Comparação patogênica, cultural, serológica e eletroforética entre isolados de Alternaria solani do tomate e da batata e variabilidade patogênica de A. solani f. sp. lycopersici N.F.

Texto

(1)COMPARAÇÃO PATOGÊNICA.. CULTURAL .. SEROLÓGICA E ELETROFORÉTICA ENTRE ISOLADOS DE IHternaria sola.ni DO TOMATE .... E DA BATATA E VARIABILIDADE PATOGENICA DE A. solani f.sp.. lycopersJ.·ci. NF.. MARIA ISABEL FANCELLI Engenheira Agrónoma. Orientador: Prof. Dr. HIROSHI KIMATI. Tese apresentada à Escola Superior de Agricultura "Luiz de Queiroz", da Universidade de São Paulo, para obtenção do titulo de Doutor em Agronomia, Área de Concentração: Fitopatologia.. PIRACICABA Estado de São Paulo - Brasil Dezembro - 1991.

(2) Ficha catalográfica preparada pela Seção de Livros da Divisão de Biblioteca e Documentação - PCAP/USP F199c. Fancelli, Maria Isabel Comparação patogênica, cultural, serológica e eletrofo rética entre isolados de Alternaria solani do tomate e da batata e variabilidade patogênica de A. solani F. sp lycopersici N.F. Piracicaba, 1991. 80p. ilus. Tese - ESALQ Bibliografia. 1. Batata - Doença 2. Fungo fitopatogênico - Patogenici da de 3. Pinta preta da batata - Patogenicidade 4. Pinta preta do tomate - Patogenicidade 5. Tomate - Doença 1. E~ cola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz, piracicaba. CDD. 632.44.

(3) ii. COMPARAÇÃO. PATOG~NICA,. CULTURAL, SEROLóGICA E ELETROFOReTICA. ENTRE ISOLADOS DE. ~lternaria. E DA BATATA E VARIABILIDADE A. solani f.sp.. solani DO TOMATE PATOG~NICA. DE. lycopersici N.F.. Maria Isabel Fancelli. Aprovada em: 11/03/1992. Comissão julgadora: Dr~ Raquel Ghini. EMBRAPA/CNPDA. Prof~. IB/São Paulo. Dr~ Rosa Maria Gayaso Cardoso. Praf. Dra Ivan Bedenda. ESALQ/USP. Prafa Dr. Tasso Leo Krügner. ESALQ/USP. Praf. Dr. Hiroshi Kimati. ESALQ/USP. Prof. Dr. HIROSHI KIMATI Orientador.

(4) ii1. Ã Deus. pela força e inspiração.. Aos meus pais. RUBENS e. ELIZABETH~. pela dedicação,apoio e incentivo.. Ao. JOÃO~. pela presença constante. DEDICO..

(5) iv. AGRADECIMENTOS A autora expressa seus agradecimentos: Ao Prof. Dr. Hiroshi Kimati, por tação e apoio durante o. desenvolvimento. da. sua. orien-. presente. pes-. quisa; Ã pesquisadora Erna E. Bach, realizaç~o. pelo auxilio. na. dos trabalhos de eletroforesej Ao Departamento de. Fitopatologia. Superior de Agricultura "Luiz de Queiroz", que a participação no Curso. de. P6s-Graduaç~o. e. da. Escola. possibilitou a. realizaç~o. deste trabalho; Aos professores do Departamento de. Fitopato-. logia da ESALQ, pelos ensinamentos; Aos funcionários do Departamento. de. Fitopa-. tologia, pela colaboração; Aos colegas do Curso de. P6s-Graduação,. pelo. convivia e amizade; A todos que direta ou. indiretamente. raram para a realização deste trabalho.. colabo-.

(6) v. SUMÁRIO. Página. .............................................................. i x. SUMMARY ................................................................................ )(. 1... ................................................................. ... 01. 2. REVISÃO DE LITERATURA . . • • . . . . . • . . • . • . . . . • . . . • •. 03. solani ...•.. 03. RESUMO. I NTRODUÇAO. ~.. 2.1.. Caracteristicas gerais de. 2.2.. Serologia aplicada ao estudo fitopatogênicos. 2.3.. fungos. ................................................ ... M~TODO. 3. MATERIAL E. .....•....•.•.•••..•....•. 10. .•..••.•....•........•.••..... 13. Local e época de execução dos tos. expe~imen-. ....................................................................... ... 3.2.. Obtenção e. 3.3.. Desenvolvimento diametral médio de. conse~vação. dos isolados. 13 colô-. naria solani ...................................................... ... Desenvolvimento diametral médio de nias de Alternaria solani tempe~atu~as. 3.5.. Espo~ulação. em. dife~entes. .......•.................... de isolados de. A. solani. 16. do. 17. 3.6.. Hid~ólise. 3.7.. Teste de eficiência pa~a. 15. colô-. tomatei~o. cidas. 13. isolados de Alter-. nias e esporulação de. 3.4.. 08. Eletroforese aplicada ao estudo de fungos fitopatogênicos. 3.1.. de. de amido. .......................................... ... in. vitro. 18. de fungi-. isolados de A. solani do tOffi3-. te e da b a t a t a . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 19.

(7) vi Página 3.8.. Frequência de aparecimento de setores isolados de A.. solani~. em. a partir de discos 20. de micél ia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 3.9.. Teste de patqgenicidade. de. A. solani em. de tomate varie-. plântulas. dade Angela e CICA 8 na. de. •••••..•..•.••••••••. 3.10. Efeito da concentração de solani. isolados. manifestação. inóculo de de. 21. A.. sintomas em. hastes de tomateiro ••••••...•.••••.•••••. 22. 3.11. Efeito da idade da planta na manifestação de. sintomas,. em. tomateiros. inoculados. com A. solani . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 3.12. Comportamento de variedades de inoculadas. com. diferentes. 24. tomateiro. isolados. de. A. solani provenientes do tomateiro ..•.• 3.13. Caracterização serológica de. 24. isolados de. Ai ternar i a sol ani . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 25. 3.13.1. Preparo do antígeno imunizante .•. 25. 3.13.2. Obtenção dos antissoros •••••••••. 26. 3.13.3. Preparo dos antígeno para. reação. em dupla difusão em gel de ágar • 3.13.4. Reação de. serológica. ~. 27. dos isolados. Alternaria solani pelo. teste. de dupla difusão em gel de ágar •. 27. 3.14. Eletroforese . . . . . . . . . . . . • . . • . . . . . . . . • .. 28. 3.14.1. Crescimento dos isolados de Alternaria solani em meio do. líqui-. .......•...•...•...•.•....... 3.14.2. Extração de proteinas dos lados de Alternaria solani? dauci e A.. 28. isoA.. parri . . . . . • . . . • . . . .. 29. 3.14.3. Determinação da concentração de proteínas nas amostras ..••..... 30.

(8) vii Página 3.14.4. Preparo do gel de poliacrilamida. .•..•.•••••••..•.••.•..•...•. 31. 3.14.5. Aplicação das amostras e corrida eletroforética .••••••••••••. 32. .................... .. 32. 3.14.7. Preservação dos géis ••••••••••. 33. 3.14.6. Coloração. 3.14.8. Análise do perfil eletroforético. ............................ .. 4. RESULTADOS 4.1.. 34. Desenvolvimento diametral médio de. coló-. e esporulação de isolados de A. solani •• 4.2.. Desenvolvimento diametral médio de. em. diferentes temperaturas ••••.•••••••.•••• Esporulação de isolados de. 34. coló-. nias de isolados de Alternaria solani 4.3.. 33. A. solani. 36. do. tomateiro. 37. 4.4.. Hidr61 i se de amido •••••.•••••••.••••••••. 37. 4.5.. Teste de eficiência in vitro de das,. fungici-. para isolados de A. solani do tomate. e da batata . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 4.6.. Frequência de aparecimento de setores. 39. em. isolados de A. solani, a partir de discos de micél ia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 4.7.. Teste de patogenicidade de isolados de A.. solani em plântulas de. tomate. variedade. Ângela e CICA 8 .•.••.••.•.••.....••....• 4.8.. Efeito da concentração de inócuclo de. A.. solani na. em. manifestação. de. sintomas. hastes de tomateiro • • . . . . . . . . . . . . • . • • . . • 4.9.. 41. 41. 43. Efeito da idade da planta na manifestação de sintomas, em tomateiros inoculados com A.. sol ani . . . . . . . . . . . . . . ., .. ., . . . . . ., . . . . . . ... 45.

(9) viii Página 4.10. Comportamento de variedades de. tomateiro. com diferentes isolados de A. solani provenientes do tomateiro •••..•.••••..••••• 4.11.. Caracterizaç~o. serol6gica de isolados. 45. de. sol ani . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 48. 4.12. Eletroforese ••••••.•••••••...••••..•••.•. 50. A.. :; • DI SCUSSAO. ........................................................... 53. 6. CONCLUSAO. ................................................................ 66. REFER1:;NC I AS 8 I BL I OGRÁF I CAS •••••••••••••••••••••••. 67.

(10) ix COMPARAÇ~O. PATOG~NICA,. ELETROFOR~TICA. CULTURAL, SEROL6GICA E. ENTRE ISOLADOS DE Alternaria soJani DO TOMATE E DA BATATA E VARIABILIDADE A. solani f.sp.. PATOG~NICA. DE. lycopersici N.F. Autora: Maria. Fancelli. Is~bel. Orientador: Prof. Dr. Hiroshi Kimati. RESUMO. Foram feitas. comparações. cul-. patogênicas,. turais, serológicas e eletroforéticas de. Alternaria. solani. do tomate e da batata. Testes de patogenicidade em tomate que somente. isolados. congeniais. conseguem. reproduzir. sintomas típicos da doença, pelo que se propõe tura de Alternaria solani f.sp. lados do tomate.. lycopersici,. Adicionalmente,. estes. mostraram. a. nomencla-. para. os. isolados. de. setores. iso-. apresen-. taram, em relação aos da batata, menor capacidade de lisar amido, maior frequência. os. hidro-. resistentes. fungicidas iprodione e polioxina, maior crescimento em. aos meio. de cultura, maior dificuldade de esporulôção in viLro e. di-. ferenças serológicas e eletroforéticas. Testes de patogenicidade de dez. A. solani do tomate em doze. variedades. denciaram a ocorrência de raças. de. patogênicas. isolados. tomateiro. sp.. lycopersici.. evi-. (agressivas. virulentas, sensu VAN DER PLANK, 1968) dentro de f.. de. A.. e. solani.

(11) x PATHOGENIC, CULTURAL, SEROLOGICAL, AND ELECTROPHORETIC COMPARISONS AMONG TOMATO ANO POTATO ISOLATES OF Alternaria solani ANO PATHOGENIC VARIASILITV OF A. solani f.sp.. lycopersici N.F. Author: Maria Isabel Fancelli. Adviser: Prof. Dr. Hiroshi Kimati. SUMMARV Pathogenic, cultural, serological trophoretic comparisons were made among isolates of. ~lternaria. tomato. only. congenial. elec-. and. potato. plants. showed. solani.. Pathogenicity tests on toma to that. and. isolates. induced. symptoms, suggesting the existence lization and the nomenclature. of. typical physiologic. solani. ~.. disease. f.sp.. specia-. lycopersici,. for the tomato isolates. In. addition,. the. toma to. isolates. showed. smaller capacity for starch hydrolysis, greater frequency of resistant sectors. to. iprodione. greater growth on culture sporulation in. vi~ro. and. and. medium,. polyoxin. greater. serological. and. fungicides,. difficulty. for. eletrophoretic. differences s in relation to the potato isolates. Pathogenicity tests of 10 A. solani. isolates. from tomato on 12 varieties of tomato plants. evidenced. occurrence of pathogenic races,. aggressiveness. in terms. of. and virulence (sensu VAN DER PLANK, 1968) within f.sp.. lycopersici.. A.. the. solani.

(12) 1. 1. INTRODUÇÃO. Nas culturas do tomate denominada pinta. preta,. provocada. e por. batata,. a. doença. Alternaria. 50lani. (ElI. & Mart.) Jones & Grout, é um dos principais em épocas de temperatura. e. problemas. umidade elevadas, podendo acar-. retar perdas consideráveis na produção. Devido aos vários fatores semelhantes entre a pinta preta que ocorre no tomate e a que aparece na. batata,. dentre os quais as condições climáticas e o estádio. de. senvolvimento da planta que favorecem a ocorrência da. dedoen-. ça, tipo de lesão e principalmente a mor'fologia dos esporos, o agente causal de ambas foi determinado como A. 50lani. entanto, dúvidas a respeito desta identidade foram das, por ROSENBAUM (1920),. No. levanta-. que observou algumas caracterls-. ticas que diferenciavam os isolados provenientes do tomate e da batata. Mas, este trabalho, assim como res, relacionados com este assunto, suficiente para estimular outros. não. outros. posterio-. tiveram. expressão. pesquisadores. a. realizar. trabalhos mais convincentes e desta forma, até nossos dias é.

(13) 2 afirmado que o agente da pinta preta em tomate e batata é. o. mesmo fungo. Em vista destas informações, o objetivo deste trabalho foi observar a. variabilidade. existente. entre. os. isolados do tomate e da batata, através de parâmetros como o crescimento em meio de cultura, amido, crescimento em meio com tomate, serologia (teste de. esporulação, fungicidas,. dupla-difusão). hidr6lise. de. inoculações. em. e. eletroforese. (esterase). Sendo também importante a variabilidade existente dentro dos isolados provenientes de cada. cultura,. neste. trabalho foi estudada esta caracteristica com os isolados do tomate, através de inoculações. em. diversas. tomateiro, pois informações desta natureza para trabalhos de melhoramento que esta doença.. visam. variedades são. a. de. importantes. resistência. a.

(14) 3. 2. REVISÃO DE LITERATURA 2.1. Características Gerais de tl. solani. o. agente causal da pinta preta. foi. observa-. do pela primeira vez por ELLIS & MARTIN (1882), sobre folhas de batata, o qual. foi. denominado. de. Macrosporium solani.. No entanto, várias sinonimias são registradas na literatura, entre elas: tllternaria solani, Sorauer,. solani varo. varians Vanha,. Neerg. f. sp.. 1904,. 1896;. tllternaria. Sporidesmium porri. (EII.). solani (EIl. & Martin) Neerg., 1945 e tllterna-. ria dauci (Ktihn) Groves & SkoIko f. sp.. solani (Ell. &. Mar-. tin) Neerg., 1945 (WALKER, 1965). WILTSHIRE (1933),. em estudos. básicos. grupo de hifomicetos, concluiu que Nacrosporium deveria. deste ser. suprimido como um nomen ambiguum em favor de tllternaria. Assim, a designação mais aceita atualmente é. tllternaria solani. ( R I CH , 1983).. tllternaria solani é um fungo. imperfeito. que. possui conidios com 9 a 11 septos transversais e poucos sep-.

(15) 4 tos longitudinais. Os conldios são mas podem ser catenulados, retos. geralmente ou. individuais,. ligeiramente. curvos,. elipsóides afinando-se em direção ao ápice, formando um bico comprido, sinuoso, ocasionalmente ramificado com 2,5 pm de comprimento, marrons, com 300 pm. Os conidióforos. isolados. grupos, com 6 a 10 pm de diâmetro e 100. 5,0. de 15 a 19 x 150 a. dimens~es. ocorrem. a. ou. pm. em. de. pequenos. comprimento. (ELLIS, 1971; HOOKER, 1981). A umidade é um fator importante para o aparecimento. da. doença,. podendo. ser. conferida. pelas. chuvas. (GRATZ, 1930) ou orvalho (MOORE, 1941; GUTHRIE, 1958;. & REICHER, 1964). No entanto, em. termos. de. ROTEM. sobrevivência,. ROTEM (1968) cita que A. 501ani é extremamente resistente ao calor e à seca. O aumento da suscetibilidade à. infecção. geralmente associado ao aumento da idade das plantas. & THOMAS, 1943; DOUGLAS & PAVEK, 1972), variedades. (MOORE precoces. & RICHARDS,. ou plantios antecipados (REILING, 1930, BARRAT 1944). Geralmente o patógeno inicia seu. está. ataque. nas. folhas. mais velhas, com o aparecimento de pequenas manchas necr6ticas pardo escuras que evoluem formando. les~es. de 0,5 a 2 em,. de formato circular a ovalado, com os caracteristicos. anéis. concêntricos, bordos definidos e ocasionalmente halos clor6ticos. Além das folhas, pode haver aparecimento de em hastes, peciolos, frutos. (no caso de tomate) e. sintomas raramente. em tubérculos (no caso da batata). Embora haja uma tendência.

(16) 5. de tecidos maduros serem mais afetados, em tomate, o do patógeno pode ocorrer em qualquer estAdio de mento. da. planta. &. (TOKESHI. CARVALHO,. ataque. desenvolvi-. 1980;. HOOKER,. Uma característica comum a todas as. espécies. 1981).. do gênero Alternaria, também observada em A. 501ani é a baixa capacidade ou mesmo ausência de cultura. Um grande número de métodos de indução da. trabalhos. esporulaç~o,. em. esporulaç~o. indicam. meio. diferentes. como a utilização de. ultravioleta (McCALLAN & CHAN, 1944;. CHARLTON,. fluorescente (JOHNSON & HALPIN, 1954; LUKENS,. de. luz. 1953);. luz. 1960;. SINGH,. 1967; DOUGLAS, 1972; STEVENSON & PENNYPACKER, 1988),. ilumi-. naç~o. solar (RANDS, 1917; LUKENS, 1960; SINGH, 1967; RATH. &. PADHI, 1973; PRASAD & DUTT, 1974), ferimento do micélio (RANDS, 1917; McCALLAN. & CHAN, 1944; LUKENS, 1960;. LUDWIG. et. alii, 1962), adição de substâncias ao meio de cultura como o carbonato de cAlcio (SHAHIN & SHEPARD, 1979),. ex-. tiamina,. trato de levedura (RATH & PADHI, 1973), potAssio, zinco (RODIGIN, 1979), peróxido de. hidrogênio. e. ozónio. (CHARLTON,. 1953). No entanto, para o sucesso da esporulação, outros fatores devem ser analisados como a idade da cultura. & HALPIN, 1954; RATH & PADHI, 1973;. PRASAD. (JOHNSON. & DUTT,. temperatura (KLAUS, 1940; McCALLAN & CHAN, 1944;. JOHNSON. HALPIN, 1954; SINGH, 1967; VERMA, 1969; DOUGLAS, 1972;. & PADHI, 1973) e umidade relativa (KLAUS, 1940; CHAN, 1944).. 1974). &. RATH. McCALLAN. &.

(17) 6. Isolados de A. solani. diferem. consideravel-. mente em caracteristicas culturais, como a coloração do. mi-. célio, pigmentação do meio de cultura e a facilidade com que formam setores (BONDE, 1929; THOMAS, 1943; HENNING & ALEXANDER, 1959; DOROZHKIN et alii, 1975). Com relação à gama de hospedeiros, ções na literatura que além 1925; PITTMAN, 1929; ELLIS, HOOKER, 1981;. de. batata. e. RICH, 1983; CAMARGO, 1984). HI & CARVALHO, 1980; HOOKER, 1981; como. 1924; HOOKER, 1981). Brassica spp. e. tomate. cita-. (STEVEN,. 1971; TOKESHI & CARVALHO,. outras solanáceas como berinjela, pimentão. outros gêneros. há. A. e. 1980;. solani jiló. afeta (TOKES-. CAMARGO,. 1984). e. (ELLIOTT,. 1917;. BOLLE,. de. plantas. várias outras espécies. até. (NEERGAARD, 1945). No entanto, ROSENBAUM (1920) questiona em seu trabalho a identidade de A.solani proveniente da batata e do tomate, criticando trabalhos anteriores, que considerava. os. pat6genos de ambas as culturas idênticos. Em seus trabalhos, esse autor encontrou um tipo de sintomatologia que. diferen-. ciava os isolados de tomate daqueles da batata, dividindo-os assim, em espécies distintas. Outros 1950; TESCHNER, 1953; JONES & DARLING, alii, 1975; B6VEDA, 1986). observaram. pesquisadores 1953; que. (BROCK,. DOROZHKIN. isolados. 501ani provenientes do tomate eram mais patogênicos planta, o mesmo ocorrendo para isolados da batata, chegaram a ser tão categóricos como Rosenbaum.. de a mas. et. A. esta não.

(18) 7 BONDE (1927,. MUKHERJI. 1929), PITTMAN (1929),. (1961) e REMNEVA & IVANYUK (1968) observaram a existência de diferenças entre isolados de A minadas como raças diferenças. foram. fisiológicas na. da batata, sendo deno-. sDlan~. coloração. por e. BONDE. (1929).. aparência. do. Estas. micélio,. produção de pigmentos em BDA, esporulação, crescimento micelial, tendência tacadas e. a. produzir setores, lesões em folhas. tubérculos, entre. outras. caracteristicas.. Da mesma maneira, para A. também foram observadas. diferenças. inclusive designados como. raças. (WELLMAN, 1943; STALL, 1957;. des-. entre. por. do. sDlan~. tomate. isolados,. alguns. sendo. pesquisadores. & ALEXANDER,. HENNING. 1959;. KING, 1967; DOROZHKIN et alii, 1977). Com relação aos testes de. patogenicidade. em. tomate, ANDRUS et alii (1942) identificaram um alto nivel de resistência à. lesão do caule provocada por A.. rias cultivares de tomate,. indicando. que. sDlan~. esta. em. vá-. resistência. estava correlacionada com resistência foliar. Da mesma ma, GARDNER (1990) observou que plantas que. exibiam. tência foliar no campo mostravam constantemente. forresis-. resistência. no caule, em inoculações em casa de vegetação, indicando que a resistência neste caso era controlada pelo mesmo. gene. genes estreitamente relacionados. No entanto, este fato foi sempre adequado para outras fontes de resistência sDlan~,. pois BARKSDALE & STONER (1973) observaram. no. ou não. a. A.. mate-. rial estudado que os genes para lesão no caule e resistência.

(19) 8. foliar segregavam independentemente. GARDNER observou este fato, pois. nos. materiais. (1988). estudados. apenas resistência foliar. Quando resistência caule. est~o. vegetaç~o. para a de. identificaç~o. vegetaç~o,. geralmente. n~o. a. les~o. no caule,. em. e. no. casa. de. adequados. s~o. da resistência (GARDNER, 1990). Em casa resistência. em. bem sucedida, pois os sintomas. n~o. identificaç~o. é. ocorreu. foliar. estreitamente relacionados, testes. para resistência à. também. da. ficientemente diferentes para discriminar veis daquelas moderadamente. resistentes. plantas. folhas, s~o. suscetl-. (BARKSDALE,. NASH & GARDNER, 1988). Assim, estes. nlveis. são discriminados de uma forma mais. satisfatória. de. su-. 1969;. resistência no. campo. (BARKSDALE, 1971; BARKSDALE & STONER, 1973; BARKSDALE & STONER, 1977; MAIERO et alii, 1989).. 2.2. Serologia aplicada ao Estudo de Fungos. Fi topatogênicos. A utilização da serologia vêm se do como uma das técnicas mais úteis no estudo. evidenciandas. relaçôes. filogenéticas de fungos fitopatogênicos (FIGUEIREDO et alii, 1977), pois várias espécies e raças não se distinguem facilmente somente através de suas morfologias. A alta. especifi-. cidade das reaçôes serológicas permite a detecção. de. renças entre moléculas complexas dos microrganismos. difeestuda-.

(20) 9. dos, a. fornecendo. classificação. informações e. de. grande. identificação. utilidade. taxonómica. para. (SHATOCK,. 1955). No caso do gênero Alternaria não. existe. nhum estudo de natureza serológica, mas em diversos. ne-. gêneros. de fungos onde foi aplicada tal técnica, esta. possibilitou,. na maioria das vezes, uma melhor. das. compreensão. relações. entre as espécies pesquisadas. MADHOSINGH (1964) comparou,. serologicamente,. três espécies do gênero Fusarium: F. oxysporum,. forme e F. solani, observando. maior. F.. proximidade. monilientre. dois primeiros, que diferiram significativamente de F.. ni, concordando assim, com a. os. sola-. taxonomia baseada em caracteres. morfológicos. Em outros trabalhos, relacionados com a tinção de espécies através de técnicas serológicas, BURREL (1967) separaram e identificaram espécies. dis-. AMOS. &. morfologi-. camente semelhantes de Ceratocystis; TERANISH et alii (1973) diferenciaram espécies de Verticj]]jum e GHINI. (1984) obser-. vou diferenças serológicas entre espécies de Botrytis. A serologia também tem se. mostrado. distinção de formae speciales, como são os casos (1957) que diferenciou F. oxysporum f.sp.. porum f. sp.. MATI (1975). que. diferenças. TEMPEL. caracterizaram. cubense e F. oxysporum f. sp.. demonstrou. de. na. lupini de F. oxys-. pisij BUXTON et alii (1961) que. F. oxysporum f. sp.. útil. pisj e KI-. antigênicas. entre.

(21) 10. Colletotrichum graminicola da cana de açúcar (t. sp.. saccha-. ri), do milho (t. sp. zeae) e do sorgo (f. sp. sorghi). Ainda a serologia pode ajudar na raças fisiol6gicas, como no caso das. raças. 1. oxysporum lycopersici (MORTON & DUKES, 1966); oxysporum f . sp. cubense e. distinç~o. de. e. 2. de. F.. raças. de. , F.. F. oxysporum f. sp. pisi. (BUXTON. e t a l i i , 1961). Apesar da reconhecida utilidade da na. identificaç~o. e classificação de. serologia. microrganismos,. poucos. trabalhos foram realizados até o momento nesta linha de pesquisa. Um dos fatores limitantes, segundo FIGUEIREDO et alii (1977) é a inexistência de uma metodologia adequada que permita o conhecimento e a purificação dos fatores. antigênicos. especificas de cada organismo estudado.. 2.3. Eletroforese aplicada ao Estudo de Fungos Fitopatogênicos. O uso da eletrotorese na taxonomia de fitopatogénicos recebeu maior atenção depois. que. fungos. CHANG. alii (1962) demonstraram a utilidade da eletroforese para. et a. separação de proteinas de Neurospora. Esta técnica é especialmente útil na. distin-. ção de espécies com pequenas diferenças morfológicas ou não esporulam em meio de cultura. (ALFENAS,. 1991).. que. Segundo.

(22) 11 BONDE et alii (1984), a utilidade da eletroforese como tério importante na taxonomia. é. devido. à. cri-. aproximação. da. variação isoenzimática e genética. BOSLAND & WILLIAMS (1987) dizem que as isoenzimas são consistentes em cada. individuo,. não sendo afetadas por fatores ambientais, portanto. capazes. de demonstrar diferenças entre populações de individuos. di-. ferentes. CLARE & ZENTMEYER (1966) observaram. diferen-. ças entre os padrões eletroforéticos de Phytophthora. momi, P. citrophthora e P.. palmivora,. quando. utilizada. a. Cylindrocla-. atividade enzimática da peroxidase. No caso de. dium, ALFENAS (1991) observou que espécies. cinna-. morfologicamente. distintas exibem índices mais elevados de similaridade. para. padrões de proteínas, em relação às isoesterases. GILL & POWELL (1968) observaram diferenças entre os padrões proteicos de P.. fragariae e P. cactorum. BURDON & MARSHALL (1981) con-. seguiram diferenciar várias espécies e. ~ormae. speciales. de. Puccinia através de diversas análises enzimáticas com a técnica eletroforética. Para a identificação de raças e variabilidade de fungos fitopatogênicos,. detecção. a análise. de. de pro-. teinas e isoenzimas tem se mostrado como uma técnica bastante promissora (ALFENAS, 1991). GILL & POWELL (1968) não conseguiram diferenciar raças fisiológicas de P.. fragariae utilizando a eletro-. forese. No entanto, JUNQUEIRA et alii (1987). e. ALFENAS. et.

(23) 12. alii (1984), analisando os padrões enzimáticos. de. isolados. de Microcyclus ulei e Cryphonectria cubensis, respectivamente, mostraram uma correlação com a virulência dos mesmos. A integração da. técnica. eletroforética. outras técnicas para uma precisa identificação de. com. espécies,. foi sugerida por GILL & ZENTMEYER (1978). Desta maneira 805LAND & WILLIAM5 (1987), trabalhando com isolados de Fusarium oxysporum, determinaram diferenças através da caracterização enzimática, testes de patogenicidade e compatibilidade vegetativa, cujos resultados levaram à divisão desta espécie. em. três formae speciales. No caso de Alternaria, não há. nenhum. na literatura quanto aos estudos eletroforéticos.. relato.

(24) 13. 3. MATERIAL E METODO 3.1. Local e época de execução dos experimentos. Os experimentos do ex€cutados nos laboratórios mento de Fitopatologia da. presente. trabalho. foram. e casa de vegetação do DepartaEscola. Superior. de. Agricultura. "Luiz de Queiroz", no período de maio de 1990 a dezembro. de. 1991.. 3.2. Obtenção e conservação dos isolados. Os isolamentos foram realizados a materiais vegetais provenientes de diversos. partir. locais. 1), retirando-se esporos individuais das lesões. e. do-os em ágar-água (20g de ágar e 1000 ml de água). de. (Tabela colocanou. cor-. tando-se pequenos pedaços de tecido da zona de transição entre a parte doente e sadia, desinfestando-os e neste mesmo meio de cultura.. colocando-os. Após quatro dias de. a 25 o C, as colônias desenvolvidas foram. incubação. repicadas para. BDA.

(25) 14 (água de infusão de 200g de batata, 20g de dextrose, 18 g de ágar e água destilada até completar 1000 ml).. Tabela 1. Isolados de Alternaria solani utilizados nos experimentos do presente trabalho.. Hospedeiro. Proced~ncia. Data do isolamento. TI.. Tomate. Piracicaba. 03/05/90. Tz. Tomate. Sta. B. D'Oeste. 09/05/90. T3. Tomate. Rafard. 18/05/90. T.. Tomate. Rafard. 18/05/90. T5. Tomate. Piedade. 18/05/90. T6. Tomate. Piracicaba. 24/07/90. T7. Tomate. Piracicaba. 07/08/90. Ta. Tomate. Tiet~. 02/08/90. T9. Tomate. Tiet~. 07/08/90. T.to. Tomate. Tietê. 07/08/90. Tu. Tomate. Botucatu. 09/10/90. T.t3. Tomate. Turvolândia. 11/12/90. T.t.. Tomate. Turvolândia. 11/12/90. T.t5. Tomate. Turvolândia. 11/12/90. T.t9. Tomate. Atibaia. 11/12/90. T20. Tomate. Atibaia. 11/12/90. B1-. Batata. Águas da Prata. 16/05/90. B2. Batata. Rafard. 18/05/90. B3. Batata. Itapetininga. 06/06/90. B.. Batata. Bragança Paulista. 22/06/90. B5. Batata. Bragança Paulista. 22/06/90. B6. Batata. Monte Mor. 01/06/90. B7. Batata. Piracicaba. 01/09/90. Isolado. Conto.

(26) 15. Tabela 1. Continuação. Hospedeiro. Procedência. Data do isolamento. B8. Batata. Monte Mor. 29/08/90. Bs>. Batata. Piracicaba. 08/10/90. B10. Batata. Piracicaba. 08/10/90. Bu. Batata. Piracicaba. 08/10/90. B13. Batata. Monte Mor. 08/10/90. B14. Batata. Cap!1ro Bonito. 11/12/90. B15. Batata. Capão Bonito. 11/12/90. B16. Batata. Capão Bonito. 11/12/90. B17. Batata. Capão Bonito. 11/12/90. Isolado. Após a identificação dos isolados, de com as metodologias 3.3.. e. 3.5,. estes. foram. acordo. conservados. de acordo com o método de Castellani (FIGUEIREDO, 1967).. 3.3. Desenvolvimento diametral médio de colônias e esporu1ação de 1so1ados de Alternaria sDlani. Este ensaio foi realizado com a finalidade de se observar diferenças no desenvolvimento. das. co16nias. isolados de Alternaria sDlani do tomate (Ti, Tz, T3 e da batata (B1, 8z, 83 e 84).. T5). de e.

(27) 16. Discos de meio de. cultura. contendo. com 0,4 cm de diâmetro foram colocados no centro. micélio. de. placas. de Petri contendo BOA e incubados a temperatura de 22°C luz constante.. No quinto dia de. para. incubaç~o,. sob. estimular. \. a. as. esporulaç~o,. placas foram deixadas no escuro, manten-. do-se a temperatura de 22°C.. No dia seguinte, retornou-se à. condição inicial. A avaliação do lizada no quinto dia de. crescimento. incubaç~o,. médio. tomando-se. foi. rea-. valores. do. efetuada. no. diâmetro em dois sentidos perpendiculares. A avaliação da oitavo dia de. incubaç~o,. foi. contando-se, através. metro, o número de conidios suspens~o. esporulaç~o. que. estavam. de. hemocitô-. contidos. em. uma. formada pela adição de 10 ml de água destilada. em. cada cultura.. o. delineamento experimental para o ensaio. crescimento micelial foi inteiramente ao acaso, com 4. de. repe-. tições.. 3.4. Desenvolvimento diametral médio de colônias de isolados de Alternaria solani em diferentes temperaturas. Com a finalidade. de. verificar. se. ocorrem. temperaturas ótimas distintas atuando no desenvolvimento. de.

(28) 17 colônias de A.. solani do tomate (Tz, Ta e T5). (B1, B3 e B5), foi realizada a temperaturas de 15°C, 20°C e. e. da. batata. incubação dos isolados,. em. 25°C.. O in6culo consistiu de discos de. micélio. 0,4 cm de diâmetro, colocados no centro de placas. de. de. Petri. contendo BDA. As avaliações foram realizadas no 6° incubação, medindo-se. o. crescimento. diametral. dia. de. médio. das. colônias, em dois sentidos perpendiculares entre si. O delineamento experimental foi fatorial 3x6, com 3 repetições.. 3.5.. solani do LomaLeiro. Esporulação de isolados de A.. Para contornar a dificuldade esporulação dos isolados de A. realizados. tratamentos. solani. do. adicionais aos. com. relação. tomateiro, descritos. à. foram. no. item. 3.3. In6culos de 0,4 cm de. diâmetro. foram. cados no centro de placas de Petri contendo BDA. dos utilizados foram Ti, Tz,. Ts e T5,. sendo. Os. No sexto. escuro, mantendo-se a. dia,. as. temperatura.. placas. 22°C. permaneceram. No dia seguinte,. foi restabelecida e no nono dia de incubação. isola-. submetidos. rante um período de cinco dias a uma temperatura de luz constante.. colo-. foi. a. due no luz. realizado.

(29) 18. ferimento. no. micélio,. isto é,. adicionou-se. água. desti-. lada às colônias e com um pincel, retirou-se o micélio. Após este processo, as placas permaneceram tampa, durante um dia.. na. mas. luz,. sem. Dois dias após este tratamento,. a foi. \. realizada a avaliação, adicionando-se água destilada a estas colÔnias, obtendo-se uma suspensão de. quantifica-. esporos,. dos através de um hemocitômetro.. 3.6. Hidr61ise de amido. Para verificar se os isolados de. soJani do. ~.. tomate diferem dos isolados da batata quanto à hidrólise. de. amido, discos de meio de cultura contendo micélio de 0,4. cm. dos isolados. T~,. Tz, Ts, T4, T5, Tó,. Ta,. To,. 82, 8s, 84 e 8ó foram cultivados em meio de cultura,. seguinte. 8i. ,. Ti.O, com. a. constituição: amido solúvel 2g, extrato de levedu-. ra 5g, extrato de carne 5g,. peptona 5g, ágar 15g e água 1000. ml. No quarto dia de incubação das colÔnias, verteu-se uma solução de lugol na superficie do. meio. de. tura, para se verificar a ocorrência da hidrólise do Segundo TUITE (1969), nas reações positivas aparece um descolorido ao redor das colÔnias e nas todo o meio de cultura se torna azulado.. reações. culamido. halo. negativas,.

(30) 19. Devido. aos. resultados. quantitativos,. realizada análise estatistica com delineamento inteiramente casualizado com 3. 3.7.. Tes~e. foi. experimental. repetiç~es.. de eficiência in vitro de fungicidas para. isolados de A. solani do. toma~e. e da batata. Com a finalidade de se detectar diferenças no comportamento de isolados de A. ta,. testando-se. solani do tomate e da. bata-. fungicidas já utilizados ou em fase de ex-. perimentação (Tabela 2), os isolados T2, T3, T5, e 84 foram incubados em O, 1, 10 e 100. ~g/ml. 8~,. do. 82,. principio. ativo de cada produto.. Tabela 2. Fungicidas utilizados nos experimentos.. Concentração do ingrediente ativo. Nome técnico. Nome comercial. Formulação. Iprodione. Rovral. Pó-molhável. 501.. Polioxina. Polyoxin AL. Pó-molhável. 101.. Defenoconazole*. Score. Conc.emulsionável. 251.. Tebuconazole*. FoI icur. Conc.emulsionável. 251.. * Produtos experimentais..

(31) 20 A técnica utilizada para preparação. do. meio. de cultura com o fungicida consistiu em se dissolver quantidade adequada. do. produto. em. 100. ml. de. água. destilada. estéril. Desta suspensão estoque, foram feitas diluições. em. série, obtendo-se as concentrações desejadas, adicionando-se. 1 ml de cada suspensão em 99 ml de meio de cultura (BDA),. a. uma temperatura de 45°C a 50°C.. O in6culo utilizado consistiu de um disco meio. de. cultura. contendo. micélio,. medindo. diâmetro, obtido da periferia de colÔnia de idade,. o. incubada a 22°C.. experimento. 0,4. cinco contou. de. cm. de. dias. de. com. 3. repetições (placas) para cada tratamento. A avaliação foi realizada medindo-se sentidos. metro das colÔnias em dois. si, no 7° dia após a colocação. do. perpendiculares inóculo. nas. crescimento do fungo foi avaliado em termos em relação à. 3.8.. o. diâentre. placas.. de. O. porcentagem. testemunha.. Frequência de aparecimento de setores em isolados de A.. solan~. a partir de discos de micélio. Neste teste, Tó,. T7,. Te,. B8,. B9 ,. B10 ,. T10, B11 ,. Tu, 813,. T13, 814,. em 8DA por cinco dias e. os isolados Ti, Tz, T3,. Ti.4, B1!> ,. T 1.!>, B16. Tzo,. e. logo a seguir,. 81,. B17. 83,. foram. incubados. transferidos. forma de discos de meio de cultura com micélio. para. sob. a. placas.

(32) 21 de BOA contendo 500 pg/ml de iprodione, 500 pg/ml de. polio-. xina e a mistura de ambos nesta mesma concentração. A avaliação foi feita aos 7 e 10 tando-se o número de colÔnias.. o. discos. de. micélio. dias,. que. con-. desenvolviam. ensaio contou com 10 repetições.. 3.9. Teste de patogenicidade de isolados de. solani. ~.. em plântulas de tomate variedade Ângela e CICA 8. Os isolados Ti, Tz, Ts, B. e B6 foram cultivados a 22°C. sob. B1,. T~,. Bz,. constante. luz. até. quinto dia, quando foram transferidos para o escuro dia, restabelecendo-se a condição inicial riores.. Os isolados. de. tomateiro. nos. por. dias. sofreram. o. o um. poste-. tratamento. adicional descrito no item 3.5 para estimular a produção. de. esporos. A suspensão de conidios foi obtida com a adição de água destilada. sobre. a. colônia,. removendo-se. conidios com o auxilio de um pincel. A suspensão brada em hemocit6metro, determinando-se. a. foi. os. cali-. concentração. de. lO· conídios/ml. As plantas de tomate, mantidas em casa de vegetação, cresceram em um substrato esterilizado de uma mistura de esterco de curral, areia e na proporção de 1,5 : 1,0. constituído. solo. argiloso. 3,0 respectivamente, contidos em. copos plásticos de capacidade de 300 ml..

(33) 22 Quando as plantas. atingiram. aproximadamente pulverizaç~o. 25 dias de idade, foram inoculadas, através da dos conidios, até o inicio do escorrimento. plantas permaneceram. em. câmara úmida. Em seguida,. durante. as. quarenta. e. foi realizada quinze dias após. a. oito horas. A. avaliaç~o. inoculação, observando-se a. presença ou ausência de sintomas. do tipo lesão, na haste de cada plântula.. o. ensaio contou com 4 repetições (copos plás-. ticos) com 3 plantas em cada recipiente.. 3.10.. E~eito. da concentração de inóculo de. solani. ~. na manifestação de sintomas em hastes de tomateiro. Para se determinar diferenças entre de. ~.. isolados. solani do tomateiro e da batata, quanto à manifestação. de sintomas em hastes de tomateiro, saio, empregando os isolados. o. inóculo. T~,. foi realizado este. Tó, B3 e. obtido. foi. B~.. conforme. descrita no item 3.5 e calibrados inicialmente centraç~o. de 10. 4. 3. ,. 2. 10. metodologia a. conforam. e 10~ esporos/ml.. Estas. de. suspensões foram pulverizadas em plântulas. com. mente 25 dias de idade, em condições idênticas às no item 3.9.. uma. diluição,. esporos/ml e por meio. obtidas as concentrações de 10. en-. aproximadadescritas.

(34) 23. o. ensaio contou com 6. tadas por plantas individuais e a. repetições,. avaliação. foi. represenrealizada. determinando-se a quantidade média de lesões, de acordo. com. os tipos de sintomas presentes na haste, determinado por uma escala, cujas caracterlsticas são apresentadas na Figura 1.. Figura 1. Escala adotada para a avaliação das les5es na haste, provocadas por isolados de Alternaria solani em plantas de tomateiro, onde: 1 = lesões menores que 0,5 cm; 2 = lesões entre 0,5 e 3 cm; 3 = les5es maiores que 3 cm; -4 = lesões que envolvem a haste..

(35) 24 3.11. Efeito da idade da planta na manifestação de sintomas, em tomateiros inocudados com A. solani. Plantas de tomateiro com 50, 40, 30, 20 e dias de idade foram inoculadas com para verificar se ocorrem testados em relação à. os. isolados. diferenças. entre. Ts. 10. e. ambos,. 93,. quando. idade da planta.. As plantas foram cultivadas em vasos pacidade de 2 1, contendo substrato esterilizado sição idântica ao descrito. no. item 3.9.. Em. de. ca-. de. compo-. cada. vaso,. cultivou-se trâs plantas e cada tratamento contou. com. três. repetições (vasos). A quantidade de. in6culo. utilizada. conldios/ml e as condições de obtenção de esporos. foi e. lOs. inocu-. lação foram semelhantes às descritas no item 3.9. A avaliação foi. realizada. 15. dias. ap6s. a. inoculação, observando-se sintomas em hastes e folhas.. 3.12. Comportamento de variedades de tomateiro inoculadas com diferentes isolados de A. soJani provenientes do tomateiro. Neste ensaio, os isolados Ts, T5, Tcs, T7, Ts>, Tu., TioS, Tio5 e Tzo variedades cereja Floradade, Principe. Rubi. AG-551,. Gigante. do. foram. Roquesso. AG-590,. Santa. tomateiro. Tz,. inocu lados. nas. AG-591,. Tropic,. Clara. 1-5300,.

(36) 25 Bar~o. Vermelho AG-561, Santa Cruz Kada. AG-373,. Ângela. Gi-. gante 1-5100, Santa Adélia, Agrocica 8 e Agrocica 16, com finalidade de se detectar. as. diferenças. existentes. a. entre. isolados, assim como entre variedades. A. obtenç~o. de in6culo, plantas. foram de maneira semelhante. ao. descrito. e. no. inoculaç~o. item. 3.9.. O. in6culo utilizado foi 102 conidios/ml. O experimento. foi. delineado. como. fatorial. 10x11 inteiramente ao acaso, com 3 repetições. As avaliações foram realizadas 15 dias ap6s a inoculaç~o. de acordo com os sintomas nas hastes. A escala para. a. determinação. de. danos. na. haste foi apresentada no item 3.10.. 3.13. Caracterização sero16gica de isolados de. Alternaria 501ani. 3.13.1.. Preparo do antigeno imunizante. Os isolados 82 e T5 foram cultivados metodologia descrita no item 3.5.. Os. esporos. tais condições, foram suspensos em. soluç~o. (NaCl 8,5g; KH2P04, O,38g, KzHP04, 1,21g. obtidos. salina. em. 1. conforme sob. tamponada de. I. água. destilada) e foram lavados por filtragem (Millipore). Em seguida, metade da quantidade obtida de cada isolado foi. colocada. no. de. congelador. esporos em. um.

(37) 26. recipiente, para facilitar o processo de. maceração.. Reali-. zada esta etapa, os esporos macerados ou não, foram. conser-. vados no congelador em solução salina tamponada, em. frascos. de 5 ml.. 3.13.2. Obtenção dos antissoros. Os antígenos dos isolados Bz e T5,. macerados. e não macerados, foram injetados em quatro coelhos Nova Zelândia, com aproximadamente 2 obtenção do antissoro.. Em. kg. adjuvante. de. peso,. completo. de. da. para. hipodermal. até. A emulsão (2 ml) foi injetada. (11) e intramuscular (2),. Antes da primeira imunização,. 2. vezes. por. foi feita uma sangria. a. Freund,. adicionou-se 2,5 ml do antígeno para homogeneização, obtenção de uma emulsão.. raça. a via. semana. para. a. obtenção do soro normal, que serviu de controle. Foram realizadas 5 sangrias, espaçadas-de dias, iniciando aos 25 dias após a primeira injeção. O foi obtido a partir de sangue coagulado, que permaneceu. 10 soro sob. refrigeração por uma noite. O plasma sanguíneo foi centrifugado a rpm, durante 10 minutos e guardados. em. frascos. de. 10.000 vidros. esterilizados de 5 ml, juntamente com a adição de 0,5 ml azida de sódio a Ir. e conservados em congelador.. de.

(38) 27 3.13.3. Preparo dos antigenos para dupla. di~usão. reação. em gel de ágar. 8z,. Discos de micélio dos isolados Bcs, B7, 8i?, Tz,. T~,. ni,. em. Tcs, T?,. Ts>, TiS e TiS>. de. solani,. A.. dois isolados de A. porri, provenientes do alho e da e um isolado de A. dauci da cenoura, obtidos cultivados. de colônias de 5 dias de idade, colocados rase,. em. 10g;. da em. periferia BOA,. foram. meio liquido com a seguinte composição: sacaL-asparagina, MgS04.. 7H20,. 19;. 2g;. extrato. O,lg;. de. levedura,. ZnS04. • 7HzO,. FeCl3.6H20, 0,48 mg; MnC12.H20, 0,36 mg, em 100 destilada e. cebola. pH 5,3. (ALFENAS. período de oito dias. de. et. alii,. incubação a ±. desenvolvidos foram retirados do meio, a uma leve secagem.. 0,44. mg;. de. água. ml. 1991). 25 o C,. Ap6s os. lavados e. um. micélios submetidos. Logo a seguir, foram macerados e. zenados em congelador, em frascos de 5 ml. A. esses. dos, foi adicionado 101. de azida de s6dio. 11.,. a. 2g;. armamacera-. antes. da. armazenagem.. 3.13.4. Reação serológica dos isolados de. Alternaria solani pelo teste de dupla di~usão. em gel de ágar. Em lâminas de vidro foram colocados cinco de meio constituído de ágar DIFCO 1 9 e solução salina panada 100 ml.. ml tam-.

(39) 28 Posteriormente, gel, com o aparelho "Furagar". foram (LEITE &. feitos. orificios. no. 1975). de. OLIVEIRA,. 0,25 em de diâmetro e de distribuição hexagonal. Depois de abertos com auxílio de uma bomba de vácuo, os orifícios foram preenchidos 2 vezes com antígenos, preparados de acordo com o item anterior, e. antissoros. dos. isolados da batata ou do tomate. As lâminas permaneceram no interior das cas de Petri e para assegurar umidade, chumaços pequenos algodão embebidos em água,. foram colocados no. interior. plade das. placas mantidas a temperatura ambiente. A avaliação do. teste serol6gico foi feita. 42. e 72 horas após o preparo da reação, observando-se as bandas de precipitação formadas.. EleLroforese. 3.14.. 3.14.1. CrescimenLo dos isolados de Alternaria solani. em meio liquido. Para efetuar a extração de proteínas e analisar o perfil eletroforético dos isolados Tz, T3, T5, Tó, T14,. 81,. 82, B3, 84, Bs e. B15 de Alternaria solani,. um. T7,. iso-. lado de A. dauci e dois de A. pDrri provenientes da cebola e de alho, quido. foi realizado o cultivo destes fungos em. com. a. seguinte. composição:. sacarose,. meio. 11-. 10g;. L-.

(40) 29 asparagina,. 2g;. extrato. de. levedura,. 2g;. KH!PO~,. MgS04.7H20, O,lg; ZnS04.7H20, 0,44 mg; FeCls.6H20, MnCI2.H20, 0,36 mg em 1000 ml de água. destilada. (ALFENAS et alii, 1991).. foi. Este. meio. quantidade de 30 ml, em erlenmeyers com. 19;. 0,4e. mg;. pH. 5,3. e. distribuido capacidade. numa. de. 125. ml. O in6culo para o cultivo dos fungos neste meio consistiu de discos. de. micélio de 5 mm de diâmetro, provenientes. periferia de colônias. da. 5 dias de idade crescidas em BDA.. de. Para cada isolado foi utilizado. 5. erlenmeyers,. foram. que. incubados a uma temperatura de 25 ± 1°C durante e dias. Ap6s este periodo, o micélio contido em frasco foi retirado separadamente e. lavado. com. tilada estéril, por filtração em funil Buchner filtro (Whatmann no 1).. água e. papel. e. pesados,. obtendo-se. o. O peso seco do micélio foi obtido. cando-se vidros de penicilina a eo°c por 24 horas, os em seguida. e. certa quantidade. colocando-se de. desde. Em seguida, os micélios foram seca-. dos a temperatura ambiente fresco do micélio.. cada. nestes. peso fresco dos. peso colo-. tarando-. mesmos. vidros,. micélios,. que. uma foram. mantidos em estufa a eooe, até a obtenção de peso constante.. 3.14.2. Extração de proteinas dos isolados de Alternaria. 5Dlani~. A. dauci e. 50 mg de peso seco de isolados testados,. micélio. A. porri. de. foram triturados em almofariz,. todos em. os. banho.

(41) 30. =. de gelo, com 1 ml de tampão Tris-glicina 0,125 M, pH 101. sacarose + 300 mg a trituração,. as. de. 8,2 +. polivinilpirrolidona (PVP).. amostras foram. mantidas. 4°C. a. Após. por. período de 4 horas, sendo depois filtradas em gaze. A. um. parte. filtrada constituiu-se de extrato proteico.. 3.14.3. Determinação da concentração de proteinas nas amostras. (LOWRY. Através do método de Lowry 1951). alii,. foi estimada a concentração de proteinas nos extratos. Para realizar estas. quantificações. cessário preparar previamente vários reagentes. B~. et. consistiu de 1% de sulfato. de. cobre. o. foi. reagente. pentahidratado. água destilada, o B2 foi formado colocando-se. sód~o. 0,1 N.. A. 49 ml. de. carbo-. solução. gente C foi preparada misturando-se 0,5 ml de cada B e. em. tartarato. sódio a 21. em água destilada, o A consistiu de 2% de nato de sódio em hidróxido de. ne-. rea-. reagente. do reagente A. Assim, o método consistiu em adicionar a cada. 0,2 ml das amostras, 1 ml da solução reagente C, agitá-las e após 10 minutos adicionar 0,1 ml do reagente teau 2N (Qeel-Ind Quim. São Paulo, SP) em água destilada (1:1, v/v).. Ciocal-. previamente. diluido. As amostras foram agitadas. após 30 minutos, foi realizada a. determinação. tivas absorbâncias no comprimento de espectrofotÓmetro ultravioleta.. Folin. onda. de. e. das. respec-. 500. nm,. em. A concentração de proteinas.

(42) 31 em cada amostra, expressa em termos de soro-albumina bovina por ml. ~g. (Eq. SAB/ml). foi determinada utilizando-se curvas. de. (Sigma Chem. Co.) de. padr~o. concentrações de SAB, variando de 500 a 1700 ç~o. ~g. equivalentes. diferentes. ~g/ml,. em. fun-. de suas respectivas absorbâncias a 500 nm.. 3.14.4. Preparo do gel de poliacrilamida. Para a análise. eletroforética. testados, foi utilizado o gel de siste numa. reaç~o. de. poliacrilamida,. polimerizaç~o. metileno-bis-acrilamida (BIS) na. =. tetrametildiamina (TEMED) e na concentração de 2%.. que. BIS. em. adicionado. 0,1. 2,8 ml de persulfato. Tal mistura foi. de. colocada. outra. de. tampão ml. amônia. placas. polietileno,. separadas entre si por intermédio de um espaçador de. polie-. tileno de 2 mm de espessura, contendo incluso um pente 12 amostras.. de. imediata-. mente com o auxilio de uma seringa de 25 ml, entre 2 (19 x 19,5 cm) sendo uma de vidro e. con-. de 5%.. concentraç~o. 8,2, foi. isolados. entre a Acrilamida (AA) e. Após a dissolução de AA e do Tris-glicina 0,125 M, pH. dos. para. Após a polimerização completa do gel, o. espa-. çador foi retirado e a placa de polietileno removida,. fican-. do o gel na placa de vidro,. que foi colocado em uma cuba. de. sistema horizontal, contendo tampão Tris-glicina 0,125 M, pH 8,2,. fazendo-se uma conexão do gel com a solução, com. de filtro Whatmann no 3.. papel.

(43) 32. 3.14.5. Aplicação das amostras e corrida eletro:forética. Em cada cavidade do gel, formada pelo foi aplicado 28 pl do extrato contendo 50 pg em de SAB.. Imediatamente, foi realizada a corrida. horizontal marca Permatron, até o corante marcador sair. pente,. equivalente em. aparelho. mantendo-se a corrente em da. cavidade,. 5. passando. mA. depois. para 10 mA até o final da corrida. O corante marcador utilizado foi o azul de bromofenol a 0,251. em tris-glicina pH 8,2 mais sacarose a 101.. As corridas eletroforéticas foram a temperatura de 10°C. Para. cada. amostra. foi. realizadas repetida. a. corrida por três vezes.. 3.14.6. Coloração. Após a corrida eletroforética, os géis. foram. retirados das placas e imersos imediatamente na solução rante da esterase, que consistiu na dissolução de 50. co-. mg. de. "Fast red TR" em 100 ml de tampão fosfato 0,1 M, pH = 6,5, e a adição de 2 ml de solução 11. de a-naftil acetato em 501. de acetona.. o. gel foi deixado nesta solução. depois fixado com ácido acético a 71. (JVO modificado por BACH, 1989).. por. uma. hora. & STOTAKY,. e. 1973.

(44) 33. 3.14.7.. Preservação dos géis. Após a coloração, os géis. foram. imersos. em. solução de metanol, ácido acético e água na proporção de 50: 75:100, contendo 101. de glicerina (v/v). durante. Duas folhas de papel celofane também foram. uma. hora.. colocadas. nesta. solução por alguns minutos. Uma placa de vidro foi envolta folhas de papel celofane, deste por baixo da placa,. dobrando-se. as. por. bordas. tendo-se o cuidado de. bolhas de ar entre a placa e o papel.. a. não. tentes, envolvendo-o na placa de acordo com anterior, deixando-se secar a temperatura. deixar colocou-. outra. bolhas o. de. folha,. ar. exis-. procedimento. ambiente.. da secagem, retirou-se o gel da placa de vidro,. das. laterais. Em seguida,. se o gel sobre o celofane na placa, e, com cobriu-se o gel retirando-se todas as. uma. Depois. recortando-. se o excesso de papel celofane.. 3.14.8. Análise do perfil eletroforético. Os perfis foram analisados com mero,. base. no. posição e intensidade das bandas e fotografados.. nú-.

(45) 34. 4. RESULTADOS 4.1.. Desenvolvimento diametral médio das colônias e esporulação de isolados de A. solani. De um modo geral, pode-se dividir os isolados em 2 grupos: os do tomate que apresentaram maior desenvolvimento e os da batata, cuja condições do ensaio foi. capacidade. de. crescimento. nas. menor do que os isolados do tomate.. Mas, observa-se também que. ocorre. variabilidade. isolados do tomate e da batata, pois Tz cresceu relação aos outros isolados do tomate. entre. menos. os em. apresentou. e. maior desenvolvimento, em comparação com os outros. isolados. da batata. Os valores de crescimento entre estes dois isolados foram muito próximos, mas a diferença estatistica. ainda. persistiu neste caso (Tabela 3). Quanto à capacidade de esporulação,. observa-. se na Tabela 4 que os isolados do tomate não esporularam nas condições estabelecidas no ensaio. No entanto,. os. isolados. da batata esporularam satisfatoriamente, diferindo assim dos isolados do tomate..

(46) 35 Tabela 3. Desenvolvimento diametral médio de colônias de. ~l-. ternaria sDlani.. Isolado. Desenvolvimento diametral. T5 T. Tó T2 B. B2 B3 Bi.. *. 5.175 A 5,125 A 5,038 A 4,560 B 4,340 C 4,038 O 4,025 D 3,925 D. * Médias. tomadas aos 5 dias'de incubação (em centlmetros). Médias seguidas por letras distintas diferem entre si ao nlvel de 51. de probabilidade, pelo teste de Tukey (DMS = 0,21 e CV = 2,797.).. Tabela 4. Esporulação de isolados de Alternaria sDJani.. Isolados. Produção média de esporos*/ placa em BOA 7,1 6,2 5,3 4,9. X X X. X. lO· lO· lO· lO·. O O. O. O. * Média. de 4 repetições. Culturas com 8 dias de idade..

(47) 36. 4.2. Desenvolvimento diametral médio de colónias de isolados de. ~lternaria. solani em diferentes. temperaturas. Na Tabela 5 observa-se que houve. uma. influ-. ência da temperatura no desenvolvimento de os todos isolados. Ç~m ~ R~m~nt~. QR. t~ffiP~r-Rt~r-a~. o çrescimento também aumentou.. Com relação aos isolados,. em. todas as. peraturas foi observada a formação de 2 grupos: os do tomate que tiveram um maior crescimento e os. da. tem-. isolados batata,. com desenvolvimento menor.. Tabela 5. Desenvolvimento diametral de isolados de naria solan.i em diferentes temperaturas. Desenvolvimento diametral Isolados*. *. 15°C. 20°C. 25°C. T5. 4,08 A a. 5,71 A b. 7,23 A b. T4. 4,00 A a. 5,55 AB a. 7,43 A c. T2. 3,85 A a. 5,35 8 b. 7,28 A c. 84. 3,01 B a. 4,48 CD. 5,55 C c. 2,91 B a. 4,63 C. 2,73 B a. 4,16 D. 8i. 83. * Médias. b b b. ~lter-. 6,00 B c 5,56 C c. tomadas aos 6 dias de incubação (em centimetros). Médias seguidas pela mesma letra (maiúscula na coluna e minúscula na linha) não diferem ao nivel de 57. de probabilidade, pelo testede Tukey (DMS entre isolados = 0,34, DMS entre temperaturas = 0,27, CV = 2,80%)..

(48) 37. 4.3.. Esporulação de isolados de. ~.. sDlan~. do f-omaf-ei ro. Na Tabela 6 observa-se que a esporulação isolados de. ~.. sDlan~. provenientes do tomateiro, é. litada através da realização de ferimentos. no. dos. possibi-. micélio. das. colônias produzidas pelos isolados.. Tabela 6. Esporulação de isolados de. Alternar~a. 5Dlan~. do. tomate.. Produção média de esporos/placa em BDA* Isolados Sem ferimento. Com ferimento. T9. O. 5,15 x 10·. T5. O. 3,20 x 10·. Tt. O. 3,16 x 10·. T2. .0. 2,45 x 10·. * Média. de 4 repetições. Culturas com 12 dias de idade.. 4.4. Hidrólise de amido. Todos os isolados hidrolisaram o houve uma diferença. quantitativa,. formado no meio de cultura.. Desta. representada forma,. amido,. mas. pelo. halo. observando-se. a.

(49) 38. Tabela 7, nota-se que os isolados da batata, que formaram um halo maior, diferiram estatisticamente ao probabilidade, de todos To, que não diferiu de. B~. os. nivel. isolados do. de. tomate,. e B4, mas que também. não. 5%. exceto. de o. diferiu. dos outros isolados do tomate.. Tabela 7. Hidr6lise de amido de isolados de. Alternaria. 50-. lani.. Isolados. Halo (cm)*. B6. 1,40 A. B2. 1,26 A. B3. 1,23 A. B~. 1,01 AB. B4. 1,00 AB. To. 0,53. BC. T2. 0,50. C. T~. 0,48. C. T!>. 0,45. C. T6. 0,28. C. T3. 0,28. C. Ta. 0,26. C. TiO. 0,16. C. Ti4. 0,11. C. T?. 0,10. C. * Médias. seguidas por letras distintas diferem entre si. nlvel de 51. de probabilidade, pelo teste de Tukey (DMS 0,48; C.V.. =. 16,691.).. ao. =.

(50) 39. 4.5.. Teste de. in vitro de fungicidas, para. efici~ncia. isolados de A. 501ani do tomate e da batata. Com. relaç~o. à. eficiência dos fungicidas ipro-. dione, polioxina, defenoconazole e tebuconazole na do crescimento micelial in vitro,. foram. n~o. inibiç~o. observadas. di-. ferenças no comportamento de isolados de A. 501ani,. de. forma que distinguissem isolados. batata.. Observando-se a Tabela 8, onde. do s~o. tomate. e. da. apresentados os. tal. ED~o. e. ED90 destes produtos, nota-se que os valores foram semelhantes para todos os isolados e que apresentou. ED~o. maior em. exceto. fungicidas, relaç~o. polioxina. aos outros produtos e. o. isolado T2 que diferiu dos demais pelo menor desenvolvimento neste funcigida.. Já. maiores variaçBes. T2, B1, B3 e B4. para. os. valores. ED90. de. ocorreram. Para o fungicida iprodione, os. tiveram. menor. tiveram um desenvolvimento. desenvolvimento,. intermediário. e. T3. isolados. T5. B2. e. apresentou. maior desenvolvimento. Para polioxina, os valores de T3 e foram superiores aos valores obtidos para os dos. Para o defenoconazole, T3,. T~. do que os outros isolados e para. e B1 o. demais. T~. isola-. desenvolveram. mais. tebuconazole, os. valo-. res obtidos para todos os isolados foram semelhantes, exceto para Tz, que apresentou menor crescimento..

(51) <1 <1 <1 <1 <1 <1 <1 '-10 1-10 '-10 1-10 1-10 1-10. <1 <1 <1 <1 <1 <1 <1 <1. <1 <1 <1 <1 <1 <1 <1. Iprodione Po1ioxina Defeno- Tebucoconazole nazole. (~g/m1). 1-10 >100 10-100 1-10 10-100 1-10 1-10. 10-100 >100 >100 10-100 10-100 10-'00 10-100. Iprodione Po1ioxina. 10-100 >100 >100 >100 10-100 10-100 1Q-100. Oefenoconazo1e. EOgO dos fungicidas. '-10 10-100 10-100 10-100 10-100 10-100 10-100. Tebuconazo1e. (~g/ml). Os valores apresentados são baseados na porcentagem de crescimento em relação ã testemunha.. * Avaliação das co15nias aos 7 dias de incubação.. T2 T3 T5 81 82 B3 B4. Isolados. E050 dos fungicidas. Tabela 8 - E0 50 e E0 90 dos fungicidas testados para a inibição do crescimento micelial dos isolado s de AUe.Jtf'l{{}f).a .6 o.tani.. +:>. o.

(52) 41 4.6. Frequência de aparecimento de setores em isolados de A. solanip. a partir de discos de micélio. Analisando-se a Tabela 9, observa-se. que. os. isolados de A. solani provenientes da batata tem menor capacidade de produção de setores,. em. quando comparados com os isolados. iprodione do. e. tomate.. polioxina, Além. disso,. observa-se que o aparecimento de setores em polioxina re em maior quantidade, à medida que é aumentado. o. ocorperiodo. de incubação. 4.7. Teste de patogenicidade de isolados de A. solani em plântulas de tomate variedade Ângela e CICA B. Quando isolados de A. solani em plântulas de tomate,. é. inoculados. possivel diferenciar os isolados. provenientes da batata e do tomate, pois manifestam. são. os. primeiros. não. lesões nos caules dos tomateiros. Os sintomas. produzidos. podem ser vistos na Figura 2.. por. estes. isolados.

(53) 42. Tabela 9. Aparecimento de setores, a partir de discos de micélio em 500 pg/ml de polioxina e iprodione, separadamente e juntos.. N° de setores aos 7 dias. Isolados I Bu. Bf.7 Be Bf. Bf.4 Bi3 Bf.O Bf.CS Bp B3 Bf.5 B4 Bcs Ta Tu. Ti5 T20 T7 .Tcs T4 Tf.4 T3 Ti3 Tf.o T5 T2 Ti. I+P. aos 10 dias I. 1. 1. 2. 3. 2. 2. 1. 1. P. 1 1 2 1. 1. 2. 2 2. 2 1 3 3 3. 3 2 2. 1 3. 3. 10. 1 1 1. 1. 2 9. 4 4 1 4. 1 2 1. =. Iprodione. P. =. Polioxina. =. 3. 2. 4 4 4. 1. I. I + P. P. N° de setores. 3 1. Iprodione + Polioxina. 4 3 5. 1 5 1 2 2. 10 9 4 3. 10 10 10 10 1 8 8. I+P.

(54) 43. Figura 2. Hastes de tomateiro inoculadas com A. solani. conce-. veniente da batata (A) e do tomate (8), na tração de 10. 4.8.. Erei~o. da. 4. esporos/ml.. concen~ração. manires~ação. de. pro-. de in6culo de A. solani na. sin~omas. em. has~es. de. ~oma~eiro. Na Tabela 10, observa-se que apenas lados do tomateiro produziram sintomas em hastes.. os. iso-. Além dis-. so, ocorreram diferenças entre os isolados de tomateiro pregados,. em-. pois o T3 provocou sintomas mesma na concentração. mais baixa empregada no ensaia, enquanto que. Tó. começou. ser estatisticamente diferente das isolados da batata, nas na concentração de 10 patogênica que o Tó.. 3. esporos/ml.. Assim, o T3 foi. a. apemais.

(55) a 5,11 B a 0,00 C a 0,00 C a. 9,72 A. (x). 10 4. 2,56 B b 0,00 C a 0,00 C a. b. 4,24 c 0,41 c 0,00 a 0,00 a. (x). (x) 7,78 A. 102. 103. B. B. B. A. 0,00 B a 0,00 B a. c. 2,56 A d 0,00 B. (x). 101. na manifestação de sin-. * Medias seguidas pela mesma letra(maiusculas entre isolados e minusculas entre concentrações} não diferem ao n;vel de 5% de probabi'lidade pelo teste de Tukey (DMS = 0,58%; CV \': 4,16%). Para anãHse estat;stica, os dados foram transformados em IxtO,S.. B3. [34. T 3 T 6. Iso1 ados. Ait~~ ~otanl,. Indice de doença nas concentrações de inôculo*. Tabela 10. Efeito da concentração de inôculo de isolados de tomas em hastes de tomateiro.. .+::> .+::>.

(56) 45. 4.9. Efeito da idade da planta na manifestação de sintomas, em tomateiros inocu1ados com A.. Uma das diferenças mais marcantes inocula isolados de A. 501ani. do. tomate. quando. se. batata. em. precocidade. de. e. plantas de tomate de diferentes idades, é. a. solani. da. aparecimento de sintomas, ocasionada pelo isolado do tomate. Tal fato não é observado para o isolado. da. batata,. capaz apenas de produzir sintomas atípicos, como a de lesões na haste e necroses pardo claras nas. que. é. ausência. folhas,. sem. os característicos circulas concêntricos (Tabela 11).. 4.10.. Comportamento de variedades de tomateiro inocu1adas com diferentes isolados de A. 501ani provenientes do tomateiro. Neste ensaio, a variedade cereja rubi não apresentou sintomas nas hastes,. sendo. AG-551. considerada. sistente e não incluida nas análises estatísticas.. Com. rere-. lação às outras variedades (Tabela 12) de uma maneira geral, Roquesso AG-591. e. Floradade foram as. CICA 8 a mais suscetível.. mais. resistentes. e.

(57) + +. -fl. 10. + + +. + + + + +. + + +,. + +. +. +. +. + +. Plantas com idade (dias) 30 40 50 20. Isolado T3 10. +. +. +. +. +. +. +. +. +. +. +. +. +. +. Plantas com idade (dias) 20 30 40 50. Isolado 83. AlX~. * Folhas mais velhas: ** Lesões com círculos concêntricos pardo-escuros; *** Lesões necrõticas (+) Sintomas observados; (-) Sintomas não observados. pardo-claras.. Tombamento Lesões na haste Pontos necrõticos nas folhas Ama re 1eci mento de folhas* Secamento de folhas* Lesões tipicas nas fo 1has** Riscos superficiais na haste Lesões atípicas nas folhas***. Sintomas. ~ ~olan[.. Tabela 11. Tipos de sintomas em plântulas com diferentes idades inoculadas com isolados de. 0"1. .,f::>.

(58) 1,38 f 1 ,13 f 0,00 h. 9. 0,22. d. 0,19 d 0,13 b 0,11 b 0,66 de O,77. 9. 1,41 A. 4,24 e CDE 1,OS c COE 0,28 b DE 0,49 ab BCD 0,41 e AB C 1, 61 bc CDEO,89 f A 1 ,47 f AB 2,69 cd E 0,78 fg 9. 2,94 f 0,11 d 0,19 b 0,64 ab 0,53 de 1,69 bc 1,30 ef 0,69 DE. CO. BC. E. E. E. E. A. 0,25 F b 0,61 F ab 1 ,94 COE a 1,33 E cd 2,06 CO bcd 4,72 B bc 1 ,61 DE f 1,42 DE ef. a. 6,69 A b 2,33 C. Pro Flora- Gigante dade AG-S90. 2,28 B de ED 0,72 DE g. B. CD. DEF. C. EF. EF. F. CDE. A. Roquesso Tropic AG-591 3,28 f 1 ,50 bc 0,30 b 0,47 ab 1,11 Dcd 2,14 b 1,00 f 4,36 c 1 ,25 f 3,44 a B. DE. A. DE. C. DE. EF. F. CO. B. St. Clara I-S300 5,72 c 2,03 ab 0,47 b 0,45 ab 0,83 cde 1,30 cd 2,72 ab 4,99 abc 2,77 cd 2,64 bc CO. C. A. C. E. EF. F. F. D. A. Bar. Vermo AG-S91 4,92 d 2,02 ab 0,61 b 0,39 ab 1,16 bcd 0,89 d 1,77 cde 5,59 a 2,69 cd 2,02 cde C. B. A. CO. EF. DE. F. EF. C. A. St. Cruz Kada AG-373 4,44 de 2,OS ab 0,47 b 0,22 ab 1 ,13 bcd 0,77 d 1,47 def 2,81 e 1 ,67 ef 2,32 bcd. lia. Sta. Ade-. DE 1,74 cde B 3,03 de DE 3,77 b BC 2,28 bcd. ti. 5,94 c CD 2,S2 a G 1 ,49 a G 0,22 ab EF 1,39 abc FG 2,00. A. Gigante I-S100. ~ngela. A 8,44 a CD 2,27 a F 1 ,61 a G 0,74 ab F 1 ,61 ab DEF3,64 a EF 2,28 bc C 5,08 ab B 5,08 a DE 2,80 ab. 16. Cica. BC. B. B. E. DE. E. D. C. A. D 1 ,81 D de. c. A 4,97 d O 2,49 a E 1,78 a F 0,83 a E 1,39 abc C 1 ,08 cd D 3,27 a B 3,58 d B 3,11. Cica 8. em diferentes variedades de tomate, atraves de. *Medias seguidas pela mesma letra (maiscu1a nas colunas e minusculas nas linhas) não diferem ao nivel de 5% de probabilidade, pelo teste de Tukey (DMS entre variedades = 0,66; DMS entre isolados = 0,65; C.V.= 12,71%).. T20. T7. T9. T11. T15. T5. T13. T2. T6. T3. Isolados. Att~~ ~olani,. Indice de doença nas variedades *. Tabela 12. Patogenicidade de isolados de sintomas nas hastes.. '-..J. ..j:::o.

(59) 48 Os isolados de tomate. testados. apresentaram. também variabilidade, sendo que de um modo geral, T3,. Tp foram os mais. patog~nicos;. e o restante com. atuaç~o. T2 e. T~3. os. menos. resist~ncia l~ncia. n~o. patog~nicos. intermediária entre estes isolados.. No entanto, o comportamento das variedades. e. T7. dos. foi constante, indicando a. horizontal e vertical nos. isolados. exist~ncia. hospedeiros. e. e de. viru-. e agressividade nos patógenos.. 4.11.. Caracterização sero16gica de isolados de ~.. solani. Para diferenciação. dos. isolados. dos de batata, as melhores reações serológicas. de. tomate. foram. obti-. das com os antissoros das 2a. e 3a. sangrias de isolados. A. 501ani de batata, com esporos não macerados e respectivamente e a 5a. sangria do. isolado. macerados,. de. esporos macerados. No entanto, estes antissoros baixo titulo, demonstrando reações até a diluição relação aos antigenos,. de. tomate. com. tiveram. um. 1/2.. Com. as reações ocorreram até as diluições. 1/2 para alguns isolados e para outros até reações mais nitidas ocorreram com. Porém,. 1/8.. antissoros. e. as. antigenos. não dilui dos. As reações nas Figuras 3 e 4.. observadas. foram. esquematizadas.

(60) 49. 0. 0. ,8 17. 0. 82. 0. 08 7. OT 2. 83. 08 4. 0. T130. <V OT 9. 86. OA. O T4 OT 5 OT 7. 0. 87. O Cen. ~ 08 4. OT 19. OCeb. Figura 3. Reações serol6gicas em dupla difus~o em gel de agar, entre ant1genos de ~lternaria 501ani da batata(Bz, B3, B4, Bcs, 87 e 817), do tomate (Tz, T4, T!:s, T7, T9, TiS, T19) , ~. por ri do alho (A), cebola (Ceb) e A. dauci (Cen), com antissoro de A. 50lani da batata (B).. o '"O. T2. O. @J. T4. 0'5 0 8 17. Figura 4. Reações serol6gicas em dupla difus~o em gel de agar entre antigenos de Alternaria 50lani do tomate (Tz, T4, T5, Tcs, T7, T9 e Ti3) , da batata (83, 8cs, Bz, B4, 817 e 87), ~. porri do alho (A), cebola (Ceb) e ~. dauci (Cen), com antissoro de A. 50lani do tomate (T)..

(61) 50 Na Figura 3 observa-se que as l6gicas utilizando antissoro de. ~.. reações. solani da batata. possivel com antigenos de isolados da batata cebola, mas a diferença entre. estas. duas. seros6. foi. porri. e~.. espécies. foi. da a. isolados. formação de um esporão na linha de precipitação em de A. 501ani. Na Figura 4, utilizando-se. 501ani do tomate, todos. antigenos. os. apresentaram reações idênticas, mas os tiveram reações diversas.. de. antissoro tomate. isolados. A.. de. testados da. batata. Isolados de A. porri da cebola. e. A. dauci mostraram certos componentes antigênicos comuns com alguns isolados de A. 501ani. Assim, o antissoro que diferenciou melhor. os. isolados de A. 501ani foi o da batata.. 4.12. Eletroforese. Nas Figuras 5 e 6, observam-se os perfis eletroforéticos, envolvendo esterase, de isolados de do tomate e da batata, A. dauci e A. porri da. 501ani. ~.. cebola. e. do. alho. Para os isolados de A.. solani do tomate nota-. se a ocorrência de dois tipos diferentes de perfis. Os lados Tz, Tó, T3 e T14 apresentaram 3 bandas com Rm 0,55, 0,74 e 0,92. O isolado. Ts,. além. valores. destes. isode. valores,.

(62) 51 ap~esentou. da batata foi também. obse~vado. dife~entes. tomate.. Na. Pa~a. uma banda adicional de Rm 0,85.. dos 6. Figu~a. de 84 e 82 (que não. dois. pe~fis. tipos. pe~fis,. elet~ofo~éticos. obse~va-se. apa~ece. de. na. mas. que. fo~am. dos isolados do. que 8s, 81, 83 e. figu~a,. os isolados. 815. dife~e. ap~esenta. pe~fil. idêntico ao isolado 84). Os senta~am. pe~fis. out~os. isolados envolvidos no estudo. dife~entes. ent~e. eles e. ent~e. ap~e-. os isolados de. A. solani.. T6. T2. Figu~a. 5.. T14. T5. T7. Cen. de Alternaria solani do tomate (Tz a T7) e A. dauci, em gel de - potiac~ila mida co~ado pa~a a visualização das enzimas da es-. Pe~fis. te~ase.. elet~ofo~éticos.

(63) 52. Ceb. 84. 88. 81. 83. 815. A. Figura 6. Perfis eletroforéticos de ~lternaria porri (Ceb e em gel de poliacrilamiA) e ~. solani (B4 a B~5) da para a visualização das enzimas da esterase..