Programa de Pós-Graduação em Genética e Melhoramento de Plantas

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Programa de Pós-Graduação em Genética

e Melhoramento de Plantas

LGN 5799 - SEMINÁRIOS EM

GENÉTICA E MELHORAMENTO DE PLANTAS

MODIFICAÇÕES PÓS-TRADUCIONAIS DE PROTEÍNAS

Fernanda Salvato Dr. Carlos Alberto Labate

Departamento de Genética

Avenida Pádua Dias, 11 - Caixa Postal 83, CEP: 13400-970 - Piracicaba - São Paulo - Brasil Telefone: (0xx19) 3429-4250 / 4125 / 4126 - Fax: (0xx19) 3433-6706 - http://www.genetica.esalq.usp.br/semina.php

Definições

?

Proteômica

:

- Diz respeito ao estudo em larga escala de proteínas em sistemas

biológicos;

- Pode ser vista como uma metodologia experimental que explica

a informação contida na seqüência genômica em termos de

estrutura, função e controle de processos biológicos.

? Proteoma

:

A totalidade de proteínas existentes em uma célula,

tecido ou organismo.

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P Transcrição Alternativa

Splicing Alternativo

Tradução

1 Gene ? 1 Transcrito ? 1 Proteína

? O número de genes é muito menor que o número de proteínas em humanos (~33.000 genes vs ~200.000 a 1 milhão proteínas) ? Cada gene codifica XX proteínas diferentes

- devido à diversidade alélica, splicing alternativo e às modificações pós-traducionais de proteínas

? Há muitos casos em que a população de RNAm não está fortemente correlacionada com o perfil protéico;

Por que estudar o

Proteoma

?

Maneira direta para se

estudar expressão estudar expressão Objeto de estudo: Objeto de estudo: PROTEOMA PROTEOMA

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Determinação direta da Determinação direta da seqüência de aminoácidos seqüência de aminoácidos Seqüência traduzida Seqüência traduzida a partir do DNA a partir do DNA

X

?Freqüentemente, as proteínas são modificadas para formar a proteína maduraque difere significativamente da predita pela tradução;

- em muitos casos, a falta da modificação pós-traducional é muito importante e tem conseqüências funcionais;

?Além disso, em alguns casos, o RNAm é editado antes da tradução, criando mudanças na seqüência de aminoácidos que não são inferidas pelos genes.

Por que estudar o

Proteoma

?

Uma proteína inferida a partir da seqüência

Uma proteína inferida a partir da seqüência genômicagenômicaé um objeto é um objeto hipotético até um experimento verificar sua existência.

hipotético até um experimento verificar sua existência.

? Desde o primeiro artigo de revisão “Plant Proteome Analysis” (Canóvas et al, 2004) foram publicados 246 artigos relacionados com proteoma de plantas menos de 1% de publicações na área proteômica!! ? Cerca de 3% são artigos relacionados ao estudo de modificações

pós-traducionais de proteínas neste mesmo período (2004-2007). ? Destes, 60% representam artigos de revisão;

? Este período pode ser interpretado como avanço potencial da proteômica, refletindo mais expectativas do que realizações;

? Período de adequações de técnicas e estratégias de análise.

Pesquisa no

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Modificações

Pós

-

Traducionais

O que são?

?

Definição Geral: qualquer modificação na forma traduzida das

proteínas.

?

Adições covalentes que regulam a função da proteína,

determinando o estado de atividade, a localização celular e a

dinâmica de interações com outras proteínas.

Por que alterar as proteínas depois de traduzidas ao invés

de utilizar

-

se do controle

transcricional

???

É mais fácil:

A partir de um “esqueleto protéico”

•Criar um espectro de proteínas ligeiramente diferentes;

•Mudar totalmente as propriedades dessas proteínas

Ao invés de construir cada proteína correndo o risco de não ser utilizada num dado momento.

Modificações

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Características Gerais

?

São conhecidas mais de 200 tipos;

?

Estão presentes em pelo menos 80% das proteínas eucariotas;

?

Foram encontradas em todas as espécies;

?

Estão localizadas em seqüências específicas;

?

Algumas são transientes;

?

Presentes sob baixa estequiometria;

?

Geralmente agem em conjunto.

Modificações

Pós

-

Traducionais

Modificações

Pós

-

Traducionais

Características Gerais

?

Quase todas as proteínas são modificadas durante a síntese ou

após a síntese de proteínas;

?

Estas modificações podem ser químicas ou por meio de clivagem;

?

Toda proteína pode potencialmente ser modificada de diferentes

maneiras;

?

As modificações não podem ser preditas através da seqüência,

somente os possíveis locais de sua ocorrência.

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Modificações

Adição de grupos funcionais

- sulfato, acetato, metil, fosfato

Cadeias de carboidratos e/ou lipídios

Modificações

Pós

-

Traducionais

?Estas mudanças químicas podem alterar a hidrofobicidade de uma proteína e assim determinar a localização celular;

?Outras modificações, como a fosforilação, são parte de um sistema de controle do comportamento protéico (por exemplo, ativando ou inativando uma enzima).

Cacatas de fosforilação envolvidas na sinalização

celular

Várias modificações regulam a

função de microtúbulos podem se ligar à membrana Proteínas de membrana através de âncoras GPI

Poliubiquitinação induz à degradação protéica Proteínas carregam O-glicanos Histonas controlam muitos processos nucleares Proteínas de Membrana com N-glicanos (Jensen, 2006)

Modificações

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A B C

Mecanismo

Mecanismo FunçãoFunção

Processamento proteolítico e mudança comformacional Ativação Proteólise dependente-MPT Degradação Reconhecimento dependente-MPT Ativação, interação, localização e secreção Múltipla-MPTs Regulação dinâmica ou modulação de atividade protéica, interação prot-prot e interação DNA-prot Função protéica Função protéica dependente dependente--MPTMPT MPT MPT

Mecanismo de Ação das

MPTs

(Jensen, 2006)

Modificações

Pós

-

Traducionais

Estabilidade protéica, estrutura tridimensional Pontes de dissulfeto Atividade protéica Sulfatação Sinal de degradação Ubiquitinação Estabilidade protéica Hidroxiprolina

Reversível, interações célula-célula, proteínas secretadas, funções regulatórias Glicosilação

Regulação da expressão gênica, estabilidade protéica

Metilação

Reversível, estabilidade, regulação das interações DNA-proteína (histonas) Acetilação

Reversível, regulação da atividade protéica, sinalização

Fosforilação

Função Tipo

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Modificações

Pós

-

Traducionais

Funções Biológicas

?Regulação da atividade de proteínas e de suas funções;

?Aumenta significativamente a diversidade e a complexidade do proteoma; ?Essenciais na transdução de sinais desde a membrana plasmática até o núcleo em resposta a estímulos externos;

?Ativação e inativação de enzimas;

?Modulação de interações moleculares proteína-proteína; ?Reconhecimento de DNA;

?Estabilidade protéica;

?Controle da transcrição gênica (fatores de transcrição); ?Desbalanços de modificações estão associadas a doenças;

Modificações Pós-Traducionais mais estudadas

?

Fosforilação

- adição e remoção de grupos fosfatos

?

Glicosilação

- adição de uma cadeia curta de carboidratos

(oligossacarídeos ou glucanos)

?

Ubiquitinação

- adição de ubiquitina

(tag para localização e degradação)

Modificações

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ANÁLISE DE MODIFICAÇÕES

PÓS-TRADUCIONAIS

•Enriquecimento de amostras complexas

•Identificação de MPTs

Análise de Modificações

Pós

-

Traducionais

?É recente o início do estudo de MPTs em uma escala proteômica; ?Muitas das modificações estudadas hoje foram descobertas ao acaso estudando-se somente uma proteína em particular;

Combinações de diferentes modificações Amostra complexa! Heterogênea! Difícil caracterização e quantificação das modificações

?Premissa básica: as modificações resultam em perda ou incremento de massa relativa no peptídeo.

?Logo, a detecção deste incremento/perda de massa pode ser feita por

espectrometria de massas

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Os métodos se baseiam: ?Em separação de proteínas;

?Análise comparativa de amostras antes e depois da remoção de modificações;

?Técnicas específicas de coloração para modificações pós-traducionais particulares.

Métodos:

Análise de Modificações

Pós

-

Traducionais

?Método ideal: Espectrometria de Massas

- Modificações pós-traducionais causam mudança na massa predita; - Ideal para adições e substituições, mas a proteína deve ser isolada. ?Anticorpos específicos para tipos de modificações

?Coloração de Gel específica

Análise de Modificações

Pós

-

Traducionais

?A complexidade das amostras com MPTs ?Características físico-químicas (MPTs lábeis) ?Tamanho de peptídeos com MPTs

?Baixa concentração de MPTs

Diminuem a eficiência/acurácia de detecção por MS

?Para análise em “escala proteômica” é necessário : - enriquecimento de amostras com MPTs

- utilização de MS em combinação com outras técnicas (géis 2D)

Só é possível detectar MPTs quando em abundância Grande quantidade de amostra é necessária

Aumenta Sensibilidade !!!

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TÉCNICAS DE ENRIQUECIMENTO

DA AMOSTRA

•IMAC

•Imunoprecipitação

•Tags

Enriquecimento da amostra

?

Objetivo é aumentar a abundância relativa de uma classe de

modificação pós-traducional de polipeptídeos de uma amostra;

?

É aplicada ao nível protéico ou peptídico.

Técnicas:

?

Colunas de afinidade (IMAC, colunas de lectina)

?

Anticorpos imunoprecipitação

?

Tags (biotina)

Enriquecimento de Amostras

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Técnicas de Enriquecimento

IMAC (Immobilized Metal-Affinity Chromatography)

?Técnica de CromatografiaCromatografiade de AfinidadeAfinidadeutlizando metal imobilizado (fase estacionária);

?Muito utilizado para isolar fosfopeptídeos a partir de uma amostra protéica digerida antes da análise por espectrometria de massas;

?Íons metálicos imobilizados carregados positivamente (FeIII) atraem grupos fosfato negativos;

?Surgiu com o estudo de fosfoproteínas de células de leveduras (Ficaro et al, 2002);

?Outros exemplos:

•purificação de fosfotirosinas de proteínas humanas (Salomon et al,2003)

• isolamento de proteínas de membranas em plantas (Nühse et al, 2003) Digestão Adesão à coluna Eluição Peptídeos fosforilados Peptídeos não fosforilados Fração não aderida Amostra complexa de proteínas Análise MS

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0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Tempo (min) Abundância Relativa 29.16 61.97 50.60 39.27 74.59 36.65 27.90

Antes do enriquecimento

Depois do enriquecimento

K.FQS*EEQQQTEDELQDK.I

50.50 28.83 22.35 33.70 62.87 42.56 _57.13 20.17 41.08

Cromatrografia de Afinidade por lectina

?Utilizada para enriquecimento de amostras com glicoproteínas e glicopeptídeos;

?Lectinas são carboidratos que se ligam às proteínas; ?Reconhecem estruturas específicas de carboidratos;

?Este método revelou 400 locais de N-glicosilação em 250 proteínas de

Caenorhabditis elegans.

Introdução de Tags de Afinidade

?Através de reações químicas incorpora-se uma tag molecular na proteína que pode subseqüentemente ser purificada;

?Converte MPTs de aminoácidos em espécies facilmente detectáveis por MS, ou seja, aumenta a habilidade de detecção de MPTs;

Técnicas de Enriquecimento

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?Biotina: é uma glicoproteína muito utilizada como tag molecular; ?Moléculas biotiniladas podem ser imobilizadas através da interação com proteínas (avidin) que se ligam à biotina.

?Avidin: proteína que possui forte interação com a biotina

+

Avidin beads Biotina-proteína

Afinidade Avidin-Biotina outras proteínas Purificação biotina Proteína com MPT

de Biotina

Proteína eluída/purificada Digestão Mistura de Peptídeos Análise MS/MS

Imunoprecipitação

Anticorpo contra proteína de interesse Anticorpo se liga às proteínas de interesse Adiciona-se proteína A tornando o complexo insolúvel Centrifugação

?Extensivamente utilizado na purificação de fosfoproteínas intactas; ?Desvantagem: ligação fraca proteína-anticorpo.

Técnicas de Enriquecimento

Descarte ! Outras proteínas Proteínas com a modificação de interesse

IDENTIFICAÇÃO E MAPEAMENTO

DE MPTs

•Espectrometria de Massas (ESI-Q-TOF)

•Gel 2D

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Espectrometria de Massas

?É o método ideal para análise de modificações pós-traducionais; ?O espectrômetro de massa determina a razão massa/carga do peptídeo ou proteína ionizadas;

?O erro de massa é freqüentemente inferior a 10 ppm (depende da máquina)

- Exemplo: 0,02 Da por peptídeo de 2000 Da

?A presença ou ausência de modificações pós-traducionais causam diferenças na massa do peptídeo.

?Em princípio, qualquer MPT pode ser detectada pela espectrometria de massa.

?O espectrômetro funciona como uma balança analítica; ?Mede a massa dos resíduos de aminoácidos;

?Cada aminoácido tem sua massa previamente definida;

Espectrometria de Massas

Massa (Da) Aminoácido 113.1594 Isoleucina (I) 137.1411 Histidina (H) 57.0519 Glicina (G) 128.1307 Glutamina (Q) 129.1155 Ácido Glutâmico (E)

103.1388 Cisteina (C) 115.0886 Ácido Aspártico (D) 114.1038 Asparagina (N) 156.1875 Arginina (R) 71.0788 Alanina (A) Massa (Da) Aminoácido 99.1326 Valina (V) 163.1760 Tirosina (Y) 186.2132 Triptofano (W) 101.1051 Treonina (T) 87.0782 Serina (S) 97.1167 Prolina (P) 147.1766 Phenylalanina (F) 131.1926 Metionina (M) 128.1741 Lisina (K) 113.1594 Leucina (L)

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-2 Ligações Disulfíticas 238 Acilação 14 Metilação 16 Hidroxilação 1 Deaminação 42 Acetilação > 1.000 Ubiquitinação > 800 Glicosilação 80 Fosforilação ? Massa, Da MPT

Espectrometria de Massas

?Exemplos de mudanças de massas devido às modificações

Espectrometria de Massas

Como funciona?

?Existem diversos modelos que diferem quanto à fonte de ionização, quanto ao analisador de massas diferentes propósitos.

?Componentes: Ionizador •MALDI •Electrospray (ESI) Amostra + _ Analisador de Massa •Tempo de vôo (TOF) •Quadrupolo •Ion-Trap

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Gás nebulizador N2

Temp 20-350ºC

Espectrometria de Massas

Como funciona ??

Modelo

:

ESI-Quadrupolo-TOF

•Fonte de ionização: Electrospray (ESI)

Análise massa + 6.000 V Eletrodo

Espectrometria de Massas

Detector Quadrupolo Amostra Voltagens Íon ressonante

Íon não ressonante

?Analisador de Massa ou Filtro de Massa ou Separador de Massa

• O Analisador Quadrupolaré o mais comum atualmente. •Mudando-se o potencial elétrico aplicado, seleciona-se diferentes massas.

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Espectrometria de Massas

?Tempo de Vôo (TOF): é um analisador de massa.

+ +

+

+ +

+

+ ₊

Íons - amostra Detector

Distância fixa Mais leve Mais pesado

Espectrometria de Massas

?Espectrometria em Tandem – MS/MS -São filtros de massa concetados em série.

-Ideal para moléculas grandes e amostras complexas (mais sensíveis).

Detecção Amostra Ionização Separação

m/z Fragmentos Separação m/z ESI MALDI Célula de Colisão -+ + + + + + MS 1 Íon precursor MS 2 produto do íon Detector Gás Ar

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Espectrometria de Massas

Análise de MPTs Levar em consideração o déficit de massa! •?m= 80 Da Protease Protease Proteína Modificada Proteína não modificada Peptídeos Peptídeos Corresponde à adição de um HPO₃

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Espectrometria de Massas

?Nos fornece picos m/z característicos durante a MS/MS;

?Espectrômetros MS/MS podem ser programados para detectar somente os peptídeos que geram sinais específicos de MPTs;

?Exemplo: peptídeos contendo resíduos Lisina acetilada geram um sinal de íon fragmentado com m/z de 126,1.

MPTs – mistura proteínas Digestão proteolítica HPLC Íons peptídeos spray Espectro MS/MS

Espectrometria de Massas

LC-MS total Anotação da MPT no peptídeo

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Gel 2 Dimensões

?Separação dos diferentes estados de modificações das proteínas; ?Em seguida, os spots são excisados e identificados por MS;

?Técnicas se baseiam na utilização de corantes e anticorpos específicos, marcações com P-32; Incorporação de P-32 (Bikova et al, 2003) IEF Massa Molecular ( KDa ) SDS -PAGE Comassie Phospho-imagem

Visualização por autorradiografia das proteínas fosforiladas

Gel 2 Dimensões

?Análise utilizando anticorpo para fosfotirosina:

(Kim et al., 2002)

Coloração de Prata Coloração imunofosforilação

MAP Kinases

GAPDH

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Gel 2 Dimensões

?Corantes fluorescentes específicos Análise Multiplex

(Invitrogen)

Células Normais de Fígado Células de Tumor de Fígado

Estratégia Geral de Análise de

MPTs

Célula

Preparação da Amostra

•Extração Proteínas

•Enriquecimento da amostra com proteínas modificadas •Digestão proteolítica •Enriquecimento da amostra com peptídeos modificados Peptídeos modificados Ionização Fase gasosa Peptídeos ionizados Aquisição MS Análise computacional Anotação de MPTs Validação da anotação Réplica Função da MPT Continuação experimentos

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Cuidados Gerais na Análise de

MPTs

?A quantidade de amostra deve ser suficiente;

- as MPTs encontram-se sob baixa concentração. - spots devem ser concentrados.

?Remoção de contaminantes e concentração da amostra através da purificação com microcolunas antes da MS;

?Deve haver uma boa cobertura de seqüência peptídica;

- requer análise do peptídeo específico que contém a modificação. - a cobertura de seqüência pode ser melhorada pela divisão da amostra em frações antes da análise MS

- outra técnica utilizada para a melhora da cobertura de seqüência é a utilização de duas enzimas diferentes para digestão das proteínas.

Cuidados Gerais na Análise de

MPTs

?Um spot pode conter uma proteína com a mesma modificação em locais específicos diferentes;

- Ex: em um mesmo spot tenho proteína fosforilada em Ser e Tyr Um spot pode conter também proteínas modificadas e não modificadas;

- a utilização de faixas de pI menores (melhor resolução) ajudará a identificar/separar proteínas modificadas das não modificadas.

?Algumas modificações possuem ligações lábeis, ocorrendo perda destas MPTs durante o processo o preparo da amostra e ionização;

- devemos encontrar condições que mantenham estas ligações (muito difícil!!!)

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SIMPLICIDADE

SELETIVIDADE

SENSIBILIDADE

Experimentos baseados em:

Bancos de

MPTs

?As diferentes MPTs ocorrem em seqüências específicas;

?A presença de uma seqüência específica não significa que a mesma se encontra modificada;

?A presença de modificações em seqüências particulares pode ser útil na predição da função e localização de proteínas;

?O RESID DatabaseRESID Databaseé um banco público que possui documentado mais de 320 modificações pós-traducionais;

?Possui uma coleção de anotações e estruturas de modificações pós-traducionais incluindo modificações na extremidade amino-terminal, carboxi-terminal e nas cadeias peptídicas;

?Possui informações cruzadas com o SWISS-PROT e TrEMBL (bancos de seqüências de proteínas);

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•EXPASYEXPASY(Ferramentas proteômicas)

•Predição de locais onde podem ocorrer modificações pós-traducionais; •É importante associar a predição com a detecção experimental!

Exemplos de Ferramentas:

•TermiNator– Predição de modificações N-terminais •Sulfinator- Predição de sulfatação de tirosina

•NetPhos– Predição de fosforilação de Ser, Thr e Tyr em proteínas eucarióticas •MITOPROT– Predição de seqüências-sinais mitocondriais

•NetNGlyc– Predição de N-glicosilação em proteínas humanas

Predição de

MPTs

http://ca.expasy.org/

Conclusões

?As MPTs são extremamente importantes para o funcionamento de sistemas biológicos;

?O grande interesse em entender a diversidade de proteínas e a regulação de processos têm levado ao estudo de MPTs;

? Existem numerosas técnicas que estão sendo desenvolvidas rapidamente e aplicadas ao estudo de MPTs;

?Instrumentos extremamente rápidos e precisos (espectrômetros de massa); ? O estudo de MPTs contribui para o entendimento:

- etiologia de doenças (diagnóstico, novas drogas); - respostas a estresses;

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