Efeitos do pré-tratamento com dimetilsulfóxido, ácido lipóico ou ternatina sobre o estresse oxidativo em ratos jovens submetidos à torção do cordão espermático

Texto

(1)UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ DEPARTAMENTO DE CIRURGIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO STRICTO SENSU EM CIRURGIA. SÉRGIO BOTELHO GUIMARÃES. EFEITOS DO PRÉ-TRATAMENTO COM DIMETILSULFÓXIDO, ÁCIDO LIPÓICO OU TERNATINA SOBRE O ESTRESSE OXIDATIVO EM RATOS JOVENS SUBMETIDOS À TORÇÃO DO CORDÃO ESPERMÁTICO. FORTALEZA 2005.

(2) SÉRGIO BOTELHO GUIMARÃES. EFEITOS DO PRÉ-TRATAMENTO COM DIMETILSULFÓXIDO, ÁCIDO LIPÓICO OU TERNATINA SOBRE O ESTRESSE OXIDATIVO EM RATOS JOVENS SUBMETIDOS À TORÇÃO DO CORDÃO ESPERMÁTICO. Tese submetida à Coordenação do Programa de Pós-graduação Stricto Sensu em Cirurgia da Universidade Federal do Ceará como requisito parcial para obtenção do Grau de Doutor em Cirurgia. Orientador: Prof. Dr. Paulo Roberto Leitão de Vasconcelos.. FORTALEZA 2005.

(3) FICHA CATALOGRÁFICA. G98e. Guimarães, Sérgio Botelho Efeitos do pré-tratamento com dimetilsulfóxido, ácido lipóico ou ternatina sobre o estresse oxidativo em ratos jovens submetidos à torção do cordão espermático / Sérgio Botelho Guimarães. Fortaleza, 2005. 125 f.: il. Orientador: Prof. Dr. Paulo Roberto Leitão de Vasconcelos. Tese (Doutorado) – Universidade Federal do Ceará. Departamento de Cirurgia. 1. Antioxidantes. 2. Testículo. 3. Ratos. 4. Estresse oxidativo. 5. Lipídios da membrana celular – peroxidação. 6. Malonaldeído. 7. Glutationa. I. Vasconcelos, Paulo Roberto Leitão de (Orient) II. Título CDD: 612.01575.

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(5) Ao nosso Senhor Jesus Cristo, o autor de minha fé, sempre presente em minha vida, pela sua imensa misericórdia e disposição em nos presentear com a vida eterna..

(6) AGRADECIMENTOS. Ao meu orientador, Professor Doutor Paulo Roberto Leitão de Vasconcelos, por sua disponibilidade e paciência no esclarecimento das muitas dúvidas que me afligiram, tanto no desenvolvimento do delineamento do estudo e na análise dos resultados como na resolução das dificuldades enfrentadas ao longo deste trabalho. Aos Professores Doutores Lídia Masako Ferreira da Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), Rodrigo Dornfeld Escalante, da Faculdade Integrada do Ceará (FIC), João Ximenes Aragão Filho da Universidade Estadual do Ceará (UECE) e Manoel Odorico de Moraes Filho, Pró-Reitor de Pesquisa e Pós-Graduação da Universidade Federal do Ceará, pela honrosa participação na Banca de Defesa desta Tese. Aos Professores Doutores Francisco Sérgio Pinheiro Regadas e Lusmar Veras Rodrigues pela participação na Banca de Qualificação e pelas oportunas e generosas sugestões, contribuindo significativamente para o aprimoramento deste manuscrito. Aos Professores Doutores Manasses Claudino Fonteles, Magnífico Reitor da Universidade Mackensie (São Paulo) e Otoni Cardoso do Vale, do Departamento de Medicina Clínica da Universidade Federal do Ceará, pela doação do ácido α-lipóico utilizado no experimento e ao Doutor Wellington Forte Alves, Cirurgião Vascular, pela doação do “kit” (Oxford TA 01) para o ensaio colorimétrico dos antioxidantes plasmáticos. Ao Professor Doutor Everardo R. Silveira, do Departamento de Química Orgânica e Inorgânica da Universidade Federal do Ceará, pelo isolamento da ternatina utilizada no experimento. Ao Professor Adjunto José Ulisses de Sousa Melo, do Departamento de Cirurgia da Universidade Federal do Ceará, por sua importante cooperação na obtenção da ternatina utilizada no experimento. Ao Doutor Domingos Barreto da Silva pela ajuda técnica na aferição do peso e distribuição do ácido lipóico (pó) em alíquotas, para posterior utilização no experimento..

(7) À Doutora Regilane Matos da Silva, farmacêutica-bioquímica, pela prestimosa ajuda nos cálculos estatísticos e na técnica de diluição da ternatina utilizada nos experimentos. Aos valorosos estudantes de Medicina Jefferson Menezes Viana Santos, Paulo Hudson Uchoa Barbosa, Alan Arruda Aragão e Osamu de Sanders Kimura pela dedicada participação na fase experimental deste trabalho. Aos meus filhos Lucas Brito Bastos Guimarães, estudante de Fisioterapia, e Isaac Beviláqua de Albuquerque Guimarães, pré-universitário, pela participação nas diversas etapas experimentais deste trabalho, realizadas na calada da noite. À Sra. Maria Luciene Vieira de Oliveira, secretária do Programa de Pós-Graduação em Cirurgia pela dedicação, competência e carinho dispensados aos alunos de pósgraduação. Ao Sr. Francisco Evanir Gonçalves de Lima, técnico da Unidade de Farmacologia da Universidade Federal do Ceará pelos esclarecimentos técnicos e presteza na preparação e execução dos ensaios laboratoriais e ao Sr. Bento Francisco de Oliveira, assistente técnico do Biotério do Laboratório de Cirurgia Experimental da Faculdade de Medicina (UFC), pelos cuidados prestados aos animais experimentais alojados no biotério. À bióloga Febe Gemmille e ao médico veterinário Francisco de Castro Junior, estagiários do biotério de Farmacologia, pela ajuda na obtenção e identificação sexual dos ratos utilizados no experimento. À Sra. Francisca Maria de Oliveira, bibliotecária da Faculdade de Medicina (UFC) pela correta identificação dos descritores e elaboração da ficha catalográfica. Enfim, a todos que contribuíram, direta ou indiretamente, para execução deste trabalho..

(8) " Um pouco de ciência nos afasta de Deus. Muito, nos aproxima. " Louis Pasteur.

(9) RESUMO EFEITOS DO PRÉ-TRATAMENTO COM DIMETILSULFÓXIDO, ÁCIDO LIPÓICO OU TERNATINA SOBRE O ESTRESSE OXIDATIVO EM RATOS JOVENS SUBMETIDOS À TORÇÃO DO CORDÃO ESPERMÁTICO. SÉRGIO BOTELHO GUIMARÃES. Tese (Doutorado). Programa de Pós-Graduação Stricto Sensu em Cirurgia. Orientador: Prof. Dr. Paulo Roberto Leitão de Vasconcelos O efeito protetor do dimetilsulfóxido (DMSO), do ácido lipóico (LA) e da ternatina (TN), conhecidos seqüestradores de radicais livres e protetores da membrana celular foram avaliados utilizando um modelo experimental de isquemia/reperfusão do testículo. Cento e vinte ratos Wistar jovens com peso médio de 174 g foram distribuídos ao acaso em cinco grupos (GS - Simulado, GC – Controle, GD – Dimetilsulfóxido. GA – Ácido lipóico e GT/D – Ternatina/DMSO) numericamente iguais e posteriormente redistribuídos em quatro subgrupos (T-0, T-1, T-3 e T-6), com seis animais cada. Todos os procedimentos cirúrgicos foram realizados sob os efeitos da anestesia geral inalatória. Os animais receberam injeções intraperitoniais (i.p.) de solução aquosa de DMSO a 3% (10 ml/kg, GD), LA (10 mg/kg, GA) ou TN+DMSO (12 mg/kg, GT/D, em solução aquosa de DMSO a 3%) 24, 12 e 4 horas antes da destorção do cordão espermático. A última dose foi administrada uma hora antes da indução da isquemia ou da segunda operação simulada (Sham). Os ratos do grupo Simulado (GS) e do grupo Controle (GC) receberam de NaCl 0,9% (10 ml/Kg) i.p. Foram determinadas as concentrações de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) e glutationa reduzida (GSH) no tecido (testículo), e a capacidade antioxidante total (CAP) do plasma. Para determinação do padrão de distribuição das amostras utilizou-se o teste de Kolmorogov-Smirnov. As comparações entre os grupos foram feitas utilizando-se o teste t de Student. Para as comparações dos grupos tratados com antioxidantes ao grupo Controle (GC) utilizou-se a análise de variância (ANOVA – teste de Dunnett). Valores de p<0,05 foram considerados significantes. A torção do cordão espermático induziu uma redução significante das concentrações de TBARS, no tempo máximo de isquemia e na reperfusão, em tratos pré-tratados com DMSO (GD) e LA (GA) e durante a reperfusão naqueles prétratados com TN/DMSO (GT/D), comparados com seus respectivos controles. Os níveis de TBARS estavam significantemente elevados nos ratos do grupo GC comparados aos animais do grupo GS, no tempo máximo de isquemia e durante a reperfusão, bem como uma hora após a destorção (T-1) comparada ao T-0, demonstrando o dano adicional decorrente do afluxo de sangue oxigenado (reperfusão) ao tecido isquêmico. As concentrações de GSH diminuíram nos ratos pré-tratados com solução salina e aumentaram significativamente nos ratos pré-tratados com DMSO ou LA, no tempo máximo de isquemia e durante a reperfusão. O modelo isquêmico utilizado não foi capaz de gerar efeitos sistêmicos. A capacidade antioxidante total aumentou significantemente durante a reperfusão (T-1) nos ratos pré-tratados com LA (GA) e TN/DMSO (GT/D) comparados aos respectivos controles. Esses resultados fortalecem a hipótese de que a isquemia e reperfusão são processos geradores de radicais livres. Os diferentes antioxidantes estudados mostraram grande eficiência na proteção da membrana celular, reduzindo a peroxidação lipídica, em todos os experimentos. O aumento dos níveis de glutationa reduzida, nos ratos pré-tratados com DMSO e LA, mostra que estes antioxidantes exercem uma proteção eficaz contra o estresse oxidativo induzido pela isquemia/reperfusão em ratos submetidos à torção do cordão espermático por três horas. Os efeitos protetores da ternatina se manifestam com maior intensidade no tecido isquêmico, no controle da peroxidação lipídica.. DESCRITORES: Antioxidantes.Testículo. Ratos. Estresse oxidativo. Lipídios da membrana celular – peroxidação. Malonaldeído. Glutationa..

(10) ABSTRACT. EFFECTS OF DIMETHYLSULFOXIDE, LIPOIC ACID OR TERNATIN PRETREATMENT UPON THE OXIDATIVE STRESS IN YOUNG RATS SUBJECTED TO TORSION OF THE SPERMATIC CORD. SÉRGIO BOTELHO GUIMARÃES. Thesis (Doctorate). PostGraduation Program (Stricto Sensu) in Surgery. Federal University of Ceará. Professor: Dr. Paulo Roberto Leitão de Vasconcelos.. The protective role of dimethylsulfoxide (DMSO), lipoic acid (LA) and ternatin (TN), known free radical scavengers and cell membrane protectants were evaluated in an experimental model of testis ischemia/reperfusion. One hundred and twenty young male Wistar rats, mean weight 172.5±15g, were randomized in five equal groups (GS - Sham, GC – Control, GD – Dimethylsulfoxide, GA – Lipoic acid and GT/D – Ternatin/DMSO). Rats of each group were distributed into four subgroups (T-0, T-1, T-3 and T-6), each comprising six animals. All surgical procedures were performed under inhalatory ether anesthesia. Experimental rats received intraperitoneal (i.p.) injections of 3% aqueous solution of DMSO (10 ml/kg, GD), LA (10 mg/kg, GA) or TN/DMSO (12 mg/kg, suspended in 3% aqueous solution of DMSO), GT/D) 24, 12 and 4 hours before cord detorsion. Last dose was given 1 hour before ischemia induction or second Sham operation. Sham (GS) and Control (GC) rats received NaCl 0.9% 10 ml/Kg i.p. Thiobarbituric acid reactive substances (TBARS) and reduced glutathione (GSH) levels (µmol/g wet tissue) were assayed in testis. Total Antioxidant Power (TAP) (µM) was measured in blood plasma. Data were first analyzed by Kolmorogov-Smirnov test to assess differences in the general shapes of distribution. Comparisons between groups were made using Student’s t test. P values of <0.05 were considered to indicate statistical significance. Comparisons between antioxidant-treated and saline-treated rats (Control group, GC) were made using analysis of variance (ANOVA - Dunnett’s test). Spermatic cord torsion induced significant decrease in testis TBARS levels during ischemia and reperfusion in DMSO (GD) and LA (GA) and in TN/DMSO (GT/D) treated rats during reperfusion, compared with respective controls. TBARS levels were significantly increased in GC compared with Sham (GS) rats at the end of the ischemia and during reperfusion as well as one hour after detorsion (T-1) in GC rats compared with T-0, in the same group, indicating additional damage imposed by the afflux of oxygenated blood (reperfusion) to the ischemic tissues. GSH levels decreased significantly in saline-treated (GC) compared with Shamoperated rats and increased significantly in DMSO and LA treated rats at the end of ischemia and during reperfusion. The model utilized in this study did not induce systemic effects. TAP was significantly increased during reperfusion (T-1) in LA (GA) and TN/DMSO (GT/D) pretreated rats, compared with respective controls. The results of the present study reinforce the hypothesis that ischemia and reperfusion are free radicals generating processes. The different antioxidants studied here have demonstrated great efficacy in cell membrane protection by decreasing lipid peroxidation in all experiments. Increased reduced glutathione levels in DMSO and LA treated rats support the view that these substances can exert a protective effect against testis oxidative stress injury caused by ischemia/reperfusion in rats subjected to torsion of the spermatic cord lasting three hours. TN protective effects in reducing lipoperoxidation were more pronounced in ischemic tissues. KEY WORDS: Antioxidants. Testis. Rats. Oxidative stress. Cell membrane lipids peroxidation. Malonaldehyde. Glutathione..

(11) LISTA DE FIGURAS. FIGURA 1 – Distribuição dos grupos e subgrupos...................................................16 FIGURA 2 – Desenho do estudo............................................................................... 18 FIGURA 3– Modelo de torção do cordão espermático.............................................. 19 FIGURA 4– Fixação do testículo - técnica atraumática ............................................ 19 FIGURA 5– Cor da gônada ao término do procedimento cirúrgico (torção do cordão espermático). ....................................................................... 23 FIGURA 6–Sutura do escroto – aspecto final............................................................ 23 FIGURA 7– Cor do testículo após três de isquemia, antes da destorção do cordão espermático (T-0)................................................................. 23 FIGURA 8– Cor do testículo após três horas de isquemia e uma hora de reperfusão (T-1).................................................................................... 23 FIGURA 9– Cor do testículo após três horas de isquemia e três horas de reperfusão (T-3).................................................................................... 23 FIGURA 10– Cor do testículo após três horas de isquemia e seis horas de reperfusão (T-6) ................................................................................... 23 FIGURA 11– Fluxograma do experimento ................................................................ 24 FIGURAs 12 e 13 – Concentrações de TBARS (µmol MDA/g) no testículo, comparando-se os grupos Simulado (GS) e Controle (GC), pré-tratados com solução salina e submetidos ao trauma (GS) e à isquemia/reperfusão (GC) ..................................................................................................... 33 FIGURA 14- Concentrações de TBARS (µmol MDA/g) no testículo, comparando-se os subgrupos Trauma vs. Pós-trauma, em ratos tratados com solução salina (grupo Simulado) e submetidos ao trauma ................................ 34 FIGURA 15- Concentrações de TBARS (µmol MDA/g) no testículo, comparando-se os subgrupos Isquemia vs. Reperfusão em ratos tratados com solução salina (grupo Controle) e submetidos à torção/destorção do cordão espermático.......................................................................................... 34 FIGURAS 16 e 17 - Concentrações de TBARS (µmol MDA/g) no testículo, comparando-se os grupos Controle (GC) vs. Dimetilsulfóxido (GD) tratados, respectivamente, com solução salina e dimetilsulfóxido e submetidos à torção /destorção do cordão espermático ...................... 35 FIGURAS 18 e 19- Concentrações de TBARS (µmol MDA/g) no testículo, comparando-se os grupos Controle (GC) vs. Grupo Ácido lipóico (GA),.

(12) tratados, respectivamente, com solução salina e ácido lipóico e submetidos à torção/destorção do cordão espermático ....................... 36 FIGURAS 20 e 21- Concentrações de TBARS (µmol MDA/g) no testículo, comparando-se os grupos DMSO (GD), tratado dimetilsulfóxido e Ternatina /DMSO (GT/D), tratado com ternatina+DMSO e submetidos à torção/destorção do cordão espermático ............................................. 37 FIGURAS 22 e 23- Concentrações de TBARS (µmol MDA/g) no testículo, comparando-se os grupos pré-tratados com antioxidantes (GD – Dimetilsulfóxido, GA - Ácido lipóico e GT/D – Ternatina+DMSO) ao grupo GC Controle , pré-tratado com solução salina, todos submetidos à torção do cordão espermático, no tempo máximo de isquemia (T-0)............. 38 FIGURAS 24 e 25- Concentrações de TBARS (µmol MDA/g) no testículo, comparando-se os grupos pré-tratados com antioxidantes (GD - Dimetilsulfóxido, GA - Ácido lipóico e GT/D – Ternatina+DMSO) ao grupo GC - Controle, pré-tratado com solução salina, todos submetidos à torção do cordão espermático, na reperfusão (T1+T3+T-6) ........................................... 39 FIGURAS 26 e 27 - Concentrações de GSH (µmol/g) no testículo, comparando-se os grupos Simulado (GS) e Controle (GC), pré-tratados com solução salina e submetidos ao trauma (GS) e à isquemia/ reperfusão (GC) ... 40 FIGURAS 28- Concentrações de GSH (µmol /g) no testículo, comparando-se os subgrupos Trauma vs. Pós-trauma, em ratos tratados com solução salina e submetidos ao trauma (grupo Simulado) .............................. 41 FIGURAS 29- Concentrações de GSH (µmol /g) no testículo, comparando-se os subgrupos Isquemia vs. Reperfusão em ratos tratados com solução salina (GC) ........................................................................................... 41 FIGURAS 30 e 31- Concentrações de GSH (µmol /g) no testículo, comparando-se os grupos Controle (GC) vs. Dimetilsulfóxido (GD) tratados, respectivamente, com solução salina e dimetilsulfóxido e submetidos à torção/destorção do cordão espermático ............................................. 42 FIGURAS 32 e 33 - Concentrações de GSH (µmol/g) no testículo, comparando-se grupos Controle (GC), tratado com solução salina e Ácido lipóico (GA), tratado com ácido lipóico, submetidos à torção/destorção do cordão espermático.......................................................................................... 43 FIGURAS 34 e 35 - Concentrações de GSH (µmol/g) no testículo, comparando-se os grupos DMSO (GD), tratado dimetilsulfóxido e Ternatina/DMSO (GT/D), tratado com ternatina +DMSO e submetidos à torção/destorção do cordão espermático......................................................................... 44 FIGURAS 36 e 37 - Concentrações de GSH (µmol/g) no testículo, comparando-se os grupos pré-tratados com antioxidantes (GD - Dimetilsulfóxido, GA Ácido lipóico e GT/D – Ternatina + DMSO) ao grupo GC - Controle ,.

(13) pré-tratado com solução salina, todos submetidos à torção do cordão espermático, no tempo máximo de isquemia (T-0) .............................. 45 FIGURAS 38 e 39 - Concentrações de GSH (µmol/g) no testículo, comparando-se os grupos pré-tratados com antioxidantes (GD - Dimetilsulfóxido, GA Ácido lipóico e GT/D – Ternatina + DMSO) ao grupo GC - Controle , pré-tratado com solução salina, todos submetidos à torção do cordão espermático, na reperfusão (T-1+T-3+T-6) .......................................... 46 FIGURAS 40 e 41- Capacidade antioxidante total do plasma (µM), comparando-se os grupos Simulado (GS) e Controle (GC), pré-tratados com solução salina e submetidos ao trauma (GS) e à isquemia/reperfusão (GC) .... 47 FIGURAS 42- Capacidade antioxidante total no plasma (µM) de ratos pré-tratados com solução salina, comparando-se os subgrupos Trauma vs. Póstrauma, em ratos tratados com solução salina (grupo Simulado) e submetidos ao trauma.......................................................................... 48 FIGURAS 43 - Capacidade antioxidante total no plasma (µM), comparando-se os sub-grupos Isquemia vs. Reperfusão (grupo Controle), em ratos prétratados com solução salina e submetidos à torção/destorção do cordão espermático .............................................................................. 48 FIGURAS 44 e 45 - Capacidade antioxidante total no plasma (µM), comparando-se os grupos Controle (GC), tratado com solução salina e DMSO (GD), tratado com dimetilsulfóxido, e submetidos à torção/destorção do cordão espermático.............................................................................. 49 FIGURAS 46 e 47 - Capacidade antioxidante total (µM) no plasma, comparando-se grupos Controle, tratado com solução salina e Ácido lipóico (GA), submetidos à torção/destorção do cordão espermático ....................... 50 FIGURAS 48 e 49 - Capacidade antioxidante total (µM) no plasma, comparando-se os grupos DMSO (GD), tratado dimetilsulfóxido e Ternatina/DMSO (GT/D), tratado com ternatina+DMSO e submetidos à torção/destorção do cordão espermático......................................................................... 51 FIGURAS 50 e 51 - Capacidade Antioxidante Total no plasma, comparando-se os grupos pré-tratados com antioxidantes (GD - Dimetilsulfóxido, GA Ácido lipóico e GT/D – Ternatina + DMSO) ao grupo GC - Controle , pré-tratado com solução salina, todos submetidos à torção do cordão espermático, no tempo máximo de isquemia (T-0) .............................. 52 FIGURAS 52 e 53 - Capacidade Antioxidante Total no plasma, comparando-se os grupos pré-tratados com antioxidantes (GD - Dimetilsulfóxido, GA Ácido lipóico e GT/D – Ternatina + DMSO) ao grupo GC - Controle , pré-tratado com solução salina, todos submetidos à torção do cordão espermático, durante a reperfusão (T-1 + T-3) .................................... 53.

(14) LISTA DE TABELAS. TABELA 1 – Concentrações de TBARS (µmol MDA/g tecido fresco) no testículo, comparando-se os grupos os grupos Simulado (GS) e Controle (GC), em ratos pré-tratados tratados com solução salina .................................................. 42. TABELA 2 – Concentrações de TBARS (µmol MDA/g tecido fresco) no testículo, comparando-se Trauma vs. Pós-trauma (grupo Simulado), em ratos pré-tratados com solução salina .......................................................... 43 TABELA 3 – Concentrações de TBARS (µmol MDA/g tecido fresco) no testículo, comparando-se Isquemia vs. Reperfusão (grupo Controle), em ratos pré-tratados com solução salina .......................................................... 43 TABELA 4 – Concentrações de TBARS (µmol MDA/g de tecido fresco) no testículo, comparando-se os grupos os grupos Controle, tratado com solução salina e DMSO (GD), tratado com dimetilsulfóxido............................. 44 TABELA 5– Concentrações de TBARS (µmol MDA/g de tecido fresco) no testículo, comparando-se grupos Controle (GC), tratado com solução salina e Ácido lipóico (GA), tratado com ácido lipóico ...................................... 45 TABELA 6 – Concentrações de TBARS (µmol MDA/g de tecido fresco) no testículo, comparando-se os grupos DMSO (GD), tratado dimetilsulfóxido e Ternatina/DMSO (GT/D), tratado com ternatina + DMSO ................. 46 TABELA 7 – Concentrações de TBARS (µmol MDA/g) no testículo, comparando-se os grupos pré-tratados com antioxidantes [(DMSO (GD), Ácido lipóico (GA) ou Ternatina/DMSO (GT/D)], entre si e ao grupo pré-tratado com solução salina (GC), todos submetidos à torção do cordão espermatico, no tempo máximo de isquemia (T-0)........................................... 47 TABELA 8 – Concentrações de TBARS (µmol MDA/g) no testículo, comparando-se os grupos pré-tratados com antioxidantes [(DMSO (GD), Ácido lipóico (GA) ou Ternatina/DMSO (GT/D)], entre si e ao grupo pré-tratado com solução salina (GC), todos submetidos à torção do cordão espermatico, na reperfusão (T1+T3+T-6).......................................................... 48 TABELA 9 – Concentrações de GSH (µmol/g tecido fresco) no testículo, comparando-se os grupos os grupos Simulado (GS) e Controle (GC), em ratos pré-tratados tratados com solução salina ............................................ 49 TABELA 10 –Concentrações de GSH (µmol/g tecido fresco) no testículo, comparando-se Trauma vs. Pós-trauma (grupo Simulado), em ratos pré-tratados com solução salina .............................................................................. 43 TABELA 11 –Concentrações de GSH (µmol/g tecido fresco) no testículo, comparando-se Isquemia vs. Reperfusão (grupo Controle), em ratos pré-tratados com solução salina .............................................................................. 43.

(15) TABELA 12– Concentrações de GSH (µmol/g tecido fresco) no testículo, comparando-se os grupos os grupos Controle (GC), tratado com solução Salina e DMSO (GD), tratado com dimetilsulfóxido........................................ 51. TABELA 13– Concentrações de GSH (µmol/g tecido fresco) no testículo, comparando-se grupos Controle (GC), tratado com solução salina e Ácido lipóico (GA), tratado com ácido lipóico ................................................ 52 TABELA 14– Concentrações de GSH (µmol/g tecido fresco) no testículo, comparando-se os grupos DMSO (GD), tratado dimetilsulfóxido e Ternatina / DMSO (GT/D), tratado com ternatina + DMSO .................................... 53 TABELA 15– Concentrações de GSH (µmol/g) no testículo, comparando-se os grupos pré-tratados com antioxidantes [(DMSO (GD), Ácido lipóico (GA) ou Ternatina/DMSO (GT/D)], entre si e ao grupo pré-tratado com solução salina (GC), todos submetidos à torção do cordão espermatico, no tempo máximo de isquemia (T-0)........................................... 54 TABELA 16– Concentrações de GSH (µmol/g) no testículo, comparando-se os grupos pré-tratados com antioxidantes [(DMSO (GD), Ácido lipóico (GA) ou Ternatina/DMSO (GT/D)], entre si e ao grupo pré-tratado com solução salina (GC), todos submetidos à torção do cordão espermático, na reperfusão (T1+T3+T-6).......................................................... 55 TABELA 17 – Capacidade antioxidante total (µM) no plasma,comparando-se os grupos os grupos Simulado (GS) e Controle (GC), em ratos pré-tratados tratados com solução salina ......................................................... 42 TABELA 18 – Capacidade antioxidante total (µM) no plasma,comparando-se Trauma vs. Pós-trauma (grupo Simulado), em ratos pré-tratados com solução salina.............................................................................. 43 TABELA 19 – Capacidade antioxidante total (µM) no plasma,comparando-se Isquemia vs. Reperfusão (grupo Controle), em ratos pré-tratados com solução salina............................................................................... 43 TABELA 20– Capacidade antioxidante total no plasma (µM), comparando-se os grupos os grupos Controle (GC), tratado com solução salina e DMSO (GD), tratado com dimetilsulfóxido ........................................... 58 TABELA 21– Capacidade antioxidante total (µM) no plasma, comparando-se os grupos grupos Controle (GC), tratado com solução salina e Ácido lipóico (GA), tratado com ácido lipóico ................................................ 59 TABELA 22– Capacidade antioxidante total (µM) no plasma, comparando-se os grupos DMSO (GD), tratado dimetilsulfóxido e Ternatina / DMSO (GT/D), tratado com ternatina + DMSO............................................... 60.

(16) TABELA 23 – Capacidade Antioxidante Total no plasma, comparando-se os grupos pré-tratados com antioxidantes [(DMSO (GD), Ácido lipóico (GA) ou Ternatina/DMSO (GT/D)], entre si e ao grupo pré-tratado com solução salina (GC), todos submetidos à torção do cordão espermático, no tempo máximo de isquemia (T-0) ....................................................... 61 TABELA 24– Capacidade Antioxidante Total no plasma, comparando-se os grupos pré-tratados com antioxidantes [(DMSO (GD), Ácido lipóico (GA) ou Ternatina/DMSO (GT/D)], entre si e ao grupo pré-tratado com solução salina (GC), todos submetidos à torção do cordão espermático, na reperfusão (T-1 + T-3) ......................................................................... 62.

(17) LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS. (-CH2-) – grupamento metileno µM – microMol ADP – adenosina difosfatada ATP – adenosina trisfosfatada ATPase – ATP sintetase ATP-Mg Cl(2) – adenosina trifosfato - cloreto de magnésio DHLA – ácido di-hidrolipóico DMSO – dimetilsulfóxido ERO – espécies reativas de oxigênio Fe+++ – íon férrico GS – Grupo Simulado (Sham) GC – Grupo Controle GD – Grupo Dimetilsulfóxido GA – Grupo Ácido lipóico GT/D – Grupo Ternatina/DMSO GR - glutationa-redutase, GSH – glutationa (forma reduzida) GSSH – glutationa dissulfeto (forma oxidada) GST - glutationa-S-transferase H2O• – hidroperoxila H2O2 – peróxido de hidrogênio I/R – isquemia/reperfusão IRFI-016 – análogo hidrofílico da vitamina E LA – ácido α-lipóico MDA - malondialdeído NAD – nicotinamida dinucleotídeo (forma oxidada) NADH – nicotinamida dinucleotídeo (forma reduzida) NADP – nicotinamida dinucleotídeo fosfatado (forma oxidada) NADPH – nicotinamida dinucleotídeo fosfatado (forma reduzida) nm – nanômetro O2-• – radical superóxido.

(18) OH• – radical hidroxila p:v – peso:volume R• – radical RLO – radicais livres de oxigênio ROO• – radical peroxila ROOH – hidroxiperóxido SeGPx - glutationa-peroxidase dependente de selênio SOD – superóxido dismutase SS – solução salina T-0 – tempo de isquemia máxima T-1 – tempo correspondente a uma hora de reperfusão T-3 – tempo correspondente a três horas de reperfusão T-6 – tempo correspondente a seis horas de reperfusão TBA – ácido tiobarbitúrico TBARS – substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico . TN – ternatina v/v – volume por volume.

(19) SUMÁRIO. LISTA DE FIGURAS LISTA DE TABELAS LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS 1 INTRODUÇÃO ........................................................................................... 1 2 OBJETIVO ................................................................................................ 14 3 MÉTODO .................................................................................................. 15 3.1 Desenho do estudo ............................................................................ 18 3.2 Indução da isquemia e fixação do testículo ........................................ 19 3.3 O estudo.............................................................................................. 20 3.3.1 Preparação das drogas utilizadas ............................................ 25 3.3.2 Técnica laboratorial ................................................................... 27 3.3.2.1 Preparação dos espécimes (sangue e tecido testicular) ...... 27 3.3.2.2 Avaliação da peroxidação lipídica ........................................ 27 3.3.2.3 Determinação da Glutationa (GSH) no tecido ...................... 28 3.3.2.4 Determinação da Capacidade Antioxidante Total no plasma ................................................................................. 29 3.4 Análise estatística ............................................................................. 31 4 RESULTADOS....................................................................................... 33 4.1 No tecido .......................................................................................... 33 4.2 No plasma ....................................................................................... 47 5 DISCUSSÃO ............................................................................................ 54 6 CONCLUSÃO ........................................................................................... 75 7 REFERENCIAS ...................................................................................... 76 APÊNDICES ............................................................................................. 93 ANEXOS ............................................................................................... 103.

(20) 1. 1 INTRODUÇÃO A sobrevivência de qualquer órgão ou tecido depende, fundamentalmente, de três fatores: a disponibilidade de oxigênio, a existência de uma fonte sempre renovada de nutrientes básicos e a remoção dos produtos tóxicos oriundos do metabolismo celular. O funcionamento harmônico desses processos metabólicos é essencial para assegurar a manutenção da bioenergética celular e da homeostase iônica. A redução da oferta de substratos energéticos, de oxigênio e o acúmulo de resíduos tóxicos do metabolismo celular afetam esse delicado balanço homeostático, comprometendo a integridade celular. Os recentes avanços do conhecimento médico têm possibilitado a reversão do processo em seu estágio inicial, utilizando métodos cirúrgicos ou farmacológicos, em áreas críticas para a sobrevivência do indivíduo, tal como o coração, prevenindo o infarto e a necrose celular nos tecidos isquêmicos (MAXWELL; LIP, 1997). Isquemia pode ser definida como uma deficiência no aporte sangüíneo a determinado órgão ou tecido originando importantes alterações metabólicas de grau variável, dependente da intensidade e a duração do distúrbio. O afluxo de sangue oxigenado aos tecidos hipóxicos é fundamental para o reinicio do metabolismo aeróbico. Paradoxalmente, apesar dos efeitos benéficos, a restauração do fluxo sanguíneo desencadeia uma série complexa de alterações que se instalam nos tecidos pré-isquêmicos, rotuladas. “lesão de reperfusão” (COTRAN;. KUMAR;. ROBBINS, 1996). A torção do cordão espermático é a emergência urológica mais freqüente em indivíduos jovens (GAUSCHE, 1996), podendo afetar o homem ao longo de sua existência, desde as primeiras semanas de vida intra-uterina (GIANNAKOPOULOS et al., 1995) até a velhice (GOMEZ et al., 2003), com picos de incidência na fase inicial da infância e na puberdade (SAUVAT et al., 2002). Até o ano de 1964 os resultados do tratamento cirúrgico eram desencorajadores com perdas de até 90% dos testículos torcidos (BARKER; RAPER, 1964). Esses resultados foram atribuídos.

(21) 2. à desinformação da população quanto à urgência e a gravidade da doença, aliada à demora na concretização do tratamento adequado. Estudos realizados na Inglaterra em 1986 ainda mostravam um elevado percentual de perdas. Testículos inviáveis ocorreram em 38% dos acessos cirúrgicos, na fase aguda; atrofia tardia do órgão foi constatada em 6% dos pacientes, totalizando perdas de 44%, justificando a necessidade da pronta intervenção terapêutica, para assegurar a viabilidade do testículo e a manutenção da capacidade reprodutora do órgão (ANDERSON.; WILLIAMSON, 1986). No Brasil, perdas ainda maiores (50%) foram verificadas por Souto et al. (1999), em 26 jovens atendidos no serviço de urgência de dois hospitais universitários, num intervalo de cinco anos (1992 a 1997). Estudos tardios em pacientes vítimas da torção do cordão espermático, com preservação do testículo aparentemente viável, mostraram que a enfermidade pode ser uma importante causa de esterilidade masculina. A produção de espermatozóides anormais foi confirmada até 12 anos após o evento isquêmico (BARTSCH et al., 1980; MASTROGIACOMO et al., 1982; THOMAS et al., 1984; FRASER, 1985; PURI; BARTON; O'DONELL, 1985; ANDERSON; WILLIAMSON, 1986). A torção do cordão espermático não produz de imediato, no homem, uma obstrução total do fluxo sanguíneo. Há, no início, uma obstrução da drenagem venosa sem o correspondente bloqueio da irrigação arterial. O edema resultante aumenta de maneira gradativa, acentuando o efeito estrangulador da torção, por aumento da compressão vascular. A conseqüência é a obstrução total do fluxo sangüíneo arterial e a isquemia do testículo (SKOGLUND; McROBERTS; RADGE, 1970), com o aparecimento de uma cascata de distúrbios metabólicos e enzimáticos. O evento inicial é a substituição do metabolismo aeróbico para o anaeróbico, incapaz. de. suprir. as. demandas. energéticas. celulares,. resultando. no. comprometimento dos processos biológicos que necessitam de energia (GRACE, 1994).. A hipóxia resultante da diminuição do fluxo sangüíneo produz níveis. elevados de ácido láctico, hipoxantina e peroxidases lipídicas nos tecidos isquêmicos, seguida da produção de grande quantidade de radicais livres de oxigênio (RLO),. que reagem com os lipídios das células e das mitocôndrias,. alterando a permeabilidade de suas membranas, culminando com a morte celular (SAUGSTAD, 1988; REILLY; SCHILLER; BULKLEY, 1991). Dois fatores são fundamentais para o sucesso do tratamento da torção do cordão espermático: a duração do período de isquemia e o grau de torção.

(22) 3. (WRIGHT, 1977). Como o tempo de duração da isquemia está diretamente relacionado à gravidade das lesões, o objetivo terapêutico principal tem como fulcro o restabelecimento precoce da perfusão. Todavia, a reintrodução do oxigênio em um meio isquêmico inicia uma corrente complexa de eventos produzindo lesões tissulares adicionais podendo comprometer, irremediavelmente, a viabilidade do testículo (PRILLAMAN; TURNER, 1997). De modo semelhante ao que ocorre em outros órgãos ou tecidos submetidos aos efeitos da isquemia/reperfusão, a lesão tissular provocada pela torção do cordão espermático tem dois componentes: a lesão isquêmica e a lesão de reperfusão. As lesões celulares resultantes representam uma somatória das ações deletérias desses dois componentes (AKGÜR; KILINC; AKTUG, 1993).. A lesão isquêmica. decorre da obstrução do acesso de sangue oxigenado ao testículo (BLANK et al., 1993; AKGÜR; KILINC; AKTUG, 1993). A lesão de reperfusão se instala após a correção cirúrgica da torção (BLANK et al., 1993; AKGÜR; KILINC; AKTUG, 1993); em decorrência da oferta de sangue oxigenado à gônada isquêmica aparecem lesões adicionais decorrentes da ação das espécies reativas de oxigênio, com agravamento do estresse oxidativo (PRILLAMAN; TURNER, 1997). Nesta fase, a hipoxantina e a xantina oxidase reagem com o oxigênio produzindo o radical superóxido (O2•-) e o peróxido de hidrogênio (H2O2). O radical superóxido também pode ser produzido por vazamento de elétrons originados de vários componentes da cadeia celular de transporte de elétrons. O radical superóxido (O2•-) é dismutado pela enzima superóxido dismutase (SOD) formando peróxido de hidrogênio (H2O2). O peróxido de hidrogênio pode produzir o radical hidroxila (OH•) através das reações de Fenton ou Haber-Weisser ou ainda ser convertido em água (H2O) pela ação enzimática da catalase ou da glutationa peroxidase (LEIFERT; JAHANGIRI; MCMURCHIE, 1999). Mais de 95% do oxigênio consumido durante o metabolismo aeróbico é utilizado nas mitocôndrias para produção de energia; o restante (5%), não sendo completamente oxidado em água, origina as espécies reativas de oxigênio, também conhecidas como radicais livres (CLARK, 2002). Radical livre é um termo aplicado a toda espécie que possui um ou mais elétrons desemparelhados; o elétron livre pode estar centrado em um átomo de hidrogênio, oxigênio, nitrogênio, carbono, enxofre ou átomos de metais de transição. Duas substâncias abundantes na natureza podem gerar radicais livres: o oxigênio no estado fundamental (O2) e o óxido nítrico (ROVER JÚNIOR et al., 2001). Este último.

(23) 4. participa da formação de complexos nitrosílicos com heme-proteínas, compostos nitrosotiólicos (cisteína e glutationa) e de peroxinitrito. O peroxinitrito promove a oxidação de grupos tiólicos, em particular a glutationa, associado com o consumo de oxigênio e regulando sua ação radicalar nas células do organismo (QUIJANO et al., 1997; ARTEEL; BRIVIBA; SIES, 1999). A molécula de oxigênio é um bi-radical (possui dois elétrons livres nos orbitais p antiligantes) e reage preferencialmente com moléculas de configuração eletrônica semelhante. Por outro lado, a maioria das biomoléculas não são bi-radicais, possuindo grande número de ligações covalentes, ficando o oxigênio impedido (por restrição de “spin”) de reagir com as mesmas, evitando assim que alvos celulares importantes sejam lesados. Apesar dessa restrição, o oxigênio possibilita a origem de diversas espécies reativas, seja por absorção de energia ou por transferência de elétrons. Na forma de oxigênio singlete a restrição de “spin” desaparece, resultando em um maior poder oxidante dessa substância (ROVER JÚNIOR et al., 2001). Uma outra via de formação de espécies reativas de oxigênio consiste na redução unieletrônica do oxigênio à água, na qual a entrada de 4 elétrons na molécula de oxigênio promove o aparecimento do radical superóxido (O2-.), peróxido de hidrogênio (H2O2) e do radical hidroxila (OH-.), intermediários parcialmente reduzidos do oxigênio molecular (HALLIWELL; GUTTERIDGE, 1995). O peróxido de hidrogênio atravessa facilmente as membranas celulares e ao receber mais um elétron origina o radical hidroxila. Este último é, entre as espécies radicalares conhecidas, uma das mais reativas, pois necessita somente de mais um elétron para se estabilizar. Estas espécies radicalares devem doar ou receber elétrons de uma ou outra molécula para se estabilizarem, tornando esta última uma espécie também radicalar e a conseqüência disto é a oxidação dos fosfolipídios de membranas celulares e subcelulares, do DNA, e das proteínas (GREENWALD, 1990). Os efeitos deletérios do oxigênio sobre os organismos vivos variam consideravelmente, na dependência do tipo de organismo e de seu estado fisiológico. Nos mamíferos, no tecido oxigenado, o oxigênio sofre redução tetravalente, com a aceitação de quatro elétrons, resultando na formação de água, radicais superóxido (O2•⎯⎯) hidroperoxila (H2O•) e hidroxila (OH•) e peróxido de hidrogênio (H2O2) (FERREIRA; MATSUBARA, 1997). A produção excessiva de radicais livres oxidantes e a capacidade do organismo de desativá-los representam o.

(24) 5. equilíbrio decisivo entre a reversibilidade das lesões e a morte celular (COTRAN; KUMAR; ROBBINS, 1996). A concentração intracelular de espécies reativas de oxigênio é, em condições normais, extremamente baixa, pelo fato de existirem enzimas antioxidantes que as removem ou impedem sua formação. Estes radicais tendem a ser eliminados do organismo pelo conjunto das enzimas glutationa peroxidase, glutationa redutase, superóxido dismutase e pela catalase (MCCORD; FRIDOVICH, 1969). Assim, em condições fisiológicas, o balanço entre os agentes pró-oxidantes e as defesas antioxidantes se mantém equilibrado. Quando esse equilíbrio é rompido, quer por produção excessiva de radicais livres quer por redução das defesas antioxidantes, estabelece-se o “estresse oxidativo” (FERREIRA; MATSUBARA, 1997), restando ao organismo três alternativas: 1) adaptação, por aumento da atividade dos sistemas antioxidantes; 2) dano tecidual, por agressão aos lipídios, carboidratos ou proteínas; 3) morte celular, por necrose ou apoptose (DRÖGE, 2002). Na peleja pela sobrevivência, o sistema de proteção contra a ação lesiva dos radicais livres atua em duas linhas diferentes: linha detoxificadora, constituída pela glutationa reduzida, vitamina E e as enzimas superóxido-dismutase, catalase, glutationa peroxidase; linha reparadora, constituída principalmente pelo ácido ascórbico e pelas enzimas glutationa-redutase e glutationa-peroxidase (FERREIRA; MATSUBARA, 1997). Além dos antioxidantes endógenos, existem antioxidantes provenientes da natureza, principalmente os provenientes da dieta e aqueles elaborados sinteticamente. Os antioxidantes. sintéticos. mais. conhecidos. são:. acetilcisteína,. coenzima. Q,. flavonóides, alopurinol, probucol, vitamina C e E, betacaroteno, selênio e zinco, entre outros (BONORDEN; PARIZA,1994). As membranas celulares do testículo dos mamíferos apresentam altos níveis de ácidos graxos poliinsaturados, o que as tornam muito vulneráveis ao ataque dos radicais livres de oxigênio (AITKEN; CLARKSON; FISHEL, 1989). Em contrapartida, o testículo é dotado de um sofisticado mecanismo de defesa que assegura a sua integridade funcional diante do ataque persistente dos agentes oxidantes. Cada célula testicular dispõe de diferentes enzimas e moléculas defensoras. Assim, as células de Sertoli apresentam concentrações relativamente altas de superóxido dismutase (SOD), glutationa-peroxidase dependente de selênio (SeGPx) , enzimas não dependentes do selênio, denominadas glutationa S-peroxidases (GST) e glutationa reduzida (GSH). Essa alta concentração enzimática é fundamental para.

(25) 6. assegurar a sobrevida do espermatozóide, facilmente lesado pelos radicais livres. (BAUCHE; FOUCHARD; JEGOU, 1994).. Comparando-se o testículo ao fígado,. observa-se que a expressão equivalente de SOD é semelhante nos dois órgãos, diferentemente da atividade da glutationa peroxidase (5%) e da catalase (2%), extremamente. reduzidas. na. gônada. masculina. (PELTOLA;. HUHTANIEMI;. AHOTUPA, 1992). Por outro lado, as células germinativas albergam concentrações muito elevadas de SOD, em contraste com as outras enzimas (glutationa peroxidase, glutationa S-peroxidase e glutationa redutase) além de quantidades não detectáveis de catalase. Há, portanto, uma diferença fundamental entre os sistemas defensivos das células de Sertoli, capazes de converter o radical superóxido O2●- em H2O2 e finalmente em substâncias não reativas, mantendo o equilíbrio da reação GSH/GSSG (glutationa reduzida/glutationa oxidada), assegurando a proteção necessária contra os radicais livres de oxigênio. Enquanto isso, as células germinativas não conseguem levar o processo de detoxificação até a fase final, permitindo que o H2O2 produzido pela inativação do radical superóxido formado possa ser utilizado para a produção de radicais ainda mais tóxicos, via reação de Fenton (BAUCHE; FOUCHARD; JEGOU, 1994). A GSH pode ser considerada um dos agentes mais importantes do sistema de defesa antioxidante da célula, protegendo-a contra a lesão resultante da exposição a agentes como íons ferro (GALLEANO; PUNTARULO, 1995), oxigênio hiperbárico, ozona, radiação e luz ultravioleta (DENEKE; FANBURG, 1989).. A oxidação da. glutationa a transforma em GSSG (glutationa oxidada), produto tóxico para o meio intracelular. Os sistemas de proteção são, mais uma vez ativados e a GSSG é reduzida, retornando ao seu estado inicial (GSH) por ação enzimática da glutationa redutase. A relação ideal GSH/GSSG (100:1) é mantida através desse mecanismo (MEISTER, 1989).. Sob condições fisiológicas, a taxa de consumo de GSH é. determinada pela intensidade de sua utilização nos processos de detoxificação. A exposição aos agentes oxidantes oriundos do meio exterior ou a presença de toxinas reativas aos tióis pode aumentar significativamente o consumo de GSH, resultando em queda temporária dos níveis de GSH intracelular; entretanto, como a capacidade de recuperação das reservas de GSH está presente na maioria das células, a concentração do tripeptídio intracelular é rapidamente recuperada, pela maior síntese e pela redução do GSSG, pelo mecanismo já descrito acima..

(26) 7. Surpreendentemente, a maioria das células tolera, sem efeitos adversos, redução de até 90% dos níveis normais de GSH (HALL, 1999). A lipoperoxidação ou peroxidação lipídica (PL) pode ser definida como uma deterioração oxidativa de ácidos graxos poliinsaturados, detentores de ligações duplas carbono-carbono, presentes em grande quantidade nas membranas e nas organelas intracelulares (mitocôndrias e peroxissomas); é um processo constituído por reações encadeadas, seqüenciais e que pode ser dividida em três etapas: iniciação, propagação e término. A peroxidação lipídica tem início quando espécies reativas de oxigênio, dotadas de elétrons desemparelhados, promovem a remoção de um átomo de hidrogênio de um grupamento metileno (-CH2-). Nesta etapa há produção de um novo radical (-CH•-) que é centrado no carbono e que normalmente se estabiliza através de um novo arranjo molecular. Sob condições aeróbicas esse radical centrado no carbono combina-se com o oxigênio (O2) formando radicais peroxila (ROO•). Esses radicais peroxila podem extrair um átomo de hidrogênio de outra molécula de lipídio, estabelecendo assim a propagação da reação. O novo radical, ao reagir com o oxigênio, origina novo radical peroxila, permitindo que a reação da peroxidação lipídica se torne contínua, pela repetição dos ciclos oxidativos. Quando o radical peroxila se combina com um átomo de hidrogênio, há geração de hidroxiperóxidos (ROOH). Uma alternativa é a formação de peróxidos cíclicos e epóxidos. Estas substâncias, altamente reativas, culminam por fragmentar os lipídios poliinsaturados, produzindo o malondialdeído (4-hidroxi-2-nonenal) e outros compostos contendo grupos carbonila. Um único evento de iniciação pode produzir várias moléculas de peróxido. À medida que as reações em cadeia se processam, proteínas de transporte ou enzimas de membrana podem ser inativadas ou pode ocorrer aumento da permeabilidade da bicamada lipídica da membrana, alterando a homeostase. Finalmente, na etapa de conclusão, ocorre a formação de um intermediário instável (tetróxido), a partir dos radicais peroxila (mecanismo de 1. Russell), que sofre decomposição, originando oxigênio singleto ( O2) e grupos carbonila excitados, entre outros produtos (LLESUY, 2002). Os testículos dos mamíferos e, especialmente as células germinativas, podem sofrer graves lesões, muitas vezes irreversíveis, quando expostos à ação dos agentes oxidantes produzidos no organismo, no curso dos processos vitais ou nas.

(27) 8. situações de estresse (CHANCE; SIES; BOVERS, 1979). A manutenção do fluxo sanguíneo é particularmente crítica no testículo. Os túbulos seminíferos, em condições normais, exibem concentrações muito baixas de oxigênio, o que explica sua maior sensibilidade a hipóxia (AHMED et al., 2000). Acredita-se que esta particular sensibilidade do testículo possa estar relacionada ao seu suprimento sanguíneo do tipo terminal e a presença de uma carapaça inelástica constituída pela túnica albugínea que limitaria sua expansão compensatória, na vigência do edema traumático (REGADERA; NISTAL; PANIAGUA, 1985). Vários modelos de torção do cordão espermático foram concebidos na tentativa de reproduzir, experimentalmente, os distúrbios circulatórios encontrados na torção do cordão espermático do homem. Os métodos mais utilizados foram a ligadura da artéria espermática, o pinçamento do cordão espermático e a torção do cordão espermático. Os dois primeiros métodos (ligadura ou o pinçamento do cordão espermático) determinam de imediato, o bloqueio do fluxo sanguíneo arterial e do retorno venoso, o que não corre no ser humano (MERIMSKY; ROCK; KATZ, 1982; ORTOLANO; NASRALLAH, 1986; PALMER; PLZAK; CROMIE, 1997). A torção do cordão espermático (duas voltas completas ou 720º), modelo atualmente utilizado pela maioria dos pesquisadores, produz efeitos semelhantes aos observados na torção que ocorre no homem (JANETSCHEK et al., 1988; RYAN; GOREY; FITZPATRICK, 1988; BLANK et al., 1993; BECKER; TURNER, 1995; PALMER; PLZAK; CROMIE, 1997; DOKUCU et al., 2000; ANDIRAN et al., 2000; GUIMARAES; VASCONCELOS, 2002; SEUNG-JUNE et al., 2004). A busca por substâncias com atividade biológica antioxidante eficaz. na. reversão ou diminuição dos efeitos do estresse oxidativo secundário à torção do cordão espermático tem sido exaustiva e sistemática. Inúmeras substâncias já foram utilizadas, com resultados nem sempre satisfatórios, apesar da comprovada ação dessas substâncias em outros órgãos. Blank et al. (1993) mostraram resultados desanimadores, estudando os efeitos preventivos da deferoxamina e diltiazem, substâncias reconhecidamente eficazes na prevenção das lesões oxidativas no músculo cardíaco. O alopurinol foi eficaz na prevenção das lesões de reperfusão no testículo submetido à isquemia de três e cinco horas e reperfusão de duas horas de duração (AKGÜR et al.,1994b). O Quadro 1 (Anexo A) apresenta a relação das principais drogas e enzimas utilizadas.

(28) 9. por diferentes pesquisadores, nos diferentes estudos experimentais sobre o tema em epígrafe, publicados a partir de 1988. É importante enfatizar o significado de algumas palavras e expressões usadas no presente estudo. A capacidade antioxidante pode ser definida como a habilidade de determinada substância ou composto na redução de substâncias próoxidantes. Quando uma determinada substância química é reduzida há um ganho de elétrons; por outro lado, quando essa substância é oxidada, perde elétrons. O agente redutor é a substância que doa elétrons e assim faz com que a substância alvo seja reduzida. Por sua vez, o agente oxidante é capaz de aceitar elétrons de outra substância, o que faz com que a substância doadora de elétrons seja oxidada. Três antioxidantes, com reconhecida atividade protetora em diferentes órgãos e tecidos (IKEDA; LONG, 1996; SOUZA; RAO; SILVEIRA,1997; BRUCK et al., 2001; MITSUI et al., 1999; FREISLEBEN, 2000; CHIDLOW et al., 2002; PRAHALATHAN; SELVAKUMAR; VARALAKSHMI, 2004; SELVAKUMAR et al., 2004) foram selecionados para a avaliação de seus possíveis efeitos protetores em animais submetidos à isquemia/reperfusão do testículo: o dimetilsulfóxido, o ácido α-lipóico e a ternatina. O dimetilsulfóxido [(CH3)2SO] é um líquido orgânico incolor derivado da lignina, substância responsável pela rigidez das células vegetais. Sua extração ocorre na preparação de polpa de madeira utilizada na fabricação do papel. Usado como solvente comercial desde 1933, o dimetilsulfóxido (DMSO) foi utilizado pela primeira vez como fármaco em 1961 pelo Dr. Stanley Jacob, chefe da unidade de transplante da Oregon Health Sciences University ao investigar o potencial desse solvente na preservação de órgãos (SZMANT, 2004). O DMSO é altamente solúvel e distribui-se rapidamente, após injeção intraperitonial, em todos os órgãos e tecidos (KOLB et al., 1967) e é capaz de melhorar a fosforilação oxidativa na própria mitocôndria. Essa ação se deve à diminuição da atividade da ATPase nas partículas submitocondriais, com redução da utilização de O2 durante a isquemia celular (GHOSH et al., 1976). Outros trabalhos experimentais comprovaram a ação antioxidante do DMSO como seqüestrador de radicais livres (BRUCK et al., 2001; KOKSAL et al, 2003). O DMSO, um poderoso seqüestrador de radicais livres de hidrogênio, é uma molécula anfipática com grande domínio polar; a presença de dois grupamentos apolares, lhes confere solubilidade tanto em meio aquoso como em líquidos.

(29) 10. orgânicos (SANTOS et al., 2003). Sua capacidade ímpar em penetrar com facilidade na intimidade dos tecidos vivos sem produzir lesões detectáveis deve-se, possivelmente, a sua natureza polar, sua capacidade em aceitar ligações hidrogenadas, seu tamanho relativamente pequeno e sua compacta estrutura (SZMANT, 2004). Suas principais ações farmacológicas são: penetração nas membranas celulares, ação antiinflamatória, analgesia, inibição da agregação plaquetária, vasodilatação e relaxamento muscular, inibição da colinesterase e proteção contra a lesão isquêmica (JACOB; HERSCHLER, 1986) O DMSO não é isento de efeitos colaterais. Pequenas doses da substância produzem efeitos tóxicos discretos no fígado do rato. Altas doses podem induzir o aparecimento de infiltração hepática gordurosa (MATHEW et al., 1980). Um estudo recente demonstrou que ratos tratados com repetidas aplicações intraperitoniais de DMSO, em doses convencionais, apresentavam uma acentuada redução dosedependente da velocidade de condução nervosa (CAVALETTI et al., 2000). Diferentes resultados foram apresentados por Authier et al. (2002); esses pesquisadores estudaram detalhadamente o efeito de doses crescentes de DMSO (1,8–3,6–7,2%), aplicadas por via intraperitonial, diariamente, durante 10 dias (10 ml/Kg), em ratos Sprague-Dawley. Não foram observados efeitos tóxicos do solvente, mesmo quando utilizado em altas doses (7,2%). O. ácido. α-lipóico. (1,2-ditiolane-3-ácido. valerico,. 1,2-ditiolane-3-ácido. pentanóico, 6,8-ácido ditiooctânico, acido tióctico) é um metabólito antioxidante sintetizado por células humanas e animais através da combinação do ácido aracdônico com a metionina ou ácido octanóico com a cisteína (DUPRE et al., 1980). Reed (1974) pensava tratar-se de uma nova vitamina originária da ingestão de determinados alimentos. Anos mais tarde confirmou-se a sua síntese por animais e humanos (CARREAU, 1979). Sua importância na terapêutica atual é ressaltada pelo crescente número de publicações que destacam o uso do produto como um ativo destruidor de radicais livres de oxigênio (MITSUI et al., 1999; FREISLEBEN, 2000; CHIDLOW et al., 2002), regenerador da glutationa e de outros antioxidantes ao seu estado reduzido (MOINI; PACKER; SARIS, 2002) e protetor das células testiculares contra o estresse oxidativo induzido por ciclofosfamida, substância com reconhecida atividade citotóxica (SELVAKUMAR et al., 2004). A ação metabólica do ácido α-lipóico tem seu papel fundamental no ciclo de Krebs onde atua como co-fator de processos enzimáticos que catalisam a.

(30) 11. descarboxilação oxidativa dos α-cetoácidos, tais como o piruvato e ácido αcetoglutarato. No processo, o ácido α-lipóico (LA) é reduzido a ácido di-hidrolipóico (DHLA) e as duas substâncias atuam como redutores acoplados (PACKER; WITT; TRITSCHLER, 1995). O LA atravessa a barreira hemato-cerebral e é considerado um “antioxidante metabólico” por ser aceito como um substrato pelas células humanas, onde é reduzido a DHLA. Diferentemente do que ocorre com outros antioxidantes, como o ácido ascórbico, o DHLA não é destruído na sua ação seqüestradora de radicais livres, sendo reciclado a partir do ácido α-lipóico e é capaz de inativar os radicais superóxido, ação não exercida pelo ácido α-lipóico (SUZUKI; TSUCHYA; PACKER, 1991). Segundo Evans e Goldfine (2000), o ácido α-lipóico é um potente antioxidante multifuncional. Sua ação se estende ao meio intracelular onde promove aumento da glutationa e das defesas celulares (BUSSE et al.,1992). As propriedades antioxidantes do ácido α-lipóico podem ser divididas em quatro categorias: seqüestração de radicais livres, quelação de íons metálicos e reparação das lesões oxidativas em macromoléculas, regeneração e síntese de novo de antioxidantes endógenos (glutationa e vitamina E) e de outros antioxidantes, como o α-tocoferol; (PACKER; WITT; TRITSCHLER, 1995; BIEWENGA; HAENEN; BAST, 1997) e o ácido ascórbico (SCHOLICH; MURPHY; SIES, 1989). Vale salientar o importante papel desempenhado pelo ácido lipóico no metabolismo, regulando o estado redox e produzindo aumento de NADH/NAD+ na hiperglicemia. O aumento da síntese de glutationa está dependente da disponibilidade de cisteína (PACKER; WITT; TRITSCHLER, 1995). No homem o ácido α-lipóico encontra-se conjugado às proteínas (HERMANN et al., 1996). Como as ações terapêuticas antioxidantes estão relacionadas à forma livre, é fundamental a suplementação dessa substância para a obtenção dos efeitos protetores. Os flavonóides, responsáveis pelo aspecto colorido das folhas e flores, são compostos polifenólicos de baixo peso molecular, amplamente distribuídos no reino vegetal (HAVSTEEN, 1983) e dotados de múltiplas propriedades biológicas, farmacológicas e antioxidantes. (CHOLBI et al., 1991; GALVEZ et al., 1995). A grande maioria desses compostos apresenta baixa toxidade (DL50 2-10 g por rato), e poucos efeitos colaterais, o que torna sua utilização segura. (HAVSTEEN, 1983). Os flavonóides atuam como antioxidantes na inativação dos radicais livres, em ambos os compartimentos celulares lipofílico e hidrofílico. Esses compostos têm a capacidade de doar átomos de hidrogênio e, portanto, inibir as reações em cadeia.

(31) 12. provocadas pelos radicais livres (HARTMAN; SHANKEL, 1990; ARORA; NAIR; STRASBURG, 1998a, 1998b). Em adição a sua propriedade antioxidante, alguns flavonóides têm a capacidade de quelar íons metálicos, reduzindo, assim, a peroxidação induzida por metais. No consenso de vários pesquisadores, a sua atividade antioxidante resulta da combinação de suas propriedades quelantes do ferro e seqüestradoras dos radicais livres (BOHM et al., 1998; BRAVO, 1998; RUSSO et al., 2000).. Outros autores incluem ainda a inibição das oxidases. (lipogenase, ciclooxidase, mieloperoxidase, xantina oxidase e NADPH oxidase) evitando a geração de espécies reativas de oxigênio, in vivo, bem como de hidroperóxidos orgânicos (FERRANDIZ; ALCARAZ, 1991; DE GROOT, RAUEN, 1998). A constituição química volátil dos capítulos florais da macela, erva popularmente. utilizada sob a forma de infusão no tratamento de distúrbios. digestivos e intestinais (BRAGA, 1960),. foi determinada. por estudos químico-. farmacológicos (CRAVEIRO et al., 1992 apud LIMA et al., 1996, p. 217). O flavonóide identificado foi denominado ternatina (4, 4’, dihidroxi 3, 7, 8, 3’ tetramoxi flavona) (SILVEIRA; LIMA; MACEDO, 1989). Posteriormente foram confirmadas as atividades antianafilática e antiinflamatória (SOUZA; RAO; SILVEIRA, 1992; SOUZA, 1993), hepatoprotetora (RAO et al., 1994; SOUZA et al., 1998), antitrombótica (SOUZA et al., 1994), antidiarréica e gastroprotetora (RAO et al., 1997) e antioxidante (SOUZA; RAO; SILVEIRA, 1997; SOUZA; RAO; SILVEIRA, 1998; SOUZA; TOME; RAO, 1999) da ternatina. A aferição direta dos radicais livres nos sistemas biológicos é dificultada por suas concentrações extremamente baixas (da ordem de 10-11 M) e por suas altas velocidades de reação, podendo atingir um nível em que as taxas de produção são praticamente iguais às taxas de reação com biomoléculas. Técnicas de ressonância paramagnética de elétrons podem permitir a aferição de subprodutos dos radicais livres de oxigênio. O uso rotineiro destas técnicas enfrenta um grande empecilho, consubstanciado nos altos custos do processo e nas limitações técnicas inerentes ao método (FLOYD, 1990). Por outro lado, a aferição indireta dos radicais livres e como conseqüência, das lesões oxidativas, pode ser feita por espectrofotometria e cromatografia, determinando a atividade enzimática (superóxido dismutase, catalase, glutationa peroxidase e glutationa reduzida) e a concentração de.