Projeções córtico-corticais do córtex auditivo primário de ratos modelo de autismo.

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CENTRO DE BIOCIˆENCIAS BACHARELADO EM BIOLOGIA

Alice Pimenta Gurgel

PROJEC

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OES C ´

ORTICO-CORTICAIS DO C ´

ORTEX

AUDITIVO PRIM ´

ARIO DE RATOS MODELO DE

AUTISMO

Natal-RN

2019

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PROJEC

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OES C ´

ORTICO-CORTICAIS DO C ´

ORTEX

AUDITIVO PRIM ´

ARIO DE RATOS MODELO DE

AUTISMO

Projeto de pesquisa apresentado ao Curso de Ciências Biológicas da Universidade Federal do Rio Grande do Norte a ser utilizado como diretriz para manufatura do Trabalho de Conclusão de Curso.

Orientadora:

Prof. Dra. Renata Figueredo Anomal

Universidade Federal do Rio Grande do Norte — UFRN Departamento de Morfologia — DMOR

Natal-RN 2019

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Gurgel, Alice Pimenta.

Projeções córtico-corticais do córtex auditivo primário de ratos modelo de autismo / Alice Pimenta Gurgel. - Natal, 2019. 38 f.: il.

Monografia (Graduação) - Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Centro de Biociências. Curso de Ciências Biológicas. Orientadora: Profa. Dra. Renata Figueiredo Anomal.

1. Autismo - Monografia. 2. Período Cítico - Monografia. 3. Projeções córtico-corticais - Monografia. 4. Córtex Auditivo Primário - Monografia. 5. VPA - Monografia. 6. TEA - Monografia. I. Anomal, Renata Figueiredo. II. Universidade Federal do Rio Grande do Norte. III. Título.

RN/UF/BSE-CB CDU 616.896

Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Setorial Prof. Leopoldo Nelson - -Centro de Biociências - CB

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”Tudo deveria se tornar o mais simples poss´ıvel, mas n˜ao simplificado.” Albert Einstein.

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Resumo

O Per´ıodo Cr´ıtico (PC) é uma fase pós-natal na qual o desenvolvimento cortical é altamente suscet´ıvel à plasticidade induzida pelos est´ımulos ambientais. Para cada ma-tura¸cão sensório, motora, e cognitiva um per´ıodo-cr´ıtico diferente é promovido. Os eventos que ocorrem durante o PC têm então impactos importantes sobre a forma¸cão dos mapas corticais de processamentos sensoriais, e também sobre a percep¸cão destes pelo indiv´ıduo durante sua vida. Sabendo disso, algumas desordens do neurodesenvolvimento tais como o transtorno do espectro autista (TEA), podem apresentar desde altera¸cões fenot´ıpicas, com padrões faciais t´ıpicos, a altera¸cões sensório-motoras, o que juntas podem gerar déficits sociais de diferentes grada¸cões no indiv´ıduo afetado. O objetivo do presente estudo foi então investigar o Per´ıodo Cr´ıtico do desenvolvimento pós-natal em ratos modelo de au-tismo, hipotetizando se este é encontrado alterado já no nascimento. Sugerimos que: 1) os déficits de comunica¸cão e altera¸cões sensoriais observadas neste transtorno possam estar relacionados, em parte, ao de tempo de abertura e/ou fechamento do PC no córtex senso-rial Auditivo primário (A1), e 2) às altera¸cões no desenvolvimento das conexões aferentes para este córtex (A1). Para tanto, propomos o estudo de aferências para A1 em ratos modelo de autismo e também em ratos controle (inje¸cão de solu¸cão salina) no primeiro dia pós-natal (P0.5), por meio da introdu¸cão, post-mortem, de neurotra¸cador retrógrado. Foi observado com isso que o A1 recebe proje¸cões axonais de diversas regiões corticais, como a região frontal, motora e ´ınsula. Sendo assim, foi constatado que não existe especificidade nas conexões córtico-corticais aferentes para A1 no dia P0.5, porém os dados obtidos se mostram inconclus´ıveis por não inclu´ırem o grupo controle na análise.

Palavras-chave: Autismo, TEA, VPA, Per´ıodo Cr´ıtico, córtex auditivo primário, co-nexões córtico-corticais.

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Abstract

The Critical Period (CP) is a postnatal time when cortical development is highly susceptible to plasticity induced by environmental stimuli. For each sensory, motor, and cognitive maturation, a different critical period is promoted. Events that occur during the CP then have important impacts on the formation of cortical maps of sensory processing, as well as on individual perception during their lifetime. Knowing that, some neurodeve-lopmental disorders such as autism spectrum disorder (ASD), may present from phenoty-pic alterations, with typhenoty-pical facial patterns, to sensorimotor changes, which together can generate social deficits of different gradations in the affected individual. The Objective of the present study was to investigate the CP of post-natal development in autism models rats by analysing cortico-cortical connections. We suggest that: 1) the communication deficits and sensory alterations observed in this disorder may be related, in part, to the opening and/or closing time of the altered CP in the sensory cortex Primary Auditory (A1), and 2) to changes in the development of afferent connections in this cortex (A1). Therefore, we propose the study of afferences to A1 in autism model rats and also in con-trol rats (saline injection) on the first postnatal day (P0.5), by introducing, post-mortem, retrograde neurotracer. It was observed that A1 receives axonal projections from vari-ous cortical regions, such as frontal, motor and insula. Accordingly to this findings, it was found that there is no specificity in the afferent cortical connections to A1 on day P0.5, but data are shown unfinished because they do not include the control group in the analysis.

Keywords: Autism, ASD, VPA, Critical Period, primary auditory cortex, cortical-cortical connections.

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Lista de Figuras

1.1 Conexões corticais de A1 no esquilo (Sciurus carolinensis). . . 7 1.2 Visão bidimensional demonstrando a proje¸cão topográfica de A1 em

ma-caco da noite (Aotus trivirgatus). . . 8 4.1 Esquema de como as marca¸cões de neurônios foram feitas em amplia¸cão.

A: Imagem sem amplia¸cão, mostrando a localiza¸cão de onde se retirou as imagens B e C : Amostragem de corpos de neurônios com (B) e sem (C) as marca¸cões . . . 15 4.2 S´ıtio de inje¸cão de cristal de DiI em caso 2. A esquerda mostra s´ıtio de

inje¸c˜ao em filtro de Fluoresce´ına. A direita s´ıtio de inje¸c˜ao em filtro de Rodamina. . . 16 4.3 Corte coronal de caso 2. A: O corte apresenta filtro azul corado por DAPI

mostrando as demarca¸cões do córtex. B e C: Os cortes de cima reve-lam marca¸cões feitas do hemisfério direito. D e E: Marca¸cões feitas do hemisfério esquerdo. . . 16 4.4 S´ıtio de inje¸cão de cristal de DiI em caso 3. A esquerda mostra s´ıtio de

inje¸c˜ao em filtro de Fluoresce´ına. A direita s´ıtio de inje¸c˜ao em filtro de Rodamina. . . 17 4.5 Corte coronal de caso 3. A: O corte apresenta filtro azul corado por DAPI

mostrando as demarca¸cões do córtex. B e C: Os cortes revelam marca¸cões feitas do hemisfério direito. D e E: Marca¸cões feitas do hemisfério esquerdo. 18 4.6 Corte coronal de caso 4. A: O corte apresenta filtro azul corado por DAPI

mostrando as demarca¸cões do córtex. B e C: Os cortes de cima revelam marca¸cões feitas do hemisfério direito. D: Marca¸cões feitas do hemisfério esquerdo. . . 18 4.7 Corte coronal de caso 4. A: O corte apresenta filtro azul corado por DAPI

mostrando as demarca¸cões do córtex. B e C: Os cortes revelam marca¸cões feitas do hemisfério direito. D e E: Marca¸cões feitas do hemisfério esquerdo. 19

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Conte´

udo

Resumo ii Abstract iii 1 Introdu¸cão 1 1.1 AUTISMO . . . 1 1.2 PERÍODO CRÍTICO . . . 5

1.3 C ´ORTEX AUDITIVO PRIM ´ARIO (A1) . . . 7

1.4 MODELO EXPERIMENTAL . . . 9

1.5 JUSTIFICATIVA . . . 10

2 Hip´oteses e Objetivos 11 2.1 HIP ´OTESES . . . 11

2.2 OBJETIVO GERAL . . . 11

2.3 OBJETIVO ESPEC´IFICO . . . 11

3 Materiais e Métodos 12 3.1 INDUÇ ÃO AO VPA . . . 12

3.2 EUTAN ÁSIA, PERFUS ÃO E DISSECAÇ ÃO CORTICAL . . . 13

3.3 INJEÇ ÃO DO NEUROTRAÇ ADOR . . . 13

3.4 AN ´ALISE DAS CONEX ˜OES CORTICAIS E SUBCORTICAIS . . . 14

4 Resultados e Discuss˜ao 15

5 Conclus˜ao 22

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Cap´ıtulo 1

Introdu¸

c˜

ao

1.1 AUTISMO

O autismo é uma desordem do neurodesenvolvimento caracterizada por altera¸cões comportamentais, as quais se apresentam majoritariamente em crian¸cas nos primeiros anos de vida e têm como principais sintomas a dificuldade de intera¸cão social, atraso no desenvolvimento da linguagem verbal e não verbal, hiperatividade, padrão restrito de interesse, de comportamento e/ou de atividade, e dificuldade em perceber e demonstrar emo¸cões (Kanner, 1943).

Dados epidemiológicos desde 2012, pelo Centro de Preven¸cão e Controle de Doen¸cas dos Estados Unidos, confirmam que uma a cada cinquenta crian¸cas, de idades entre 6 a 17 anos, são autistas, sendo mais presente no gênero masculino que no feminino, em uma propor¸cão de quatro para um (Garcia-Penãs, 2009). Pesquisas recentes, como as publica¸cões de Fombonne (2005; 2009), consideram que a prevalência dessa s´ındrome esteja entre cinco a dez a cada mil pessoas. No Brasil, os achados mais atuais indicam uma prevalência em torno de 0,3% na popula¸cão (Paula et al., 2011). No entanto, não há muita riqueza de dados referentes a frequência deste transtorno pelo território nacional (Gomes et al., 2015).

Segundo Sousa (2013), os critérios para a classifica¸cão e diagnóstico do autismo têm sido constantemente alterados, pois sua etiologia não é bem definida. A heterogenei-dade dos perfis encontrados no autismo, está relacionada parcialmente à multiplicidade de fatores etiológicos possivelmente envolvidos nesta desordem, podendo cada indiv´ıduo apresentar altera¸cões em grada¸cões diferentes, como um espectro de sintomas. Por isso, o autismo é referido como transtorno do espectro autista (TEA), sendo o afloramento cl´ınico no in´ıcio da infância um dos principais critérios para seu diagnóstico diferencial (American Psychiatric Association, 2013). Sugere-se, pelas pesquisas promovidas, haver

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uma forte rela¸cão entre fatores genéticos e ambientais no desencadear deste transtorno (Chaste e Leboyer, 2012). Até então, o TEA foi descrito na última edi¸cão do Manual Estat´ıstico e Diagnóstico de Doen¸cas Mentais de 2013 (DSM-V) como uma única catego-ria: o Transtorno do espectro autista (TEA), juntamente com a s´ındrome de Asperger e o distúrbio generalizado do desenvolvimento não espec´ıfico, possuindo dentro deste espectro dos diversos n´ıveis de comprometimento social.

De acordo com Ameis e Catani (2014), as dificuldades de intera¸cão social são per-cept´ıveis a partir dos 4 anos, seguidas por duas janelas de altera¸cões sensoriais: entre os 4 e 6 anos, e entre os 6 e 8 anos de idade (Starr et al., 2003). Sintomas representados por menor reconhecimento de faces (Johnson et al., 2005), menor imita¸cão e interesse social (Zwaigenbaum et al., 2005) e dificuldades na forma¸cão pessoal da teoria da mente (Elsabbagh e Johnson, 2007) são percept´ıveis também na infância, podendo haver uma melhora considerável na adolescência (Szatmari et al., 2009). Ainda assim, o desenvolvi-mento enviesado do cérebro resulta geralmente em um adulto com défices sociais (Howlin et al., 2004).

Altera¸cões no processamento sensorial dos indiv´ıduos com autismo, tais como a res-posta sensorial aumentada ou diminu´ıda (Leekam et al., 2007), são caracter´ısticas chaves do reconhecimento cl´ınico deste transtorno, embora exista pouco consenso sobre como elas se manifestam (Marco et al.; 2011). Sugere-se que altera¸cões nos sentidos do tato, paladar e olfato sejam consequência da imaturidade de desenvolvimento do sistema ner-voso (Baranek et al., 2006). As altera¸cões nas vias de processamento auditivo e visual são as mais bem descritas na literatura (Marco et al.; 2011), como as descritas nos estudos neurofisiológicos do sistema auditivo, demonstrando atividade neural at´ıpica no córtex auditivo primário (Anomal et al., 2013; Bruneau et al., 2003). Estas altera¸cões podem ser causa de desconforto nos indiv´ıduos afetados, que usualmente reagem desproporcio-nalmente ao escutar sons usualmente inofensivos, além de apresentarem atraso da fala (Marco et al.; 2011). Indiv´ıduos com TEA possuem dificuldade na deteçcão de formas em movimento (Jonge et al.,2007) e dificuldade de processamento facial pelos est´ımulos visu-ais (Vlamings et al., 2010). Muitas vezes também apresentam distúrbio de coordena¸cão do desenvolvimento (DCD) associado (Piek e Dyck, 2004), que é a falta de controle motor e integra¸cão dos movimentos. Considera-se então, que essa percep¸cão sensorial at´ıpica possa gerar uma cascata disruptiva em processamentos corticais mais complexos, como a socializa¸cão (Marco et al., 2011), falta de empatia (Piek e Dyck, 2004) e dificuldade em reconhecer emo¸cões (Marco et al., 2011).

Considerando as varia¸cões fenot´ıpicas e de sintomatologia descritas nos TEA (Mueller et al, 2013), diversos trabalhos vêm tentando descrever as caracter´ısticas morfológicas e funcionais de causa e efeito. Estudos de imagem por ressonância magnética (IRM), como

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citado nos artigos de Rane e colaboradores (2015) e Courchesne e colaboradores (2007), descreveram alguns padrões morfológicos t´ıpicos de pacientes com autismo, tais como anormalidades na circunferência e volume da cabe¸ca e do encéfalo, que parecem crescer rapidamente na infância, se normalizando na vida adulta. Já estudos anatômicos de co-nectividade de Bauman e colaboradores (2005) demonstraram altera¸cões na am´ıgdala e hipocampo apresentando uma circuitaria irregular com lesões na substância branca (Mu-eller et al., 2013; Nair et al., 2013), que podem causar disfun¸cões corticais (Stigler et al., 2011). As lesões axonais (Ameis e Catanis, 2014), por exemplo, afetariam tanto as conexões de curta distância do cingulado anterior, produzindo um aumento de conectivi-dade local no córtex pré-frontal, quanto de longa distância, promovendo uma redu¸cão das conexões que fazem a conexão do cingulado anterior e do córtex orbitofrontal a outras regiões do córtex (Zikopoulos e Barbas, 2010). Também, foi verificado a existência de uma maior compacta¸cão (densidade) e menor tamanho dos neurônios na am´ıgdala (Bauman et al, 2005) e menor número absoluto de células de Purkinje no cerebelo (Ingram et al, 2000), ambos resultados condizentes com a existência de um desenvolvimento sensorial e emocional comprometido dos indiv´ıduos dentro do TEA (Ameis e Catanis, 2014).

Com rela¸cão às conexões, foram encontradas contradi¸cões nos dados obtidos a par-tir do uso de imagem por tensor de difusão (ITD), que são apresentadas no trabalho de Ameis e Catanis (2014), as quais apontam diferen¸cas microestruturais das proje¸cões do fasc´ıculo uncinado e talâmicas para o córtex pré-frontal e lobo temporal como ocasiona-das pelo desenvolvimento alterado na organiza¸cão da substância branca e mieliniza¸cão no TEA. Sugere-se adicionalmente que as altera¸cões na percep¸cão sensorial descritas no autismo podem estar relacionadas devido a um desequil´ıbrio entre a conectividade neuroal inibitória e excitatória (Le Blanc e Fagiolini, 2011), no entanto foi uma hipótese recen-temente contestado por Goel e Portera-Cailliau (2019) e necessita, portanto, de mais evidências.

O fator genético no TEA parece estar relacionado a um conjunto de genes que codifi-cam prote´ınas da neurogênese, como o observado na S´ındrome do X frágil, S´ındrome de Rett, e na S´ındrome de Angelman (Munnich et al., 2019). Estudos envolvendo irmãos gêmeos monozigóticos também fornecem fortes evidências de hereditariedade genética no TEA (Brkanac et al, 2008), podendo chegar a uma taxa de herdabilidade de cerca de 80% entre gêmeos monozigóticos (Geschwind, 2011). Sugere-se ainda que alguns fatores ambientais possam contribuir para o desenvolvimento do TEA (Arndt et al., 2005), como o contágio da progenitora por algumas viroses durante a gravidez (ex: rubéola), e até mesmo o consumo de algumas drogas e substâncias (talidomida e ácido valpróico) no primeiro trimestre de gesta¸cão, per´ıodo onde se ocorre a neurula¸cão. O ácido valpróico (VPA) é um fármaco amplamente utilizado para tratamento de pacientes epilépticos ou

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com distúrbios de humor (Nalivaeva et al., 2009). Seu mecanismo de a¸cão ainda não é entendido em sua totalidade, porém sabe-se que ele atua na redu¸cão da atividade neural bloqueando os canais de sódio e cálcio existentes por aumentar os n´ıveis dos neurotrans-missores GABA no indiv´ıduo (Kwan and Brodie, 2001). Gestantes que fazem uso deste medicamento mostram uma taxa alta de filhos com caracter´ısticas autistas (Christensen et al., 2013). Ainda, estudos sobre a análise do histórico médico de crian¸cas mostram que a há uma forte correla¸cão entre o VPA utilizado na gravidez pela genitora e o nascimento de crian¸cas autistas (Moore et al., 2000).

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1.2 PER´

IODO CR´

ITICO

O per´ıodo cr´ıtico (PC) é descrito como uma janela de desenvolvimento pós-natal (Be-gum e Sng, 2017) altamente suscet´ıvel à plasticidade induzida pela experiência sensorial do ambiente. Durante o PC, a atividade elétrica gerada pela experiência sensorial modula a organiza¸cão dos mapas corticais, através da expansão e retra¸cão das conexões corticais e subcorticais (Wiesel et al..,1965; Berardi et al., 2000). O PC está presente tanto nos sistemas sensoriais como nos sistemas motores e cognitivos (Knudsen, 2004; Begum e Sng, 2017), e vem sendo bem descrito na literatura na forma¸cão do córtex de barril no córtex somatossensorial ( Lu et al., 2001), na visão binocular no córtex visual (Hensch, 2005a), no refinamento do mapa tonotópico auditivo (Hensch, 2005a; Anomal et al., 2015), e no aperfei¸coamento do sistema motor (Hensch, 2005b). O estudo do PC nos córtices senso-riais possui grande importância cl´ınica, pois o resultado da experiência sensorial at´ıpica ao longo de um PC terá dif´ıcil reversão no córtex na vida adulta (Knudsen, 2004).

A n´ıvel celular, são observados dois tipos de plasticidade cortical durante o PC (Butz et al., 2009): a plasticidade estrutural e funcional. A primeira é relacionada às mudan¸cas anatômicas na conectividade dos neurônios, com forma¸cão de novas conexões sinápticas e altera¸cões do número de neurônios e de sinapses existentes. Já a plasticidade funcional refere-se a “for¸ca” de uma única liga¸cão sináptica e sua capacidade para desempenhar a atividade dos neurônios existentes, que pode depender de diversos mecanismos, como: a inser¸cão ou remo¸cão de receptores pós-sinápticos, altera¸cão da libera¸cão pré-sináptica de transmissores e/ou altera¸cão da espessura da sinapse (Butz et al., 2009).

Com rela¸cão aos circuitos, a plasticidade dependente de experiência sensorial do PC está diretamente relacionada ao amadurecimento dos circuitos inibitórios (Hensch e Fagi-olini, 2004), que são compostos por interneurônios inibitórios que secretam o neurotrans-missor ácido gama aminobut´ırico (GABA), essenciais para a inibi¸cão lateral dos neurônios adjacentes e forma¸cão do equil´ıbrio entre as sinapses inibitórias e excitatórias (Swadlow, 2003). Estes interneurônios inibitórios são conhecidos, em sua maioria, como células parvalbumino-positivas (Hensch, 2005b). Estudos descrevem que neurônios parvalbumino-positivos estão diminu´ıdos no córtex somatossensorial de animais modelos dos TEA (Go-golla et al., 2009). Devido a essas caracter´ısticas, sugere-se que a altera¸cão na produ¸cão e libera¸cão de GABA seja capaz de contribuir para a sintomatologia autista (Yip et al., 2007), podendo resultar em um córtex hiperexcitável (Sousa, 2013).

Diversos estudos também têm demonstrado a importância do fator neurotrófico deri-vado do cérebro (BDNF) na abertura e dura¸cão do PC, e consequentemente no desenvol-vimento do córtex e percep¸cão visual (Cabelli R. et al, 1996), auditiva (Anomal et al., 2013) e somatossensorial (O’Leary et al., 1994). A expressão de BDNF é influenciada pela

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atividade neuronal do per´ıodo pós-natal, que por sua vez, determina o in´ıcio do amadure-cimento do circuito inibitório cortical (Anomal et al., 2013). No córtex auditivo primário (A1), a BDNF modula a organiza¸cão do mapa tonotópico, promovendo o chamado de per´ıodo cr´ıtico do desenvolvimento espectral de A1 (Anomal et al., 2013). O bloqueio da expressão de BDNF durante o per´ıodo cr´ıtico prejudica não só a especializa¸cão dos neurônios em A1, como também reduz a expressão de receptores gabaérgicos nesta região (Anomal et al., 2013).

Por este motivo, consideramos que o desenvolvimento adequado das conexões t´ alamo-corticais e córtico-corticais para as áreas somatossensorial, visual e auditiva primária seria importante para a abertura do PC e o desenvolvimento do mapa topográfico nestas regiões. Assim, o presente trabalho considerou por hipótese que os per´ıodos cr´ıticos das ´

areas sensoriais prim´arias estariam alterados nos TEA, contribuindo para as altera¸c˜oes sensoriais e comportamentais nos indiv´ıduos com autismo.

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1.3 C ´

ORTEX AUDITIVO PRIM ´

ARIO (A1)

Já se tem conhecimento que os neurônios do córtex auditivo projetam para as áreas adjacentes no hemisfério ipsilateral, assim como para as áreas corticais auditivas do he-misfério contralateral (Pandya e Sanides, 1973). Em roedores, as conexões do córtex auditivo vêm sendo estudadas em esquilos adultos (Sciurus carolinensis), como demons-trado no trabalho de Luethke e colaboradores (1988) por meio da inje¸cão de WGA-HRP (aglutinina de gérmen de trigo conjugada com peroxidase de rábano silvestre) em A1. Foi-se mostrado que esta área está conectada reciprocamente com o próprio A1, com a área Rostrodorsal (R), com a região Parieto-Rinal (PR), com a área Parieto-Ventral (PV), com a região Temporal Anterior intermediária (TAi) e Caudoventral (TAcv), além de outras regiões próximas de A1 do mesmo hemisfério. A Figura 1.1 resume o padrão de conexões aferentes de A1 em esquilos:

Figura 1.1: Conexões corticais de A1 no esquilo (Sciurus carolinensis). Uma inje¸cão de WGA-HRP (grande c´ırculo preto) foi confinada e centrada em A1, definindo-o arquitetônica e fisiologicamente. As delimita¸cões das áreas corticais foram desenhadas de acordo com várias seçcões do cérebro e então so-brepostas com a marca¸cão do neurotra¸cador, para formar uma ilustra¸cão composta. Os pontos maiores indicam a localiza¸cão dos corpos celulares marcados de forma retrógrada, enquanto os pontos menores representam a marca¸cão anterógrado. Imagem retirada de ( Imagem retirada de Luethke et al., 1988).

Um estudo feito no primata (Figura 1.2) macaco da noite Aotus trivirgatus, demons-trou que A1 projeta para as áreas ipsilaterais relacionadas ao sistema auditivo, tais como as áreas Rostral (R), ntero-Lateral (AL), Póstero-Lateral (PL), Rostro-Medial (RM) e Caudomedial (CM) (Fitzpatrick e Imig, 1980). No hemisfério contralateral, A1 projeta para as áreas RM, R, e ao próprio A1 (Fitzpatrick e Imig, 1980).

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Figura 1.2: Visão bidimensional demonstrando a proje¸cão topográfica de A1 em macaco da noite (Aotus trivirgatus). As linhas pretas grossas representam os limites citoarquitetônicos de A1 e R. A região preta se corresponde ao s´ıtio de inje¸cão de tritiado de Prolina 3H (radioativo). As áreas pontilhadas representam regiões do córtex que recebem proje¸cões da região injetada. As setas indicam a localiza¸cão dos cortes analisados no animal. Cada mapa é orientado com a parte anterior em baixo e medial à esquerda. Tamanho das barras representam 5mm. (Imagem retirada de Fitzpatrick e Imig, 1980).

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1.4 MODELO EXPERIMENTAL

Os modelos animais do TEA tentam reproduzir diferentes caracter´ısticas do autismo a partir de altera¸cões genéticas (Janusonis et al., 2006) ou ambientais (Schneider e Pr-zew locki, 2005). Um dos modelos mais utilizados atualmente é o modelo de indu¸cão do TEA por administra¸cão embrionária de VPA, padronizado primeiramente por Rodier e co-laboradores (1996). Este modelo em ratos resulta em altera¸cões morfológicas, fisiológicas e comportamentais similares ao autismo, tais como menor número de neurônios presentes nos núcleos motores do nervo craniano, anomalias cerebelares, altera¸cões imunológicas, comportamentos repetitivos, déficits na latência de resposta evocada eletrofisiológica e na funcionalidade social-emocional (Rodier et al., 1996; Ingram et al., 2000; Bugalho et al., 2006; Whishaw et al., 2005). Em testes com animais, a exposi¸cão a esta droga diminui a sensibilidade à dor, promove hiperatividade locomotora e aumenta o comportamento repetitivo (Schneider e Przew locki, 2005; Chomiak et al., 2013).

Devido às suas caracter´ısticas multidimensionais morfológicas, anatômicas, funcionais e fisiológicas, o modelo de autismo induzido pela administra¸cão embrionária de VPA em ratos se torna um interessante modelo para esta pesquisa, a fim de se compreender melhor a circuitaria neural e o desenvolvimento do PC dos sujeitos com TEA.

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1.5 JUSTIFICATIVA

No presente trabalho investigamos se a questão neurobiológica de conecctividade sub-jacente à abertura do PC de A1 nos ratos modelos de autismo induzidos por VPA se encontra alterada. Considerando que o número de células inibitórias nem sempre estão comprometidas nesta s´ındrome (Anomal et al., 2015), sugerimos que outros fatores pode-riam interferir na abertura e dura¸cão do PC. Por exemplo, o padrão alterado das conexões aferentes para A1 poderia ocasionar a diminui¸cão da expressão da prote´ına BDNF, atra-sando a matura¸cão da circuitaria inibitória cortical (Anomal et al., 2013) e consequente-mente a forma¸cão do mapa tonotópico (Anomal et al., 2015). Esta informa¸cão é relevante para a nossa hipótese, pois o est´ımulo sensorial influencia o desenvolvimento do mapa cortical por meio de proje¸cões aferentes vindas da periferia e do córtex cerebral (Budinger et al., 2006; Kimura et al., 2003).

Atualmente, as drogas dispon´ıveis para o tratamento do autismo se baseiam em con-tornar os sintomas disfuncionais com o uso de vitaminas e/ou psicotrópicos (Posey e McDougle, 2001), tais quais: antipsicóticos, ansiol´ıticos, antidepressivos e estabilizado-res de humor (Leskovec et al., 2008). Novas hipóteses para a neurobiologia do autismo ou o aprofundamento do conhecimento das altera¸cões já descritas são importantes para a melhor compreensão desta desordem, facilitando o desenvolvimento novas formas de tratamento (Begum e Sng, 2017) que possam trabalhar melhor os fatores centrais que desencadeiam esse transtorno. Por exemplo, confirmando a nossa hipótese, seria mais fácil desenvolver fármacos voltados à reabertura do per´ıodo cr´ıtico do desenvolvimento pós-natal e criar abordagens terapêuticas que envolvam estimula¸cão sensorial direcionada para este transtorno.

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Cap´ıtulo 2

Hip´

oteses e Objetivos

2.1 HIP ´

OTESES

Em nossa hipótese, sugerimos que haverá altera¸cões nas conexões córtico-corticais para os córtices sensoriais dos ratos modelo de autismo por administra¸cão embrionária de VPA. Estas altera¸cões poderiam ser um dos fatores contribuintes para falhas no tempo de abertura e fechamento do per´ıodo cr´ıtico dos córtices sensoriais.

2.2 OBJETIVO GERAL

Descrever as altera¸cões morfológicas relacionadas a um atraso na abertura e no fecha-mento do per´ıodo cr´ıtico do desenvolvifecha-mento pós-natal de áreas sensoriais primárias do TEA por meio da caracteriza¸cão do padrão de conexões aferentes destas áreas em ratos modelos de autismo.

2.3 OBJETIVO ESPEC´

IFICO

Descrever as altera¸cões das conexões córtico-corticais de A1 de ratos modelos de au-tismo e de ratos controles no primeiro dia pós-natal (P0.5).

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Cap´ıtulo 3

Materiais e M´

etodos

3.1 INDUC

¸ ˜

AO AO VPA

O presente trabalho foi aprovado pelo Comitˆe de ´Etica da Universidade Federal do Rio Grande do Norte (Protocolo 076/2017). Foi realizado por meio de um estudo experimental do tipo caso-controle.

Primeiramente, o ciclo estral das ratas fêmeas foi acompanhado por 5 dias, para iden-tifica¸cão do estágio do ciclo que ela se encontrava através do esfrega¸co vaginal. Ao iden-tificarmos o estágio de proestro, as fêmeas foram colocadas junto a um rato macho na mesma caixa. O dia em que foram encontrados espermatozóides no esfrega¸co foi definido como provável dia de fecunda¸cão [dia embrionário zero (E 0.5)]. Após 12 dias, no 12o dia do per´ıodo embrionário (E 12.5), foi realizada uma única inje¸cão intraperitoneal de 500 mg/kg de VPA (concentra¸cão de 250 mg/ml) em uma rata matriz do grupo caso e, uma inje¸cão de 500 mg/kg de salina a 0,9% na rata matriz do grupo controle. Sendo então utilizadas duas ratas fêmeas no total para os propósitos deste trabalho, cada uma servindo para um grupo de análise. Após o fim do per´ıodo gestacional, foram obtidas duas proles: a prole VPA, a qual nasceram 9 ratos, e a prole controle, a qual nasceram 3 ratos, as quais compunham, respectivamente, o grupo caso e o grupo controle. As fêmeas grávidas foram mantidas em caixas separadas no biotério após o momento analisado da fecunda¸cão até o parto, considerado dia pós-natal 0 (P 0.5).

(22)

3.2 EUTAN ´

ASIA, PERFUS ˜

AO E

DISSECAC

¸ ˜

AO CORTICAL

No dia P 0.5 (dia do nascimento), os filhotes foram separados da progenitora e re-ceberam uma inje¸cão anestésica de Tiopental (via i.p.), em dose de 100 mL/kg, sendo verificados os sinais de indu¸cão anestésica por meio do reflexo doloroso na cauda. Após isso, os animais foram perfundidos com 300 ml de solu¸cão salina, seguido de 300 ml de solu¸cão de Paraformalde´ıdo 4%. Depois da disseca¸cão do encéfalo, o restante do corpo do animal foi descartado respeitando as normas da CEUA.

3.3 INJEC

¸ ˜

AO DO NEUROTRAC

¸ ADOR

As inje¸cões para análise das conexões foram efetuadas com neurotra¸cador fluorescente retrógrado. Tra¸cadores retrógrados são captados pelos axônios e transportados para o corpo celular que então pode transmitir a proje¸cão. A inje¸cão deste tipo de tra¸cador per-mite identificar a localiza¸cão de neurônios que projetam para a área injetada (aferências). Nos animais dos grupos caso e controle (P 0.5), a inje¸cão do neurotra¸cador foi feita por meio da introdu¸cão de cristal de DiI post-mortem a 500 micrômetros de profundidade a partir da superf´ıcie pial (Molecular Probes, Eugene, OR). Este neurotra¸cador é uma carbocianina com pouco efeito em encéfalo maduros, que têm uma taxa de transporte post-mortem de 2 mm por mês em temperatura ambiente (Vercelli et al., 2000).

O encéfalo desses animais foi retirado do crânio e armazenado para fixa¸cão por uma semana em solu¸cão de paraformalde´ıdo 4% em tampão de PO4 (pH 7,4) (Azevedo et al., 1997). Os cristais de DiI foram inseridos de acordo com a área de interesse e por meio de coordenadas estereotáxicas do “Atlas of the Developing Rat Nervous System” (Paxinos et al., 1994). Em seguida, foram mantidos no mesmo fixador em temperatura ambiente por 4 a 6 meses (Azevedo et al., 1997). A microtomia foi realizada por meio de um vibrátomo Leica VT1000 S, com os encéfalos emblocados por agarose 3%, cortando-se seçcões coronais de 100-200 micrômetros. Todas as seçcões foram imersas em uma solu¸cão de 4’6-diamidina-2-fenilindol (DAPI) a 0.1 Molar para a caracteriza¸cão arquitetônica das camadas corticais e áreas cerebrais.

(23)

3.4 AN ´

ALISE DAS CONEX ˜

OES CORTICAIS E

SUBCORTICAIS

Cortes coronais alternados do encéfalo, exceto tronco encefálico e cerebelo, foram mon-tados para fluorescência e DAPI. Em seguida, foram analisados em um microscópio (Nikon C-HGFI) dotado de uma fonte de epifluorescência e filtros adequados para a observa¸cão dos s´ıtios de inje¸cão e das células marcadas retrogradamente pelo tra¸cador. Foram realiza-das fotomicrografias de todos os cortes marcados por DiI usando o software NIS-Elements AR 64-bit. As imagens foram obtidas a partir das objetivas de 2x, 4x e 10x.

Após a microfotografia das células fluorescentes e da arquitetura cortical por DAPI, a posi¸cão das células marcadas retrogradamente no córtex foram plotadas por meio do programa CANVAS 12 (ACDsee) de forma qualitativa pelas alunas de inicia¸cão cient´ıfica e posteriormente analisadas pela orientadora. Adicionalmente, neste programa foram demarcados digitalmente o contorno dos cortes e s´ıtios de inje¸cão observados.

(24)

Cap´ıtulo 4

Resultados e Discuss˜

ao

Até o momento foram processados e analisados três animais modelos de autismo inje-tados com DiI, (caso 2 a 4). Todos os animais analisados até o momento possuem VPA, não tendo portanto, um animal controle. Dois animais VPA tiveram DiI introduzido em A1, no hemisfério esquerdo (caso 2) e no hemisfério direito (caso 3). Em um animal VPA, o DiI foi introduzido no hemisfério direito somatossensorial (caso 4).

Para as marca¸cões de corpos de neurônios marcados retrogradamente pelo cristal de DiI, utilizamos as delimita¸cões já conhecidas na literatura sobre o formato caracter´ıstico triangular de seu corpo, fazendo uma classifica¸cão qualitativa, como mostrado abaixo (Figura 4.1) e segundo trabalho proposto por Vercelli e colaboradores (2000).

Figura 4.1: Esquema de como as marca¸cões de neurônios foram feitas em amplia¸cão. A: Imagem sem amplia¸cão, mostrando a localiza¸cão de onde se retirou as imagens B e C: Amostragem de corpos de neurônios com (B) e sem (C) as marca¸cões. As setas indicam a localiza¸cão dos corpos celulares. O tra-cejado azul indica marca¸cões anterógradas feitas pelo cristal de DiI e que não serão analisadas. Aumento de 10x em todas as imagens.

No Caso 2, com inje¸cão no hemisfério esquerdo de A1 (Figura 4.2), foi poss´ıvel ob-servar as áreas corticais contendo células retrogradamente marcadas no Córtex cingulado

(25)

(Cg) no Córtex Frontal (Fr), um pouco na Área Anterior do Córtex (FL), e principalmente na Área 1 do Córtex Parietal (Par1) e no Córtex Insular (Ins) em ambos os hemisférios (Figura 4.3: A, B, C, D e E). Para verificarmos que os s´ıtios de inje¸cão se encontra-vam devidamente no Córtex Auditivo, comparamos as regiões Pós-natais com as regiões encontradas em adultos. Conseguimos averiguar com isso que, na Figura 4, o s´ıtio de inje¸cão se encontra onde seria o Córtex Auditivo Primário (Au1), e um pouco do Córtex Auditivo Secundário dorsal (AuD).

Figura 4.2: S´ıtio de inje¸cão de cristal de DiI em caso 2. A esquerda mostra s´ıtio de inje¸cão em filtro de Fluoresce´ına. A direita s´ıtio de inje¸cão em filtro de Rodamina. O corte se assemelha a aproximadamente `

a imagem P0-34 da segunda edi¸cão de “Atlas do Desenvolvimento do Sistema Nervoso de Ratos” de Paxinos et al. (1994), e à figura 84 da sexta edi¸cão de “The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates” de Paxinos e Watson (2007), fazendo uma liga¸cão ao cérebro adulto. Aumento de 10x em ambas as imagens.

Figura 4.3: Corte coronal de caso 2. A: O corte apresenta filtro azul corado por DAPI mostrando as demarca¸cões do córtex. Se assemelha a aproximadamente a imagem P0-12 da segunda edi¸cão de “Atlas do Desenvolvimento do Sistema Nervoso de Ratos” de Paxinos et al. (1994). B e C: Os cortes de cima revelam marca¸cões feitas do hemisfério direito. D e E: Marca¸cões feitas do hemisfério esquerdo. O pontilhado verde representa marca¸cões de corpos de neurônios e os tra¸cos azuis indicam axônios que foram marcados anterogradamente. Aumento de 2x em A e de 10x em B-E.

(26)

No Caso 3, a inje¸cão do cristal de DiI foi feita em A1, no hemisfério direito (Figura 4.4). Como resultado das análises, foram observadas células nas áreas corticais Frontal (Fr), na Placa Cortical (CxP), e da Área 1 do Córtex Parietal (Par1) nos dois hemisférios (Figura 4.5: A, B, C, D, E). Na Figura 4.4, o s´ıtio de inje¸cão se encontra próximo do que seria o Au1, Córtex Auditivo Secundário Ventral (AuV) e também o Córtex Entorrinal (Ect).

Figura 4.4: S´ıtio de inje¸cão de cristal de DiI em caso 3. A esquerda mostra s´ıtio de inje¸cão em filtro de Fluoresce´ına. A direita é o s´ıtio de inje¸cão em filtro de Rodamina. O corte se assemelha a aproximada-mente à imagem P0-31 da segunda edi¸cão de “Atlas do Desenvolvimento do Sistema Nervoso de Ratos” de Paxinos et al. (1994), e à figura 65 da sexta edi¸cão de “The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates” de Paxinos e Watson (2007), fazendo uma liga¸cão ao cérebro adulto . Aumento de 10x em ambas as imagens.

(27)

No Caso 4, a inje¸cão do cristal de DiI foi feita em S1, no hemisfério direito. Como resultado das análises, foi poss´ıvel observar células nas áreas corticais Fr, no Córtex Agra-nular Insular (AI), na Placa Cortical (CxP) e na Par1 em ambos os hemisférios (Fig 4.6: A, B, C, D e Fig 4.7: A, B, C, D, E).

Figura 4.6: Corte coronal de caso 4. A: O corte apresenta filtro azul corado por DAPI mostrando as demarca¸cões do córtex. Se assemelha a aproximadamente a imagem P0-2 da segunda edi¸cão de “Atlas do Desenvolvimento do Sistema Nervoso de Ratos” de Paxinos et al. (1994). B e C: Os cortes de cima revelam marca¸cões feitas do hemisfério direito. D e E: Marca¸cões feitas do hemisfério esquerdo. O pontilhado verde representa marca¸cões de corpos de neurônios e os tra¸cos azuis indicam axônios que foram marcados anterógradamente. Aumento de 4x em A e de 10x em B-E.

(28)

Essas marca¸cões, feitas no presente trabalho, indicam que o neutro¸cador foi transpor-tado da sua área de inje¸cão até as áreas acima citadas, e que no nascimento, A1 e S1 já recebem proje¸cões de diversas áreas corticais, muitas delas presentes em ratos adultos. A partir de estudos sobre as aferências talâmicas do córtex somatossensorial feito por Jo-nes (1981) e Erzurumlu e Jhaveri (1990), já são observáveis um padrão de neurônios nos ´

ultimos dias embrionários e primeiros dias pós-natal, demonstrando certo desenvolvimento já presente nesses córtices.

Como já citado anteriormente, o diagnóstico cl´ınico dos TEA é promovido em crian¸cas a partir dos 4 anos de idade e permanecendo no indiv´ıduo adulto. Sendo nossas análises promovidas em modelos animais recém nascidos (P0.5), fizemos aqui a compara¸cão com as áreas encefálicas presentes nos adultos para que, dessa compara¸cão, possamos verificar se há alguma anomalia já presente na circuitaria primária destes animais.

No caso 2, fizemos a compara¸cão do corte apresentado (Figura 4.3) com a figura 14 da sexta edi¸cão de “The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates” de Paxinos e Watson (2007). No corte as áreas apresentadas como o Córtex cingulado (Cg), Córtex Frontal (Fr), a Área Anterior do Córtex (FL), e a Área 1 do Córtex Parietal (Par1) e o Córtex Insular (Ins). No adulto são denominadas como a Área 1 do Córtex Cingulado (Cg1), o Córtex Motor Secundário (M2), o Córtex Motor primário (M1), a Área Somatossensorial Primária (S1ULp), Córtex Agranular Insular (GI), Córtex Insular Desgranular (DI), e o Córtex Insular Agranular Dorsal (AID) e ventral (AIV), respectivamente. Aparenta-se com isto que, no neonato, o Par1 se desenvolve em S1ULp e a Ínsula em GI, DI, AID e

(29)

AIV nessa regi˜ao encef´alica analisada.

No caso 3, fizemos a compara¸cão do corte apresentado (Figura 4.5) com a figura 13 da sexta edi¸cão de “The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates” de Paxinos e Watson (2007). No corte as áreas apresentadas como o Córtex Frontal (Fr), a Placa Cortical (CxP), e a Área 1 do Córtex Parietal (Par1). No adulto são denominadas como Córtex Motor Secundário (M2), o Córtex Motor primário (M1), as Áreas Somatossensoriais Primária (S1FL), (S1DZ) e (S1J), respectivamente. Aparenta-se com isto que, no neonato, o Par1 se desenvolve em S1FL, S1DZ e S1 nessa região encefálica.

No caso 4, fizemos a compara¸cão do corte (Figura 4.6) apresentado com a figura 6 da sexta edi¸cão de “The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates” de Paxinos e Watson (2007). No corte as áreas apresentadas como Fr (Fig. 4.6: B e C), e Córtex Agranular Insular (AI) (Fig. 4.6: D). No adulto são denominadas como o Córtex Motor Secundário (M2) e o Córtex Orbital Dorsolateral (DLO), respectivamente. Aparenta-se com isto que, no neonato, o Fr se desenvolve em M2 e o AI em DLO nessa região encefálica.

Ainda no caso 4, fizemos a compara¸cão do corte (Figura 4.7) apresentado com a figura 15 da sexta edi¸cão de “The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates” de Paxinos e Watson (2007). No corte as áreas apresentadas como CxP, Par1 e Ins. No adulto são denominadas como (S1FL), (S1DZ), (S1J), (S1DZO), S1ULp, e Córtex Agranular Insular (GI), Córtex Insular Desgranular (DI), e o Córtex Agranular Dorsal (AID) e ventral (AIV), respectivamente. Aparenta-se com isto que, no neonato,a CxP se desenvolve nas

´

Areas Somatossensoriais primárias S1FL e S1DZ, o Par1 se desenvolve em nas Áreas Somatossensoriais primárias S1J, S1DZO e S1ULp e a Ínsula em GI, DI, AID e AIV.

´

E importante ressaltar que se foi utilizado as análises do Córtex Somatossensorial neste trabalho por já ser uma área muito bem conceituada na literatura, e tivemos o intuito de analisar, com isso, se as proje¸cões estimadas possuem certo grau de confiabilidade.

A exposi¸cão ao VPA no embrião causa mudan¸cas e preju´ızos a longo prazo na tra-jetória do neurodesenvolvimento do indiv´ıduo, como já mencionado anteriormente. Par-ticularmente, um estudo in vivo em camundongos mostrou colora¸cão de Nissl reduzida em neurônios corticais e redu¸cão da neurogênese em córtex pré-frontal e somatossenso-rial após exposi¸cão in vivo ao VPA (500 mg / kg i.p.) em E12.5 (Kataoka et al., 2011). Essas mudan¸cas pós-natais provindas da neurogênese foram associadas com um poss´ıvel aumento da apoptose e redu¸cão da prolifera¸cão celular em células embrionárias (Kataoka et al., 2011).

Rodier e colaboradores (1996) fizeram um trabalho comparando caracter´ısticas neu-roanatômicas de ratos expostos a VPA e cérebros humanos de autistas post-mortem, e conclui que o impacto do VPA estava relacionado com o tempo de fechamento do tubo neural. Algumas anormalidade anatômicas incluem mudan¸cas na densidade e número de

(30)

neurônios em várias regiões do cérebro (Frisch et al., 2009).

Como em nosso trabalho observamos as conexões córtico-corticais no neo-córtex, é im-portante estabelecer que a exposi¸cão ao VPA altera a morfologia e os circuitos neurais de uma maneira complexa: a excitabilidade neural é alterada (Anomal et al., 2015), existem mudan¸cas pré e pós-sinápticas sugeridas pelos dados de estudos anteriores, entre outros. É dif´ıcil identificar, contudo, quais altera¸cões são primárias e quais são secundárias. Nessas altera¸cões, alguns trabalhos apontam aumento da complexidade de arboriza¸cão dendr´ıtica no córtex motor, além do aumento da conectividade com células vizinhas nos córtex soma-tossensorial e pré-frontal medial. Em ambos os casos, o aumento do número de conexões acompanha a diminui¸cão da for¸ca dessas conexões e pode sustentar uma hiperreatividade da circuitaria (Rinaldi et al., 2008a, 2008b).

Em nosso estudo, apesar dos resultados ainda iniciais, observamos diversas conexões córtico-corticais por meio da marca¸cão do DiI, as quais se vê necessário a adi¸cão da análise do grupo controle e mais análises de animais de ambos os grupos para determinar se existem, de fato, altera¸cões nas conexões e como elas afetam no fenótipo do indiv´ıduo autista. No entanto, conseguimos observar que diversas áreas cerebrais se comunicam com o córtices auditivos primário, como a região frontal, motora e ´ınsula. Sendo verifi-cado, com isto, apenas as proje¸cões córtico-corticais para o A1 e S1, e não suas poss´ıveis altera¸cões. Tal como Rinaldi e colaboradores (2008b), demonstraram em seu estudos ci-tados anteriormente e que podem ser os causadores das respostas exacerbadas do sujeito enquadrado nos TEA.

(31)

Cap´ıtulo 5

Conclus˜

ao

Ao longo do tempo, diversas anormalidades vêm sendo descritas em decorrência do uso do VPA no per´ıodo embrionário. Recentemente, um interesse maior vem se direcionando para a indu¸cão do TEA em indiv´ıduos expostos a este medicamento durante a gesta¸cão. Esses efeitos sofrem influência da dose, sexo, data de indu¸cão e da frequência de exposi¸cão, até onde se tem dados.

Em nosso estudo usamos a dose de 500 mg/kg, que é suficiente para induzir o quadro do autismo em modelos animais, e observamos proje¸cões corticais similares tanto para o córtex auditivo primário (A1) quanto para o somatossensorial primário (S1) durante as análises.

Conclu´ımos que não existe especificidade nas conexões córtico-corticais aferentes para o A1 no dia do nascimento, mas que a hipótese inicial não pôde vir a ser corroborada por não ter entrado, no presente trabalho, os dados referentes à análise do grupo controle. O impacto deste trabalho está em poder demonstrar os procedimentos feitos e as fotografias analisadas em córtices de poss´ıvel A1 e S1 de ratos modelos de autismo logo após o nascimento, feito que não há muito conhecimento na literatura atual. No entanto, nossos resultados se demonstram inconclusivos, pois os dados ainda estão em processo de análise, no sentido de aumentar a amostra e incluir mais animais do grupo controle, e obter assim mais respostas à pergunta deste trabalho.

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