Determinação de polimorfismo nos genes mitocondriais 16S rRNA em Melipona quadrifasciata LEP por SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism)

UNIVERSIDADE FEDERAL DE UBERLÃNDIA CENTRO_{DE CIENCIAS BIOMÉDICAS}

CURSO_{DE CIENCIAS BIOLÓGICAS}

DETERMINAÇÃO DE POLIMORFISMO NOS _{GENES MITOCONDRIAIS} 163 rRNA EM

_Melipona

_{quadrifasciata}

_{LEP POR}

SSCP

(SINGLE STRAND CONFORMATION POLYMORPHISM)

Cristina Rodrigues de

Lima

Monografia

_{apresentada à Coordenação}

do Curso de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Uberlândia

_para

obtenção

_{do grau}

_de

_{Bacharel em}

Ciências _Biológicas.

Uberlândia—MG

UNIVERSIDADE FEDERAL DE UBERLANDIA CENTRO_{DE CIENCIAS BIOMÉDICAS}

CURSO_{DE CIENCIAS BIOLÓGICAS}

DETERMINAÇÃO DE POLIMORFISMO _{NOS GENES MITOCONDRIAIS} 163 rRNA EM

_{Melipona quadrifasciata}

_{LEP POR}

SSCP

_{(SINGLE STRAND}

CONFORMATION POLYMORPHISM)

Cristina Rodrigues de Lima Prof. Dr. _{Warwick Estevam Kerr}

Monografia

_{apresentada à Coordenação}

do Curso de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Uberlândia para

obtenção

_{do grau de Bacharel em}

Ciências _Biológicas.

Uberlândia— MG

UNIVERSIDADE FEDERAL DE UBERLÃNDIA CENTRO_{DE CIENCIAS BIOMÉDICAS}

CURSO _{DE CIÉNCIAS BIOLÓGICAS}

DETERMINAÇÃO DE POLIMORFISMO NOS_{rRNA GENES MITOCONDRIAIS}

₁₆₈

EM

_Melipona

_{quadrifasciata}

_{LEP POR}

_SSCP

(SINGLE STRAND CONFORMATION POLYMORPHISM)

Cristina Rodrigues

de

Lima

APROVADA PELA BANCAEXAMINADORA EM "

_{/;'_:/_N0TA}

_I'm

/

_{“XXI/((_LLI}

!'/./

;

/

Prof. Dr. WanIviCk

_Estevam

_Kerr MSC.

_{Soraya Matos de Vasconcelos}

»»

, . .

. .ªo. MSC. MaunCIo MachaIm

Franco

Não

acrediteis

_{em coisa}

_alguma

Pelo

_fato

_{de vos}

_mostrarem

_o

_testemunho

escrito

de

_{algum sábio antigo;}

Não

acrediteis

_{em coisa}

_alguma

com base na

autoridade

de

_mestre

_e

sacerdotes.

Aquilo,

_{porém, que}

se

_enquadrar

_{na vossa}

razão

e

depois

de

minucioso

estudo

for

conârmado

_pela

_{vossa experiência}

conduzindo

_ao

_vosso

_próprio

bem

_e

_ao

de

todas

as

outras

coisas vivas

a

isso

acreditais como verdade;

Por

isso,

_pautai

_{vossa conduta.}

SAKYA

MUNI

RESUMO

A

_espécie

_{Mel/pone quadrifasciata}

_se

_{encontra distribuida ao}

longo de toda a

costa

brasileira da Paraíba

_até

_o Rio _{Grande do Sul}

_{apresentando duas}

subespécies,

Melipona _{quadrifasciata quadrifasciata Lepeletier. e Me/ipona} quadrifasciata anthidioides Lepeletier.. A _{identificação de mutações SSCP}

Single» _{Strand Conformation Polymorphism (SSCP) desenvolvida como uma}

forma de

_detectar

_uma

_sequência

_que

_tenha

_{sofrido mutação tem}

apresentado

um

_grande

_{potencial para}

_estudos

_{filogenéticos}

_e

_evolutivos

especialmente

quando utilizada _com mtDNA. A _{variação inter—regional}

_{nas taxas}

evolucionárias do mtDNA

é

particularmente útil _{pois facilita a}

_escolha

_de

_genes

apropriados para

estudos

de biogeografiaou filogenia. _{Amostras de indivíduos} de colônias diferentes de Me/ipona _{quadrifasciata anthidioides Lep.} provenientes do

_estado

_{de São Paulo, Sul de Minas}

_{e amostras}

_de

Melipona quadrifasciata quadrifasciata Lep. _{provenientes do}

_Paraná

_foram

_analisadas

para

o

_gene

mitocondrial _{168 rRNApor SSCP.}

_{Para a}

_população

_analisada

_de Me/ipona _{quadrifasciata anthidioides Lep. não foi}

_encontrada

_{divergência entre}

as amostras analisadas,

mas em Mel/"pone _{quadrifasciata quadrifasciata Lep.}

ocorreram 3 _{haplótipos. Tais resultados demonstram que}

_{estas abelhas}

apresentam

_{uma maior variabilidade genética por encontrarem—se em um}

ecossistema

_{mais preservado que propicia}

_{a conservação}

_{de um maior número}

de colônias ou ainda erro

_nas

_{informações}

_sobre

_{a procedência}

_das

_colônias coletadas, que pode levar a um falso resultado

_e

_que

_{deverá ser}

posteriormente verificado. _{Os híbridos}

_amostrados

_{em Pedreira—SP}

apresentaram

o _{mesmo padrão de}

_bandas

_{de Melipona quadrifasciata} anthidioides o _{que pode}

_ser

_{explicado com}

_base

_{no fato de que na maioria} animais, a progênie

_apresenta

_{mitocôndrias}

_somente

_{dotipo materno.}

Figura 1 Figura2 Figura3 Figura4 LISTADE FIGURAS

Representação

esquemática — SSCP ...

Mel/pone _{quadrifasciata anthidioides visitandoflor}

...

Padrão

_{de variabilidade gerado por “primerª“}

_{correspondente}

_{a região}

de

534 pb do

_gene

mitocondrial _{168 rRNA em gel PAGE 14%.} Amostras

_{correspondentes}

_{ao município de} Curitiba-PR...

Padrão de

_{variabilidade gerado por "primer"}

_{correspondente a}

_região

de 534 pb do

_gene

mitocondrial _{168 rRNAem Gel acrilamida 14%.1e2} Pedreira SP., 3, 7,10, 11, 12 ,13, 14, 15, 16 _{Itamonte MG., 9 Jacutinga} MG. * _{Híbridos amostra 1} e 2_... 05 07 14 15

LISTADE TABELAS

Tabela1

_{Localização geográfica dos pontos de coleta de}

_{amostras de}

Mel/"pone _{quadrifasciata quadrifasciata ... 08}

Tabela 2 _{Localização geográfica dos pontos de coleta de}

_amostras

_de Mel/pone _{quadrifasciata anthídioides... 08} Tabela 3 _{Localização geográfica dos pontos}

_de

_coleta

_de

_{amostras de}

3.2.3.2 SSCP

_{(Single Strand Conformation Polymorphism)}

3.2.3.3 GEL DE _{POLIACRILAMIDA 49:1} 4 _RESULTADOSE _DISCUSSÃO 5 _CONCLUSÓES 11 13 16 e REFERÉNCIAS_{BIBLIOGRÁFICAS} 17

1_{.INTRODUÇÃO}

1.1.

_{Os meliponíneos:}

Os meliponíneos

_são

_{conhecidos popularmente como}

_abelhas

_{indígenas sem} ferrão,

são

_{parte integrante do}

_ecossistema

_{da região em}

_que

_vivem,

responsáveis

por realizarem

de

40

_a

_{90% de polinização}

_de

_{árvores nativas e,}

_{consequentemente}

pela produção de frutos (KERR

et

_{al., 1996). Por isso}

_torna-se

_{importante o}

_estudo

da

biologia

_{destas abelhas, seu}

_{correto manejo}

_{e sua}

_{reprodução controlada} As

_abelhas

_{nativas pertencem}

_à

_{superfamília Apoidea, familia}

Apidae

e

subfamília Meliponinae,

esta

última dividida _em

_duas

_{tribos: Meliponini}

_e

_Trigonini (KERR

_et

_{al., 1996). Na familia Meliponinae}

_se

_{encontram mais}

_de

300

_espécies,

dentre elas a

Melipona _{quadrífascíata} (KERR

et

_{al., 1996).}

1.2. A

ESPÉCIE

_Melipona

_{quadrifasciata:}

A _{Melipona quadnfascíata Lepeletier}

_{é encontrada}

em muitas

_regiões

do Brasil

e

se

destaca

no

gênero

Melipona _{pela intensa atividade}

_{das abelhas}

_campeiras, mesmo em

temperaturas

baixas

_e

_{horários matutinos quando outras}

_espécies

_não forrageiam (IMPERATRIZ-FONSECA & _{KLEINERT-GIOVANNINI, 1983}

_apud

AIDAR, _1996).

.

Melipona _{quadrífascíata anthidioides}

Ocorre

_ao

_norte

_{e nordeste de São}

_{Paulo, Minas Gerais, Rio}

de Janeiro indo em direção

_{ao nordeste}

_{do Brasil .} É _uma

_{subespécie de}

_{regiões quentes.}

(KERR, 1951), (MELO&_CAMPOS,

_1987apud

_{AIDAR, 1996).}

.

Melipona _{quadrífasciata quadrifasciata}

Ocorre no sul

de São

_{Paulo seguindo}

_para

_{o sul do Brasil, em}

regiões

mais

altas e

frias,

_ao

sul

de

_{Minas Gerais ocorre em alturas acima}

_de

_1.500

m; na

Serra

de

_{Bocaina, Serra do Mar, Litoral Norte}

_{de São}

_Paulo

e

em

_{alturas superiores a}

1600m (KERR, 1951e _{MOURE, 1975}

_apud

_{AIDAR, 1996).}

A

_subespécie

_Melipona

quadn'fasciata quadn'fasciata difere morfologicamente da Melipona

_{quadnfasciata}

_{anthidioides, pela primeira possuir}

bandas amarelas

inteiras nos tergitos 3

_a

6

_{(às vezes a banda}

_{do tergito 3 possui}

um

_espaço

separando-a) e

na

_segunda,

_as

_{mesmas bandas}

_da

_subespécie

Melipona quadrifasciata quadrifasciata

_possuem

_{uma interrupção mediana nos tergitos 4 a}

6 (KERR, 1951).

Segundo

FUTUYMA _{(1992) uma explicação possível}

_{das causas}

da distribuição geográfica

de

um táxon

_{é a de que}

_{o grupo deve}

_{sua presença}

_na

_área

atual

_a

_uma

_{dispersão a}

_{partir da região na qual}

_a

linhagem evoluiu originalmente.A

evolução

das

novas

espécies

_{ocorre juntamente com}

_a

_evolução

_das

_barreiras

para

o fluxo _gênico. As

_{vezes é}

difícil _avaliar

_{se a}

_{variação que ocorre entre indivíduos de}

uma

_mesma

localidade

_{representa apenas}

_uma

_espécie

com variabilidade ou mais que uma simples

_espécie.

1.3. HÍBRIDOS

Na _região

_{de São}

_Paulo

_e

_{Minas Gerais há uma}

zona de

hibridação onde

_{são encontrados}

_{vários híbridos com diferentes}

padrões

na distribuição

das

bandas amarelas

_{dos tergitos abdominais (MOURE &}

KERR, 1950; KERR, 1951; MOURE, 1975). _{Atualmente devido a}

_{desmatamentos e a grande}

número

_{de abelhas, a}

_{região da}

_{zona de}

_{hibridação pode ter}

_desaparecido

_ou encontrar—se muito _{reduzida. Entretanto relatos de meliponicultores}

_que

_adquirem colônias

de

localidades diferentes

_e

_{colocando em contato}

_{as duas subespécies}

acabam

_{por produzir hibrido como relatado por}MOURE E KERR _em 1950.

1.4

DNA MITOCONDRIAL

Na

_{década passada, análises}

_do DNA _{mitocondrial (mtDNA)}

_{estabeleceram-se}

como uma ferramenta

_poderosa

_para

_estudos

_{evolucionários em animais (MORITZ}

et

al., 1987).

Esses estudos

têm sido

usados

_{para evidenciar informações}

_sobre

estrutura

de

populações, fluxo _{gênico, hibridação, biogeografia}

_{e relações}

filogenéticas (AVISE, 1986; WILSON

et

_{al., 1985).}

O mtDNA

_{reúne características}

_ideais

_{para análises}

_{filogenéticas pois}

_é

_uma molécula distinta

_e

_{bem distribuida permitindo}

_{comparações}

_{entre uma}

_grande

variedade

_{de organismos. Possui uma}

_estrutura

_{genética simples sem modelos}

complexos de DNA repetitivo, elementos

de

transposição,

_{pseudogenes e}

introns exibindoum modo de

transmissão

_{genética direta, sem}

_{recombinações}

_{ou rearranjos}

(AVISE

et

_{al., 1987). Inicialmente, o mtDNAanimal foi considerado não}

_somente

_um "exemplo

de

_{extrema economia genética" (ATTARDI, 1985) mas um paradigma}

_de

estabilidade estrutural.

_{Essa percepção}

foi

_baseada

_na

_{descoberta de grande}

similaridade

entre

o mtDNA

de

quatro

vertebrados

(humanos, ratos, bovinos

_e

répteis) tanto no tamanho (16.5

a

17.6 Kb) _{como na ordem invariante}

_{dos genes.}

Uma

_pequena

_{variação existe entre}

_vertebrados

_restrita

_a

_{região D—Loop (CLAYTON,} 1984). Mais _{recentemente,}

_essa

_visão

_de

_{uniformidade estrutural tem sido}

_desafiada

por

estudos

de mtDNA_{em animais adicionais}

_{especialmente}

_{invertebrados.}

A molécula

de

mtDNA_{em primatas}

_apresenta

_{como característica uma taxa}

_de

evolução da

sequência

de nucleotídeos

_cerca

de

_{dez vezes}

_{mais rápida que}

_a

descoberta subsequentemente estendida a

outros mamíferos (MIYATA

et

al., 1982

apud

MORITZ

_et

al., 1987).

A

_exposição

_do DNA

_{e danos}

_oxidativos,

_{a pequena}

_{fidelidade do sistema}

_de

reparo ou

até

mesmo

sua

deficiência ou

_{ausência, a perda}

_{relativa do mecanismo de} recombinação

_que

podem eliminar

_{mutações deletérias e}

_altas

_{taxas de}

_{turnover do} mtDNA

_são

_algumas

_possiveis

_{explicações para}

_sua

_{alta taxa evolutiva (GRAY,} 1989).

1.5-

A TÉCNICA DE

sscp

_(Single

_Strand

_Conformation

Polymorphism)

A _técnica

_de

_{Single—Strand Conformation Polymorphism (SSCP)}

_detecta

_com

grande

sensibilidade

_{sequências que}

_{tenham sofrido mutação por diferenças}

_de

mobilidade eletroforética em fita _{única de ácido nucléico em PAGE (ORlTA}

_et

_al., 1989) (Fig.1).

_{Comparações}

_entre

_{as subespécies}

_podem

_ser

_informativas

_para

estudos

populacionais. A _{análise de fragmentos}

_de

_um

_gene

_{mitocondrial, altamente}

conservado, permite

acesso a

uma

parte

da história evolutiva da

_{espécie. Esse}

procedimento tem sido

usado

por, HOSHINO

et

al., 1992

_e

BANNAl,

et

al., 1994

para

tipificar alelos. A _formamida

_age

_como

_{agente desnaturante}

_{tornando instáveis}

as

pontes de

hidrogênio entre timina

_e

adenina.

Procedimento diferente de formação de fita única

de

DNAfoi _{desenvolvido por} (MARUYA

e

_{YOKOHAMA, 1996)}

_uando

_uma

_solução

_{US (10%}

_{de sacarose,}

_001%

de

azul

de

bromofenol

_e

0,01% de chileno cianol). A _{formação de fita simples}

_de

DNA _por

_este

_{método foi mais estável}

_até

_mesmo

_{à temperatura}

_ambiente.

Essa

técnica, pela

sua

alta sensibilidade, permite

detectar até

mesmo

mutações de

ponto em fragmentos analisados. A _{utilização do fragmento de um}

gene

mitocondrial, _{altamente conservado, permite}

_{acesso a}

_uma

_parte

_{da história} evolucionária da

_{espécie e}

_{ainda compara}

_as

_taxas

_{de divergência nuclear}

_e

mitocondrial.

GeneA _(selvagem) GeneB(mutante)

W.

DesnatumrcomLIS&950C

|

w.

|_;

Já

ª

Eletroforese em PAGE-nativo

2.

OBJETIVOS

Verificar _{prováveis variações da}

_sequência

_{168 rRNA do mtDNA} por

análise

_{do fragmento (534 pb) entre populações}

_{de duas subespécies}

_{de Me/ipona}

))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))

)

)

)

3. MATERIAL

E

MÉTODOS

Esse

experimento foi _{desenvolvido no Laboratório de Genética do}

Departamento

de

Genética

_e

Bioquimica (DEGEB)

da

Universidade Federal de Uberlândia.

3.1. Material

Biológico

, ,

&?

Figuraz

— Melipona quadrifascíata anthidioides visitandoflor

O material biológico

deste

trabalho foi

_a

_{Melipona quadrifasciata}

amostrados para

análise: M. _{quadrifasciata quadrifasciata, provenientes do}

estado

do

_{Paraná (tabelal) e}

M. _{quadn'fasciata anthidióides}

_coletadas

_no

Estados de São

Paulo

_e

Sul

_de

Minas _{Gerais (tabela 2).}

Tabela

1 _{Localização geográfica dos pontos de coleta}

_{de amostras de}

Me/ipona _{quadn'fasciata quadn'fasciata}

Pontos de

Coleta Nº

_{de amostras}

_{Longitude Latitude}

1 Curitiba—PR. _{18 49º 12” O 25º 23'}

S

* _As

_{amostras de}

_{número 1}

ao

10

são

provenientes do Bairro Portão

_{e as}

de número 11

_ao

₁₈

são

_{do Bairro}

_Santa

_{Cândida da cidade}

_de

_Curitiba.

Tabela

2 _{Localização geográfica dos pontos de coleta}

_{de amostras de}

Me/ipona _{quadrifasciata anthidioides}

Pontos

de

Coleta Nº

_{de amostras}

_{Longitude Latitude}

1 Itamonte-MG. _{01 44º 39” O}

_22º

12” _S

2 _{Jacutinga-SP. 10 46º27” O 22º 12' S}

Tabela

3 _{Localização geográfica}

_dos

_pontos

_de

_coleta

_{de amostras}

_de Híbridos.

Pontos

de

Coleta Nº

_{de amostras}

_{Longitude Latitude}

3.2

Análise Molecular

3.2.1

Extração

de

DNA

As

_amostras,

_{constituídas por}

abelhas

adultas, foram

coletadas na entrada das

colônias

e colocadas

diretamente em vidros com álcool comercial. As

_amostras

de Curitiba foram

coletadas

pelo

senhor Sebastião Gonzaga e

as

de

Pedreira, Jacutinga

e

Itamonte pelo Engenheiro Agrônomo

José

Luciano,

sendo enviadas

pelo correio

_{para a}

Universidade Federal

de

Uberlândia,

onde

foram

armazenadas à

—20ºC

Inicialmente

cada

indivíduo foi _{retirado do álcool lavado em}

_tampão

(Tris-HCl 0,01 M, _{pH 8,0; NaCl 0,1} M

e

_{MgClz 0,001 M) em}

três

imersões

sucessivas

de 15 min

_e

_em

_seguida

foram

_secos

em papel de filtro.

O DNA total foi extraído do tórax

de

uma única abelha/colônia

segundo

método desenvolvido porAZEREDO—ESPIN

_et

al. (1991).A _amostra foi _{triturada em}

N _líquido adicionou-se em

_seguida

600 _ul

de

_{solução grinding (10} mM _{Tris, 60} mM NaCl, 30 mM

_Sacarose,

10 mM EDTA, 2.700 pl Água)

de

acordo com o

tamanho

da amostra. Em

_{seguida acrescentou-se a}

_mesma

_quantidade

_{de tampão de} lise, ( Tris

300 mM, 40 mM _{SDS, 20} mM EDTA, 0,7% DEPEC, 1,191 ul Água)

_permanecendo

em gelo por 15 min. .Adicionou—se 10

_a

20pl

de

proteinase K_{(10 mg/ml),}

incubando-a

por 45 min 45ºC.

Acrescentou-se

20 ul

de RNase

incubando

a

37ºC por 1 h

e

30

mim. O volume foi _{dobrado com fenol}

_e

_{centrifugando}

_a

10.000 rpm por 5 min. Retirou-se

a fase

superior para um novo tubo

e

novamente dobrou—se o volume com fenol: clorofórmio: álcool isoamil _{(25:24:1) centrifugando}

_a

10.000 _{rpm por} 5 min. Realizou—se _{uma terceira lavagem}

_somente

_com clorofórmio

semelhante

às

duas

anteriores. Adicionou—se

à

fase

_{superior dois volumes de etanol gelado}

_e

1/10 do volume total

de

NaCl 2MAs

amostras

foram mantidas

_a

-20ºC overnight. O DNA foi

precipitado por centrifugação

a

13000 _{rpm por} 15 min

_{e a fase aquosa}

foi

descartada.

Procedeu—se

_a

lavagem do pel/et com 500 pl

de

etanol 70%. Pipetou—se

10

para

fora todo o _{etanol do tubo. Após o}

_pel/et

_se

_{encontrar completamente}

_{seco este}

foi

_{ressuspendido}

_{em 70 ul}

_de

_{H20 dd. As}

_{amostras estoque}

_foram

_{armazenadas à}

—

soºc.

3.2.2 Quantificação do

DNA

_{em espectrofotômetro}

O DNA foi _{quantificado porleitura}

_{de absorbância a}

_{260 nm. Alíquotas}

_de

_{10 ul}

diluídas 100

_vezes

_em

_água

_{ultra pura foram}

_{submetidas a}

_{leitura em} espectrofotõmetro

_e

_{a concentração}

_{calculado como auxílio da}

_seguinte

_fórmula.

[DNA]= _{ABS(260)xfcxfd,}

Onde:

[DNA]—

concentraçãode

_DNA

ABS(260)-leitura

_{da absorbânciaa}

_260nm

fc—fator

de conversão

_{da cuveta}

fcl-_fator

de

_{diluição da amostra}

Após

a

quantificação

a

amostra foi _{diluída em}

_água

_ultrapura

_{para a}

concentração de

trabalho

de

10nglul. As

_{amostras de}

_{trabalho já diluídas foram}

armazenadas a

—20 ºC.

3.2.3

_{CARACTERIZAÇÃO DE POLIMORFISMO DO}

_GENE16$

rRNA DO DNA MITOCONDRIAL

_POR

_SSCP

11

A _{PCR (Polymerase Chain Reaction)}

_é

_uma

_técnica

que envolve

a síntese

enzimática

_de

_{milhões de cópias}

_de

_um

_segmento

_específico

_de

DNA _na

_presença

da

enzima Taq DNA _{polimerase. A}

_{reação está baseada}

_{em ciclos}

de

anelamento

_e

extensão

enzimática

de

um

_{par de}

_{oligonucleotideos}

_chamados

_{iniciadores ou} “primers”

_que

_delimitam

_{a sequência de}

_DNA

_de

tita dupla alvo da amplificação (FERREIRA &_{GRATTAPAGLIA, 1998).}

Com _{o auxilio}

_desta

_{técnica foi feita}

_a

amplificação

da

região 168 rRNA do mtDNA _{do genoma mitocondrialutilizando—se 60}

ng

de

DNA, _400uM

_de

_{dNTPs, 3} mM

_de

_MgClz

_e

1_,5U

de

_{Taq polimerase,}

_e

₈

pmols do

_{par de}

_{“pn'mer”RCO1/RC02} específico

_{para esta}

_{região, desenvolvido}

_a

_partir

_{de sequências de}

A. _mel/ifera

descrito porCAMERON

_et

_{al. (1992).}

No 1º ciclo _ocorre

_{a desnaturação da}

_{dupla fita}

_de

DNA,

_a

_temperatura

_é

mantida

à

_{94º por 2 min, o}

_2º

_{ciclo ocorre}

_a

_{94º C por 5 min. Na}

_{fase de}

anelamento

a

temperatura

é

reduzida

à 48º

C

_durante

1 min.

a

_{qual posteriormente}

é elevada à

70º C _{por 4 min.}

_{para que}

_ocorra

_{a extensão}

_da

fita. _{Os ciclos}

_são

_{repetidos 35}

vezes para que a

quantidade de DNA

_{da sequência}

_{alvo dobre}

_{a cada}

_ciclo,

_de

modo

_{que depois de}

_{20 ciclos}

_são

_{produzidos mais}

_de

um _{milhão de cópias}

_da

quantidade inicial

_{da sequência}

_{alvo. A}

_temperatura

_final

_{é de}

_{4º C.}

3.2.3.2 SSCP (single strand confonnation polymmphism)

Foram adicionados 2

_a

6 ul do produto da purificação

_a

_{18 ou 14 pl}

_{de solução}

de

LIS

_(sacarose

_{10%, azul}

_de

_{bromofenol0,01%,}

xileno cianol 0,01%). Tal _mistura foi _incubada

_a

_{95ºC por 5 minutos}

_e

₂₀

ul foram aplicados em _{PAGE 14%} (Acrilamida—bisacrilamida _{49:1) com}

_espaçadores

_0,7

mm. A _{eletroforese foi}

realizada

_à

10 mA_{porum periodo}

_de

_17h. 3.2.3.3 _{GEL DE POLIACRILAMIDA( 49:1)}

11)))))))))))))))))))))))))))))))))))

12

Os fragmentos

_gerados

_{por amplifrcações}

_e

_submetidos

_{à desnaturação}

em tis-SSCP foram aplicados em gel

de

poliacrilamida : bis-acrilamida na proporção

de

4911;

_{na concentração de}

_14%

_durante

_{17h & tomA em}

tampão

trís—borato _EDTA (TBE 1,0 x) conforme SAMBROOK

_et

_{al. (1989). Foi corado com prata}

_e

_revelado com

carbonato

de sódio.

)

)))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))7

13

4. RESULTADOS

E

DISCUSSÃO

Análise Molecular do Gene 168

rRNA

_do

DNA

Mitocondrial

_por

SSCP (Single

Strand

_{Conformation Polymorphism)}

4.1 _{Me/ipona quadrifasciata quadrifasciata}

A

_{comparaç㺠das bandas}

_por

_{análise de}

_{migração diferencial de}

fragmentos ampiificados (SSCP) em Meiipona quadn'fasciata quadrífasciara reveiou 3 _{hapiótipos diferentes na cidade}

_de

_{Curitiba—PR em 2 bairros} analisados.

Uma _possivei

_{consideração para}

_{tal variabilidade pode}

_estar

_relacionada

a

fatores ambientais como

_bºsques

de

mata nativa

_preservada,

_{que pedem} abrigar um maior número

de cºlônias

_{proporcionando}

_a

_{esta populaçãº}

_uma

maior variabilidade genética.

Outra hipótese

a ser considerada

é

a

procedência

destas

amostras. €)

meiipenicuitor

_{que as cedeu}

informou

_que

_as

_coiõnias

_são

_{provenientes do} municipio

de

Curitiba,

_{mas a}

_{prática comum}

_entre

_{aiguns meiiponicuitores}

_de

trºca

de

rainhas

eloa

colônias, pode justificar

_a

_{variabilidade genética}

aumentada

“5a? reeditada precisa

_ser

_verãficadc

_{para se}

_dªfinir

_{as variações da}

)))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))

14

Esse

probiema

ressalta a

importância

da

coleta

das amostras

preferenciaimente nos troncos originais. Muitas

_{vezes a grande}

_dificuidade

_de

iocalizar colônias naturais levam

_{os pesquisadores a}

_{amostrarem colônias}

_de

meiiponários. O _{controie rigoroso}

_da

_{substituição}

_de

_{rainhas nem}

_{sempre é}

feito

_{e análises de}

_biogeografia

_e

_{evolução podem}

_ser

_{comprometidas.}

01 02 03 04 05 06 07 08

Figura

03.

_{Padrão de}

_{variabilidade}

_gerado

_{por primer}

_{correspondente a}

_região

de

534 pb do

_gene

mitocondriai 168 rRNA _{em ge! PAGE 14%. Amostras}

correspondentes ao

município

de

Curitiba PR.

4.2 Melipona quadrífascíata anthidioides

As

_{amostras coletadas das cidades de}

_{Pedreira SP, Jacutinga MG}

_e

_itamonie

MG,

não apresentaram

_diferenças

_entre

_{si na}

_comparação

_de

_bandas

_por

_anaiise

de

_{migração diferenciai dos fragmentos, mesmo}

_{entre os}

_{híbridos (Figura 4}

amostras

1

e

2).

Segundo infomações

do meiiponicultor

que cedeu

as

amostras,

os

híbridos

_se

_{originaram devido}

_{a presença de}

_{Melipona quadiffasciata} quadrífascíata

de

um _{meiiponicuitorvizinho, em um}

_bosque

_distante

_{cerca de}

_1.5

))) )))))

)

))))))))) )))))) )))))))))))) )))))))

)

15

Km

_{de seu}

_{meliponário. O haplótipo}

_dos

_híbridos

_não

_{diferiu do haplótipo}

encontrado

_para

_as

_outras

_{amostras, isto indica que o padrão}

_{de bandas}

_no abdome, referencial

_{usado neste}

_trabalho

_para

_{identificação}

_{das subespécies e}

híbridos ,

não está

relacionado

ao

mtDNA. Seria, então,

interessante análises

do

DNA _nuclear

_para

_se

_inferir

_a

_formação

_dos

_{híbridos. Em}

_alguns

_{animais mesmo}

que

as

mitocôndrias dos

_gameta

_{masculino penetrem no óvulo no momento da} fertilização,

a

progênie

_apresenta

mitocôndrias

_somente

do tipo materno. Há

duas

explicações

_para

_esse

fato: _{diferença na taxa}

_de

_{replicação entre mtDNA materno}

e paterno e

maior quantidade no zigoto, de mt DNA _{materno em}

_{relação ao}

paterno (HECHT

et

al.,)

_apud

Arias 1992.

Foi _{descrito em MYTILUS}

_resultados

_{revelando contribuição}

_{paterna na}

herança

do mtDNA (HOEH

_et

al. 1991

_apud

_{ARlAS 1992). A}

_{transmissão paterna}

e a

mutação podem

_ser

um

dos

mecanismos

_{responsáveis}

_{pela heteroplasmia,}

_a

qual

consiste

da coexistência

de

mais

de

um tipo

de

mtDNA _numa

_mesma

_célula ouindividuo (ARlAS, 1992).

Um único tipo

de

_{haplótipo observado}

_dá

_{indícios de inexistência}

_{cu de}

_uma

pequena

taxa

de

mitocôndrias

de

origem

paterna

na fertilização do ovo.

Não

_se

_{pode afirmar com}

_{certeza a}

_{inexistência da heteroplasmia em M.} quadrífasciefa por

não se conhecer

_{previamente o haplótipo}

_de

_{origem paternal.}

Figura 4.Padrão de

variabilidade

_gerado

_{por “primer”}

_{correspondente a}

_região

de

534 pb do

_gene

mitocondrial 168 _rRNA. _{Gel acrilamida 14%,1e2 Pedreira}

SP., 3, 7,10, 11, 12 ,13, 14, 15, 16 Itamonte MG., 9

_Jacutinga

MG. * _Híbridos

))

)

)

)))))

)

)))))))) ))))

)

)))

)

16

5.

_CONCLusõEs

Os 3 _{haplótipos obtidos em 18}

_populações

_{de M.}

quadiífasciat'a quadnfasciata indicam um _{provável intercâmbio de colônias ou rainhas ou} variações climáticas

_e

_{geográficas com diferentes}

_adaptações

A

_não

_{variação entre Mel/pone quadrifasciata anthiclioides}

e

o híbrido revelam

_a

_{não correlação entre}

_a

_{característica listras abdominais}

e

mtDNA.

Também revalam possível

_{ausência de}

_{heteroplasmia. O}

_{que pode ser}

esclarecido, posteriormente,

realizando-se

o _{cruzamento controlado}

_para

_se

)

)))))))))))

)

17

6.

REFERÉNCIAS

BIBLIOGRÁFICAS

AIDAR, D. _{S., 1996. Amandaçaia: biologia}

_{de abelhas,}

_manejo

_e

_{multiplicação}

artificial _{de colônias de Melipona quadnfasciata. Ribeirão Preto:}

_Sociedade

Brasileira

de

Genética _{pp. 104}

ARIAS, M. C. _{(1992). Estudos}

_sobre

_{o mtDNA}

_{das abelhas}

_{Apis mellifera}

(Hymenoptera): Apoidea—Apidae.

Tese

_{de Doutorado., Ribeirão Preto SP. pp.}

114.

ATTARDl, G. _{(1985). Animal mitochondrial DNA: Na extreme example of genetic}

economy. Int. _{Rev. Cytol. 93:93-145.}

AVISE, J. C. _{(1986). Mitochondrial DNA}

_and

_{the evolutionary genetics of higher}

animals. Phil.

Trans.

R.

_{Soc. London}

_{B 312;} 325—42.

AVISE, J.C., ARNOLD, J., BALL, R. M., _{BERMIGHAM, E., LAMB, T., NIEGEL, J. E.,} REEB, C. A, _SAUNDERS, N. _{C., (1987). IntraespeclfIc phylogeographic: The}

mitochodrialDNA _{bridige between populations}

_{genetics and}

_{systematics. Ann.} Ver. Ecol.

_Syst.,

18: 489—522.

AZEREDO—ESPIN,A.M. L., _SCHRODER, R. F. _{W., HUETEL,} M. _D., & _SHEPARD,

W. _{S. (1991). Mitochondrial DNA variation in geographic populations of}

Colorado _potato

_beethe,

_{Leptinotarsa decemlineata (Coleoptera;} Chrysomelidae).

_Experientia

_47:483-485.

BANNAl, M., _TOKUNAGA, K., _{LlN, L., KUWATA, S., MAZDA, T., AMAKI, l.,}

FUJIKAWA, K., & _JUJl, T. _{(1994). Discrimination of human HLA-DRB1 alleles} by _{PCR-SSCP (single-strand conformation polymorphism) method. Eur.}

_J.

)

)))))) ))))))))))

)

)

18

BROWN, WM & _{WILSON, AC.(1979). Rapid evolution of animal mitochondrial}

DNA.

Proc. Natl. _Acad. Sci. USA, 76: _1967-1971

CAMERON, S. A , DERR, J. N., AUSTIN, A D., WOLLEY

and

_{WHARTON, R. A.}

(1992). The application of _nucleotide

_{sequence data}

_{to phylogeny of}

_the

hymenoptera: A Review.

_J.

_{Hym. Res.1 (1): 13-16.}

CLAYTON, D. _{A.(1984). Transcription of the mammalian mitochondrial genome.}

Ann. Rev.

Biochem.

53: 573-94.

FERREIRA, E. M., & _{GRATTAPAGLIA, D. (1998)}

_{Introdução ao}

uso

de

marcadores

_{moleculares em}

_análise

_{genética. 3ª}

_{ed. EMPRAPA—}

CENARGEM _{Brasíliapp. 220.}

FUTUYMA, D. _{J., (1992)}

_Biologia

_Evolutiva.

_2ª

_ed.

_Sociedade

Brasileira

de

Genética Ribeirão Preto _{pp. 646.}

GRAY, M. _{W. (1989). Origin}

_and

_{Evolution of Mitochondrial}

DNA. _{Ann. Rev.CeII}

Biol. 5:25-50.

HOSHINO, S,, KIMURA, A., _{FUKUDA,Y., DOHI, K.}

_and

_{SASAZUKI, T.(1992).}

PCR-SSCP analysis of polymorphismin DPA1

_and

_DPB1

_genes:

_{Simple and rapid}

method for histocompatibilitytest. Human. lmunol. 33: 98—108.

KERR, W. E., _(1951).

_{Bases para}

_o

_{estudo da}

_{genética de}

populações

dos hymenoptera em geral

e

_{dos Apinae sociais em particular.Tese}

_de

_Livre

Docência.

Piracicaba SP.

KERR,.W.E.; CARVALHO, G.A E _{NASCIMENTO, V.ª 1996. Abelha Uruçu: Biologia,}

Manejo

e

Conservação. Ed.

_Fundação

_{Acangaú, BH.-MG, 144 pp}

MARUYA, E., _{SAJI, H.,} & _{YOKOYAMA, S. (1996). PCR-LIS—SSCP (Low Ionic}

Strength Single-stranded Conformation Polymorphism) A _{simple method for}

high-resolution allele _{typing of HLA-DRB1, DQB1 and DPB1.}

_Genome

Research

6: 51-57.

MORITZ, C., DOWLING, T. E., BROWN, W. M. _{(1987). Evolution of animal}

mitochondrial DNA: _{Revelance for population biology and systematics. Ann.}

Rev. Ecol.

_Syst.

18: 269—92.

MOURE, J. S. & _{KERR, W. E., 1950.}

_{Sugestões para a}

modificação da sistemática do

_gênero

_{Melipona (Hymenoptera, Apoidea)}

_Dusenia

_{1 (2): 125-129.}

19

MOURE, J. S. _{(1975) Notas}

_{sobre as espécies}

de Melipona descritos por Lepeletier em 1836 ( _{Hymenoptera, Apidae). Rev. Brasil. Biol.,}

35(4): 615—23.

ORITA, _{M., IWAHANA, H., KANAZAWA, H., HAYASHI,}

& _{SEKIYA, T. (1989).}

Detection of _{polymorphisms of human DNA by}

gel electrophoresis

_as

single-strand conformation polymorphisms.

_Proc.

_Natl.

_Acad.

_{Sci. 86: 2766—2770.} SAMBROOK, J., FRITSCH, _{E. E.,} & _{MANIATS, T. 1989.}

_{Molecular Cloning:}

A

Laboratory manual.

Cold _{Spring Harbor Laboratory}

_Press-NY.

WILSON, A. _{C., CANN, R. L., CARR, S.}

M., _{GEORGE, M., GYLLENSTEIN, U. B.} (1985). Mitochondrial DNA

_and

_two

_perspectives

on evolutionary genetics. Biol.

_J.

_Linn.

_Soc.

_{26: 375—400.}