UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE BIOCIÊNCIAS CURSO DE BIOMEDICINA
DOUGLAS FELIPE DE LIMA SILVA
Estudo das vias de reparo de DNA em Câncer de Bexiga Natal-RN 2019
Estudo das vias de reparo de DNA em Câncer de Bexiga por
DOUGLAS FELIPE DE LIMA SILVA
Monografia Apresentada à Coordenação do Curso de Biomedicina da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como
Requisito Parcial à Obtenção do Título de Bacharel em Biomedicina.
Orientadora: Profª. Drª. Tirzah Braz Petta Lajus
Natal-RN 2019
Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN Sistema de Bibliotecas - SISBI
Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Setorial do Centro de Biociências – CB
Silva, Douglas Felipe de Lima.
Estudo das vias de reparo de DNA em Câncer de
Bexiga / Douglas Felipe de Lima Silva. - Natal, 2019. 45 f.: il.
Monografia (Graduação) - Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Centro de Biociências. Curso de Biomedicina.
Orientadora: Profa. Dra. Tirzah Braz Petta Lajus.
1. Câncer de bexiga - Monografia. 2.
Bioinformática - Monografia. 3. Cigarro - Monografia. 4. Reparo de DNA - Monografia. I. Lajus, Tirzah Braz Petta. II. Universidade Federal do Rio Grande do Norte. III. Título.
RN/UF/BSE-CB CDU 616-006.6
AGRADECIMENTOS
Agradeço a todos os outros colegas pesquisadores que realizaram estudos que serviram como inspiração e embasamento para este trabalho.
Agradeço imensamente e eternamente a minha orientadora Tirzah Petta que há quatro anos atrás me acolheu como seu orientando me dando a oportunidade de participar do seu grupo de pesquisa que me envolvi e desenvolvi atividades e projetos incríveis.
Agradeço ao professor Jorge Estefano de Souza e seu aluno Danilo que mesmo com seus próprios afazeres se disponibilizaram a me auxiliar no aprendizado da linguagem de programação utilizada nesse trabalho.
Sou grato a toda minha família que sempre acreditou e mim, me apoiou em todos os momentos da minha vida e sempre deram o seu melhor para me tornar quem sou hoje. Agradeço a todos da banca avaliadora que se interessaram e se dispuseram a participar e avaliar o trabalho que desenvolvi.
RESUMO
Afetando 500 mil pessoas em todo mundo, o câncer de bexiga compreende uma série de lesões que acometem o urotélio e variam entre pequenas lesões benignas até tumores agressivos que podem sofrer metástase e levar a morte. O consumo de tabaco se destaca como o principal fator de risco para o desenvolvimento do câncer de bexiga e seus compostos são capazes de promover uma série de lesões no DNA que promovem a ativação das vias de reparo do DNA para manutenção da integridade do material genético. Utilizando bancos de dados foram secionados pacientes com câncer de bexiga e definidos 51 genes de 6 vias de reparo e da família APOBEC para estudar a influência do tabagismo em sua expressão de acordo com a classificação molecular de Lund. Foram observadas alterações em todas as vias de reparo, as alterações se mostraram específicas de acordo com a proteína e seu grupo molecular, a influência do tabagismo também se apresentou de forma específica para cada proteína e dependente ou não do status de fumante.
ABSTRACT
Affecting 500,000 people worldwide, bladder cancer comprises a range of lesions that affect the urothelium, ranging from small benign lesions to aggressive tumors that can metastasize and lead to death. Tobacco use stands out as the main risk factor for the development of bladder cancer and its compounds are capable of generating a series of DNA lesions that promote activation of DNA repair pathways to maintain the integrity of genetic material. Using databases, patients with bladder cancer were sectioned and 51 genes from 6 repair pathways and from the APOBEC family were defined to study the influence of smoking on their expression according to the molecular classification of Lund. Changes were observed in all repair pathways, the changes were specific according to the protein and its molecular group, the influence of smoking was also specific for each protein and dependent or not on smoking status.
ÍNDICE LISTA DE ABREVIATURAS... 8 LISTA DE TABELAS ... 9 LISTA DE FIGURAS ... 10 1 – INTRODUÇÃO ... 12 1.1 O Câncer de Bexiga ... 12
1.1.1 Classificações Histopatológicas do Câncer de Bexiga ... 13
1.1.2 Desenvolvimento e Classificações Moleculares do Câncer de Bexiga ... 15
1.2 Tabagismo e o Câncer de Bexiga ... 18
1.3 Carcinógenos provenientes do tabaco ... 19
1.3.1 Hidrocarbonetos Aromáticos Policíclicos (PAH) ... 19
1.3.2 Aminas Aromáticas (AA) e Aminas Aromáticas Heterocíclicas (HAA) ... 20
1.3.3 Nitrosaminas ... 21
Espécies Reativas de Oxigênio (ROS) ... 21
1.4 Atuação das Vias de Reparo do DNA nas lesões provenientes dos componentes do tabaco ... 22
1.4.1 Reparo por Excisão de Nucleotídeos (NER) ... 22
1.4.2 Reparo por Excisão de Bases (BER) ... 22
1.4.3 Reparo de Bases Mal Pareadas (MMR) ... 23
1.4.4 Recombinação Homologa (HR) ... 23
1.4.5 Recombinação Não Homologa (NHEJ) ... 23
1.4.6 Síntese Translesão (TLS) ... 23
2 – OBJETIVOS ... 25
3 – MATERIAIS E MÉTODOS ... 26
3.1 Obtenção dos dados relativos a pacientes com Câncer de Bexiga ... 26
3.2 Seleção dos genes associados as vias de reparo ... 26
3.3 Manipulação dos dados e extração dos resultados ... 27
3.4 Confecção dos gráficos e validação estatística ... 27
4 – RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 28
5 – CONCLUSÕES ... 39
LISTA DE ABREVIATURAS
AA - Aminas Aromáticas
APOBEC - Apolipoprotein B mRNA editing catalytic polypeptide-like BER - Reparo por Excisão de Bases
DFS – Disease Free Survival
EAU - European Association of Urology
FGFR3 - Receptor de Fator de Crescimento do Fibroblasto GU - Genomically Unstable
HR - Recombinação Homologa
IARC - International Agency for Research on Cancer ISUP - International Society of Urological Pathology KEGG - Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes MAPK - Proteínas Kinases Ativadas por Mitógenos Mês – Mesenchymal
MMR - Reparo de Bases Mal Pareadas NER - Reparo por Excisão de Nucleotídeos NHEJ - Recombinação Não Homologa WHO - Organização Mundial da Saude OS – Overall Survival
PAH - Hidrocarbonetos Policíclicos Aromáticos PI3K - Fosfatidilinositol 3-quinase
PUNLMP - Neoplasias Uroteliais Papilares de Baixo Potencial Maligno SC – Squamous
TCGA – The Cancer Genome Atlas TLS - Sintese Translesão
TNM - Tumor, Nódulo Linfático e Metástase Uro – Urobasal
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Marcadores histopatológicos associados a cada grupo molecular. (SJÖDAHL,
2018) ... 18
Tabela 2: Relação de genes e vias selecionados para o estudo.. ... 26
Tabela 3:Dados clínicos da coorte utilizada no estudo. ... 28
Tabela 4:Valores de p-value da expressão das proteínas analisadas ... 38
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Classificação histopatológica do carcinoma urotelial de acordo com os critérios
WHO/ISUP. ... 14
Figura 2:Vias de sinalização envolvidas no desenvolvimento dos tumores de baixo e alto grau. ... 16
Figura 3:Principais representantes dos PAH (MOORTHY e colab., 2015) ... 20
Figura 4: Principais representantes das AA e HAA (TURESKY e LE MARCHAND, 2011) ... 20
Figura 5: Principais representantes das nitrosaminas (HECHT, 2011) ... 21
Figura 6: Principais representantes dos ROS (HELD e INSTRUMENTS, 2015) ... 21
Figura 7: Esquema dos principais danos ao DNA e suas vias de reparo. (WEEDEN, 2018) 24 Figura 8:Proteínas da via NER com alteração na expressão. ... 30
Figura 9: Proteínas da via BER com alteração na expressão... 31
Figura 10:Proteínas da via MMR com alteração na expressão. ... 32
Figura 11: Proteínas da via HR com alteração na expressão ... 33
Figura 12:Proteínas da via NHEJ com alteração na expressão... 34
Figura 13:Proteínas da via TLS com alteração na expressão. ... 35
Figura 14:Proteínas da família APOBEC com alteração na expressão. ... 36
Figura 15:Sobrevida Global e Sobrevida Livre de Doença no grupo SC. ... 37
Figura 16:Sobrevida Global no grupo URO. ... 37
1 – INTRODUÇÃO 1.1 O Câncer de Bexiga
O câncer de bexiga engloba lesões do tipo epitelial de transição e escamoso, representando 95% dos casos, sendo os 5% restantes compostos por carcinomas glandulares. Os tumores uroteliais compreendem uma série de lesões observadas onde ocorre o Urotélio, epitélio de transição que reveste a bexiga e se estende da pelve renal até a uretra distal(JON C., 2013).
O câncer de bexiga é o mais comum dentre os tumores do trato urinário, sendo responsável por cerca de 200.000 mortes e incidência de aproximadamente 500.000 casos por ano em todo o mundo e dentre os países ocidentais ocupa a décima posição entre os casos mais comuns de câncer (BRAY e colab., 2018). No brasil, a estimativa de novos casos é cerca de 9 mil (INCA, 2018). De acordo com o sexo, existem diferenças na incidência do câncer de bexiga, Dobruch relata em uma revisão da literatura que a incidência do câncer de bexiga em homens é de três a quatro vezes maior que nas mulheres, entretanto elas tendem a serem diagnosticadas em estágios mais avançados da doença (DOBRUCH e colab., 2016).
O câncer de bexiga é substancialmente uma doença relacionada ao envelhecimento, com surgimento a partir dos 60 anos, sendo raro em indivíduos abaixo dos 40 anos. O consumo de tabaco se destaca como o principal fator de risco para o desenvolvimento do câncer de bexiga, entretanto estima-se que 27% dos casos possuem influência da exposição ocupacional a Aminas Aromáticas (AA), Hidrocarbonetos Policíclicos Aromáticos (PAH) (MALATS e REAL, 2015). Em 2005 García demonstrou a importância do componente genético ao estudar a influência dos genes NAT2 e GSTM1, responsáveis pelo metabolismo desses compostos, e seu risco para o câncer de bexiga (MALATS e colab., 2005). Outros fatores de risco incluem consumo de agua contaminada por arsênico, infecções crônicas por
Schistosoma spp, exposição à radiação ionizante, exposição intensa em longo prazo a
ciclofosfamida, uso crônico de analgésicos(KNOWLES e HURST, 2015; JON C., 2013). Os sintomas mais comuns do câncer de bexiga incluem hematúria indolor e hematúria macroscópica, a suspeita pode surgir também de sintomas relacionados a obstrução do canal urinário, acarretando na urgência urinária (MAFFEZZINI e CAMPODONICO, 2010). O diagnóstico pode ser realizado por Ressonância Magnética, Tomografia Computadorizada, Radiografia ou Cistoscopia, um procedimento realizado pelo urologista que consiste em aplicação de anestesia local e introdução na uretra de um scope flexível com uma câmera para permitir a observação do interior do órgão. Amostras histológicas podem ser obtidas
através de biopsia transuretral, assim como podem ser realizadas observações das células dispersas na urina pela citologia (CARE, 2017). Detectada alguma anomalia após os exames diagnósticos, é realizado o procedimento de ressecção transuretral que provê informação histopatológica essencial para determinar a conduta de tratamento. Tumores de baixo risco são tratados com ressecção da região comprometida seguida por dose única de imunoterapia, tumores de alto risco são submetidos a quimioterapia intravesical (DEGEORGE e colab., 2017).
1.1.1 Classificações Histopatológicas do Câncer de Bexiga
O câncer de bexiga consiste em lesões do urotélio que se apresentam de diferentes formas, representando cerca de 90% dos casos de câncer de bexiga e variando entre pequenas lesões benignas até tumores agressivos que sofrem metástase e podem levar a morte. Pelo caráter heterogêneo desse tipo de lesão, surgiu a necessidade de um sistema de classificação aceito universalmente entre patologistas, urologistas e oncologistas que englobasse as lesões pré-neoplásicas e neoplásicas do urotélio e em 2004 a Organização Mundial da Saúde (OMS) adotou os critérios de classificação propostos pela International Society of Urological Pathology (ISUP), que consiste na caracterização histológica da lesão, sendo a existência de tal sistema vital determinar o grau da lesão e definir a conduta clínica do paciente (KIRKALI e colab., 2005; JON C., 2013).
O sistema WHO/ISUP agrupa os tumores em Neoplasias Uroteliais Papilares de Baixo Potencial Maligno (PUNLMP), Carcinoma Urotelial de Baixo Grau e Carcinoma Urotelial de Alto grau. As PUNLMP se apresentam como lesões de morfologia papilar com um núcleo de tecido fibrovascular frouxo recoberto por urotélio mais espesso que o comum e não estão associados a invasão. O Carcinoma Urotelial de Baixo Grau aparenta certa manutenção dos aspectos citológicos e do arranjo das células, sua polaridade e coesão, apresentam leve polimorfismo nuclear refletido na variação de seu tamanho e forma e poucas figuras de mitose, nesse estado do tumor ocorre invasão da lâmina própria e parte da camada muscular superficial da bexiga. O Carcinoma Urotelial de Alto grau exibe células pouco coesas, sem polaridade definida e desarranjo celular, com figuras de mitose frequentes e atípicas e com maior inclinação a invadir a mucosa até as camadas musculares mais profundas e sofrerem metástase (KNOWLES e HURST, 2015; JON C., 2013). Lesões de baixo grau geralmente surgem em vários focos no epitélio e tendem a ser recorrentes, porém raros são os casos no
qual a doença avança para o estágio invasivo enquanto as lesões de alto grau tendem a desenvolver tumores metastáticos (WU, 2005).
Dada a necessidade de realizar o estadiamento patológico das lesões, em 2002 a European Association of Urology (EAU) apresentou o sistema de estadiamento patológico TNM (Tumor, Nódulo Linfático e Metástase) para o câncer de bexiga. O sistema TNM para o câncer de bexiga consiste em lesões Ta onde não existe evidencia de tumor invasivo, apenas o aparecimento de papilomas não invasivos, T1 consiste em tumores com capacidade de invadir a lamina própria do epitélio, T2 engloba tumores que invadem a camada muscular e se divide em T2a que invadem a camada mais superficial de musculo e T2b invasores das camadas mais profundas. T3 consiste em tumores que invadem tecidos perivesicais enquanto tumores T4 apresentam a características de crescimento mais agressivas capacidade de invadir outros órgãos, como ilustra a Figura 1 ( JON C., 2013;KIRKALI e colab., 2005; OOSTERLINCK e colab., 2006).
Figura 1: Classificação histopatológica do carcinoma urotelial de acordo com os critérios WHO/ISUP. A figura ilustra as etapas do desenvolvimento do câncer de bexiga e características dos tumores. (KNOWLES e HURST, 2015)
1.1.2 Desenvolvimento e Classificações Moleculares do Câncer de Bexiga
Historicamente (III e colab., 1994) a hipótese proposta para o surgimento do câncer de bexiga se baseia no modelo de duas vias (Figura 2) para distinguir os carcinomas de alto e baixo grau. Nesse modelo, o carcinoma de baixo grau não invasivo apresenta uma série de alterações genéticas características em vias como a das Proteínas Kinases Ativadas por Mitógenos (MAPK), que está envolvida na regulação do ciclo celular, proliferação, diferenciação celular e apoptose (DHILLON e colab., 2007) e a via Fosfatidilinositol 3-quinase (PI3K) que também participa do controle do ciclo celular, sobrevivência celular, crescimento celular e angiogênese, envolvida também nos processos de síntese proteica (DUEÑAS e colab., 2015).
A maioria dos casos de tumores não invasivos apresentam alterações ligadas ao Receptor de Fator de Crescimento do Fibroblasto (FGFR3), que pertence a via MAPK (BILLEREY e colab., 2001). Di Martino relata que em experimentos realizados em culturas de células uroteliais humanas, a expressão de FGFR3 mutante promove a ativação de proteínas da família RAS, levando as células a apresentarem um fenótipo superdesenvolvido ao momento da confluência, sugerindo que FGFR3 atue nos eventos iniciais da hiperplasia urotelial e estima que a ativação da via RAS-MAPK contribua para o desenvolvimento de aproximadamente 80% dos tumores não invasivos (DI MARTINO e colab., 2009; JEBAR e colab., 2005)(JEBAR e colab., 2005)(JEBAR e colab., 2005). Mutações pontuais nos códons 12 e 13 do protoncogene HRAS foram descobertas (BOULALAS e colab., 2009) e estão associadas a ativação constitutiva de RAS, que por si só é suficiente para ativar as vias MAPK e PI3K. Esta via também pode ser ativada por mutações no gene PIK3CA que codifica uma subunidade da proteína PI3K, e sua prevalência nos carcinomas não invasivos chega a quase 50% (SOLOMON e HANSEL, 2016). Alterações em outros membros da via PI3K também são frequentes, como em PTEN (MARTIN-DOYLE e KWIATKOWSKI, 2015), uma fosfatase que regula negativamente a atividade de PI3K, e do complexo TSC, onde, devido a alterações cromossômicas e mutações em TSC1 e TSC2, a síntese proteica na célula fica comprometida devido a perda da regulação da proteína mTOR (WEINSTEIN e colab., 2014). Cerca de 50% dos tumores apresentam deleção do cromossomo 9 na região 9p21 onde se encontram proteínas como a p16 e p14, que são reguladores da atividade de RB e p53, respectivamente (SANLI e colab., 2017).
Tumores do tipo invasivo geralmente apresentam pior prognóstico e estão associados a metástase, tais tumores possuem frequentes mutações em genes que regulam o ciclo celular, especificamente os envolvidos na transição G1/S. A maioria dos casos de câncer de bexiga apresentam perda de um dos alelos TP53 associada a mutação no outro alelo, acarretando a perda de função de p53, gerando células incapazes de regular seu ciclo. Deleções do cromossomo 13 comprometem a via da proteína RB e na ocasião de sua perda a célula tende a progredir no ciclo celular, independente de sinalização externa ou danos no DNA. Também apresentam deleção no cromossomo 9, nas regiões 9q22, 9q32-33 e 9q34, comprometendo a expressão de genes supressores tumorais como Netrin, TSC1, PTCH e DBCCR1, respectivamente (Luis, N. M. e colab., 2007). São relatadas mutações nos genes do reparo e reconhecimento de dano ao DNA como ERCC2, ATM e FANCA (KNOWLES e HURST, 2015).
Figura 2:Vias de sinalização envolvidas no desenvolvimento dos tumores de baixo e alto grau. A figura ilustra as proteínas alteradas (destacadas em vermelho) da via MAPK em tumores não invasivos e das proteínas p14, p53 e RB em tumores invasivos (KEGG Pathway Database)
Devido a heterogeneidade clinica com a qual o câncer de bexiga se apresenta, esse modelo de duas vias simplifica a complexidade da doença e com o advento e desenvolvimento de novas técnicas de biologia molecular, diversos grupos e instituições de pesquisa (CHOI e colab., 2014; DAMRAUER e colab., 2014; WEINSTEIN e colab., 2014) fizeram uso desses recursos para subclassificar de acordo com outras alterações moleculares observadas em diversos tumores.
De relevância para o atual estudo, adotou-se a classificação realizada pelo grupo de Lund (SJÖDAHL e colab., 2012), pioneiro na utilização dos perfis de expressão de mRNA dos tumores para realizar a taxonomia molecular dos subtipos de câncer de bexiga. Ao analisar o perfil de expressão de 308 casos de câncer de bexiga, o grupo determinou a existência de 5 subtipos moleculares que mostram desfechos clínicos distintos e que diferem quanto a expressão de genes relacionados ao ciclo celular, receptores tirosina quinase (FGFR3, ERBB2, e EGFR), citoqueratinas, genes de adesão celular, e frequência de mutação em TP53.
O grupo Urobasal engloba tumores do tipo Ta e são caracterizados por marcadores de diferenciação urotelial e adesão celular (citoqueratinas) com alta expressão, conferindo características ligeiramente diferentes do tecido normal. Tumores do tipo Mesenchymal apresentam infiltrado inflamatório característico, provavelmente indicando a ocorrência de alterações celulares em proteínas da parede celular devido à perda de diferenciação e apresentando matriz contendo marcadores de células não tumorais. Tumores considerados Genomically Unstable apresentam atividade de invasão tecidual, alta proliferação e expressão dos genes ativados na fase tardia do ciclo celular, assim como redução na expressão das moléculas de aderência. O grupo Squamous apresentou a expressão de queratinas que normalmente não se apresentam no urotélio, como KRT4, KRT6A, KRT6B, KRT6C, KRT14 além de mau prognóstico, enquanto o grupo Basal engloba tumores com elevadas frequências de mutação em FGFR3, CCND1, TP63 e TP53. Além dessa classificação baseada no perfil molecular dos tumores, em 2018 Sjödahl descreve um painel de proteínas utilizadas como marcadores do fenótipo de cada grupo, como mostra a Figura 3 (SJÖDAHL, 2018).
Tabela 1: Marcadores histopatológicos associados a cada grupo molecular. A tabela mostra os marcadores utilizados para determinação do subtipo dos tumores. (SJÖDAHL, 2018)
1.2 Tabagismo e o Câncer de Bexiga
O tabagismo já é estabelecido como o principal fator de risco para o desenvolvimento do câncer de bexiga, estando associado ao surgimento de cerca de 50% dos tumores (CUMBERBATCH e colab., 2016). Uma gama de marcadores da exposição aos constituintes da fumaça do tabaco como os PAH, AA e Nitrosaminas são identificados na urina, pois esta é sua principal via de excreção (GREGG e colab., 2013) e diversos são os critérios para avaliar a contribuição dos carcinógenos do tabaco nesse processo.
O principal fator é a capacidade inata de cada indivíduo em metabolizar os componentes do tabaco com diversas variações na eficiência da desintoxicação, diferenças entre gêneros estão associadas a questões hormonais e padrões de consumo do tabaco distintos entre homens e mulheres, além da duração e quantidade de tabaco consumido, assim como o tipo do tabaco e seu modo de preparação que modificam os componentes e suas concentrações, alterando o seu potencial carcinogênico (SORIA e colab., 2018).
Os componentes da fumaça do tabaco são responsáveis pelos mais diversos danos ao material genético como quebras de fita simples e dupla, formação de adutos e distorções de hélice, formação de sítios abásicos e modificações nas bases que conduzem ao processo de mutação quando não reparados, entretanto, diversos são os processos mutacionais e fatores de risco que dão origem a alterações permanentes no DNA e comparado aos outros fatores de risco, o tabagismo se associa a uma assinatura mutacional predominante do tipo C>G/C>T que também é encontrada em tumores de mama e pulmão, estando associada a alterações na expressão e atividade da família de proteínas Apolipoprotein B mRNA editing catalytic polypeptide-like (APOBEC). Tal família é constituída por 11 proteínas com atividade citosina deaminase responsáveis pela deaminação (C>U) dos resíduos C nas pontas das fitas simples de DNA, sendo sua função a defesa da célula contra o material genético dos
retrovírus livres no núcleos ou citoplasma, entretanto em células tumorais essas proteínas atuam promovendo a hipermutação somática quando há quebra de fita simples (GLASER e colab., 2018; Alexandrov e colab., 2013).
1.3 Carcinógenos provenientes do tabaco
A fumaça do cigarro é uma mistura complexa e heterogênea que segundo Green e Rodgman, contém mais de 4800 compostos diferentes (GREEN, 1996), entre eles estão uma variedade de carcinógenos, co-carcinógenos, mutágenos e substâncias tumorigênicas. O potencial carcinogênico dessas substâncias tem sido avaliado pela International Agency for Research on Cancer (IARC), que entre todas essas substâncias, já identificou 69 carcinógenos em animais, sendo 48 desses possivelmente carcinógenos humanos, 8 provavelmente são e 11 já foram comprovados como carcinógenos humanos (IARC, 2000).
Dentre todos os compostos analisados e caracterizados foram elencados os mais relevantes baseados em seu potencial carcinogênico e seguem descritos abaixo.
1.3.1 Hidrocarbonetos Aromáticos Policíclicos (PAH)
São hidrocarbonetos com dois ou mais anéis aromáticos, produtos da combustão incompleta de matéria orgânica e combustíveis fosseis, fumaça do tabaco, fuligem, alcatrão e comidas grelhadas. Dentre os PAH com potencial carcinogênico encontram-se naftaleno, antraceno, pireno, 1-hidroxipireno, 1-nitropireno, benzo(a)-pireno, dibenzo[a,l]pireno, entre outros mostrados na Figura 4 que após ativação por enzimas do citocromo P450 geram metabolitos carcinogênicos com capacidade de formar adutos no DNA substrato para as vias de reparo NER e BER (CHATTERJEE, 2017)
1.3.2 Aminas Aromáticas (AA) e Aminas Aromáticas Heterocíclicas (HAA)
Esses compostos fazem parte de uma classe de carcinógenos estruturalmente semelhantes formados por hidrocarbonetos aromáticos associados a um grupamento amina e são gerados a partir da fumaça do cigarro, combustíveis fosseis, queima de carvão, corantes industriais. Sob ação das enzimas do citocromo P450, tais aminas são convertidas em agentes alquilantes carcinogênicos da bexiga urinaria como 4-aminobifenil, benzidina, 2-naftalamina que atacam o carbono 8 (C8) guanina, acarretando o surgimento de substituição de bases ou mutações frameshift. Esse tipo de lesão recruta proteínas da via NER para ser reparado ( CHATTERJEE, 2017; TURESKY e LE MARCHAND, 2011).
Figura 3:Principais representantes dos PAH (MOORTHY e colab., 2015)
1.3.3 Nitrosaminas
São potentes carcinógenos sistêmicos formados por combinações de grupamentos funcionais amina e nitrogênio, com atividade demostrada em mais de 30 espécies de animais. Os compostos 4-(metilnitrosamina)-1-(3-piridil)-1-butanona (NNK) e N-nitrosonornicotina (NNN) são as nitrosaminas provenientes da fumaça do tabaco mais importantes e estudadas e atuam no DNA gerando adutos de guanina (O6-mG) e espécies reativas de oxigênio
substrato para a via NER e BER de reparo (BARNES e colab., 2018; HECHT, 2006, 2011).
Espécies Reativas de Oxigênio (ROS)
A fumaça do tabaco induz estresse oxidativo nas células através das espécies reativas de oxigênio contidas nela, os radicais superóxidos, peroxido de hidrogênio e hidroxil formados pelo metabolismo e interação dos componentes do tabaco com os componentes celulares são capazes de interagir e danificar a estrutura de proteínas e DNA gerando sítios abásico ou quebras de fita simples e dupla, lesões que recrutam as vias BER, MMR, HR e NHEJ (HELD e INSTRUMENTS, 2015, CHATTERJEE, 2017)
Figura 5: Principais representantes das nitrosaminas (HECHT, 2011)
Figura 6: Principais representantes dos ROS (HELD e INSTRUMENTS, 2015)
1.4 Atuação das Vias de Reparo do DNA nas lesões provenientes dos componentes do tabaco
A integridade do material genético na célula é fundamental para manutenção das suas funções e gerações futuras, a todo momento o DNA está à mercê de danos que podem comprometer a sua estrutura e função, sejam eles endógenos produtos do metabolismo celular ou exógenos como radiação ultravioleta e ionizante, poluição, hábitos alimentares, infecções, espécies reativas de oxigênio, fumaça do tabaco, entre outros mostrados na Figura 7. Devido a gama e diversas estruturas dos componentes contidos na fumaça do tabaco descritos por Green e Rodgman, tais agentes exógenos, ao interagirem e provocarem danos no DNA, desencadeiam uma série de respostas celulares engajadas em tentar reverter tais lesões.
A exposição a esses carcinógenos está associada a várias formas de danos ao DNA, como adutos que se ligam covalentemente ao DNA alterando sua conformação e processos celulares como replicação e transcrição, quebras de fitas duplas e fitas simples causando aberrações cromossômicas, lesão a bases nitrogenadas provocadas por estresse oxidativo e ligações cruzadas entre DNA-DNA e DNA-Proteína (BARNES e colab., 2018; WEEDEN, 2018), entretanto as células eucarióticas são dotadas de várias proteínas que compõem vias celulares com função de assegurar a manutenção da integridade do DNA devido as suas atividades de reparo, evitando que tais danos gerem uma alteração permanente e hereditária na sequência do DNA, acarretando no surgimento de uma mutação. Os carcinógenos presentes na fumaça do tabaco geram danos ao DNA que são substrato para ação das enzimas das vias de reparo a seguir.
1.4.1 Reparo por Excisão de Nucleotídeos (NER)
Essa via global de reparo atua sobre os danos gerados pelos PAH, AA e aldeídos presentes na fumaça do tabaco que geram adutos, distorções na estrutura da hélice e ligações cruzadas entre bases adjacentes, é composta por proteínas responsáveis por reconhecer danos, realizar sua excisão, ressíntese e ligação do DNA (CHATTERJEE e colab., 2017)
1.4.2 Reparo por Excisão de Bases (BER)
Tal via é ativada na célula para reparar quebrar de simples fita, bases nitrogenadas alquiladas, oxidadas, desaminadas espontaneamente ou em decorrência da interação do
DNA com espécies reativas de oxigênio ou adutos de eteno provenientes da fumaça do tabaco, sendo composta por proteínas que reconhecem um sitio abásico ou base danificada, realizam a excisão do dano, ressíntese e ligação do DNA (DIETLEIN e colab., 2014; HANG, 2010).
1.4.3 Reparo de Bases Mal Pareadas (MMR)
A principal atuação dessa via de reparo se dá sobre os adutos 8-oxo-G gerados pelas espécies reativas de oxigênio que interagem com o DNA, atuando também sobre bases mal pareadas, loops na hélice formados por inserções ou deleções, as proteínas dessa via atuam reconhecendo a lesão no DNA, removendo-a e utilizando o cromossomo homologo como molde para ressintetizar a região lesionada (BRIERLEY e MARTIN, 2012; VENS e SOBOL, 2013).
1.4.4 Recombinação Homologa (HR)
A recombinação homologa consiste numa via que repara principalmente quebras de fita dupla e ligações cruzadas entre fitas de DNA, lesões promovidas por espécies reativas de oxigênio ou alterações de bases como a (O6-meG), a HR opera utilizando áreas de
homologia na cromátide irmã para ressintetizar a área afetada no cromossomo que necessita de reparo (BARNES e colab., 2018).
1.4.5 Recombinação Não Homologa (NHEJ)
Essa via resume-se a reparar quebras de dupla fita no DNA promovidas pelos carcinógenos presentes na fumaça do tabaco utilizando proteínas capazes de reconhecer os danos, remove-los, polimerizar a região a ser reparada utilizando o cromossomo não homologo em forma de crossing over e religar as pontas das fitas (CHANG e colab., 2017).
1.4.6 Síntese Translesão (TLS)
As polimerases translesão são capazes de remover nucleotídeos de alguma forma lesionados e realizar o reparo de acordo com as propriedades da base complementar, sem se importar com a manutenção da fidelidade do nucleotídeo original, concedendo a célula a capacidade de tolerar os danos em seu material genético (CHATTERJEE e colab., 2017).
Figura 7: Esquema dos principais danos ao DNA e suas vias de reparo. A figura ilustra a relação entre as lesões as quais o DNA está submetido e as vias de reparo que atuam para reverter as lesões (WEEDEN, 2018)
2 – OBJETIVOS
O tabagismo é relatado como o principal fator de risco relacionado com o desenvolvimento do câncer de bexiga e os diversos compostos contidos na fumaça do tabaco promovem um variedade de danos ao material genético que quando não reparados podem levar ao surgimento de mutações no DNA e para remediar tais danos as células são capazes ativar vias de reparo do DNA que se mobilizam para reverter os danos promovidos ao material genético.
Em homeostase existe um nível basal de proteínas de reparo dispersas na célula para reparar eventuais danos que ocorram no DNA, entretanto ao serem expostas aos compostos do tabaco, estes interagem com o material genético causando lesões que os níveis basais de proteínas de reparo não são suficientes para remediar, induzindo a célula a aumentar a expressão de tais proteínas para assegurar a manutenção da integridade do DNA.
Tendo isso em vista, este trabalho possui como objetivo:
1. Estudar a influência do tabagismo na expressão das proteínas das vias de reparo do DNA em carcinoma urotelial de acordo com a classificação de Lund
2. Avaliar a influência das alterações na expressão das proteínas de reparo na sobrevida global e sobrevida livre de doença
3 – MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 Obtenção dos dados relativos a pacientes com Câncer de Bexiga
Dados brutos contendo informações clinicas e de expressão do mRNA de 413 pacientes (394 casos e 19 controles) com Câncer de Bexiga foram obtidos a partir da plataforma cBioPortal (CERAMI e colab., 2014). Dentre as coortes disponíveis, para a realização do atual estudo foi selecionada a coorte Bladder Urothelial Carcinoma (TCGA,
Provisional).
Para definição do grupo molecular de acordo com os critérios de Lund dentro do dataset selecionado, recorreu-se a um dos autores (Gottfrid Sjödahl) da publicação (SJÖDAHL e colab., 2012) o qual disponibilizou a relação entre cada paciente e seu grupo molecular.
3.2 Seleção dos genes associados as vias de reparo
Genes envolvidos nas vias de reparo selecionadas para o atual estudo foram obtidos a partir do banco de dados KEGG Pathway Database. Uma relação de genes e suas vias foram definidas, resultando um total 7 vias e 51 genes analisados e listados na tabela abaixo.
Tabela 2: Relação de genes e vias selecionados para o estudo. A imagem mostra as vias de reparo utilizadas no estudo e as proteínas selecionadas que pertencem a cada via.
3.3 Manipulação dos dados e extração dos resultados
Através do software R Studio e utilizando a linguagem de programação R, criada por Ross Ihaka e Robert Gentleman em 1996 (IHAKA, 2016) foi possível manipular as imensas tabelas de dados brutos e extrair as informações necessárias para obtenção dos resultados apresentados neste trabalho.
Para extração dos resultados relativos à expressão dos genes das vias de reparo, os dados de expressão do mRNA em log2 foram utilizados para determinação dos níveis de expressão dos genes que foram previamente selecionados. Foram analisadas as proteínas pertencentes as vias de reparo em todos os grupos de Fumantes e Não Fumantes individualmente, todos os grupos de Lund individualmente e do grupo resultante da intersecção das três condições, os quais foram utilizados para interpretação e descrição dos resultados.
Através da plataforma cBioPortal, conhecendo o ID de cada paciente contidos nos dados fornecidos por Gottfrid Sjödahl, foi possível extrair as informações relativas a Overall Survival (OS) e Disease Free Survival (DFS).
3.4 Confecção dos gráficos e validação estatística
Após a manipulação e filtragem dos dados relevantes o resultante foi utilizado para geração dos gráficos dos níveis de expressão dos genes de cada via e aplicação do teste t. Recorreu-se ao pacote ggplot2 versão 2 2.0.0 do R para elaboração dos gráficos. O teste utilizado para validação estatística dos resultados foi o teste t pareado, um teste paramétrico utilizado para determinar se existe diferença entre as médias, considerando válidos os resultados que apresentaram p value p < 0.05 e p <0.01.
4 – RESULTADOS E DISCUSSÃO
Os dados brutos utilizados nesse trabalho continham informações sobre a situação clínica e tabelas relativas à expressão do mRNA (RNA Seq V2 RSEM) de 20532 genes em amostras (394 casos e 19 controles) de tumores de pacientes com Câncer de Bexiga, os dados clínicos podem ser observados na tabela abaixo.
Dados clínicos dos pacientes foram utilizados para a determinação das características clínicas e epidemiológicas da população e determinação do histórico de consumo de tabaco dos pacientes, agrupando-os em Fumantes (n=285) e Não Fumantes (n=108) assim como para a investigação da Sobrevida Global e Sobrevida Livre de Doença.
Tabela 3:Dados clínicos da coorte utilizada no estudo. A tabela mostra as principais características da população como Idade, Gênero, Etnia, Status vital, Histórico do tabagismo e o subtipo histológico dos tumores.
Através do material cedido por Gottfrid Sjödahl, os pacientes foram atribuídos a 5 grupos moleculares (Classificação de Lund): Basal (n=108), Genomically Unstable (n=58), Mesenchymal (36), Squamous(n=21), Urobasal (n=170).
Foram cruzadas as informações relativas ao histórico de consumo de tabaco e classificação de Lund, formando um novo grupo que atendia a esses dois critérios, resultando em:
• Basal Não Fumante (n=31)
• Genomically Unstable Não Fumante (n=12) • Mesenchymal Não Fumante (n=4)
• Squamous Não Fumante (n=5) • Urobasal Não Fumante (n=48)
o Basal Fumante (n=70)
o Genomically Unstable Fumante (n=44) o Mesenchymal Fumante (n=31)
o Squamous Fumante (n=13) o Urobasal Fumante (n=114)
os quais foram utilizados como substrato para a análise da expressão das proteínas dos genes das vias de reparo.
A figura 8 mostra as alterações encontradas nas proteínas da via NER e seus respectivos grupos moleculares afetados, 3 das 7 proteínas analisadas para esta via foram encontradas com expressão acima dos controles, em todos os casos podemos observar que quando consideramos o grupo molecular associado ao tabagismo a expressão das proteínas encontra-se acima da expressão obtida para o grupo isolado. A influência de tais proteínas na carcinogênese do câncer de bexiga é elucidada em estudos que demonstram a relação entre polimorfismo de nucleotídeo único (SNP) e o risco de desenvolvimento do câncer de bexiga associados a CCNH, proteína que atua como fator de transcrição para proteína LIG1 da via NER, que participa da etapa final do reparo, unindo a fita de DNA(CHEN e colab., 2007; FIGUEROA e colab., 2007), assim como na relevância da endonuclease ERCC1 no tratamento do câncer de bexiga com cisplatina onde Welsh demonstrou que o aumento da
expressão de ERCC1 conduz a uma redução da sensibilidade do tumor a tal quimioterápico (WELSH e colab., 2004).
A figura 9 mostra as alterações encontradas na via BER e seus respectivos grupos moleculares afetados, 4 das 6 proteínas analisadas nessa via, apresentaram alteração na expressão em no mínimo um dos grupos moleculares, destacando a relevância dos danos gerados pelas espécies reativas de oxigênio e quebras de fita em algum dos níveis dessa via. Considerando as atividades de incisão e junção das fitas de DNA desenvolvidas por APEX1 e LIG3 respectivamente (FIGUEROA e colab., 2007), tumores do tipo BASAL e MES apresentaram redução na expressão, indicando um déficit nos processos iniciais e finais dessa via de reparo nesses grupos. NEIL1 e OGG1 (GALICK e colab., 2017; GANGWAR e Figura 8:Proteínas da via NER com alteração na expressão. A imagem mostra o aumento da expressão de CCNH, ERCC1 e LIG1.
colab., 2009) são glicosilases que reconhecem as bases nitrogenadas e dão início ao processo de reparo, a tentativa de intensificar as atividades de reparo do DNA se reflete no aumento da expressão de tais proteínas nos grupos afetados.
A figura 10 mostra as alterações encontradas na via MMR e seus respectivos grupos moleculares afetados, 3 das 7 proteínas analisadas nessa via apresentaram alteração em sua expressão em algum dos grupos quando comparados com os controles. Observa-se comportamentos de expressão semelhantes das proteínas EXO1 e MSH2 nos grupos SC e URO. EXO1 é uma proteína com atividade de endonuclease e exonuclease que atua na excisão de mal pareamentos e interage com MSH2 que compõe o sistema de reparo pós replicativo (BRIERLEY e MARTIN, 2012). A partir do padrão de expressão que os grupos apresentam podemos inferir que tumores do tipo SC apresentam proficiência nesse tipo de reparo, assim como tumores do grupo URO apresentam deficiência nessa via de reparo, Figura 9: Proteínas da via BER com alteração na expressão. A imagem mostra o aumento na expressão de NEIL1 e OGG1 e redução na expressão de APEX1 e LIG3.
indicando uma susceptibilidade do grupo URO a danos que induzem mal pareamento. Sanguedolce relata uma associação entre a alteração na expressão de MSH2 com o desenvolvimento de tumores de alto grau e com redução na sobrevida global (SANGUEDOLCE e colab., 2018) assim como Kawakami expõe a relação inversa entre a redução na expressão de MSH3 e o desenvolvimento do câncer de bexiga, corroborando o achado da expressão de MSH3 no grupo GU e indicando sua participação no desenvolvimento do tumor nesse grupo (KAWAKAMI e colab., 2004).
A figura 11 mostra as alterações encontradas na via HR e seus respectivos grupos moleculares afetados, 3 das 9 proteínas analisadas desta via apresentaram alteração em sua expressão em algum dos grupos quando comparados com os controles. A proteína MRE11A é responsável pelos processos de reparo de quebras de fita dupla, união de fita simples durante o reparo, recombinação do DNA e manutenção da integridade dos telômeros, apresentando a maior frequência de mutação dentre as proteínas da via HR (HEEKE e colab., 2018), a redução de sua expressão no grupo MES indica uma deficiência nesses processos e susceptibilidade desse grupo a tais tipos de lesão. Embora a redução da sua expressão Figura 10:Proteínas da via MMR com alteração na expressão. A imagem mostra o aumento na expressão de EXO1 e MSH2 no grupo SC, redução na expressão de MSH3 e de EXO1 e MSH2 no grupo URO.
esteja associada com pior prognostico em casos onde a radioterapia é utilizada para tratamento dos tumores invasivos (TEO e colab., 2014), a mesma redução da expressão favoreceu o tratamento com cisplatina, reduzindo a sobrevida da célula (DA SILVA e colab., 2014). Durante o processo de reparo promovido por essa via, PALB2 atua no reconhecimento do dano, uma redução na expressão de PALB2 afeta sua eficiência no reparo dos tumores do tipo MES e GU, Heeke relata uma significante porção de tumores de bexiga com mutações em PALB2 (HEEKE e colab., 2018). Nessa via de reparo XRCC2 atua na manutenção da estabilidade cromossômica, reparo de quebras de fita dupla, translocações e deleções (GENECARDS, 2008), a redução da sua expressão no grupo URO indica uma sensibilidade a esses danos.
Figura 11: Proteínas da via HR com alteração na expressão. A imagem mostra a redução na expressão de MRE11A, PALB2 e XRCC2.
A figura 12 mostra as alterações encontradas na via NHEJ e seus respectivos grupos moleculares afetados, 2 das 6 proteínas analisadas desta via apresentaram alteração em sua expressão em algum dos grupos quando comparados com os controles. Atuando no reparo de quebras de fita dupla e como sinalizadora do dano ao DNA, a redução de expressão em PRKDC indica uma perda da capacidade de reconhecer e sinalizar danos ao DNA, levando a um retardo do reparo das quebras de fita dupla nos grupos GU e URO, que é agravada em GU pela redução da expressão da helicase XRCC6, proteína que interage com PRKDC aumentando sua afinidade com o DNA em cerca de 100 vezes (GENECARDS, 2019).
A figura 13 mostra as alterações encontradas na via TLS e seus respectivos grupos moleculares afetados, 4 das 6 proteínas analisadas desta via apresentaram alteração em sua expressão em algum dos grupos quando comparados com os controles. Yuan relata que um aumento o aumento na expressão de POLI pode contribuir para o processo de mutagênese no câncer de bexiga devido ao processo de reparo com baixa fidelidade em relação ao nucleotídeo complementar, os resultados mostram que no grupo URO houve aumento na expressão dessa proteína, indicando uma susceptibilidade desse grupo ao surgimento de mutações, efeito que se acumula devido à queda na expressão de REV3L, uma subunidade Figura 12:Proteínas da via NHEJ com alteração na expressão. A imagem mostra a redução na expressão de PRKDC e XRCC6.
que compõe a POLZ, polimerase de alta fidelidade responsável pelo reparo de bases mal pareadas produtos da atuação de outras TLS e adutos no DNA (WATERS e colab., 2009), enquanto o grupo MES apresentou aumento na expressão de POLH, proteína que promove o reparo com alta fidelidade, apontando a atuação e eficiência desse reparo para esse grupo, tal fato pode ser corroborado pelos achados de Zhang, que relata uma resistência no tratamento com cisplatina em tumores com alta expressão de POLH (PRAKASH e colab., 2005; YUAN e colab., 2013). Tal aumento na expressão de POLH observado no grupo MES também pode ser compreendido como uma compensação pela queda na expressão de REV1 uma vez que essa proteína é um componente indispensável para o reparo mediado por POLH (YOON e colab., 2015).
A figura 14 mostra as alterações encontradas na família das proteínas APOBEC e seus respectivos grupos moleculares afetados, todas as proteínas analisadas desta família apresentaram alteração em sua expressão em algum dos grupos quando comparados com os controles. Evidencias sugerem que a atividade mutacional da família APOBEC ocorre no princípio da carcinogênese e que devido a origem clonal da maioria dos tumores de bexiga, o processo de mutagênese perdura durante todo o desenvolvimento do tumor (ROBERTSON e colab., 2018). Os achados para essa família de proteínas corroboram os relatos da literatura Figura 13:Proteínas da via TLS com alteração na expressão. A imagem mostra o aumento na expressão de POLH e POLI e redução na expressão de REV1 e REV3L.
que associam a assinatura mutacional C>T/C>G com câncer de bexiga ( Alexandrov e colab., 2013; SWANTON e colab., 2015). Observamos que a maioria das proteínas (7 de 10) apresentam significativa redução da expressão na maioria dos grupos, Glasser relata um enriquecimento da mutagênese em oncogenes como FGFR3 e genes da família RAS que são comprovadamente associados ao surgimento de tumores uroteliais mediada pela redução na expressão das proteínas APOBEC (DI MARTINO e colab., 2009; GLASER e colab., 2018; SHI e colab., 2019). Embora apresentem aumento na expressão, Mullane reporta que APOBEC3C e APOBEC3G não possuem forte influência no desenvolvimento do tumor por não serem tão eficientes em gerar mutações quanto as outras APOBEC e associa o aumento na expressão de APOBEC3H a um aumento na sobrevida global (MULLANE e colab., 2016)
Figura 14:Proteínas da família APOBEC com alteração na expressão. A imagem mostra o aumento na expressão de APOBEC3C, 3G e 3H e redução na expressão de APOBEC1, 2, 3A, 3B, 3D, 3F, 4.
Analisando a sobrevida global (do inglês, Overall Survival; OS) e a sobrevida livre de progressão (do inglês, Disease Free Survival, DFS) dos grupos moleculares, o grupo SC apresentou menor OS e DFS quando comparado com os outros grupos independente das proteínas encontradas com alteração na expressão (Figura 15), enquanto o grupo URO apresentou redução na OS quando se leva em consideração a participação das proteínas com alteração na expressão (Figura 16A) ou não (Figura 16B), indicando pior prognóstico desse subtipo molecular do câncer de bexiga.
Figura 15:Sobrevida Global e Sobrevida Livre de Doença no grupo SC. A curva de Kaplan-Meier mostra a redução na DFS e OS do grupo SC.
Figura 16:Sobrevida Global no grupo URO. A curva de Kaplan-Meier mostra a redução na OS do grupo URO levando em consideração a alterações nas proteínas encontradas nesse grupo (A) e redução na OS independentes das alterações nas proteínas encontradas nesse grupo (B).
Na Tabela 4 estão todos os valores significativos dos p-values resultantes da aplicação da estatística, observa-se que o p-value está relacionado com a magnitude da alteração na expressão, condizente com o que é observado nos gráficos.
Tabela 4:Valores de p-value da expressão das proteínas analisadas. A tabela mostra os p-value resultantes da aplicação do teste t paramétrico.
5 – CONCLUSÕES
Em todos os grupos de Lund alterações no nível de expressão foram observados tanto para mais quanto para menos em relação aos controles, os resultados se apresentam como específicos da relação de cada proteína com o grupo de Lund com exceção de alguns observados na família APOBEC que afetam todos os grupos, considerando o status de fumante, a influência do tabagismo se apresentou de forma específica da relação de cada proteína com o grupo de Lund, a maior variação estatística se deu no grupo dos não fumantes, observada nos resultados com p> 0.05 indicando o tabagismo como fator diferencial nesses grupos, em contrapartida os resultados dos não fumantes com p<0.05 e fumantes com p<0.05 refletem o tabagismo como fator indiferente atuante nesses grupos.
Dentre os grupos de Lund, URO apresentou maior número de proteínas afetadas, 16 de 51, resultado que se correlaciona com a redução na sobrevida global desse grupo.
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