 NMP MMAMAA

MIB 10/155 35 2800 25 140 Contagem APHA 4th _Edition

MIB 10/199 39 1100 46 150 NMP Outros(2)

MIB 10/217 40 > 1100 09 240 NMP Outros(2)

MIB 10/227 43 1100 05 140 NMP MMAMAA

MIB 10/278 07 2200 14 120 NMP MMAMAA

MIB 10/280 24 < 3,6 15 23 NMP APHA 4th _Edition

INCQS HA 2269 HB 117 Contagem BAM/FDA 2002

HA = Média da homogeneidade (maior concentração) e HB = Média da homogeneidade (menor concentração)

(1) APHA 4th_{Edition→ AMERICAM PUBLIC HEALTH ASSOCIATION - Compendium of Methods for the Microbiological}

Examination of Foods, 4th_{, 2001}

MMAMAA→ da silva, N.; Junqueira, V. C. A.; Silveira, N. F.A.; Manual de Métodos de Análise Microbiológica de

Alimentos e Água – 4ed_{, 2010.}

BAM/FDA → Enumeração de Coliformes Totais e Escherichia Coli - Bacteriological Analytical Manual (BAM/FDA), 2002.

(2) Instrução Normativa 62 do MAPA (2003); da silva, N.; Junqueira, V. C. A.; Silveira, N. F.A.; Manual de Métodos de

(14)

(15)

(16)

7.3. Cálculo do Índice z

A avaliação de desempenho dos laboratórios participantes, expressa através do índice z (Equação 1), está apresentada na Tabela 11.

Tabela 11: Valores do índice z obtidos pelos laboratórios participantes e pelo INCQS.

Laboratórios Item de Maior Concentração z-score Item de Menor Concentração z-score

MIB 10/027 48 -1,3 18 -2,5 MIB 10/029 19 1,9 30 RNN MIB 10/042 11 0,9 10 1,2 MIB 10/062 31 0,1 34 -1,3 MIB 10/074 28 -2,4 13 -2,0 MIB 10/075 20 RNN 23 0,0 MIB 10/080 41 0,1 06 0,5 MIB 10/085 36 0,1 12 0,0 MIB 10/091 44 0,7 27 3,6 MIB 10/105 08 0,1 33 -0,5 MIB 10/145 32 0,9 38 -0,6 MIB 10/155 35 0,1 25 0,0 MIB 10/157 04 -2,7 21 3,6 MIB 10/166 02 0,9 17 0,4 MIB 10/183 49 -0,8 42 0,3 MIB 10/199 39 -1,0 46 0,0 MIB 10/214 01 0,9 26 1,0 MIB 10/217 40 RNN 09 0,5 MIB 10/227 43 -1,0 05 -0,1 MIB 10/249 50 0,9 29 0,0 MIB 10/250 37 0,1 22 -0,5 MIB 10/256 16 0,1 45 0,5 MIB 10/278 07 -0,5 14 -0,3 MIB 10/280 24 RNN 15 -2,0

Azul = resultado questionável, Vermelho = resultado insatisfatório. RNN → Resultado Não Numérico;

As Figuras 3 e 4 apresentam os resultados de índice z obtidos pelos laboratórios participantes para os dois lotes de itens de ensaio.

(17)

(18)

(19)

Alguns laboratórios informaram Resultados Não Numéricos (RNN), tais como “menor que” ou “maior que”, para os itens de ensaio. A Figura 5 apresenta a abordagem que foi utilizada para a avaliação dos resultados não numéricos:

Figura 5: Abordagem para a avaliação dos laboratórios que informaram RNN

Se considerarmos o valor designado (VD) e sua incerteza expandida (U) (Tabela 9) teremos: como limites inferior e superior 99 e 234 UFC/mL (2,00-2,37; na base logarítmica) para o lote de menor concentração e 1898 e 7828 UFC/mL (3,28-3,89; na base logarítmica) para o lote de maior concentração. Assim, o laboratório MIB 10/029 que informou (técnica de Número Mais Provável) resultado para o item de menor concentração (#30) como <3, o laboratório MIB 10/075 que

informou para o item de maior concentração (#20) >11000 e o laboratório MIB 10/280 que informou como <3,6 também para o de maior concentração (#24), foram considerados

INSATISFATÓRIOS.

O laboratório MIB 10/217, que reportou resultado para item de maior concentração (#40) como >1100, não pode ser matematicamente considerado insatisfatório, contudo o laboratório NÃO seguiu as instruções da coordenação que previa a diluição até 10-4_{(item 2.2 subitens j e l das}

“Instruções para Armazenamento e Preparo dos Itens de Ensaio”), sendo considerado

INSATISFATÓRIO.

Lembramos que o índice z é apenas um indicativo do desempenho do laboratório, cabendo a cada participante fazer a sua interpretação e implementar, caso necessário, as ações corretivas.

(20)

7. Conclusões e Comentários

A análise dos dados obtidos neste EP sugere:

 A maioria dos resultados reportados pelos laboratórios participantes (81,3%) atingiu o valor de índice z ≤ I2I, sendo que oito laboratórios (33,3 %) reportaram resultados insatisfatórios ou questionáveis para pelo menos um dos itens de ensaio;

 O percentual de resultados insatisfatórios, 12,5 %, foi relativamente alto;

 Nenhum laboratório apresentou resultado insatisfatório para os dois itens de ensaio e somente um laboratório (4,2 %) teve resultados adversos para ambos os itens;

 A maioria dos laboratórios preencheu o formulário conforme estabelecido nas instruções. Contudo, alguns campos importantes ainda foram deixados em branco;

 Para os laboratórios que obtiveram resultados insatisfatórios ou questionáveis, ações corretivas poderão ser adotadas para o aprimoramento das suas medições. Uma avaliação detalhada, desde o recebimento do material e seu armazenamento, até o preenchimento do Formulário para Registro dos Resultados, e a avaliação de todos os passos da metodologia de análise, será importante para a identificação dos pontos críticos.

O estabelecimento de ações corretivas e a contínua participação em ensaios de proficiência são ferramentas de grande contribuição para o aprimoramento das medições realizadas pelos laboratórios.

8. Confidencialidade

Os resultados deste Ensaio de Proficiência são confidenciais, isto é, cada laboratório é identificado por código individual conhecido apenas pelos participantes da rodada e pela Coordenação deste Ensaio de Proficiência. Os resultados obtidos neste EP poderão ser utilizados em trabalhos e publicações do provedor mantendo evidentemente a confidencialidade dos laboratórios participante.

9. Modificações em Relação a Versão Anterior

Foram corrigidos os valores dos resultados do laboratório MIB 10/155, NMP e Contagem, que estavam descritos de forma incorreta na Tabela 10(página 12).

(21)

10. Referências Bibliográficas

ABNT ISO/IEC 17025. Requisitos Gerais para a Competência de Laboratórios de Ensaio e Calibração, Associação Brasileira de Normas Técnicas, 2005.

ABNT ISO/IEC 17043. Avaliação de Conformidade — Requisitos Gerais Para Ensaios de Proficiência, Associação Brasileira de Normas Técnicas, 2011.

ABNT ISO GUIA 35. Materiais de Referência — Princípios Gerais e Estatísticos para Certificação, Associação Brasileira de Normas Técnicas, 2012.

P. Feng, S.D. Weagant, M.A. Grant, “Enumeration of Escherichia coli and Coliform Bacteria”.

Chapter 4. In: Bacteriological analytical manual online. FDA, 2002. Acesso em: 15 fevereiro 2011.

Instituto Nacional de Metrologia, Normalização e Qualidade Industrial. Vocabulário Internacional de Metrologia: Conceitos Fundamentais e Gerais e Termos Associados (VIM 2012). Edição Luso-Brasileira. Rio de Janeiro, 2012.

International Organization for Standardization – ISO 13528 - Statistical methods for use in proficiency testing by interlaboratory comparisons, 2005.

A. Lamberty, H. Schimmel e J. Pauwels, “The Study of the Stability of Reference Materials by Isochronous Measurements” Fresenius J. Anal. Chemistry, pp. 359-361, 1997.

The International Harmonized Protocol for the Proficiency Testing of Analytical Chemistry Laboratories. Pure Appl. Chem; Vol. 78, No._{1, pp. 145–196, 2006.}

(22)

11. Laboratórios Participantes

A lista dos laboratórios que enviaram os resultados à coordenação do Programa é apresentada na

Tabela 12.

Tabela 12: Laboratórios participantes do Ensaio de Proficiência em Microbiologia de Alimentos 10ª Rodada – Enumeração de Coliformes Termotolerantes em Matriz Ovo.

Instituição

BioQuality Análises, Pesquisa e Desenvolvimento Ltda Centro de Laboratório Regional – IAL – Campinas Centro de Laboratório Regional – IAL – Ribeirão Preto VI

Núcleo de Ciências Químicas e Bromatológicas – Laboratório de Microbiologia de Alimentos

Centro de Laboratório Regional – IAL – Santo André VIII Centro de Laboratório Regional – IAL – Santos

Laboratório de Microbiologia Alimentar

Divisão de Produtos do LACEN – AC

Laboratório de Microbiologia de Produtos

Fundação Ezequiel Dias – LACEN – MG IBERPHARM Laboratórios do Brasil Ltda

Instituto Oswaldo Cruz – Laboratório Central de Saúde Pública do Maranhão – LACEN – MA Laboratório Central de Saúde Pública – LACEN – AL

Laboratório Central de Saúde Pública – LACEN – CE Laboratório Central de Saúde Pública – LACEN - MS Laboratório Central de Saúde Pública – LACEN – TO Laboratório Central de Saúde Pública do DF – LACEN – DF

Laboratório de Microbiologia de Alimentos

Laboratório Central de Saúde Pública Prof. Gonçalo Moniz – LACEN – BA

Laboratório de Microbiologia de Alimentos

Laboratório Central do Estado do Pará – LACEN – PA

Setor de Microbiologia de Alimentos

Laboratório Central do Estado do Paraná – LACEN – PR

Seção de Microbiologia de Alimentos

Laboratório Central Noel Nutels – LACEN- RJ

Microbiologia de Alimentos da Gerência de Controle Sanitário e Ambiental

Laboratório de Microbiologia de Alimentos – LACEN – RO

Laboratório de Saúde Pública Dr. Giovanni Cysneiros – Secretaria de Estado da Saúde – LACEN – GO

Prefeitura do Município de São Paulo – Secretaria de Saúde – Coordenação de Vigilância em Saúde (COVISA)

Laboratório de Controle de Qualidade em Saúde

Prefeitura Municipal de Guarulhos

Laboratório Municipal de Saúde Pública Dr. Jefferson de Araújo

Serviço Nacional de Aprendizagem Industrial – SENAI – Chapecó – PEP SENAI/SC Subsecretaria de Vigilância Sanitária do Rio de Janeiro

Laboratório de Controle de Produtos

 Total de participantes: 24 laboratórios

(23)

Anexo A – Homogeneidade Segundo o Protocolo Harmonizado

Da temperatura de referência, foram retirados aleatoriamente vinte itens de ensaio. Os frascos foram analisados sob condições de repetitividade, segundo metodologia descrita por Feng et al. (2002). Dos frascos representantes de cada um dos lotes, após a reconstituição dos liófilos, foram preparadas diluições sucessivas, de acordo com as concentrações conhecidas. Alíquotas de 0,1 mL das diluições selecionadas foram semeadas em superfície de ágar VRBA. Para verificar a ocorrência de problemas estatísticos, os dados foram dispostos num gráfico simples de resultados x número de amostra e analisados visualmente em busca de características usuais em diagnóstico, tais como:

(a) tendências ou descontinuidades;

(b) distribuição não-aleatória de diferenças entre o primeiro e segundo resultado de ensaio; (c) arredondamento excessivo; e

(d) resultados dispersos intra-amostras.

Como não foi verificado nenhum problema estatístico, os dados foram usados para estimar as variâncias analíticas e amostral conforme descrito abaixo:

Valores Dispersos

Primeiramente foi aplicado o teste de Cochran aos resultados, com o propósito de eliminar possíveis valores dispersos. Assim, calculou-se a soma, Si, e a diferença, Di, de cada par de resultados, para

i = 1 até 10.

Calculou-se a soma dos quadrados SDD das m diferenças a partir da Equação 1:





2 i DD

D

S

(1) A estatística do teste de Cochran (Equação 2) é a razão entre

D

2_max, a maior diferença ao quadrado, e a soma dos quadrados das diferenças:

DD 2 max S D C (2)

Foi calculada a razão acima e comparada com o valor crítico apropriados da tabela de teste de Cochran para um nível de confiança de 95 %.

Não-homogeneidade significativa

A mesma soma dos quadrados das diferenças (Equação 4) foi utilizada para calcular a variância analítica, 2

an

(24)

 

D /2m MS

s2_an  _w   _i2 (3)

Onde Di é a diferença de cada par de resultados do teste de homogeneidade e m é o número de

recipientes selecionados para o teste de homogeneidade.

A seguir, calculou-se a variância VS das somas Si de acordo com a Equação 4:











2 MS

(

s

)

/(

m

1 )

v

_s _B _i 2 (4) Onde s é a média de Si.

Calculou-se a variância amostral, 2

sam

s , de acordo com a Equação 5 2 / ) MS MS ( s B w 2 sam  (5)

Calculou-se a variância amostral aceitável,



2all, como all2 (0,3p)2onde p é o desvio padrão para avaliação da homogeneidade.

Tomando-se os valores de F1 e F2, onde

) 1 m ( X F 2 0,95 1; -m 1 _ e 2 ) 1 F ( F₂  m-1;m;0,95  , calculou-se o valor

crítico de homogeneidade para o ensaio como (Equação 6):

2 an 2 2 all 1 F s F c    (6) Como 2 sam

s < c, não há evidência de que o desvio-padrão amostral na população de amostras

(25)

Anexo B – Valor Designado Segundo a Norma ISO 13528

A Norma ISO 13528 é um documento complementar à ISO GUIA 43 e fornece os métodos estatísticos a serem empregados nos ensaios de proficiência. Este documento descreve a análise robusta envolvendo o emprego da estimativa do algoritmo A para o cálculo do valor designado e do desvio padrão. Neste EP, somente o valor designado foi calculado através da análise robusta, sendo o desvio padrão estimado através das equações derivadas do modelo geral de Horwitz (4.3.3). Inicialmente, todos os valores objetos da análise (valores enviados pelos laboratórios participantes) foram colocados em ordem crescente. A seguir, foram calculados os valores da mediana de xi (x*)

e do desvio padrão (s*), conforme as Equações 1 e 2.

i x de mediana x* (1) * 483 , 1 * medx x s   _i  (2)

Onde: med é a mediana; xi valor de concentração reportado pelo laboratório.

Em seguida, foi calculado o valor de Fi, segundo a Equação 3, e a partir da estimativa de Fi,

calculou-se o novo valor inferior (concentração inferior), e o novo valor superior (concentração superior), através das Equações 4 e 5.

Fi = 1,5s* (3)

Novo Valor Superior = x* + Fi (4)

Novo Valor Inferior = x* - Fi (5)

Os novos valores, superior e inferior, foram comparados a cada um dos resultados individuais dos laboratórios participantes, e os que estavam acima do valor superior ou abaixo do valor inferior foram descartados, ou seja, foram considerados valores dispersos ou discrepantes e substituídos pelos novos valores superiores e inferiores. Este procedimento compreende a um ciclo ou Ciclo 0.

Iniciou-se um novo ciclo, a partir do cálculo da média robusta (x*)1_{e do desvio padrão (s) dos novos}

valores encontrados, e a seguir calculou-se o novo desvio padrão robusto (s*)2_{. O novo valor de s*}

foi calculado pela Equação 6:

𝑆∗_{= 1,134𝑠} ₍₆₎

1 _{Na ISO 13528 quando se inicia o Ciclo 1, x* passa a ser denominado como média robusta, uma}

vez que advém de um algoritmo robusto.

2 _{Na ISO 13528 quando se inicia o Ciclo 1, s* passa a ser denominado como desvio padrão robusto,}

(26)

Em seguida, calculou-se novamente o valor de Fi, os novos valores superiores e inferiores,

conforme descrito, respectivamente, nas Equações 3, 4 e 5, sendo os valores discrepantes substituídos pelos novos limites. Este procedimento corresponde a outro ciclo ou Ciclo 1.

O ciclo é reiniciado até o momento em que os valores da nova média robusta (x*) e do novo desvio padrão robusto (s*) convergirem, ou seja, até que não haja nos ciclos, diferença entre eles. Neste momento o ciclo é finalizado e os novos valores de x* e s*, que são os valores da média robusta (valor designado do EP) e do desvio padrão robusto.

Para a incerteza do valor designado descrito, será adotada a fórmula apresentada no item 5.6.2 da norma ISO 13528, específica para valores designados obtidos a partir do algoritmo A. A incerteza padrão será calculada pela Equação 7:

u_x∗ = 1,25 × s∗/√p ₍₇₎

(27)