Identificação de Loci potencialmente amplificáveis em
Jurupoca (Hemisorubim platyrhynchos)
Identification of potentially amplifiable loci in Jurupoca
(Hemisorubim platyrhynchos)
Mateus Tremea¹, mateustremea@outlook.com Suele Bueno dos Santos¹,
Suellen Susin Gazzola¹, Rafael Aldrighi Tavares¹
¹Universidade Federal de Santa Maria campus Palmeira das Missões Palmeiras das Missões-RS
Submetido em 28/08/2017 Revisado em 04/09/2017 Aprovado em 30/10/2017
Resumo: Objetivou-se a identificação de loci potencialmente amplificáveis de microssatélites na espécie Hemisorubin platyrhynchos. A biblioteca de DNA, da espécie jurupoca (Hemisorubim platyrhynchos) foi obtida a partir de um sequenciador GAIIx (Illumina, USA) com leituras de 150 pares de bases. O programa PAL_FINDER_v.0.02.03, foi utilizado para fazer as leituras adquiridas do sequenciamento. O desenho dos primers foi realizado com o programa Primer3 v.2.. Foi encontrado um total de 457965 loci, também foi obtido um total de 186157 loci com primers (PALs). O motivo com maior apresentação entre os tetranucleotídeos foi o AAAT com 27.814 repetições. Os dados técnicos e científico auxiliam no planejamento e execução de projetos relacionados à análise genética de populações e os microssatélites servirão como base para estudos genéticos da espécie à serem realizados sequentemente, podendo identificar a perda de variabilidade genética da espécie.
Palavras chave: Microssatélites; PALs; Conservação.
Abstract: It was aimed the identification of potentially amplifiable loci of microsatellites in the species Hemisorubin platyrhynchos. The DNA library of the Jurupoca species (Hemisorubim platyrhynchos) was obtained from a GAIIx sequencer (Illumina, USA) with readings of 150 base pairs. The PAL_FINDER_v.0.02.03 program was used to make the acquired sequencing readings. The design of primers was done in the Primer3 v.2. program. A total of 457965 loci was found, also a total of 186157 loci were obtained with primers (PALs). The motive with the highest tetranucleotide presentation for AAAT with 27,814 replicates. The technical and scientific data help in the planning and execution of projects related to the genetic analysis of populations and the microsatellites will serve as a basis for genetic studies of the species to be carried out sequentially, being able to identify the loss of genetic variability of the species.
Introdução
O fato da pesca extrativista ser dependente das espécies nativas de peixes, aliada à crescente demanda de alimentos provenientes do ambiente aquático (peixes, moluscos, algas entre outros), faz surgir uma preocupação com a preservação destas espécies em seu habitat natural (FAO, 2015). Tornando-se necessário o estudo das espécies mais populares que apreTornando-sentem um bom desempenho produtivo e que são mais apreciadas na culinária, para evitar que sua exploração econômica seja considerada um fator prejudicial ao meio ambiente.
Hemisorubim platyrhynchos, popularmente conhecida como jurupoca, é
uma espécie de médio porte, pertencente à família Pimelodidae e tem ocorrência nos grandes rios da América do Sul, nas bacias dos rios Amazonas, Maroni, Orinoco e Paraná (REIS et al., 2003). No Brasil a espécie Hemisorubim
platyrhynchos está distribuída nas regiões Norte e Centro-Oeste, além dos
estados de São Paulo, Minas Gerais, Paraná e Rio Grande do Sul.
A espécie jurupoca habita a boca das lagoas, os canais mais profundos dos rios e entre a vegetação aquática que cresce nas margens, é predadora de microfauna bentônica e de peixes, com uma longevidade de 11,4 anos, podendo alcançar até 64 cm de comprimento (PENHA et al., 2003). Trata-se de uma espécie carnívora que alimenta-se de peixes e invertebrados, sua carne é de tonalidade amarelada de excelente sabor, o que a torna uma espécie promissora. A pesca dessa espécie é sazonal e vem ganhando importância à medida em que a captura das espécies mais visadas diminui (CATELLA, 2001).
Apesar de sua ampla distribuição, mediana abundância e de sua importância para o funcionamento do ecossistema e a pesca nas regiões em que ocorre, pouco se conhece acerca da biologia da espécie. (PENHA et al. 2003). A fim de que programas de conservação, produção e melhoramento genético de peixes nativos revelem resultados adequados, precisos e de longo prazo, é necessário que se desenvolva o monitoramento genético de populações. (LOPERA BARRERO et al., 2009).
Com isso o conhecimento sobre a variabilidade genética e os padrões de estrutura das populações são pré-requisitos para o desenvolvimento de
estratégias para aquicultura, através de futuros programas de melhoramento genético. No entanto, estudo de variabilidade genética em Hemisorubim
platyrhynchos requer o desenvolvimento de marcadores moleculares
polimórficos. (TAVARES,2014).
É fundamental entender e conhecer mais sobre a genética das populações de peixes nativos, o tamanho destas populações e a variabilidade genética dos indivíduos que as constituem, sendo que a demanda de carnes saudáveis pela população, influência de modo indireto na manutenção destas espécies em seus ambientes naturais. Tendo como base os conhecimentos acima citados, pode-se caracterizar os indivíduos de uma população, detectando por meio da presença de microssatélites, por exemplo, se a população apresenta problemas relacionados a variabilidade genética e indicar as possíveis alternativas para correção dos mesmos.
Os microssatélites são encontrados no DNA, em zonas constituídas em sua formação de sequências repetidas em tandem, compostas de 2 a 6 nucleotídeos de comprimento. Também são conhecidos como repetições curtas em tandem (STRs) ou simples sequências repetidas (SSRs), localizadas entre os loci mais polimórficos do genoma (MILACH, 1998; MATIOLI, 2001).
Os avanços tecnológicos na área de sequenciamento de DNA possibilitaram o surgimento de eficientes e baratos para a análise de marcadores moleculares de espécies que ainda não possuíam dados disponíveis, acarretando nos denominados loci potencialmente amplificáveis (PALs) (CASTOE et al., 2012).
O presente estudo objetivou a identificação de loci potencialmente amplificáveis de microssatélites para a espécie nativa Jurupoca (Hemisorubim
platyrhynchos), busca o entendimento da genética dessa espécie.
Materiais e métodos
A biblioteca de DNA, da espécie jurupoca (Hemisorubim
platyrhynchos) foi obtida a partir de um sequenciador GAIIx (Illumina, USA) com
et al., 2012) foi utilizado para fazer as leituras adquiridas do sequenciamento, o mesmo foi instalado em um computador com sistema operacional compatível com o do programa. Foram identificados como microssatélites (SSRs), aqueles que apresentaram dinucleotídeos (2mer), trinucleotídeos (3mer), tetranucleotídeos (4mer), pentanucleotídeos (5mer) e hexanucleotídeos (6mer), com repetições simples de, pelo menos, 12 pb de comprimento para 2mer, 3mer e 4mers, e pelo menos três repetições para 5mers ou 6mers.
Os microssatélites encontrados foram agrupados para um subdiretório local do programa Primer3 v.2 (LANCE et al., 2013), tendo estabelecido como critérios para o desenho de primers: conteúdo GC superior a 30%; temperaturas de anelamento de 58 – 65°C com uma diferença máxima entre 2°C entre o par; os dois últimos nucleotídeos 3’ sendo G ou C e poli-N de no máximo quatro nucleotídeos. Todos os outros parâmetros foram ajustados para valores padrão do programa. Os loci SSRs, que apresentaram sequências flanqueantes bastante adequadas, conforme o critério estabelecido, para desenho de primers, foram denominados de Loci Potencialmente Amplificáveis (PALs).
Resultados e discussão
Obteve-se 644.122 leituras, contendo 0,187 gigas pares de base (Gpb) para a espécie, sendo 457.965 loci, também foi obtido um total de 186.157 loci potencialmente amplificáveis (PALs).
O tamanho do genoma da espécie Hemisorubim platyrhynchos não é conhecido, mas ao considerar genomas de peixes que já foram estudados, pesquisadores encontram valores próximos a 1,250 Gpb (KATAGIRI et al., 2005; JIANG et al., 2013), considerando esses valores, para a Jurupoca foi obtida a cobertura de aproximadamente 14,96 % do genoma. Valores semelhantes foram encontrados por Tavares et al. (2014) em seu estudo com Peixe-Rei (Odontesthes humensis), em que 0,184 Gpb foram encontrados, correspondendo a uma cobertura de aproximadamente 15% do genoma. Garcia (2015) em uma análise do genoma da viola (Loricariichthys anus), encontrou 0,159 Gpb, indicando que houve uma cobertura pequena do genoma da espécie, de apenas 12,72 %. A semelhança nos valores encontrados pode ser atribuída ao uso da mesma plataforma de sequenciamento.
Do total de leituras obtidas para a Jurupoca, 457.965 contiveram SSRs (loci), e foram divididos em: 2mers 274.706; 3mers 36.991; 4mers 115.456; 5mers 20.071 e 6mers 10.741; porém apenas 28,90 % apresentaram sequencias flanqueantes para o futuro desenho dos primers, gerando 186.157 PALs, divididos em: 2mers 96.257; 3mers 20.630; 4mers 54.427; 5mers 10.770 e 6mers 4.073. (fig1).
Figura 1: Total de loci e o número de loci potencialmente amplificáveis (PALs), identificados por tamanho das repetições de microssatélites.
Demostrou-se uma semelhança com Rodrigues et al. (2015) que encontrou dinucleotídeos como sequência que mais se repetiu em Rhamdia sp., distinguindo-se de Garcia (2015) que teve trinucleotídeos como sequência que mais se repetiu em Loricariichthys anus e de Tavares et al. (2014) que encontrou tetranucleotídeos como sequências que mais se repetiu em Odontesthes
humensis.
Levando em consideração o uso da mesma plataforma de estudo e a semelhança entre os Gpb o número de PALs encontrados no estudo foi de 186.157, sendo que Tavares et al. (2014) no estudo da espécie Odontesthes
0 50000 100000 150000 200000 250000 300000
2 mers 3 mers 4 mers 5 mers 6mers
total loci
humensis encontrou 25.806, já Rodrigues et al. (2015) em estudo da espécie Rhamdia sp. Identificou 6.331, apresentando números inferiores de PALs
quando comparados com a espécie Hemisorubim platyrhynchos. Quanto mais abrangente for a cobertura do genoma, maior será a quantidade de Gpb e o número de PALs tende a ser maior, isso possibilita uma maior precisão nos dados obtidos.
Dentre os motivos considerados melhores - BestPALs (CASTOE et al., 2012), os tetranucleotídeos foram os que mais apresentaram repetições, com 54.427, seguidos por pentanucleotídeos com 10.770 repetições e hexanucleotídeos com 4.073 repetições. Entre os tetranucleotídeos o motivo com maior número de repetições foi o AAAT com 27.814. (Fig2).
Figura 2: Relação de motivos com maior apresentação em tetranucleotídeos.
Não há semelhança com os resultados obtidos por Tavares et al. (2014) que encontrou o motivo (ATGG) e Garcia (2015) que identificou o motivo de maior repetição entre os tetranucleotídeos o (TCTG) mostrando neste caso, grandes variações entre as repetições de loci microssatélites presentes nos peixes. 0 5000 10000 15000 20000 25000 30000
Conclusão
A obtenção de dados técnicos e científico auxiliam no planejamento e execução de projetos relacionados à análise genética de populações de
Hemisorubim platyrhynchos. Os microssatélites servirão como base para
estudos genéticos da espécie à serem realizados sequentemente, podendo identificar a perda de variabilidade genética da espécie.
Referências
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CASTOE, T.A. et al. Rapid microsatellite identification from Illumina paired-end genomic sequencing in two birds and a snake. PLoS ONE, v.10, n.8, 2012.
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