Desenvolvimento de microemulsões liofilizadas como um potencial sistema de liberação de fármacos usando planejamento experimental fatorial

Texto

(1)MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE. DESENVOLVIMENTO DE MICROEMULSÕES LIOFILIZADAS COMO UM POTENCIAL SISTEMA DE LIBERAÇÃO DE FÁRMACOS USANDO PLANEJAMENTO EXPERIMENTAL FATORIAL. ANDREZA ROCHELLE DO VALE MORAIS. NATAL/RN 2013.

(2) ANDREZA ROCHELLE DO VALE MORAIS. DESENVOLVIMENTO DE MICROEMULSÕES LIOFILIZADAS COMO UM POTENCIAL SISTEMA DE LIBERAÇÃO DE FÁRMACOS USANDO PLANEJAMENTO EXPERIMENTAL FATORIAL. Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde da Universidade Federal do Rio Grande do Norte como requisito para obtenção. do. título. de. mestre. em. Ciências da Saúde.. Orientador: Prof. Dr. Eryvaldo Sócrates Tabosa de Egito Co-orientador: Prof. Dr. Arnóbio Antônio da Silva Júnior. NATAL/RN 2013 ii.

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(4) MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE. Coordenadora do Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde Prof.ª Dr.ª Ivonete Batista de Araújo. iii.

(5) ANDREZA ROCHELLE DO VALE MORAIS DESENVOLVIMENTO DE MICROEMULSÕES LIOFILIZADAS COMO UM POTENCIAL SISTEMA DE LIBERAÇÃO DE FÁRMACOS USANDO PLANEJAMENTO EXPERIMENTAL FATORIAL. Aprovada em 28 / 06 / 2013. Banca examinadora. Presidente da Banca: Eryvaldo Sócrates Tabosa do Egito Membros da Banca: Fernando Sérgio Escócio Drummond Viana de Faria Rosangela de Carvalho Balaban. iv.

(6) DEDICATÓRIA. Aos meus pais, pelo apoio incondicional.. v.

(7) AGRADECIMENTOS. Primeiramente agradeço a Deus, porque sem Ele nada seria possível. Aos meus pais, Hildo e Ione, que me deram o exemplo de dedicação e perseverança. Obrigada pela compreensão, carinho e amor, por terem a minha educação como prioridade, por me ensinarem a prosseguir na jornada, fossem quais fossem os obstáculos. A vocês que mesmo distantes mantiveram-se sempre ao meu lado, lutando comigo. Aos meus irmãos, Júnior e Débora, pela confiança na minha capacidade, pelo acolhimento toda vez que eu voltava para casa e por serem pessoas em que eu sempre posso confiar. A toda minha família, especialmente às minhas tias Ivete e Isa por assumirem o papel de cuidar de mim quando meus pais não poderiam estar presentes, e aos meus primos Éverson, Émerson, Êlika e Emanuel, os quais eu considero irmãos. A todos os professores e funcionários que contribuíram para o meu aprendizado. Aos amigos do LaSiD por me ajudarem nas manipulações, resumos, artigos e endnote, pelos conhecimentos que me passaram, por me escutarem ou simplesmente por “no intervalo discutirem ciência”. Em especial a Laura, Scheyla, Rafael, Thales e Izabel. Ao meu orientador, Prof. Sócrates e ao meu Co-orientador, Prof. Arnóbio, por acreditarem em mim e me mostrarem o árduo e gratificante caminho da ciência. A Nednaldo, que só veio a acrescentar ao grupo LaSiD e à minha vida, como um grande amigo. A Lucas, que por mais novo que seja na equipe se encaixou perfeitamente. A Christian Melo e Teresa por serem meus braços direito e esquerdo nas manipulações. A Francisco H. X. Júnior pela orientação e paciência, e a Éverton por ser o melhor amigo que alguém poderia ter. Aos amigos Janaína, Deyse, Maria Luiza, Karídia, Arion, Gutembergue, Raquel, Roberta e Milson pelas farras, conversas, ombro amigo e conselhos. E não poderia deixar de agradecer à Capes e ao CNPq pelo apoio financeiro. vi.

(8) " Sessenta anos atrás eu sabia tudo, hoje sei que nada sei. A educação é o descobrimento progressivo da nossa ignorância. ". William James Durant. vii.

(9) RESUMO Microemulsões. (MEs). são. sistemas. de. liberação. de. fármacos. termodinamicamente estáveis. Contudo, devido ao elevado conteúdo de água, estes sistemas são passíveis a estresses microbiológicos. No entanto, o uso da técnica de liofilização vem possibilitando o aumento na estabilidade dos sistemas carreadores, a partir da remoção da água de amostras, através do processo de sublimação. A qualidade do produto final pode ser influenciada por vários fatores, que através do uso do planejamento experimental fatorial (PEF) possibilita a escolha das condições ideais para a liofilização da MEs. O objetivo deste trabalho foi desenvolver um sistema microemulsionado liofilizado contendo Anfotericina B (AmB), como fármaco modelo, utilizando a técnica de PEF. As MEs foram produzidas a partir da mistura adequada de tampão fosfato pH 7.4, Tween 80®, Lipoid S100® e Mygliol 812®, usando agitação magnética, sonicação e banho de ultrassom. Diferentes crioprotetores foram adicionados às MEs e realizado um estudo do PEF completo 23 com três pontos centrais, no qual o tamanho da gotícula foi a variável dependente e a concentração do crioprotetor, a temperatura de congelamento e o tempo de liofilização foram as variáveis independentes. Após análise estatística das melhores condições para formação da formulação liofilizada, a AmB foi incorporada à ME e realizados testes de caracterização físico-químicos e doseamento do fármaco antes e após o processo de liofilização. A análise dos resultados mostrou que os crioprotetores maltose e lactose obtiveram sucesso no processo de liofilização da ME. Adicionalmente, observou-se que MEs com menores tamanhos de gotículas foram obtidos. quando utilizado maltose como crioprotetor na. concentração de 5 %, com congelamento a - 80 ºC e por um período de liofilização de 24 h. Bem como, foi observado que na ME contendo AmB não teve mudanças significativas quanto ao conteúdo do fármaco, quando comparado o produto antes e após o processo de liofilização. Portanto, a ME contendo 5% de maltose é uma formulação adequada para incorporação de fármacos e para liofilização, de acordo com os parâmetros adequados. Desta forma, a ME, em sua forma liofilizada, pode manter a estabilidade do sistema perante os danos que poderiam ser causados pela quantidade de água.. Palavras-chave: Sistemas coloidais, Anfotericina B, Desenho experimental. viii.

(10) LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS. ME. Microemulsões. AmB. Anfotericina B. min. Minuto. DSC. Calorimetria Diferencial Exploratória. mL. Mililitro. µL. Microlitro. nm. Nanômetro. cm. Centímetro. PEF. Planejamento Experimental Fatorial. MT. Maltose. MN. Manitol. ST. Sorbitol. LT. Lactose. GC. Glicose. ix.

(11) LISTA DE FIGURAS. Figura 1 - Estrutura molecular da AmB Figura 2 - Diagrama de fases da água pura.. x.

(12) SUMÁRIO. 1.. INTRODUÇÃO ............................................................................................ 1. 2.. JUSTIFICATIVA .......................................................................................... 6. 3.. OBJETIVOS ................................................................................................ 7. 4.. 3.1. Objetivo geral ........................................................................................ 7. 3.2. Objetivos específicos ............................................................................ 7. MÉTODOS .................................................................................................. 8 4.1. Produção da ME ................................................................................... 8. 4.2. Caracterização das amostras ................................................................ 8. 4.2.1. Análises macroscópicas, pH, condutividade e isotropia. ................ 8. 4.2.2. Espalhamento de Luz dinâmico ...................................................... 8. 4.3. PEF para liofilização.............................................................................. 9. 4.4. Incorporação de AmB na ME .............................................................. 10. 4.4.1. Análises em espectrofotômetro .................................................... 11. 4.4.2. Eficiência de incorporação de AmB .............................................. 11. 4.5. Análises estatísticas ............................................................................ 11. 5. ARTIGOS PRODUZIDOS ............................................................................ 12 6. COMENTÁRIOS, CRÍTICAS E SUGESTÕES ............................................. 44 7. REFERÊNCIAS ............................................................................................ 53 ANEXOS .......................................................................................................... 55 ANEXO 1 .......................................................................................................... 56. xi.

(13) 1 1. INTRODUÇÃO. O desenvolvimento de sistemas carreadores de fármacos surge como uma proposta para solucionar os problemas relacionados à farmacocinética e farmacodinâmica destes. Efeitos adversos, eliminação precoce e pouca biodisponibilidade podem ser minimizados através da veiculação de fármacos em sistemas coloidais, como microemulsões (MEs) (1). As MEs são sistemas termodinamicamente estáveis, transparentes, isotrópicos e compostos por uma fase hidrofílica e outra lipofílica, sendo normalmente estabilizadas por um conjunto de tensoativos (2). Estes sistemas apresentam vantagens tais como: armazenar fármacos em sua fase interna, protegendo-os. contra. enzimas. digestivas. e. contra. a. luz. (fármacos. fotossensíveis); aumentar a eficácia terapêutica, o que proporciona uma redução da dose, minimizando os efeitos adversos e a toxicidade dos fármacos utilizados (3, 4); aumentar a absorção de substâncias farmacológicas, devido ao uso de tensoativos, e estes causarem fluidez da membrana, alterando sua permeabilidade (5, 6) e direcionar a substância ativa para os sítios de ação, no qual deverá exercer o efeito farmacológico, além de poder controlar sua velocidade de liberação sem alterar a estrutura química dos compostos transportados (3, 7). As MEs são sistemas eficazes no encapsulamento de Anfotericina B (AmB), a qual será utilizada como modelo de fármacos termossensíveis, por ser um antibiótico poliênico macrocíclico, com uma potente função fungicida e fungistática, utilizada em infecções fúngicas sistêmicas como histoplasmoses, aspergiloses e candidoses (8, 9). Sua estrutura molecular (Figura 1) exibe característica lipofílica devido as sete ligações duplas de carbono-carbono, e hidrofílica devido ao grande número de hidroxilas. Contudo devido a presença dos grupamentos amino e carboxilas em pH neutro a AmB apresenta baixa solubilidade em água. A sua incorporação visa a liberação prolongada, diminuição da toxicidade e aumento da solubilidade, visto que este possui baixa solubilidade em água (10, 11)..

(14) 2. Figura 1: Estrutura molecular da AmB.. Contudo, sistemas microemulsionados apresentam alto teor de água o que, geralmente, diminui a estabilidade do sistema durante o armazenamento, e pode acarretar contaminação microbiana, além da perda da atividade biológica do fármaco (12). Portanto, faz-se necessário utilizar um processo de secagem para diminuir a umidade desses produtos, melhorando assim, sua estabilidade. O processo de liofilização apresenta-se como um excelente método de desidratação, que vem sendo utilizado em sistemas coloidais (13). O processo de liofilização consiste na remoção da água de amostras encontradas na forma líquida, por sublimação a vácuo, deixando os solutos ou substratos no estado anidro ou quase anidro (14). As condições de temperatura e pressão são imprescindíveis para as mudanças no estado físico da água, sendo necessário trabalhar com a mesma abaixo do seu ponto triplo (temperatura de 0,0098°C e pressão de 4,58 mmHg) (Figura 2).. Figura 2: Diagrama de fases da água pura..

(15) 3. Uma das principais razões para a escolha da liofilização como método farmacêutico e bioindustrial é a sua capacidade de aumentar a estabilidade química do sistema quando a água é retirada de sua composição (14). Os sistemas com conteúdo aquoso estão sujeitos a várias reações que prejudicam a sua funcionalidade e a sua segurança, tais como a hidrólise, ligações cruzadas, oxidação e agregação das gotículas (15). Este processo apresenta vantagens como o aumento da estabilidade a longo prazo (16), o menor risco de contaminação por micro-organismos (15) e a prevenção de fenômenos de decomposição (17), além de não ser necessária utilização de altas temperaturas, quando comparado a outros métodos de secagem, visto que elevadas temperaturas alteram a estabilidade de fármacos termossensíveis, aumentam o processo de oxidação e, no caso de MEs, favorece a coalescência das gotículas, desestabilizando o sistema (18). O processo de liofilização é composto por três ciclos: congelamento (solidificação), secagem primária (sublimação do gelo) e secagem secundária (dessorção da água) (19). A etapa inicial de congelamento é quando a maior parte do solvente é congelada, aumentando a concentração do soluto no produto (20). O congelamento, muitas vezes, causa danos que podem desestabilizar os sistemas, o que poderá acarretar na perda se suas propriedades. Entre estes danos encontram-se o aumento na concentração e a interação entre os componentes do sistema, os quais levam à agregação e alteração do pH, redução das interações hidrofóbicas e formação de uma grande interface geloágua (21). A secagem primária começa quando a pressão na câmara é reduzida e a temperatura é elevada para fornecer calor para que ocorra a sublimação do solvente (22). O vapor do solvente é continuamente removido, mantendo-se a pressão da câmara do liofilizador abaixo da pressão de vapor do gelo, através de uma bomba a vácuo, com posterior condensação em uma serpentina de refrigeração (21). A terceira etapa é a secagem secundária, em que a água é dessorvida do concentrado congelado, através da crescente temperatura de prateleira, normalmente em temperaturas elevadas e baixa pressão (23). Nesta etapa, a.

(16) 4 água remanescente, que se encontra ligada ao produto, é removida por dessorção (14). A secagem secundária reduz o teor de umidade residual a um nível, geralmente, inferior a 1% (13, 15, 24). O tempo da secagem secundária é responsável por 30-40% do tempo total do processo de liofilização. No entanto, remove apenas 5-10% da umidade da amostra total (25). Após estas etapas, as amostras podem ser armazenadas de acordo com a especificidade e sensibilidade dos produtos (à temperatura ambiente, 4 °C 20 °C) em recipientes hermeticamente fechados (24). Entretanto, durante estas etapas podem ser gerados diversos estresses, os quais podem causar a desestruturação e desestabilização do sistema, principalmente na etapa do congelamento (12). A integridade do sistema pode ser protegida contra eventuais danos através da seleção adequada de crioprotetores, que são compostos que protegem as estruturas moleculares contra fenômenos provocados pela desidratação e redução da temperatura (26). O mecanismo de proteção dos crioprotetores pode ser explicado por eles serem, geralmente, compostos multi-hidroxilados capazes de formar pontes de hidrogênio com moléculas da água e substituí-las no sistema quando ocorre a sublimação do gelo durante o processo de liofilização. Desta forma, os componentes da formulação não sofrem agregação, o que provocaria um aumento no tamanho das gotículas ou partículas, desestruturando o sistema (27). Além disso, a sua adição aumenta a viscosidade da solução devido a interação entre as hidroxilas dos crioprotetores e as moléculas de água. O aumento da viscosidade do sistema pode suprimir a cristalização de gelo e limitar os danos mecânicos aos sistemas (27-29). As moléculas crioprotetoras mais utilizadas são carboidratos como trealose, sorbitol, maltose, glicose, manitol, sacarose, frutose e lactose (27). As concentrações utilizadas estão associadas a fatores como temperatura, taxa de resfriamento e congelamento (30). Vários fatores. importantes. devem. ser considerados. durante. a. liofilização. Dente estes, destacam-se a espessura da camada congelada, composição e concentração do produto, tipo de recipiente (frasco ampola, seringa), equipamentos e variáveis do processo de liofilização, tais como a.

(17) 5 pressão da câmara, o tempo e temperatura (congelamento, secagem primária e secundária), o crioprotetor e a sua concentração mais adequada (15, 31). Diante de diversos fatores, faz-se necessário o uso de técnicas que otimizem o processo de liofilização. Neste contexto, insere-se o planejamento experimental fatorial (PEF), o qual apresenta como principal função a melhora da qualidade dos produtos ou processos, avaliando um grande número de variáveis com um número reduzido de testes, através de todas as combinações possíveis entre os níveis dos fatores investigados (32). Adicionalmente, é capaz de identificar as variáveis do processo que mais influenciam nos parâmetros de resposta de interesse, bem como atribuir valores às variáveis influentes do processo. O PEF é recomendado para o início do procedimento experimental, quando é necessário definir os fatores mais importantes e estudar os efeitos sobre a variável resposta escolhida (33). No PEF encontram-se experimentos planejados com as técnicas fatoriais com dois, três ou mais níveis. O experimento fatorial 2k é composto por dois níveis (-1 e +1) com k fatores e consiste em realizar testes com cada uma das combinações da matriz experimental e, posteriormente, determinar e interpretar os efeitos principais e de interação dos fatores, analisados de tal modo que seja possível identificar as melhores condições experimentais do produto ou processo de fabricação (34). Através do PEF é possível obter análises de superfície de resposta, que é uma eficiente técnica estatística para otimizar variáveis múltiplas, capaz de estabelecer quais são as condições das variáveis independentes que produzem o melhor valor para a variável dependente, além de conhecer as características da função resposta, que se aproxima das condições reais de operação dos sistemas e identificar o relacionamento que existe entre os parâmetros e as respostas (35)..

(18) 6 2. JUSTIFICATIVA. MEs são empregadas como veículos para o carreamento de fármacos, o que permite uma liberação prolongada e diminuição da dose administrada. Contudo, devido ao conteúdo de água existente neste sistema, é necessário realizar uma técnica de secagem para minimizar os riscos de contaminação por micro-organismos, melhorar a forma de armazenamento e prevenir fenômenos de decomposição, além de aumentar a sua estabilidade a longo prazo. A liofilização é um método adequado para a retirada de água das MEs, visto que apresenta baixa umidade residual. Seus produtos são fáceis de reidratar, as alterações nas características organolépticas são reduzidas e são utilizadas baixas temperaturas, o que favorece a secagem de fármacos termossensíveis, como por exemplo, a AmB. Entretanto, as MEs não são facilmente liofilizadas, devido às várias formas de danos físico-químicos na estrutura do sistema, incluindo a perda do fármaco, precipitação, coalescência e separação de fases, os quais podem ocorrer durante as etapas do processo de liofilização. Há diversos parâmetros a serem definidos para o sucesso desse processo, contudo a otimização de variáveis experimentais realizada por meio de procedimentos que avaliam o efeito de uma variável por vez (univariado), apresenta desvantagens tais como tempo e materiais gastos para otimização e a falta de avaliação acerca das interações entre as variáveis que afetam o processo em estudo. Portanto, faz-se necessário o emprego de sistemas multivariados através do planejamento experimental fatorial, pois ele permite avaliar simultaneamente o efeito de um grande número de variáveis, a partir de um número reduzido de ensaios experimentais. Desta forma, diante de tantas variáveis, torna-se um desafio tecnológico a liofilização de MEs para o aumento da estabilidade do sistema e do fármaco nele incorporado..

(19) 7 3. OBJETIVOS. 3.1 Objetivo geral. O objetivo geral deste trabalho foi desenvolver uma ME liofilizada, para servir como modelo de sistema liofilizado de liberação de fármacos. Para isto, foi realizado o PEF para a otimização dos componentes da amostra e do processo de liofilização, e AmB foi adicionada a ME como fármaco modelo a ser incorporado nesse sistema.. 3.2 Objetivos específicos. 1. Produção e caracterização de um sistema microemulsionado; 2. Estudar o efeito dos crioprotetores e suas concentrações sobre a formação de MEs liofilizadas; 3. Determinação dos parâmetros ideais para a liofilização de MEs, através de análises por PEF, a fim de otimizar o processo de produção da mesma; 4. Definição da melhor formulação e dos melhores parâmetros de liofilização; 5. Caracterização do sistema microemulsionado, antes e após o processo de liofilização; 6. Obtenção de uma ME liofilizada contendo AmB; 7. Caracterização da ME contendo AmB antes e após a liofilização; 8. Avaliação da incorporação da AmB frente ao processo de liofilização..

(20) 8 4. MÉTODOS. 4.1 Produção da ME. A ME foi preparada misturando Tampão Fosfato pH 7.4 (68 %), Lipoid S100® (6,3 %), Mygliol 812® (11 %) e Tween 80® (14,7 %) através de agitação magnética, seguido de três ciclos do processo de sonicação (1,5 min.) e banho de ultrassom (3,0 min.).. 4.2 Caracterização das amostras. 4.2.1 Análises macroscópicas, pH, condutividade e isotropia. A metodologia da análise macroscópica utilizada foi descrita por Shinoda et al (36). As preparações foram examinadas a olho desarmado, avaliando-se ao longo do tempo os aspectos relativos à homogeneidade, à cor e à consistência. A isotropia das amostras foram avaliadas por microscopia de luz polarizada no microscópio Olympus BX4 (Olympus Corporation, Tokyo, Japan). A determinação potenciométrica foi analisada em equipamento précalibrado PG 2000 (Gehaka, Brasil), realizada através da inserção da célula diretamente nas amostras previamente climatizadas à temperatura ambiente (25ºC ± 2ºC) (37). Análises de alterações eletrolíticas foram realizadas através da inserção do eletrodo diretamente nas amostras previamente climatizadas à temperatura ambiente, realizada no Conductivity Meter MC 226 (Mettler-Toledo, Suíça) (37).. 4.2.2 Espalhamento de Luz dinâmico. Valores médios de distribuição do tamanho de gotícula foram determinados pelo analisador de tamanho de gotícula por espalhamento de luz (Nanosizer eckman Coulter particle sizer Delsa Nano S). As amostras foram diluídas em água ultra-pura na proporção de 1:20 e aplicadas na cubeta do aparelho (12)..

(21) 9 Foram realizadas análises de tamanho nas amostras de MEs que continham os crioprotetores (maltose, manitol, glicose, lactose e sorbitol) nas concentrações de 5, 10, 15 e 20 % para observar se o tipo e a concentração do crioprotetor influenciava no tamanho da gotícula da ME, bem como nas amostras das análises do PEF e nas MEs que continham AmB.. 4.2.3 Calorimetria Exploratória Diferencial (DSC). O comportamento térmico da ME e de seus componentes foram avaliados por DSC, utilizando o DSC-60 Shimadzu (Shimadzu Scientific Instruments, Kyoto, Japan). As amostras (5 mg) foram pesadas em cadinhos de alumínio e analisadas segundo os seguintes parâmetros: atmosfera de nitrogênio, fluxo de 50 mL/min, congelamento de 25 ºC a -40 ºC a uma razão de resfriamento 5 ºC/min. O sistema permaneceu 10 min na temperatura inferior, com posterior aquecimento até 110 ºC com razão de aquecimento de 5 ºC/min (38). 4.3 PEF para liofilização. Para determinar os melhores parâmetros a serem utilizados na técnica de liofilização, foi utilizado o método de PEF a fim de otimizar o experimento e diminuir a quantidade de amostras necessárias para obtenção dos resultados (33). Neste estudo foram construídos planejamentos fatoriais para cada crioprotetor cujo tamanho de gotícula da ME não foi alterado com a sua adição. Nestes planejamentos foram utilizadas como variáveis independentes a concentração do crioprotetor, a temperatura de congelamento e o tempo de liofilização (Tabela 1). Os níveis das variáveis concentração de crioprotetor e tempo de liofilização foram escolhidas de acordo com os valores mais utilizados na literatura, enquanto que a temperatura de congelamento utilizada foi escolhida de acordo com a mínima temperatura atingida através da utilização de nitrogênio líquido e congelamento em freezer como temperatura superior..

(22) 10 Como variável dependente foi escolhido o tamanho da gotícula após a reconstituição. Foi escolhido o PEF, com sequência de experimentos aleatorizada de acordo com o tempo de liofilização, do tipo 23 com três pontos centrais para obter uma estimativa do erro com nC-1 graus de liberdade. Os estudos das variáveis foram estatisticamente e graficamente interpretados usando o programa Statistic (Versão 7.0, StatSoft Inc., USA).. Tabela 1: Variáveis independentes codificadas. Nível. Variáveis independentes. -1. 0. +1. Congelamento (ºC). -20. -88. -196. % Crioprotetor. 5. 12,5. 20. 24. 36. 48. Tempo de liofilização(h). A liofilização foi realizada no liofilizador CHRIST ALPHA 1-2 LD (Osterode am Harz, Alemanha). As amostras foram reconstituídas com a mesma quantidade de água perdida no processo de liofilização, com posterior agitação em vórtex e seguidas de três ciclos de sonicação e banho de ultrassom. A amostra que formou pó e que apresentou o menor tamanho de gotícula foi selecionada para ser caracterizada antes e após o processo de liofilização, quanto às características macroscópicas, ao pH, condutividade e tamanho. Nesta mesma amostra foi incorporado AmB para verificar a influência da liofilização em MEs contendo fármacos, através de caracterizações de teor, além das anteriormente citadas.. 4.4 Incorporação de AmB na ME. A AmB em uma concentração final de 2M foi incorporada ao sistema através da agitação por vórtex e posteriormente neutralização com uma solução Hidróxido de Sódio 1N. Em seguida, o pH foi ajustado com Ácido Clorídrico 1N para 7,0 – 7,5. Adicionalmente, foi acrescentada a concentração de crioprotetor ideal estudado no experimento de PEF..

(23) 11 4.4.1 Análises em espectrofotômetro. O estudo de doseamento foi baseado em métodos de validação desenvolvidos previamente (resultados não apresentados) (11). A quantidade de Anfotericina B incorporada na ME foi doseada por espectrofotômetro (Biochrom Libra S32 UV-VIS spectrophotometer Massachusetts, USA). As amostras, realizadas em triplicata, foram diluídas na proporção de 1:10 de DMSO: Metanol (1:9). Posteriormente, desta solução, foram retirados 50 µL e misturado na cubeta estacionária de 10 cm com 20 mL de Metanol, e analisadas a 405 nm.. 4.4.2 Eficiência de incorporação de AmB O teste foi realizado em triplicata, retirando-se 1 mL da ME contendo AmB, a qual foi centrifugada a 14.000 g por 20 min na Centrifuge 5410 (Eppendorf, Hamburg, Germany) para precipitação da AmB não dissolvida. Posteriormente, foi retirada uma alíquota de 100 µL do sobrenadante e diluída na proporção de 1:10 em DMSO:Metanol (1:9) e depois em metanol na proporção de 1:20. A medida da absorbância foi analisada em 405 nm. A eficiência foi obtida comparando a concentração de AmB na ME antes e após o processo de centrifugação.. 4.5 Análises estatísticas. Os resultados do trabalho são expressos como média ± desvio padrão. Diferenças significativas entre 3 grupos ou mais foram avaliados por Análise de Variância (ANOVA) seguido do teste Dunnet para comparação de médias com a amostra padrão ou Bonferroni para comparação de todas as amostras entre si. Análise entre 2 grupos foram realizadas por meio do teste t pareado. Valores de p menores que 0,05 (p<0,05) foram considerados como significativos..

(24) 12 5. ARTIGOS PRODUZIDOS. O artigo Development of lyophilized microemulsions as potential drug delivery systems using design of experiment será publicado no periódico Drug development and industrial pharmacy que possui fator de impacto 1.494 e Qualis B2 para área Medicina II..

(25) 13 Development of lyophilized microemulsions as potential drug delivery systems using design of experiment. Andreza Rochelle do Vale Morais 1, Francisco Humberto Xavier Júnior 2, Éverton Nascimento Alencar 2, Christian Melo de Oliveira 3, Teresa Raquel Fernandes Dantas 3, Waltecá Louis Lima da Silveira 1, Nednaldo Dantas Santos 3, Arnóbio Antônio Silva Júnior 3, Eryvaldo Sócrates Tabosa do Egito 1,2,3*. 1. Programa de Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas, Universidade Federal do Rio Grande. do Norte (UFRN), Natal, Rio Grande do Norte (RN), Brasil. 2. Programa de Pós-graduação em Biotecnologia - RENORBIO, Universidade Estadual do Ceará,. Fortaleza, Ceará, Brasil. 3. Departamento de Farmácia, UFRN, Natal, RN, Brasil.. * Corresponding author at: UFRN, Departamento de Farmácia, Rua General Gustavo Cordeiro de. Faria,. Petrópolis,. Natal/RN,. Brazil.. Tel. +55(84). 33429817.. E-mail. address:. socratesegito@gmail.com. Keywords: Amphotericin B; Statistical experimental design; Freeze-drying; colloidal system..

(26) 14 ABSTRACT: Context: The aqueous media present in microemulsions (MEs) may become the drug instable in this system. This drawback may be solved by the use of lyophilization process. Design of experiment (DOE) allows finding the optimal working conditions. Objective: The aim of this work was to develop a lyophilized ME system containing Amphotericin B (AmB), as a drug model, using DOE method. Materials and methods: Different types of cryoprotectants were added to MEs and performed the 23 full factorial design with three center points. The blank ME chosen and AmB-loaded ME were characterized before and after lyophilization. Results and discussion: The best result was using Maltose 5%, freezing at - 80 ºC and 24 h of freeze-drying time. It was observed that after the lyophilization, the droplet size became smaller and that there were not significant changes in the AmB content. Conclusion: Therefore, the ME containing Maltose 5% is suitable for drug incorporation and lyophilization, enhancing the drug stability in the system..

(27) 15 INTRODUCTION Colloidal drug delivery systems are becoming more interesting because they enable controlled drug release and improved bioavailability (1). Microemulsions (MEs) are optically transparent systems with low viscosity and thermodynamically stable dispersions of two liquid immiscible, stabilized by an interfacial film of a surfactant, usually in combination with a cosurfactant (2). They have shown several advantages such as enhanced drug solubility, good thermodynamic stability, increase of surface area improving absorption, and enhancing effect on transdermal ability over conventional formulations (3). These properties may find applications in food, cosmetic and pharmaceutical industry when solubilization of lipophilic or hydrophilic ingredients (4). In pharmaceutics, MEs are used as vehicles to deliver a number of drugs due to their thermodynamic stability, simple preparation, and good appearance (2). Amphotericin B (AmB) is the drug of choice for the treatment in immunodeficient patient affected by some systemic fungal infections, as well as local fungal infection in the eye. However, due the high incidence of adverse drug reactions, i.e. cardiotoxicity and hepatotoxicity (5), AmB has been incorporated in MEs systems in order to decrease these reactions (6, 7). Generally, MEs are in aqueous media which have some disadvantages such as risk of microbiological contamination, degradation by hydrolysis and loss of pharmacological activity of the drug. As an alternative to solve such these problems, the use of lyophilization, also known as freeze-drying, as a drying method has been suggested. Lyophilized products have a good stability, are easy way to transport and store (8). This process consists on removing water by sublimation though three steps: freezing, primary-drying and secondary-drying (9). During this process it may be generated several stresses that might destabilize the colloidal structure of the MEs, especially the freezing stage, which the crystallization of ice may produce a mechanical stress. However, cryoprotectant (CP) can be used in order to protect the integrity of these systems against damages (10). Some excipients have been reported to exert cryoprotective effects, for instance, the carbohydrates, that are chemically innocuous and can be easily vitrified during the freezing, supporting their use as CPs in the freeze-drying process (7)..

(28) 16 The quality of the final lyophilized product might be influenced by several factors relating to the formulation, the container, equipment and the freeze-drying process (8). Therefore, the process efficiency must be optimized through adjustment of these factors and the process monitoring is crucial in order to obtain a product having the desired quality. It is necessary to select suitable freeze-drying parameters which will evaluate the effects of these parameters and their possible interactions. For this purpose, it has been used the Design of Experiment (DOE) for the optimization, modeling and characterization process (11). The DOE is an approach based on statistical aspects, used in order to determine the influence of several independents variables on the dependent variable of the process. The optimal design allow the reduction of the cost experimentation and the time process, besides improving process yield (12). Therefore, this method is more applied than one factor at time method, which is time consuming, expensive because it requires a large number of experiments and does not examine interactions between the variables (13). The response surface methodology is a technique of DOE which combines mathematics and statistics to analyze the relative significance of different parameters, finding the optimal working conditions, by combining a small number of variables, resulting in fewer experiments (14). The aim of this work was to develop a lyophilized ME as a model to design lyophilized MEs systems containing drugs, improving its stability. Therefore, AmB was used as a drug model incorporated in the ME. An experimental design approach was used in order to establish the ideal formulation and the methods to develop this system. Important parameters, which can influence the droplet size of this system, such as concentration and type of CP, freezing temperature and freeze-drying time were evaluated.. MATERIALS AND METHODS Materials Miglyol 812® was obtained from CONDEA Chemie GmbH (Hamburg, Germany), Lipoid S100® was purchased from LIPOID GMBH (Ludwigshafen, Germany), Tween 80®,.

(29) 17 Mannitol (MN), Glucose (GC), Lactose (LT) Sorbitol (ST) and Maltose (MT) were obtained from Sigma Aldrich Inc (St. Louis, USA), and the Na2HPO4 and the NaHPO4, used to produced the Phosphate buffer pH 7.4, were purchased from Vetec Química Fina Ltda (Rio de Janeiro, Brazil). It was used ultra pure water in the experiments obtained by a Milli Q water purification system (Merck Millipore, Massachusetts, U.S.A.).. MEs preparation The ME were prepared by mixing 68 % of phosphate buffer pH 7.4, 14.7 % of Tween 80®, 6.3 % of Lipoid S100® and 11% of Mygliol 812® using magnetic stirring, following by three cycles of sonication process (1.5 min) and ultrasound bath (3 min). The MN, MT, GC and LT were added to the MEs prior lyophilization for the study of the DOE for lyophilization conditions.. Samples characterization Macroscopic aspect, pH evaluation, isotropy and conductivity analysis The color and homogeneity were evaluated by visual aspects. The isotropy of the samples was evaluated by polarized light microscopy Olympus BX4 (Olympus Corporation, Tokyo, Japan) . The electrical conductivity was measured using DM-32 conductivity (Digicrom Analytical, SP, Brazil), having a cell constant of 0.11 cm−1. The observed pH values measured by a PG-2000 pHmeter (GEHAKA, SP, Brazil). All analyses were performed at 25 ± 2 °C.. Dynamic Light Scattering (DLS) In order to evaluate the influence of different type and CP concentration on MEs droplet size, MT, MN, GC, LT and ST were added to the MEs at 5 %, 10 %, 15 % and 20% and analyzed their droplet size. The MEs were previously diluted with water in the ratio of 1:20 and measured their droplet size distribution by DLS using a ZetaPlus (Brookhaven Instruments Corporation, NY, USA) to evaluate the droplet size of all samples in this work..

(30) 18. Differential Scanning Calorimetry (DSC) The thermal behavior of the ME and its components were analyzed by DSC using a DSC-60 Shimadzu (Shimadzu Scientific Instruments, Kyoto, Japan) in order to characterize the type of the system (water-in-oil, bicontinuous or oil-in-water). The samples (5-15mg) were weighed using aluminum pans. An auto-cooling system TAC-60i (Shimadzu Scientific Instruments, Kyoto, Japan ), with ratio of 5 °C/min., using a nitrogen atmosphere at the flow of 50mL/min, and cooled at a pre-determined rate from 25°C to -40°C (for 10 minutes) and then heated at a constant scanning rate to 110 °C.. DOE methodology for lyophilization conditions To determine the optimum parameters for lyophilization process, it was performed the DOE methodology. It was developed a DOE for each CP whose ME droplet size has not changed with its addition. The CP concentrations, freezing temperature and freeze-drying time were chosen as independent variables and the ME droplet size after freeze-drying process as the dependent output response variable. The experimental levels of independent variables for ME droplet size after lyophilization are given in Table 1.. Table 1. The levels of the variables CP concentration and lyophilization time were chosen in accordance with the values commonly used in the articles, while the freezing temperature used was selected according to the minimum temperature attained by the use of liquid nitrogen, maximum temperature by Freezer Frost Free 260 (Brastemp, São Paulo, Brazil) at - 20 ºC and the central point was chosen according to the freezer available that reached temperatures near the central point, in this case at -80 ºC using Glacier NU-9438 ULT Freezer (NuAire,Inc., Minnesota, U.S.A.)..

(31) 19 A two-level three-factor full-factorial design with three centre points leading to 8 experimental randomizations runs were performed for each CP which can be observed in Table 2.. Table 2. The lyophilization was performed on freeze-dryer Christ alpha 1-2 LD (Martin Christ Gefriertrocknungsanlagen GmbH, Osterode am Harz, Germany). After lyophilization process, the MEs were reconstituted by adding the same amount of water lost after the process, followed by vortex and sonication stirring. After reconstitution their droplet size was measured by DLS. The effects of the studied variables were graphically and statistically interpreted using the Statistic software version 7.0 (StatSoft Inc., Oklahoma, USA). Based on the statistical results, the ME formulation that produced a dry powder and presented the smallest droplet size values after reconstitution was chosen to analyze the pH, conductivity and the droplet size before and after the lyophilization process in order to evaluate the influence of the process in these parameters.. Incorporation of AmB to ME system The AmB was incorporated, as a drug model, on the chosen ME formulation aiming to observe the efficiency of the lyophilization process on the production of dried MEs systems containing drugs. It was evaluated the production of dried powder and measured the pH, conductivity and droplet size of the sample before as well as after freeze-drying. The incorporation of AmB was performed by adding the drug to ME, to obtain the final concentration of 2 x 10-6 M, under continuous stirring. In order to improve the AmB dissolution, the pH of the ME was increased by the addition of sodium hydroxide solution (NaOH 1 N). Additionally, the pH was reduced (pH 7.4) using hydrochloric acid solution (HCl 1 N) (6).. Spectrophotometric analysis.

(32) 20 A spectrophotometric assay was delineated to analyze and compare the quantity of AmB before and after the freeze-drying process. The experiment was carried out using a Biochrom Libra S32 UV-VIS spectrophotometer (Biochorom US, Massachusetts, USA), at wavelength of 405 nm, to measure the absorbance of the reference solution (Methanol) and the absorbances of the MEs containing AmB. The assay was made in triplicate, the samples were diluted with DMSO: Methanol (1:9) first in the ratio of 1:10 and then 50 µL of this solution was diluted in 20 mL of Methanol. The drug loading efficiency was obtained by comparing the AmB concentration before and after centrifugation (6).. Incorporation efficiency In triplicate, about 1 mL of ME containing AmB was centrifugated at 14,000 rpm for 20 min to precipitated any excess of AmB in the Centrifuge 5410 (Eppendorf, Hamburg, Germany). After an aliquot of 100 µL of the supernatant of each sample was carefully diluted 1:10 in DMSO: Methanol (1:9) and then 50 µL of this solution was diluted in 20 mL of Methanol. The measure of absorbance was at 405 nm.. Statistical Analysis The statistical tests used in the experiments were the Analysis of Variance (ANOVA) performed to analyze the statistical significance between 3 groups, followed by Dunnet post-test to compare with sample control or Bonferroni that compare all samples; and paired t-test, used between 2 unpaired groups. p values less than 0.05 (p<0.05) were used as level of significance.. RESULTS AND DISCUSSION Characterization of the ME system before addition of CP Macroscopic aspect, isotropy, evaluation and conductivity analysis The ME was homogeneous and clear yellowish product that appeared dark under crosspolarized light microscopy (no birefringence) and was classified as isotropic system. The pH value for ME was 7.1 ± 0.09 which it is considered physiologically acceptable..

(33) 21 In general, MEs can be divided into 3 types: water-in-oil (W/O), bicontinuous, and oilin-water (O/W) (15). The correlations exist between a ME structure and its electrical conductivity behavior has been demonstrated and used as a tool to assess aspects of ME properties (16). The electrical conductivity value was 832.90 ± 22.08 µS cm-1. It has known that O/W microemulsions present conductivity value similar of aqueous phase. This high value is due the large volume percentage of water in the system, which can be concluded that the system is of the O/W type (17, 18).. DSC analysis of ME components The DSC analysis evaluated the thermal behavior of the ME and of its components separately. Through the thermogram (Figure 1), it is possible to observe the thermal events of the ME and phosphate buffer 7.4 characterized by the exothermic large peak during the cooling curve which it is due the process of water freezing, following by the endothermic peaks during the heating curve explained by the melting of water of the system. It is also possible to observe the small exothermic peak of Tween 80® and Miglyol 812®, following by only endothermic peak of Miglyol 812®. The following endothermic peak for microemulsion occurred, probably, due to the water loss that presents an enthalpy value of - 1.57 kJ/g.. Figure 1. During the cooling curve, the position of the peak may indicate the state of water in ME, since represents the freezing water. The strong interaction of water molecules with surfactants, compared with weaker interactions, solidify at lower temperature (19). The exothermic peak in the Figure 1 indicating the freezing of water with less interaction with surfactants molecules, since the microemusion freezing approximately, at - 9.81 ºC, which it is near of phosphate buffer freezing temperature (-13.54 ºC). Moreover, evaluating the ME thermal profile it was not observed the characteristics peaks of Miglyol 812® and Tween 80®, which suggesting the.

(34) 22 interaction of them with others components of the system and its presence on the internal phase or interface of the droplet. Therefore, through the DSC measurements, it may be concluded that the water molecules are in continuous phase, thus O/W type of ME is assumed, confirming the results of electrical conductivity.. Droplet size evaluation after addition of CP Based on the hypothesis that the ME stability could be modified by the type and concentration of the CP used, which may interfere on the droplet size distribution and on the freeze-drying process of the system. It was studied the influence of different CP types and concentrations in MEs systems, that was assessed by droplet size measurements. Macroscopically, almost all the MEs systems, with and without CP, were clear, isotropic and homogeneous. However, the ones with Lactose 15 %(w/w) and 20 %(w/w) presented a turbid aspect. The effect of CP addition on droplet size can be observed on Figure 2. It was possible to observe that ME showed an average size of 21.96 nm, which do not change with the addition of MT, MN, GC and LT (p > 0.05). However, concerning ST, the addition of a minimal amount induces an increase on the droplet size (28.10 nm). At large amount, the droplet size of ME containing ST reaches a value of 61.70 nm. Those variations, compared to MEs without CP, were statistically significant (p<0.05).. Figure 2. The CPs MN, MT, GC and LT at the concentrations from 5% to 20% may be used in order to protect MEs against the freezing and dry steps required for lyophilization process. In fact, these CPs did not induce important changes on the MEs droplet size generated. Nevertheless, ST did not show to be an ideal CP because interfere on the droplet size distribution, changing the ME stability. Therefore, ST was not used for DOE tests..

(35) 23 DOE for lyophilization conditions All MEs remained transparent after the addition of MT and GC. On the other hand, the LT and the MN appeared turbid over 12.5 % and at 20 % respectively, showing that they do not have a good solubility in this ME system. Among the samples submitted to lyophilization process, the MT and LT showed effectively to produce dry powders. Disaccharides, such as these CP are more effective freezedrying protectants then others type because they form an amorphous sugar glass (8). The ME-LT at 5 % produced a powder, but its appearance was not completely dry. This might be occurred, probably, because at this concentration the CP was not able to reach the complete stabilization in the ME, requiring higher levels of CP concentration (20), whereas all MEs-MT produced dry powders, showing the high capacity of this CP on freeze-dried ME stabilization. The use of the monosaccharide GC resulted in a freeze-dried cakes, which might be occurred due to the temperature of primary drying, during the lyophilization process, to be above of the glass transition temperature (transition temperature range in which an amorphous sample in the glassy state change to a rubbery state or the reverse (21)) of MEs-GC, causing the collapse of the product (22). Only the ME-MN at 20 % freezing at - 196 ºC yielded dry powders after lyophilization, this succeed in this process is probably due the concentration be sufficient to stabilized the system and the rapid cooling inhibited the MN crystallization (23). However, at this concentration, this CP was not soluble in the system; furthermore after a period of time at room temperature it became rubber, therefore proving to not be the best choice as CP. The MEs-MN at 5 % and 12.5 % might have presented some problems during the process due to the tendency of MN to partly crystallize into MN hemi-hydrate, which can allow the hydrate water release and conversion into anhydrous crystal forms occur. This crystallization may cause phase separation in the cryo-concentrated portion of the frozen samples, resulting in the loss of CP activity and destabilization of the system (13, 24) ..

(36) 24 The samples that produced powders were reconstituted with the same amount of water lost during lyophilization process. After reconstitution, The ME-MN 20 % and all samples of MEs-MT and MEs-LT were clear and their droplet size were measured. The MEs-LT samples and ME-MN at 20 % were not show turbid as before drying, probably due the sonication process that increase the system energy and CP solubility. It was prepared a Pareto chart for investigate the standardized effect of independent variables and their interaction on ME droplet size. The results for MEs-MT showed the square freezing is the most important factor controlling the droplet size. The negative coefficients for square freezing variable indicated an unfavorable or antagonistic effect on the droplet size, therefore the closer to the lower limit (-1 level) of square freezing temperature ( - 20 ºC) larger the droplet sizes, in other words, higher freezing temperatures values larger the ME droplet sizes (Figure 3a) (25). Freezing is the stage where most of the water is removed from the sample, the system separates into ice and concentrated solution (9). In the case of this microemulsion, the concentrated phase is composed of oil, surfactants and buffer. Increasing the concentration destabilizes the system, that may enhances the interaction between the droplets leading to their aggregation or fusion, increasing the droplet sizes (20). The analysis of Pareto chart of the MEs-LT presented (Figure 3b) positive coefficients for model components (x2, x3, x2x3, x1x3) showed a synergistic or favorable effect on the droplet size, and the concentration of CP was the most significant variable for droplet size (25).. Figure 3. The CP concentration dependent of the samples it was also observed by Date PV, 2010 (26). As there was a large increase in the droplet size with increasing CP concentration, it is necessary evaluate the certain amount of CP to preserve effectively the droplet size to ensure a maximum stabilization of system (8)..

(37) 25 The empirical second order polynomial equation was developed for the response variable droplet size in terms of the three independent variables. This equation for MEs-MT is expressed by y = 23.4 +1.31x1 + 6.11x12 + 1.41x2 + 0.96x3 + 1.61x1x2+ 0.41x1x3 – 0.54x2x3, and for MEs-LT is y = 30.93 + 2.04x1 + 3.00x12 + 9.86x2 + 4.19x3 +2.26x1x2 + 3.19x1x3 + 4.16x2x3. Where y represents the response variable (droplet size), x1, x2 and x3 are the coded values of the test variables, which are freezing, CP concentration and freeze-drying time, respectively. The statistical significance was evaluated using Fisher’s F-test and ANOVA. The statistical analysis showed, based on probability values less than 0.05, that statistical significance was indicated for quadratic term of freezing in MEs-MT, and MEs-LT presented statistical significance for concentration, freeze-drying, interaction of them, and interaction between freezing and freeze-drying. Furthermore, the ANOVA results (Table 3) for both MEs showed that the calculated F value was found to be greater than the tabulated F value at the 5% level, indicating that treatment combinations are significants. Moreover, concerning to lack of fit and pure error, the calculated F˂ tabulated F demonstrated that the model is predictive (14). The value of the coefficient of determination for MEs-MT and MEs-LT were, respectively, R2 = 0.9236 and R2 = 0.9120, indicating that 92.36 % and 91.2 % of the response variability could be explained by the previously discussed models in this work.. Table 3. To observe the average responses for each level of each factor it was plotted a marginal means chart . It was observed to ME-MT (Figure 4a) that when compared the minimum level to the maximum level during the freeze-drying time of 24 h the lowest droplet size was obtained using the minimum CP level (5 % MT), regardless of the freezing temperature. Whereas, at 48 h of lyophilization, the behavior varies depending on freezing temperature. Freezing at - 196 °C the smallest droplet size is achieved using 5% MT, and freezing at - 20 ° C the smallest size is.

(38) 26 achieved with 20% MT. It also observed that rapid freezing (-196 ºC) the droplet size increased with increase of CP concentration. The analysis of marginal means of ME-LT (Figure 4b) showed that both in the lyophilization time of 24 h and 48 h the ME droplet size increased with increasing of CP concentration, regardless of the freezing temperature. Nevertheless, at the minimum level of lyophilization time the freezing of - 20 ºC produced larger droplet size than at -196 ºC. Otherwise, freeze-drying time of 48 h that presented lower droplet size at this freezing time. Both levels of freezing temperature decreased the size with decreasing of CP concentration.. Figure 4. The relationship between the dependent and independent variables was further elucidated by analysis of response surface diagrams, evaluating the relative significance of all the factors involved in the process. Throughout of this technique it was possible to determine the optimum operational conditions for the system and the process (27). It was observed that the MEs droplet size decreased with reduction of freeze-drying time and MT concentration at linear form. However, when it was compared freezing time to others independent variables there were no direct linear relationship among them. Nevertheless, it is possible to identify the smaller droplet size values of ME-MT at - 80 ºC of freezing temperature (Figure 5a and Figure 5b). Response surface analysis when it was used LT as CP, the independent variables and their interaction on the droplet size were graphically represented (Figure 5c and Figure 5d) in order to predict determinate the optimum values for freeze-drying ME. According to these graphs the droplet size increased with increase LT concentration and freeze-drying time, and the smallest droplet size was found at the central point of freezing temperature.. Figure 5.

(39) 27 Therefore, the best parameters to obtain small droplets size for lyophilized MEs for both MT as LT were 5 % of CP concentration, freezing at - 80 ºC, and freeze-drying for 24 hour. However, at this concentration ME-LT become rubber after few minutes after lyophilization process and at higher concentrations was not reached its complete solubilization in the system. Therefore MT was chosen as the best CP for this ME.. Characterization of the ME before and after lyophilization After the choice of the best parameters for lyophilization, it was performed the characterization of the ME before and after lyophilization in order to evaluated if the ME physical chemistry characteristics remained unchanged after the process. The ME presented 52.3 nm ± 0.65 of droplet size, the pH value of 7.1 ± 0.090 and the 832.9 µS cm-1 ± 22.08 of conductivity value. The macroscopic appearance remained homogeneous and clear yellowish after addition of CP and lyophilization process. However there were changes in pH values, conductivity values and droplet size (Table 4).. Table 4. The pH value decreased, probably due the stress induced by freezing that cause pH change arising from crystallization of buffer salts (9). However, even in this pH (6.86), the ME is physiologically acceptable. The droplet size of ME might be decreased due to the CP present the co-surfactant role, due the short-chain poly-hydroxy-alcohol, which was adsorbed and intercalated onto the interfacial film of the microemulsion after the lyophilization and reconstitution, decreasing the surface tension (28, 29). At this droplet size (20.13nm), the sample remains within the ME droplet size range of 10 - 100 nm (30). The decrease of conductivity when the CP was added is probably due its protective mechanism that enhances the viscosity of the system due to the interaction between the hydroxyl of CP and water molecules. The ice crystallization can be suppressed by increase.

(40) 28 viscosity and limit the mechanical damage (20). Therefore, the decrease of the amount of ions, perhaps, decreasing the conductivity value. However, when the water is removed during the drying process, the ions of buffer remain in the sample, thus when the lyophilized ME was reconstituted the electrical conductivity increased due the ions present in the water added. The protective mechanism of the CPs may be also explained by the formation of a eutectic mixture in the presence of water, due the multi-hydroxy compounds, that lead to the formation of amorphous or imperfect ice crystalloids; the maintenance of spatial orientation and distance among the droplet size when the ice sublimes during the freeze-drying process, prevented from forming the aggregates (31); and amorphous glass formation, where the cryoconcentrated solution may vitrify at Tg. The immobilization of the sample within a glassy matrix of CP can prevent their aggregation and protect them against the mechanical stress of ice crystals (22).. Incorporation and lyophilization of ME containing AmB The ME after incorporation of AmB showed homogeneous and clear yellowish aspect. The addition of MT 5 % did not show changes in the ME appearance. The lyophilization process was performed freezing the samples for 24h at - 80 ºC and freeze-drying for 24 h. It was observed the formation of a dry powder, and its reconstituted in sonicator with a ice bath, with the same amount of water lost during the process, showed changes in the electrical conductivity, pH and droplet size (Table 5) that may be explicated by the same reasons of ME without AmB.. Table 5. Observing the Table 4 and Table 5 it is possible notice that the addition of the drug increased the ME droplet size and the conductivity value. The ionization of AmB ionizable functional groups (carboxyl and/or amino groups) conductivity probably increases the amount of ions in the system increasing the electrical conductivity value (32). The increase on the droplet size may be explained by the AmB molecule partitioned into the oil phase since it is.

(41) 29 insoluble in water, increasing the oily phase volume, furthermore due its amphiphilic properties the molecule might be adhered in the system interface also increasing the droplet size (33). In order to determine the analytical content of AmB into ME it was constructed a standard curve (data not shown) of absorbance versus AmB solution concentrations. The curve provided the linear equation y = 1.2565x – 0.0257 and R2 = 0.9992. Thus, the linear fit could explain more than 99% of the experimental data. Therefore, the result confirms that the methodology could be adequately used for quantitative analysis of AmB. The analytical content of AmB in ME remained after lyophilization process, since there was not significant change (p > 0.05). Therefore MT 5 % was effective in preventing ME diameter changes and loss of AmB. Even though the low AmB loading efficiency (24.4 %), the freeze-drying process did not change the concentration of drug encapsulated (p > 0.05), therefore there was not loss of encapsulated drug. MT was a efficient CP avoiding the drug loss, probably, due the ability of forming hydrogen bond to phospholipid head groups, replacement the water and reducing the gel to liquid crystalline phase transition of dry phospholipids that occur when phospholipids are rehydrated. Thereby, the MT did not lead to inhomogeneous rearrangement of phospholipids that could result in particle aggregation and loss of incorporated drug to the aqueous medium (8).. CONCLUSION Difficulties in development of MEs lyophilizated are due to the few papers in this issue and the several parameters that affect the system during the process. However, the use of DOE allowed to determine the optimal freeze-drying conditions for the ME, concerning type and concentration of CP, freezing temperature and freeze-drying time and analyzed by the evaluation of the smallest droplet size, using a low number of experiments. It was concluded that 5% of MT as CP, - 80 ºC of freezing temperature and 24 h of freeze-drying time were the best parameters to freeze-drying ME. This new product developed may be used as a model for.

(42) 30 drug delivery system, because do not changes in the loaded drug, as proved with AmB incorporation, and improving the system stability related to the problem with aqueous media.. ACKNOWLEGMENTS The authors would like to acknowledge CAPES and CNPq for the financial support. The drug development laboratory and Center Research on Oil and Gas of UFRN for the equipment support..

(43) 31 REFERENCES 1. Podlogar F, Gagperlin M, Tomsic M, Jamnik A, Rogac MB. Structural characterisation of water-Tween 40((R))/Imwitor 308((R))-isopropyl myristate microemulsions using different experimental methods. Int J Pharm. 2004;276(1-2):115-28. 2. Date AA, Nagarsenker MS. Parenteral microemulsions: An overview. Int J Pharm. 2008;355(1–2):19-30. 3. Lawrence MJ, Rees GD. Microemulsion-based media as novel drug delivery systems. Adv Drug Deliv Rev. 2000;45(1):89-121. 4. Kogan A, Garti N. Microemulsions as transdermal drug delivery vehicles. Adv Colloid Interfac Science. 2006;123:369-85. 5. Das S, Suresh PK. Nanosuspension: a new vehicle for the improvement of the delivery of drugs to the ocular surface. Application to amphotericin B. Nanomedicine-UK. 2011;7(2):242-7. 6. Damasceno BPGL, Dominici VA, Urbano IA, Silva JA, Araujo IB, Santos-Magalhaes NS, et al. Amphotericin B Microemulsion Reduces Toxicity and Maintains the Efficacy as an Antifungal Product. J Biomed Nanotechnol. 2012;8(2):290-300. 7. Darole PS, Hegde DD, Nair HA. Formulation and evaluation of microemulsion based delivery system for amphotericin B. AAPS PharmSciTech. 2008;9(1):122-8. 8. Abdelwahed W, Degobert G, Stainmesse S, Fessi H. Freeze-drying of nanoparticles: formulation, process and storage considerations. Adv Drug Deliv Rev. 2006;58(15):1688-713. 9. Tang X, Pikal MJ. Design of freeze-drying processes for pharmaceuticals: practical advice. Pharm Res. 2004;21(2):191-200. 10. Lee MK, Kim MY, Kim S, Lee J. Cryoprotectants for freeze drying of drug nanosuspensions: Effect of freezing rate. J Pharma Sci. 2009;98(12):4808-17. 11. Fissore D, Pisano R, Barresi AA. A Model-Based Framework to Optimize Pharmaceuticals Freeze Drying. Dry Technol. 2012;30(9):946-58. 12. Jeirani Z, Jan BM, Ali BS, Noor IM, Hwa SC, Saphanuchart W. The optimal mixture design of experiments: Alternative method in optimizing the aqueous phase composition of a microemulsion. Chemometr Intelli Lab. 2012;112:1-7. 13. De Beer TR, Wiggenhorn M, Hawe A, Kasper JC, Almeida A, Quinten T, et al. Optimization of a pharmaceutical freeze-dried product and its process using an experimental design approach and innovative process analyzers. Talanta. 2011;83(5):1623-33. 14. Yetilmezsoy K, Demirel S, Vanderbei RJ. Response surface modeling of Pb(II) removal from aqueous solution by Pistacia vera L.: Box-Behnken experimental design. J Hazard Mater. 2009;171(1-3):551-62. 15. Liu DY, Kobayashi T, Russo S, Li FL, Plevy SE, Gambling TM, et al. In Vitro and In Vivo Evaluation of a Water-in-Oil Microemulsion System for Enhanced Peptide Intestinal Delivery. Aaps J. 2013;15(1):288-98. 16. Hathout RM, Woodman TJ, Mansour S, Mortada ND, Geneidi AS, Guy RH. Microemulsion formulations for the transdermal delivery of testosterone. Eur J Pharm Sci. 2010;40(3):188-96. 17. Saha R, Rakshit S, Mitra RK, Pal SK. Microstructure, Morphology, and Ultrafast Dynamics of a Novel Edible Microemulsion. Langmuir. 2012;28(22):8309-17. 18. Mehta SK, Bala K. Tween-based microemulsions: a percolation view. Fluid Phase Equilibr. 2000;172(2):197-209. 19. Podlogar F, Rogac MB, Gagperlin M. The effect of internal structure of selected waterTween 40 (R)-Imwitor 308 (R)-IPM microemulsions on ketoprofene release. Int J Pharm. 2005;302(1-2):68-77. 20. Zhang LJ, Liu L, Qian Y, Chen Y. The effects of cryoprotectants on the freeze-drying of ibuprofen-loaded solid lipid microparticles (SLM). Eur J Pharm Biopharm. 2008;69(2):7509. 21. Liu Y, Bhandari B, Zhou W. Glass transition and enthalpy relaxation of amorphous food saccharides: a review. J Agric Food Chem. 2006;54(16):5701-17..

(44) 32 22. Hirsjarvi S, Peltonen L, Hirvonen J. Effect of sugars, surfactant, and tangential flow filtration on the freeze-drying of poly(lactic acid) nanoparticles. AAPS PharmSciTech. 2009;10(2):488-94. 23. Pyne A, Surana R, Suryanarayanan R. Crystallization of mannitol below Tg' during freeze-drying in binary and ternary aqueous systems. Pharm Res. 2002;19(6):901-8. 24. Cavatur RK, Vemuri NM, Pyne A, Chrzan Z, Toledo-Velasquez D, Suryanarayanan R. Crystallization behavior of mannitol in frozen aqueous solutions. Pharm Res. 2002;19(6):894900. 25. Caldas LFS, de Paula CER, Brum DM, Cassella RJ. Application of a four-variables Doehlert design for the multivariate optimization of copper determination in petroleum-derived insulating oils by GFAAS employing the dilute-and-shot approach. Fuel. 2013;105:503-11. 26. Date PV, Samad A, Devarajan PV. Freeze Thaw: A Simple Approach for Prediction of Optimal Cryoprotectant for Freeze Drying. AAPS PharmSciTech. 2010;11(1):304-13. 27. Bezerra MA, Santelli RE, Oliveira EP, Villar LS, Escaleira LA. Response surface methodology (RSM) as a tool for optimization in analytical chemistry. Talanta. 2008;76(5):96577. 28. Moreno M, Frutos P, Ballesteros MP. Lyophilized lecithin based oil-water microemulsions as a new and low toxic delivery system for amphotericin B. Pharm Res. 2001;18(3):344-51. 29. Steckel H, Eskandar F, Witthohn K. Effect of cryoprotectants on the stability and aerosol performance of nebulized aviscumine, a 57-kDa protein. Eur J Pharm Biopharm. 2003;56(1):11-21. 30. Tandel H, Raval K, Nayani A, Upadhay M. Preparation and evaluation of cilnidipine microemulsion. J Pharm Bioallied Sci. 2012;4(Suppl 1):S114-5. 31. Abdelwahed W, Degobert G, Fessi H. Investigation of nanocapsules stabilization by amorphous excipients during freeze-drying and storage. Eur J Pharm Biopharm. 2006;63(2):8794. 32. Mazerski J, Bolard J, Borowski E. Effect of the Modifications of Ionizable Groups of Amphotericin-B on Its Ability to Form Complexes with Sterols in Hydroalcoholic Media. BBABiomembranes. 1995;1236(1):170-6. 33. Pestana KC, Formariz TP, Franzini CM, Sarmento VHV, Chiavacci LA, Scarpa MV, et al. Oil-in-water lecithin-based microemulsions as a potential delivery system for amphotericin B. Colloid Surfaces B. 2008;66(2):253-9..

(45) 33 Table 1: Experimental levels of independent variables for ME droplet size after lyophilization. Level Independent variable -1. 0. +1. Freezing (ºC). - 20. - 80. -196. % CP. 5. 12.5. 20. Freeze- drying time (h). 24. 36. 48.

(46) 34 Table 2: DOE for lyophilization of MEs for each CP. Samples. Freezing. CP. Freeze - drying time. 1. -1. -1. -1. 2. +1. -1. -1. 3. -1. +1. -1. 4. +1. +1. -1. 5. -1. -1. +1. 6. +1. -1. +1. 7. -1. +1. +1. 8. +1. +1. +1. 9. 0. 0. 0. 10. 0. 0. 0. 11. 0. 0. 0.

(47) 35 Table 3 : Statistical analysis (ANOVA) of MEs-MT and MEs-LT samples. ME - MT Source. Mean. ME -LT. Calculated Tabulated. Mean. Calculated Tabulated. 2. R2. R square. F. F. square. Regression. 81.518. 9.9861. 5.117. Residue. 8.163. Lack of fit. 9.755. Pure Error. 2.590. 2,843333. Total. 15.498. 135,1116. F. 0.9236 250,3153 12,57359. F 5.05. 19,90802 3.7666. 19.35. 31,28448 11,00275. 19.16. 0,9120.

(48) 36 Table 4: Physical and chemistry characterization of ME before and after lyophilization process. Electrical Samples. Appearance. pH. Droplet size conductivity. Homogeneous 749.1 µS cm-1 ± ME + MT 5%. and clear. 7.23 ± 0.04. 48.13 nm ± 1.57 25.65. yellowish Homogeneous 876.5 µS cm-1 ±. ME + MT 5% and clear. 6.86 ± 0.01∗. 20.13 nm ± 3.30∗ 14.80∗. reconstituted yellowish Average values ± SD reported. ∗p < 0.05 compared with the same sample before lyophilization..

(49) 37 Table 5: Physical and chemistry characterization of ME with AmB containing 5 % of MT before and after lyophilization process.. Samples. Before. Appearance. Electrical. Droplet. AmB. conductivity. size. concentration. 7.59 ±. 1583 µS cm-1 ±. 54.07 nm. 1.97 x 10-3 M ±. 0.10. 39.55. ± 2.35. 0.03. 7.4 ±. 1639 µS cm-1 ±. 32.30 nm. 1.94 x 10-3 M ±. 0.11∗. 53.75∗. ± 4.20∗. 0.02∗∗. pH. Homogeneous. freeze-. and clear. drying. yellowish. After. Homogeneous. freeze-. and clear. drying. yellowish. Average values ± SD reported ∗p < 0.05 compared with the same sample before lyophilization. ∗∗p > 0.05 compared with the same sample before lyophilization..

(50) 38 Figure captions Figure 1: ME and its components Thermograms. Figure 2: The droplet size of MEs formulations without and with the CPs MT, MN, LT, GC and ST. Figure 3: Pareto chart the standardized effect of independent variables and their interaction on (a) MEs-MT droplet size (b) MEs-LT droplet size. Figure 4: Plots of marginal means for CP concentration, freezing temperature and freeze-drying time. (a) ME-MT (b) ME-LT. Figure 5: Response surface plot showing (a) the effect on freezing, concentration and their mutual effect on the MEs-MT droplet (b) size the effect on freezing, freeze-drying and their mutual effect on the MEs-MT droplet size (c) the effect on freezing, concentration and their mutual effect on the MEs-LT droplet size (d) the effect on freezing, freeze-drying and their mutual effect on the MEs-LT droplet size..

(51) 39. Figure 1.

(52) 40. Figure 2.

(53) 41. Figure 3.

(54) 42. Figure 4.

(55) 43. Figure 5.